N. Capote, C. Monz, A. Urbaneja, J. Prez-Panads, E. Carbonell, M. Ravelonandro, R. Scorza, M. Cambra

EVALUACIN DEL RIESGO AMBIENTAL DEL CULTIVO EN CAMPO DE CIRUELOS EUROPEOS TRANSGNICOS SENSIBLES

Y RESISTENTES A PLUM POX VIRUS

Separata ITEA

INFORMACIN TCNICA ECONMICA AGRARIA, VOL. 103 N. 3 (156-167), 2007

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Evaluacin del riesgo ambiental del cultivo en campo deciruelos europeos transgnicos sensibles y resistentes aPlum pox virus

N. Capote*, C. Monz*, A. Urbaneja*, J. Prez-Panads*, E. Carbonell*, M. Ravelonandro**, R. Scorza***, M. Cambra*

* Centro de Proteccin Vegetal y Biotecnologa, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, IVIA,Valencia, Espaa** Institut de Biologie Vegetale et Moleculaire, INRA, Bordeaux, Francia*** USDA-ARS Appalachian Fruit Research Station, Kearneysville, West Virginia, EEUU

ResumenEl impacto ambiental de la liberacin al campo de ciruelos europeos (Prunus domestica L.) transgni-cos portadores del gen de la protena de la cpsida (CP) de Plum pox virus (PPV) se ha evaluado duran-te un periodo de ocho aos, en una finca experimental de Liria, Valencia, y los resultados obtenidos serevisan y discuten en este trabajo. La variabilidad molecular de poblaciones de PPV que infectan cirue-los transgnicos se compar con la de poblaciones de PPV que infectan ciruelos no transgnicos, ascomo el nmero y las especies de pulgones (vectores de transmisin del virus) y otros artrpodos quevisitaron los dos tipos de rboles del campo experimental. Adems, se estudi la posibilidad de que enlos ciruelos transgnicos emergieran virus recombinantes (entre el ARNm del transgn y el ARN de unvirus infectivo) con propiedades biolgicas alteradas y potencialmente peligrosas. Para los ensayos seutilizaron cinco lneas transgnicas de ciruelo europeo (la lnea C5 HoneySweet resistente a PPV y laslneas C4, C6, PT6 y PT23, susceptibles a PPV) y ciruelos europeos y japoneses (P. salicina Lind) no trans-gnicos. No se detectaron diferencias entre la variabilidad de las poblaciones de PPV presentes enciruelos transgnicos y no transgnicos ni en el nmero y especies de pulgones y otros artrpodos quevisitaron ciruelos transgnicos y convencionales. Tampoco se detectaron virus recombinantes viablesen las plantas transgnicas despus de ocho aos de exposicin de las mismas a la infeccin naturalpor PPV. Los datos indican que el cultivo en campo de ciruelos europeos transgnicos en condicionesmediterrneas no supone ningn riesgo ambiental, en trminos de los parmetros estudiados, msall del ocasionado por el cultivo de ciruelos convencionales.

Palabras clave: Prunus domestica L. transgnicos, PPV, evaluacin riesgos, poblaciones de virus yartrpodos.

SummaryRisk assessment of the field release of transgenic European plums susceptible and resistant to Plumpox virusThe environmental impact of the field release of transgenic European plums (Prunus domestica L.)carrying the coat protein (CP) gene of Plum pox virus (PPV) was assessed in Valencia over an eight-yearexperimental period. The obtained results are reviewed and discussed in this manuscript. The molecu-lar variability of PPV populations present in transgenic vs. non-transgenic plums was compared, andtotal numbers and species of visitor aphids (PPV transmission vectors) and other arthropods that werefound on transgenic and conventional plums were estimated. Additionally, the possibility of recombi-nation between the transcripts derived from the transgene and the infecting viral RNA was tested.Five different P. domestica transgenic lines (the PPV-resistant C5 HoneySweet line and the PPV-sus-ceptible C4, C6, PT-6 and PT-23 lines) and non-transgenic P. domestica and P. salicina Lind trees, were

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Introduccin

En este trabajo se revisan, divulgan y discu-ten resultados experimentales sobre la eva-luacin de los riesgos (otros que el flujogentico del transgn por polen) del cultivode ciruelos europeos transgnicos portado-res del gen del la protena de la cpsida delvirus de la sharka (Plum pox virus, PPV). Losexperimentos se llevaron a cabo en Espaaentre los aos 1997 y 2005. La intencin deeste estudio fue la de evaluar la influenciaque tienen los ciruelos transgnicos sobre ladinmica y diversidad de poblaciones vira-les, concretamente de PPV, de pulgones vec-tores de transmisin del virus y de otrosartrpodos que pueden ejercer control bio-lgico o constituir plaga. Algunos resultadoshan sido previamente publicados, aunque seincluyen resultados nuevos relacionados conel estudio de la diversidad de artrpodosencontrados en plantas transgnicas y con-vencionales.

Como fruto de este y otros trabajos llevadosa cabo en otros pases, se ha autorizado enEEUU el cultivo, comercializacin y uso confines de mejora de la lnea transgnica deciruelo europeo C5 (denominada HoneyS-weet) autocompatible, resistente al virusde la sharka y productora de frutos de inte-rs comercial por su calidad.

La sharka como enfermedad de frutales dehueso

La sharka o viruela, est considerada comola enfermedad ms grave de los frutales dehueso en trminos de impacto agronmicoe importancia econmica (Dunez and Sutic,1988; Nmeth, 1994). Afecta principalmentea albaricoquero, ciruelo y melocotoneroproduciendo prdida de calidad y cada pre-matura de los frutos. Adems, complicaenormemente la produccin en viveros deplantas libres de virus. El agente causante esun virus de ARN perteneciente al gneroPotyvirus, familia Potyviridae, denominadoPlum pox virus (PPV) o virus de la sharka. Elcoste asociado a la enfermedad de la sharkay su manejo a nivel mundial desde los aos1970s se estima que supera los 10.000 millo-nes de euros (Cambra et al., 2006a).

PPV se puede transmitir mediante injerto ode forma no persistente a travs de pulgones.El movimiento ilegal de material vegetalinfectado es la principal va de dispersin delvirus a grandes distancias. Una vez instaladoen una plantacin, los pulgones puedentransmitirlo a cortas distancias, de rbol arbol o incluso de plantacin a plantacin,simplemente al efectuar picaduras de prueba.

Actualmente se han descrito seis tipos dePPV que difieren en sus caractersticas epi-

tested. No differences in terms of diversity of PPV populations and numbers of aphids and other arth-ropod species that visited the trees were detected between transgenic and non-transgenic plums. Norecombination between the transgene transcripts and the incoming viral RNA was detected over aneight-year period of exposure to natural PPV infection in the field. The overall data indicate that thegrowth of PPV-CP transgenic European plums under Mediterranean conditions does not represent anenvironmental risk, in terms of the parameters studied, beyond the cultivation of conventional plumtrees.

Key words: transgenic Prunus domestica L., PPV, risk assessment, virus and arthropod popu-lations.

demiolgicas, serolgicas y genticas: PPV-Do Dideron, que afecta principalmente aalbaricoquero (Prunus armeniaca), ciruelojapons (P. salicina), ciruelo europeo (P.domestica) y apenas afecta a melocotonero(P. persicae); PPV-M o Marcus muy agresivoen melocotonero, ciruelo y albaricoquero, yque se transmite con ms eficacia a travsde pulgn; PPV-EA o El Amar, aislados loca-lizados geogrficamente en Egipto; PPV-C oCherry, que afecta a cerezo dulce (P. avium)y guindo (P. cerasus); PPV-W o Winona, unaislado inusual descrito en Canad queinfecta a ciruelo europeo; y PPV-Rec orecombinante entre D y M, de epidemiolo-ga similar al tipo D (Candresse y Cambra,2006; James y Glasa, 2006).

PPV se detect en Espaa por primera envez en 1984 en ciruelo japons (Llcer yCambra, 1985), un nuevo hospedador natu-ral de PPV no descrito hasta entonces, y deah se propag a albaricoquero y cirueloeuropeo en las zonas de produccin tem-prana a lo largo de toda la costa mediterr-nea (Cambra et al., 2006b). La sharka tipo Do Dideron es la nica presente actualmenteen Espaa. Los programas de erradicacinvoluntaria no han sido suficientes para con-trolar la enfermedad, debido a que PPV-Dapenas afecta a melocotonero, no provocaserios problemas en ciruelo japons (queacta como reservorio de la enfermedad) yadems el arranque de todos los rbolesinfectados no es obligatorio. Unido a ello, laelevada incidencia de pulgones y la alta efi-cacia de Aphis spiraecola Patch y otras espe-cies en transmitir la enfermedad explica larpida dispersin de PPV en la mayora deespecies de Prunus en toda Espaa (Cambraet al., 2006b). Los aislados virales pertene-cientes al tipo D, presentes en nuestro pasno se dispersan entre melocotoneros nidesde otras especies de Prunus a ellos. Sinembargo, los aislados de tipo Marcus siguenuna pauta epidemiolgica muy diferente,

ya que se dispersan muy fcilmente entrecualquier tipo de melocotonero, albarico-quero o ciruelo. La introduccin de aisladosde PPV tipo M en Espaa causara gravesdaos en la produccin de melocotonero(Capote et al., 2005b). Ms an, cuandoestudios de proteccin cruzada han demos-trado que la infeccin de un rbol con un ais-lado tipo D no protege frente a la infeccincon M, sino que por el contrario, los aisladosM tienden a desplazar a los aislados D en unrbol doblemente infectado (Capote et al.,2006). La diligente y acertada erradicacin delos focos de PPV-M detectados en Aragn(Cambra et al., 2004), as como la permanentevigilancia de los Servicios de Sanidad Vegetalde las distintas Comunidades Autnomas hanconseguido que los aislados agresivos delvirus de la sharka no se estn dispersandoactualmente en nuestro pas.

El uso de plantas transgnicas comoestrategia de control. Ventajas einconvenientes

En la actualidad existen programas demejora gentica encaminados a conseguirvariedades del gnero Prunus resistentes alvirus de la sharka. Sin embargo, la naturale-za polignica de la resistencia y el extensoperiodo de tiempo necesario para conseguiruna variedad resistente y comercialmenteaceptable, han motivado que hasta elmomento slo se dispongan de variedadesde albaricoquero resistentes al virus de lasharka (Badenes et al., 2006; Karayiannis etal., 2006). La obtencin de plantas transgni-cas que expresan un gen viral puede conside-rarse una estrategia de control alternativa ocomplementaria a programas convencionalesde mejora basados en cruzamientos. La ven-taja que ofrece la ingeniera gentica es laposibilidad de poder introducir directamen-te en la planta la caracterstica deseada y a

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ms corto plazo. Sin embargo, una de lasprincipales controversias del cultivo de plan-tas transgnicas es el desconocimientosobre los posibles riesgos medioambientalesasociados a la liberacin al campo de orga-nismos modificados genticamente, queincluyen: 1) la hiptesis de que los produc-tos de las plantas transgnicas pueden serpeligrosos para el consumo animal y/ohumano, 2) el flujo gentico va polen deltransgn desde las plantas transgnicas aplantas convencionales de su misma espe-cie, 3) la influencia de las plantas transgni-cas sobre la diversidad y dinmica de artr-podos y microorganismos asociados a lasplantas y al suelo, y 4) en el caso especficode plantas que portan un gen viral, la posi-bilidad de recombinacin entre los transcri-tos derivados del transgn y el ARN del virusinfectivo. Este fenmeno podra originartericamente la aparicin de virus recombi-nantes viables con caractersticas distintas ypotencialmente peligrosas, como aumentode la patogenicidad o cambio o ampliacinde la gama de huspedes o del vector detransmisin. Por todo ello, es esencial, porsus implicaciones econmicas, ecolgicas,polticas y sociales, llevar a cabo investiga-ciones para evaluar el impacto ambientaldel cultivo en campo de plantas transgni-cas y ms an cuando se trata de plantasleosas con una permanencia elevada en elcampo.

Obtencin del ciruelo europeo transgnicoHoneySweet

Siguiendo la estrategia de control de laresistencia derivada del patgeno (PDR)(Sanford and Johnston, 1985), los Drs. R.Scorza (USDA, EEUU) y M. Ravelonandro(INRA, Francia) obtuvieron plantas transg-nicas de ciruelo europeo (P. domestica L.)mediante la introduccin en las clulas

vegetales del gen de la protena de la cpsi-da (CP) de PPV va Agrobacterium tumefa-ciens (Scorza et al., 1994). La resistencia aPPV de siete lneas transgnicas denomina-das C2, C3, C4, C5, C6, PT6 y PT23 fue eva-luada en condiciones de invernadero (Rave-lonandro et al., 1997) y en tres plantacioneslocalizadas en Espaa, Polonia y Rumania(Ravelonandro et al., 2002; Hily et al., 2004;Malinowski et al., 2006). En Espaa, elcampo experimental se estableci en 1997en Liria, Valencia. Filas de ciruelos europeostransgnicos de las lneas C4, C5, C6, PT6 yPT23 (10 rboles por lnea transgnica) seplantaron separadas de filas de ciruelos notransgnicos, tanto europeos como japone-ses. El seguimiento del campo se llev acabo entre los aos 1997 y 2005 medianteinspeccin visual de sntomas y los mtodosde diagnstico oficialmente recomendadospor la Organizacin Europea y Mediterr-nea para la Proteccin de Plantas (OEPP,2004): ELISA-DASI usando el anticuerpomonoclonal universal 5B-IVIA (Cambra etal., 1994), comercializado en forma de kitpor AMR Lab y Real/Durviz (Valencia); einmunocaptura RT-PCR usando los iniciado-res universales P1 y P2 (Wetzel et al., 1992).

La lnea transgnica C5 (cv. HoneySweet)autoincompatible demostr ser altamenteresistente a la infeccin natural del virus y ala transmisin de la enfermedad medianteinjerto (Ravelonandro et al., 2002; Hily etal., 2004; Malinowski et al., 2006). El restode las lneas analizadas fue tan sensible aPPV como los ciruelos convencionales usa-dos como control. La resistencia de los cirue-los C5 es debida a un mecanismo de defensanatural de las plantas denominado silencia-miento post-transcripcional (PTGS) (Scorzaet al., 2001) en la que estn involucradosARN pequeos de interferencia (siRNA)(Hily et al., 2005) y que conlleva finalmentea la degradacin especfica del ARN delvirus infectivo. El carcter de resistencia se

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transmite a la progenie mediante hibrida-cin cruzada (Ravelonandro et al., 1998;Scorza et al., 1998).

El proceso de autorizacin para el cultivo ycomercializacin de la variedad de cirueloeuropeo transgnica HoneySweet se estllevando a cabo actualmente en EEUU (Scor-za et al., 2007). Adems de los estudios deresistencia al virus de la sharka desarrolladosen invernadero y en campo en distintas zonasecolgicas europeas, en EEUU (USDA-ARS,Kearneysville) se llevaron a cabo anlisis decampo para evaluar las caractersticas agro-nmicas del rbol y la calidad de los frutos. Laproductividad del cultivar HoneySweet injer-tado sobre P. marianna o Nemaguard esbuena y la calidad del fruto es excelente, conun peso medio de fruto de 59,5 g y tamaomedio de 4,39 x 5,08 cm. El hueso es libre conuna pequea zona unida al fruto. El conteni-do medio de azcar, medido como gradosBrix, es de 21-22 (Scorza et al., 2007). Laautorizacin del cultivo de la variedadHoneySweet permitira no slo su comerciali-zacin como una nueva variedad de ciruela,sino su uso en investigacin y mejora para eldesarrollo de nuevas variedades y patronesresistentes a PPV. Por otro lado, la aplicacinde la tecnologa de silenciamiento (PTGS)para la obtencin directa de plantas transg-nicas resistentes a virus podra aplicarse parael desarrollo de otros cultivares de frutalesde hueso (melocotonero, albaricoquero,ciruelo japons y cerezo) resistentes al virusde la sharka, as como para obtener nuevosportainjertos resistentes.

Riesgos medioambientales del cultivo deplantas transgnicas

Para evaluar el impacto de las plantas trans-gnicas sobre el medio ambiente se estudi:1) la diversidad de poblaciones de PPV pre-sentes en plantas transgnicas de ciruelo

europeo (susceptibles a la infeccin por PPV)comparada con plantas convencionales deciruelo europeo y japons, 2) la posible pre-sencia de secuencias virales recombinantes enciruelos transgnicos, y 3) la diversidad yabundancia de artrpodos (con especial aten-cin a los pulgones, vectores del virus) quevisitaron ciruelos transgnicos y no transgni-cos. Los ensayos se realizaron desde 1997hasta 2005 en una parcela experimental loca-lizada en Liria, Valencia, con permisos para laliberacin de organismos modificados genti-camente (OMGs) (B/ES/96/16 y B/ES/05/14)concedidos por el Ministerio de MedioAmbiente. Similares anlisis de riesgo se reali-zaron paralelamente en Polonia y Rumana.

Diversidad de poblaciones de PPV

Para comparar la diversidad de poblacionesde PPV presentes en plantas transgnicas yconvencionales en condiciones mediterr-neas se definieron artificialmente trespoblaciones: 1) poblacin de aislados dePPV que infecta ciruelos transgnicos delcampo experimental (32 aislados), 2) pobla-cin de PPV presente en ciruelos no transg-nicos del campo experimental (24 aislados)y 3) aislados de PPV presentes en ciruelosconvencionales de una finca control externaal campo experimental (29 aislados). Se ana-liz la diversidad gentica de los 85 aisladosmediante la secuenciacin del fragmentoms variable del genoma de PPV correspon-diente a la regin 3 del gen de la ARN repli-casa viral (NIb) y la regin 5 del gen de laprotena de la cpsida (CP). Todos los aisla-dos fueron del tipo D, confirmndose as losestudios serolgicos y moleculares desarro-llados en la misma parcela experimental(Capote et al., 2005a). A travs de unamatriz de distancia gentica se determinque el porcentaje de homologa a nivel decidos nucleicos entre los distintos aisladosanalizados variaba entre un 96,9% y un

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99,8% y que, por tanto, la variabilidadgentica en la regin del genoma analizadaentre los distintos aislados de PPV era muybaja. Haciendo uso de la comparacin entrelas secuencias se construy un rbol filoge-ntico en el que los aislados no se agrupa-ron por origen transgnico o no transgni-co, demostrndose de nuevo que todos losaislados de PPV formaban una nica pobla-cin o metapoblacin. El anlisis de la diver-sidad en el interior de cada poblacin yentre poblaciones determin que existamayor diversidad gentica (una medida dela frecuencia de haplotipos de una pobla-cin) y nucleotdica (una medida de lo dife-rentes que son los aislados a nivel de lasecuencia de nucletidos) dentro de unamisma poblacin que entre ellas. Todosestos anlisis no detectaron diferenciasmoleculares significativas entre los aisladosde PPV presentes en plantas transgnicas yno transgnicas y, por tanto, es posible con-cluir que el carcter transgnico del rbol alque infecta PPV no altera la diversidadgentica natural de las poblaciones virales.

Anlisis de recombinacin

La recombinacin es una de las estrategiasque siguen los virus de ARN para aumentar suvariabilidad. Existen recombinantes naturalesde PPV originados a partir de un eventoancestral de recombinacin entre aislados deltipo D y M. El primer aislado recombinante dePPV fue descrito por Cervera et al. (1993),pero fue considerado un aislado inusual norepresentativo de la poblacin natural dePPV. Sin embargo, el aumento y desarrolladode anlisis para la caracterizacin de aisladosde PPV ha puesto de manifiesto que los aisla-dos recombinantes son ms frecuentes de loque inicialmente se crea en varios pases deEuropa Central y del Este (Glasa et al., 2002,2004; James and Glasa, 2006). Estos aisladosforman un nuevo grupo o tipo de PPV (PPV-Rec) y comparten un origen ancestral comn

(Glasa et al., 2004). Por otro lado, se han aisla-do virus recombinantes con propiedades bio-lgicas alteradas en plantas transgnicas,pero estos experimentos se realizaron bajocondiciones de presin de seleccin modera-das o altas para favorecer la emergencia devirus recombinantes (Greene and Allison,1994, 1996; Wintermantel, 1996; Varrelmanet al., 2000). Para poder descartar este riesgo,se analiz la posible presencia de virus recom-binantes en las plantas transgnicas delcampo experimental. Para ello, se secuenciel gen completo de la protena de la cpsidade 14 aislados de PPV presentes en las lneastransgnicas C4 (con altos niveles de expre-sin del transgn y elevados niveles de trans-crito en el citoplasma) y PT6 (con nivelesmoderados de transcrito en el citoplasma).Despus de comparar estas secuencias con lasecuencia del transgn, no se detect ningu-na seal de recombinacin entre los transcri-tos del transgn y el ARN del PPV infectivo.Por tanto, se puede concluir que los ciruelostransgnicos que portan el gen CP de PPV noindujeron la aparicin de virus recombinantesa niveles detectables despus de ocho aosde exposicin a la infeccin natural de PPV(Capote et al., 2007). En el caso de los ciruelosC5, la posibilidad de riesgo ambiental poremergencia de virus recombinantes es toda-va ms reducida, si no nula, ya que esta lneatransgnica posee niveles indetectables detranscrito de CP en el citoplasma (una de lascaractersticas del silenciamiento post-trans-cripcional) (Scorza et al., 1994 y 2001) y esresistente a la infeccin por el virus (Ravelo-nandro et al., 2002; Hily et al., 2004; Mali-nowsky et al., 2006).

Diversidad y abundancia de poblaciones depulgones

Las poblaciones de pulgones que visitanuna parcela determinada varan a lo largodel ao y entre unos aos y otros. General-mente, la abundancia de pulgones se rela-

ciona con la aparicin de nuevos brotes y lapresencia de temperaturas templadas. Portodo ello, el mes de mayo suele ser el demxima afluencia de pulgones en parcelasde frutales de hueso en condiciones medite-rrneas (Cambra et al., 2006). Para determi-nar la abundancia y la diversidad de pobla-ciones de especies de pulgones que visitaronlos ciruelos europeos transgnicos y compa-rarlas con la de ciruelos europeos y japone-ses convencionales, se capturaron poblacio-nes de pulgones a lo largo los meses demayo de dos aos consecutivos (2004 y2005) mediante el mtodo del brote pega-joso (Avinent et al., 1993; Cambra et al.,2000). Este mtodo consiste en aplicarpegamento en forma de aerosol a un nme-ro determinado de brotes jvenes y sucu-lentos de un rbol. Despus de 10 das serecolectan los brotes. Los insectos captura-dos se despegan mediante aguarrs u otrodisolvente y se lavan con agua jabonosa. Seseleccionan los pulgones capturados y sepreservan en 70% de alcohol para su poste-rior conteo e identificacin bajo una lupabinocular. El mismo da de la recoleccin secolocan nuevos brotes pegajosos y as seacta hasta abarcar todo el periodo demuestreo. Mediante este mtodo se anali-zaron un total de 6.097 pulgones recogidosen mayo 2004 y 2005 de 2 brotes por rbolen 6 ciruelos europeos transgnicos, 6 cirue-los europeos convencionales y 6 ciruelosjaponeses convencionales del campo experi-mental. Los pulgones que ms visitaron losrboles del campo experimental pertenecie-ron a la especie Aphis spiraecola Patch(51%) seguida de A. gossypii Glover (28%),Hyalopterus pruni (Geoffroy), (16,5%),Brachycaudus helichrysi (Kaltenbach) (1,8%),A. fabae Scopoli (1,0%), A. craccivora Koch(1.0%), Myzus persicae (Sulzer) (0,1%) yotras especies (0,7%). No se detectarondiferencias significativas entre las especies yel nmero de pulgones que visitaron cirue-

los transgnicos y no transgnicos (europeoy japons) (Capote et al., 2007).

No todos los pulgones que visitan un rbolson capaces de transmitir PPV. Si un pulgnse alimenta sobre hojas de un rbol infecta-do con PPV es altamente probable que en suestilete queden retenidas partculas virales ysea capaz de transmitirlo a otro rbol al rea-lizar simplemente picaduras de prueba,antes de alimentarse. Todo ello tiene quesuceder en un corto periodo de tiempo(mximo una hora) por tratarse PPV de unvirus que se transmite de forma no persisten-te (Kunze and Krczal, 1971; Labonne et al.,1995). En el mecanismo de adquisicin/trans-misin del virus participa la protena viral HC-Pro o helper component-proteinasa queestablece un puente de interaccin reversi-ble entre el estilete del pulgn y la cpsidadel virin. El virin queda retenido en el esti-lete cuando el pulgn succiona y luego esliberado a la clula vegetal cuando el pulgninsaliva, llevndose a cabo la transmisin delvirus de una planta a otra. (Pirone and Blanc,1996; Syller, 2006). Los pulgones portadoresde partculas virales se denominan virulfe-ros. Para conocer si el carcter transgnico deun rbol influye en el nmero de pulgonesvirulferos que lo visitan, se compar el por-centaje de pulgones virulferos que aterri-zaron en ciruelos transgnicos y no trans-gnicos en el mes de mayo de dos aosconsecutivos. La deteccin del virus en pul-gones se realiz mediante PCR a tiempo realusando sondas TaqMan (Olmos et al., 2005).Aproximadamente el 25% de los pulgonesque visitaron el campo experimental resulta-ron ser PPV-virulferos. La alta incidencia depulgones y el alto porcentaje de virulferosfue consistente con la rpida dispersin delvirus en el campo experimental (Malinowskiet al., 2006) y en otras plantaciones de fruta-les de hueso de la zona mediterrnea (Cam-bra et al., 2004).

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No se detectaron diferencias significativasentre el nmero de pulgones virulferos delas especies A. spiraecola y A. gossypii quevisitaron los ciruelos transgnicos y conven-cionales. Por tanto, las especies de pulgonesson potencialmente capaces de adquirir ytransmitir PPV en ciruelos transgnicos y notransgnicos con la misma frecuencia, noexistiendo preferencias ni interferencias conel carcter transgnico de las plantas (Capo-te et al., 2007). La nica excepcin la consti-tuyen los ciruelos C5 que, debido a su proba-da resistencia, es la nica lnea transgnicacapaz de alterar la epidemiologa de la shar-ka, frenando la dispersin del virus.

Diversidad y abundancia de otrosartrpodos

El ecosistema del campo experimental tam-bin est compuesto de otros artrpodosque bien pueden ser considerados comoplaga o tener o no inters en control biolgi-co. Para conocer si la presencia en el campode plantas transgnicas alteraba el equilibriode las poblaciones de artrpodos, se compa-raron el nmero y la diversidad de rdenes yfamilias de artrpodos encontrados en losciruelos transgnicos y no transgnicosmonitoreados del campo experimental. Secapturaron un total de 24.908 artrpodos(sin inclur pulgones) en septiembre 2005mediante el mtodo del brote pegajoso yfueron preservados en 70% de alcohol, con-tados e identificados haciendo uso de unalupa binocular. Los artrpodos ms abundan-tes pertenecieron al orden Diptera (Familias:Sciaridae, Muscidae y Culicidae) (57,8% deltotal de artrpodos capturados) seguidos delos rdenes Psocoptera (28%), Hemiptera(9,4%) (Familias: Cicadellidae, Anthocoridaey Miridae), Neuroptera (1,7%) (Familias:Coniopterygidae y Chrysopidae), Coleoptera(Familias: Coccinellidae y Staphylinidae),Hymenoptera (1%) (Familias: Braconidae,

Ichneumonidae, Encyrtidae, Eulophidae, Cyni-poidea, Proctotrupoidea, Platygastroidea,Ceraphronoidea, Aphelinidae, Agaonidae,Pteromalidae, Perilampidae, Agaonidae,Mymaridae, Mymarommatoidea, Formicidae,Vespoidea, Apoidea, Torymidae, Eurytomi-dae y Leucospidae), Lepidoptera (0,3%),Thysanoptera (0,2%) y finalmente la claseAraneae (0,1%) (Familia Liniphydae) (Figura1). No se encontraron diferencias significati-vas (p < 0.05) en la abundancia y diversidadde rdenes y familias de artrpodos encon-trados en ciruelos transgnicos comparadoscon no transgnicos. Las familias de insectosque pueden ejercer un control biolgicosobre pulgones u otras plagas visitaron conla misma frecuencia los rboles transgnicosy convencionales. Estos resultados sugierenque la presencia en campo de plantas trans-gnicas de ciruelo europeo no altera la abun-dancia y diversidad de las poblaciones deartrpodos. Por tanto, la introduccin en lasplantas transgnicas de un gen viral, quepuede conferirle resistencia al mismo, noalter la ecologa natural de la relacin hus-ped-artrpodos.

Conclusiones

Las evaluaciones realizadas indican que elcultivo en campo de plantas transgnicas deciruelo europeo no altera la diversidad odinmica de poblaciones de PPV, pulgones yotros artrpodos ni promueve la aparicinde virus recombinantes con propiedadesbiolgicas alteradas. Estos datos apoyan lahiptesis de que el cultivo de ciruelos euro-peos transgnicos que expresan el gen de lacpsida de PPV no supone un riesgo para elmedioambiente ms all del que representael cultivo habitual de ciruelos convenciona-les. Adems, el carcter de autocompatibili-dad de estos ciruelos disminuye considera-blemente el riesgo de flujo del transgn

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mediante polinizacin cruzada. Este y otrosestudios han ayudado a la autorizacin delcultivo y comercializacin de la lnea trans-gnica C5 en EEUU, dando origen a unanueva variedad de ciruelo europeo denomi-

nada HoneySweet. El carcter de resisten-cia a PPV de esta nueva variedad le haceidnea para su uso en mejora gentica clsi-ca de otros cultivares de ciruelo europeo yde patrones de Prunus.

Figura 1. Comparacin del nmero de artrpodos (sin inclur pulgones) de distintos rdenes (a),familias plaga (b), y familias con potencial inters biolgico (c) encontrados en ciruelos europeostransgnicos (T) y ciruelos europeos y japoneses convencionales (C) del campo experimental enSeptiembre 2005 (p < 0.05). Los datos representan el n de individuos capturados en 15 rboles

transgnicos y 15 convencionales (2 brotes / rbol). Figure 1. Comparison of the number of arthropods (aphids not included) from different orders (a),

pest families (b), and biological control families (c) found in transgenic European plums (T) andconventional European and Japanese plums (C) from the experimental orchard in September 2005

(p < 0.05). Data represent the number of captured individuals in 15 transgenic trees and 15conventional trees (2 shoots / tree).

N. Capote et al. ITEA (2007), Vol. 103 (3), 156-167 165

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado en el marco deproyectos de investigacin financiados porUE (QLK3-CT-2002-02140), INIA (SC98-060 yRTA03-099) y Ministerio de Educacin y Cien-cia (RTA05-00190). Los autores agradecen aC. Collado por la identificacin de especiesde pulgones y a B. Tamargo y J. Mic (Coope-rativa Vincola de Llria) por asistencia tcni-ca en el campo experimental. Los permisospara la liberacin al campo de OMG nos

B/ES/96/16 y B/ES/05/14 fueron concedidospor el Ministerio de Medio Ambiente.

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(Aceptado para publicacin el 30 de mayo de2007)