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Revista Colombiana de Química
ISSN: 0120-2804
Universidad Nacional de Colombia
Colombia
Cuervo, Diana C.; Martínez, Sixta T.; Ardila, Harold D.; Higuera, Blanca L.
INDUCCIÓN DIFERENCIAL DE LA ENZIMA PEROXIDASA Y SU RELACIÓN CON LIGNIFICACIÓN
EN LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL CLAVEL (Dianthus caryophyllus L.) DURANTE SU
INTERACCIÓN CON Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi
Revista Colombiana de Química, vol. 38, núm. 3, 2009, pp. 379-393
Universidad Nacional de Colombia
Bogotá, Colombia
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=309026682004
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Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal
Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
INDUCCIÓN DIFERENCIAL DE LA ENZIMA PEROXIDASA Y SU RELACIÓNCON LIGNIFICACIÓN EN LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL CLAVEL
(Dianthus caryophyllus L.) DURANTE SU INTERACCIÓN CONFusarium oxysporum f. sp. Dianthi
DIFFERENTIAL INDUCTION OF PEROXIDASE ENZYME AND ITSRELATIONSHIP WITH LIGNIFICATION IN CARNATION DEFENSE
(Dianthus caryophyllus L.) MECHANISM AGAINST Fusariumoxysporum f. sp. Dianthi
INDUCAO DIFERENCIAL DA ENZIMA PEROXIDASE E A SUA RELACAOCOM A LENHIFICACAO NOS MECANISMOS DE DEFESA DE CRAVO
(Dianthus caryophyllus L.) DURANTE A SUA INTERACCAO COMFusarium oxysporum f. sp. Dianthi
Diana C. Cuervo1, Sixta T. Martínez1, 2, Harold D. Ardila1, Blanca L. Higuera1
Recibido: 14/07/09 – Aceptado: 15/12/09
Se evaluó la actividad enzimática peroxi-dasa (POD) y el contenido de lignina entallos de esquejes de clavel (Dianthus ca-
yophyllus L.) inoculados con el hongoFusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod)raza 2, con el fin de determinar su posibleparticipación en la respuesta de defensa yen la resistencia de la planta al marchita-miento vascular. Inicialmente se seleccio-naron las condiciones para la extracción ydeterminación de la actividad enzimática.Se encontró que el tratamiento con buffercitrato 100 mM pH 5,0 con 3% de PVPPpresentó los mejores resultados de activi-dad peroxidasa para la extracción de la
enzima a partir de tallos de clavel. Se de-terminaron las mejores condiciones parala medida de actividad enzimática POD através de la reacción de oxidación deo-dianisidina con H2O2 seguida a 460 nm.Una mezcla de reacción con una concen-tración 0,6 mM de o-dianisidina y 2,0mM de H2O2 en buffer citrato 100 mM apH 5,5 y 45ºC, presentó los mejores re-sultados para la cuantificación de la enzi-ma. Una vez establecidas las condicio-nes, esquejes de clavel de una variedadtolerante y una susceptible al marchita-miento vascular fueron inoculados con elpatógeno y se evaluaron los niveles de ac-tividad de POD y de acumulación de lig-
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1 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Bogotá, Colombia.
nina a diferentes tiempos pos-inocula-ción. La variedad tolerante (Bárbara),presentó inducción de dicha enzima a las8 y 48 h pos-inoculación y aumento en elcontenido de lignina a 48 y 72 h. A su vez,en la variedad susceptible (Delphi) no seencontraron cambios significativos en losniveles de POD ni en el contenido de lig-nina. Se estableció, por tanto, que la in-ducción de la actividad POD está asocia-da a la lignificación, que a nivel del tallo,hace parte de los mecanismos asociados adefensa en el modelo clavel-Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi.
clavel, Fusarium oxy-
sporum, defensa vegetal, peroxidasa, lig-nina.
Peroxidase (POD) enzymatic activity andlignin content in carnation stems (Diant-
hus cayophyllus L.) infected with the fun-gus Fusarium oxysporum f.sp. dianthi
race 2 were evaluated with the purpose ofdetermining the possible enzyme partici-pation in the plant defense response and inthe resistance to the vascular wilting. Ini-tially, the conditions for extraction anddetermination of enzymatic activity wereselected. It was found that when citratebuffer 100 mM pH 5.0 with 3% PVPPwas employed, the results of POD acti-vity in enzyme extract obtained from car-nation stems were higher. Best conditionswere set for POD activity measurethrough oxidation reaction of o-dianisidi-ne and H2O2 at 460 nm. A reaction mixtu-re with a concentration of o-dianisidine0,6mM and H2O2 2.0 mM in citrate buffer100 mM pH 5.5 at 45 oC displayed thebest results for enzyme quantification.Once conditions were established, tole-
rant and susceptible vascular wilting car-nation cuttings were inoculated with thepathogen. In each treatment at stem level,different postinoculation times were eva-luated for enzyme activity levels and lig-nin accumulation. Tolerant variety (Bar-bara) showed a POD induction at 8 and 48h pos-inoculation and an increase in lig-nin content at 48 and 72 h. At the sametime, in susceptible variety (Delphi) therewere no significant changes in POD le-vels or lignin contents. Therefore, it wasestablished that POD activity induction isassociated to lignification which, at stemlevel, is part of the mechanisms associa-ted to defense in carnation (Dianthus car-
yophyllus L.) against Fusarium oxyspo-
rum f. sp. dianthi.
carnation, Fusarium oxy-
sporum, plant defense, peroxidase, lig-nin.
Foram avaliadas a actividade enzimáticaperoxidasa (POD) e o conteúdo de ligninaem talos de estacas de cravo (Dianthus
cayophyllus L.) inoculados com o fungoFusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2,com o propósito de determinar a sua pos-sível participação na resposta de defensae à resistência da planta ao murchamentovascular. Inicialmente foram selecciona-das as condiciones para a extracção e de-terminação da actividade enzimática. Foiencontrado que o tratamento com buffercitrato 100 mM pH 5,0 com 3% dePVPP, apresentou os melhores resultadosde actividade peroxidasa na extracção daenzima a partir de talos de cravo. Foramdeterminadas as melhores condições paramedir a actividade enzimática POD a tra-vés da reacção de oxidação de o-dianisidi-
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na com H2O2 e com seguimento a 460 nm.Uma mistura de reacção com uma con-centração 0,6 mM de o-dianisidina e 2,0mM de H2O2 em buffer citrato 100 mM apH 5,5 e 45 ºC, apresentou os melhoresresultados para a quantificação da enzi-ma. Uma vez estabelecidas as condições,estacas de cravo de uma variedade tole-rante e uma susceptível ao murchamentovascular foram inoculadas com o fungopatogénico, e se avaliaram a diferentestempos pos-inoculação os níveis de acti-vidade desta enzima e de acumulação delignina. A variedade tolerante (Bárbara),apresentou uma indução de POD às 8 e 48h pos-inoculação e um aumento no con-teúdo de lignina às 48 y 72 h. Por outrolado, na variedade susceptível (Delphi)não se encontraram mudanças significati-vas nos níveis de POD nem no conteúdode lignina. Se estabeleceu, por tanto, quea indução da actividade POD está associa-da à lignificação que a nível de talo fazparte dos mecanismos associados à defesano modelo cravo-Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2.
cravo, Fusarium
oxysporum, defesa vegetal, peroxidasa.
El marchitamiento vascular causado porel patógeno Fusarium oxysporum f. sp.dianthi (Fod) es la enfermedad de mayorimpacto para el cultivo del clavel en elmundo. Colombia es el segundo produc-tor mundial de esta flor, y la presencia dela enfermedad genera pérdidas a niveleconómico y una disminución significati-va en su producción. Para el control delmarchitamiento vascular, el sector flori-cultor ha implementado un plan integradode manejo basado principalmente en evi-
tar la entrada y diseminación del patóge-no en los cultivos (1). Sin embargo, dichoplan, además de aumentar los costos en laproducción, genera apenas un controlaceptable de la enfermedad, siendo fre-cuente la aparición de la misma en los cul-tivos. El desarrollo de nuevas alternativasde control más eficaces, compatibles conlos sistemas de producción actuales e ino-cuos para el medio ambiente, se convier-ten en una necesidad para el fortaleci-miento del cultivo de esta flor en nuestropaís. Alternativas de control como el cul-tivo de variedades tolerantes, el controlbiológico y el uso de elicitores, han lla-mado la atención de la comunidad cientí-fica en este aspecto. Para el desarrollo dedichas alternativas se requiere un conoci-miento detallado de los mecanismos bio-químicos y moleculares involucrados enla interacción planta-patógeno, mecanis-mos que finalmente van a determinar laresistencia o susceptibilidad a la enferme-dad. Se ha encontrado que la infección ac-tiva un proceso de defensa multicompo-nente y compartimentalizado, que tienecomo objetivo localizar el patógeno en lostejidos vasculares xilemáticos infectados(2-4). En este proceso, inicialmente sepresenta la formación de geles, compues-tos principalmente de polisacáridos ycompuestos fenólicos en los vasos, am-bos exudados de las células parenquimáti-cas adyacentes al punto de infección. Unavez los fenólicos se fusionan a la pared y alas gomas, estos pueden estar sujetos areacciones de polimerización y oxida-ción, con el fin de formar una barrera du-rable en la interfase de la infección y lostejidos sanos. Este proceso conocidocomo lignificación, es central en la res-puesta de defensa del clavel a este patóge-no (5, 6). La enzima peroxidasa desem-
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peña un papel determinante en diversosprocesos fisiológicos necesarios para elfuncionamiento de la plantas, incluida lalignificación (7-9). La participación deesta enzima en los mecanismos de defensaha sido ampliamente documentada paradiversas especies (8-10), y a pesar de queun incremento en la actividad de esta en-zima es frecuente en las condiciones deestrés biótico, para muchos modelosplanta-patógeno, incluido el estudiado enesta investigación, dicho aumento en laactividad no se ha relacionado simultá-neamente con otros procesos de defensacomo la lignificación. La evaluación si-multánea de los fenómenos bioquímicosque se presentan durante la interacción in
vivo entre la planta y el patógeno son unprimer paso en la búsqueda de aquellosprocesos que al regular la respuesta de de-fensa vegetal, pueden ser finalmente de-terminantes en la resistencia a la enferme-dad (10). Con el fin de aportar en elconocimiento de estos fenómenos bioquí-micos relacionados con defensa en la inte-racción clavel-Fusarium oxysporum f. sp.dianthi, en el presente trabajo se evalua-ron de manera simultánea los niveles de laenzima peroxidasa y los niveles de ligni-na, en variedades con diferentes nivelesde tolerancia a la enfermedad durante elproceso mismo de la interacción entre es-tos dos organismos.
La primera etapa del presente estudioconsistió en la selección de las condicio-nes para realizar la extracción de la enzi-ma peroxidasa a partir de tallos de clavel.Con tal fin se realizaron ensayos de ex-tracción usando metodologías previa-mente reportadas para otras enzimas pre-sentes en esta matriz vegetal (11) (Tabla1). Se pesaron aproximadamente 0,4 g detallos y se maceraron vigorosamente connitrógeno líquido. Se adicionó la soluciónextractora por evaluar y se agitó durante 1h a 4 ºC. Se centrifugó a 12000xg por 30minutos y el sobrenadante fue separadodel precipitado para la determinación deactividad y cuantificación de proteína. Elmismo procedimiento se siguió con cadauno de los sistemas de extracción denomi-nados (E1, E2, E3 y E4), usando diferen-tes aditivos como la PVPP (Polivinil poli-pirrolidona). La selección se realizó bajoun diseño experimental completamentealeatorio con 4 tratamientos, realizandotriplicado de extracción y duplicado decuantificación de la actividad.
La medida de la actividad peroxidasa sehizo a través del seguimiento espectrofoto-métrico a 460 nm cada 10 s por 1 min, delos productos de la reacción de oxidación
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SoluciónNaH2PO4
-
Na2HPO4
100 mM pH 6,5
Solución NaH2PO4-
Na2HPO4100 mM pH 6,5 +
3% PVPP
Solución ácidocítrico-citrato
de sodio100 mM pH 5,0
Solución ácidocítrico-citrato de sodio
100 mM pH 5,0 +3% PVPP
. Soluciones reguladoras usadas para la extracción de la enzima peroxidasa
de la o-dianisidina en presencia de H2O2 ydel extracto enzimático (4). La velocidadde la reacción se calculó a partir de la pen-diente de la zona lineal de la gráficaA460nm vs. tiempo y la actividad específi-ca se definió como el cambio de la absor-bancia a 460 nm por minuto por mg deproteína (�Abs460nm/min*mg proteína).
Se empleó un diseño experimental escalo-nado con el fin de seleccionar las mejorescondiciones para la medida de actividadPOD. En primer lugar, se evaluó el pH dela reacción en un intervalo de 3 a 10 utili-zando las soluciones reguladoras descri-tas a continuación para cada uno de lospH evaluados: ácido acético: acetato desodio 100 mM para pH 3 y 4; ácido cítri-co-citrato de sodio 100 mM para pH 4,5,5 y 5,5; fosfato ácido de sodio-fosfatodiácido de sodio 100 mM para pH 6, 6,5,7, 7,5, 8; y finalmente borato de so-dio-ácido bórico 100 mM para pH 9 y 10.El efecto de la temperatura fue analizadoen un rango de 5 a 60 ºC, y se evaluó laconcentración del sustrato o-dianisidinaen el intervalo de 0,1 a 1,5mM y de H2O2
de 0,5 a 15 mM.
Se determinó según el método de Brad-ford modificado por Zor y Selinger, 1996(12), empleando como patrón albúminade suero bovino.
Para realizar el ensayo in vivo se utiliza-ron esquejes de clavel con 4 semanas deenraizamiento de las variedades Delphi(susceptible) y Bárbara (tolerante). Se
utilizó un aislamiento del patógeno obte-nido de plantas susceptibles con síntomasevidentes de marchitamiento, el cual semantuvo en el medio comercial PDA(Papa-Dextrosa-Agar) con repiques cada20 días. El inóculo se preparó por transfe-rencia del medio sólido a medio líquidoCzapeck Dox-Broth por 10 días a 25 ºCcon agitación de 90 rpm. El micelio se fil-tró en gasa estéril y se preparó una sus-pensión de 1,5x106 conidias/mL (porconteo en el hemocitómetro). Esta sus-pensión fue utilizada para la inoculaciónde los esquejes. Todo el material biológi-co fue suministrado por la empresa Flora-mérica.
in vivo
Para evaluar la dinámica de la actividadPOD en respuesta a la infección con el pa-tógeno se llevó a cabo un ensayo in vivo
con un diseño experimental de bloques alazar para 4 tratamientos: variedad sus-ceptible control, variedad susceptibleinoculada, variedad tolerante control yvariedad tolerante inoculada. Para ello,esquejes de clavel de cada una de las va-riedades (Delphi y Bárbara) fueron ino-culados por inmersión de sus raíces du-rante 30 s en la suspensión de conidias(1,5x106 conidias/mL) (13). Los esquejesfueron sembrados en recipientes con sus-trato estéril (tierra + cascarilla de arroz)que contenían 300 mL de solución nutriti-va. Para asegurar la infección de las plan-tas con el patógeno, la solución nutritivatenía una concentración de 1x103 coni-dias/mL (11). Esta solución fue utilizadaúnicamente para la siembra de los esque-jes sometidos a inoculación. Se prepara-ron de igual modo los respectivos contro-les, los cuales se sumergieron en agua
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estéril y se sembraron en un sustrato consolución nutritiva. Los esquejes inocula-dos y los controles se mantuvieron en lasmismas condiciones ambientales. Elmuestro se realizó a 0, 8, 24, 48 y 72 hpos-inoculación por triplicado para cadauno de los tratamientos y con duplicadoen cada uno de los ensayos de cuantifica-ción de la actividad.
En los esquejes provenientes del ensayoin vivo se determinó el contenido de ligni-na aplicando el método del ácido tioglicó-lico (14), con algunas modificaciones.Los precipitados obtenidos luego de la ex-tracción de la peroxidasa fueron resus-pendidos en etanol (1:2) y centrifugados a5000xg. Los precipitados se secaron a 60ºC durante 24 h. Se pesaron aproximada-mente 10 mg de material vegetal seco y seresuspendió en 1mL de HCl 2N y 100 �Lde ácido tioglicólico. La mezcla fue ca-lentada durante 4 h a 92 ºC con agitaciónconstante. Una vez enfriada la mezcla, secentrifugó a 16000xg por 15 minutos. Losprecipitados se lavaron con agua desioni-zada, se les adicionó 1 mL de NaOH 0,5Ny se dejaron en agitación durante toda lanoche a temperatura ambiente. El residuoinsoluble fue removido por centrifuga-ción y el tioglicolato de lignina se precipi-tó por la adición de 1 mL de HCl concen-trado (3 h, 4 ºC). Después de centrifuga-ción a 16000xg por 20 min, el residuo fueresuspendido en 1,5 mL de NaOH 0,5N.Se hizo la lectura a 280 nm y el contenidode lignina fue expresado en unidades deabsorbancia por mg de material vegetalseco. La determinación en cada uno de lostiempos de muestreo se lleva a cabo reali-
zando triplicado en la extracción y dupli-cado de cuantificación.
Para este estudio se optó por un diseñoexperimental completamente aleatoriza-do, realizando en cada uno de los mues-treos triplicado de tratamiento y duplica-do de cuantificación. El análisis estadís-tico se realizó mediante análisis de va-rianza sencillo ANOVA (p = 0,05) y seasignaron grupos estadísticamente dife-rentes mediante la prueba de Tuckey.
La literatura reporta diferentes sistemasde extracción para peroxidasa vegetalque van desde la utilización de solucio-nes reguladoras de tris-HCl, fosfato o ci-trato hasta el uso de estas mismas solu-ciones con aditivos como PVPP, tritón oEDTA. La variedad de soluciones ex-tractantes concuerda con la composiciónvariable de las diferentes partes queconstituyen la planta, y es la razón quemotiva a encontrar la mejor soluciónpara extraer la enzima de acuerdo con elsistema que se va estudiar (9, 15). Eneste trabajo se utilizaron 4 soluciones ex-tractantes con las que se evaluó tanto elefecto del pH como del uso de PVPP. Deacuerdo con los resultados obtenidos(Figura 1), el mejor nivel de actividad seobtuvo con el sistema E4, constituidopor buffer citrato 100 mM pH 5,0 y 3%de PVPP. Teniendo en cuenta que loscompuestos fenólicos pueden reaccionarcon las enzimas, inactivarlas o disminuirsu actividad (15), es necesario el uso de
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aditivo PVPP, ya que en cualquiera delos sistemas evaluados mejora los nive-les de actividad, dada su capacidad pararetener dichos compuestos reactivos, po-tenciales interferentes en la determina-ción de actividad enzimática debido a sureactividad química y a su abundancia enesta especie vegetal (13).
Se determinó que existe variación de laactividad específica en los diferentes pHevaluados y que el pH con el que se pre-sentan los mayores niveles de actividad esde 5,5 (Figura 2). Este coincide con elutilizado en la mejor solución extractora,
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. Selección de condiciones de extracción de POD a partir de tallos de clavel. Se realizaron triplicadosde extracción y duplicado de la actividad para cada extracto. Los tratamientos que presentan diferencias signi-ficativas aparecen con diferentes letras.
. Efecto del pH sobre la actividad POD en tallos de clavel.
indicando que en dichas condiciones depH, la enzima, además de presentar unaalta solubilidad, tiene un ambiente quími-co conveniente para que en su sitio activose transforme el sustrato. A condicionesde pH extremo se observa una disminu-ción en la actividad de la enzima, lo cualdemuestra el conocido efecto que puedellegar a tener la concentración de iones hi-dronios sobre la estructura de las proteí-nas, alterándolas y, en algunos casos,inactivándolas. Este resultado es similaral encontrado para una peroxidasa aisladade hojas de palma real con un pH 5,2(16). Los valores de pH reportados parala máxima actividad de POD se encuen-tran entre 5 y 7 (17-22) aunque se repor-tan valores de pH más ácidos (23).
Se encontró que entre las temperaturasevaluadas, la de 45 ºC presenta la mayoractividad de la enzima POD. (Figura 3).Algunas enzimas incluso peroxidasas ais-ladas de otras fuentes vegetales (24) a es-tas condiciones, pueden estar inactivasporque se han desnaturalizado; sin em-bargo, es conocido que, en general, las
POD son bastante estables al calor y no esraro encontrar buena actividad de ellasaun a altas temperaturas (25, 26). Peroxi-dasa aislada de uvas malvasia presentó unpH y una temperatura óptima de 5,5 y 40ºC, respectivamente, valores similares alos encontrados en tallos de clavel (27).
La Figura 4 se realizó manteniendoconstante la concentración de H2O2 a ni-veles de saturación; la Figura 5, mante-niendo constante la concentración deo-dianisidina a niveles de saturación. Enlas dos gráficas se observa claramente elcomportamiento típico de una enzima quesigue la cinética de Michaelis-Menten,resultado que concuerda con el reportadopara 6 isoperoxidasas purificadas de raí-ces de rábano originarias de Corea, lascuales también siguen esta cinética en en-sayos realizados usando como sustratoo-dianisidina o guaiacol (22). Los valoresde Km aparente obtenidos para cada unode los sustratos utilizados en el presenteensayo, o-dianisidina y H2O2 a las condi-ciones descritas, fueron 1,49 mM y 0,56mM, respectivamente.
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. Efecto de la temperatura sobre la actividad POD en tallos de clavel.
in vivo
La peroxidasa es una enzima involucradaen diferentes procesos fisiológicos de lasplantas, algunos de ellos propios del desa-rrollo, otros inducidos por estrés bióticoo abiótico. Entre los procesos que involu-cran la enzima están: regulación hormo-nal, mecanismos de defensa, control de
elongación celular, polimerización de ex-tensina, entrecruzamiento de los polisa-cáridos de la pared celular, biosíntesis delignina y procesos de suberización (28).Estudios previos realizados por investi-gadores holandeses concluyen que estaenzima se induce en clavel de manera nodiferencial en interacciones compatiblese incompatibles (29). Sin embargo, di-
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. Selección de concentración de o-dianisidina para la determinación de la actividad POD en tallos declavel.
. Selección de concentración de peróxido de hidrógeno para la determinación de la actividad POD entallos de clavel.
chos estudios se llevaron a cabo usandorazas del patógeno con alta prevalencia enHolanda y en condiciones de inoculaciónmuy diferentes a las usadas por el patóge-no para entrar en la planta en las condicio-nes de cultivo. Por otro lado, la actividadde esta enzima no se relaciona con otrasrespuestas bioquímicas asociadas, puntocentral en la búsqueda de probables me-canismos de regulación de la respuesta dedefensa vegetal. El ensayo in vivo del pre-sente estudio, además de realizarse usan-do condiciones de inoculación semejantesa las usadas por el patógeno en los culti-vos de clavel, permite relacionar la activi-dad de la enzima con un proceso bioquí-mico reportado como determinante en larespuesta de defensa del clavel. Los re-sultados obtenidos del ensayo in vivo semuestran en la Figura 6, y en esta se pue-de observar que a las 8 y 48 h pos-inocula-ción se presentó una inducción significa-
tiva de la enzima POD en la variedad tole-rante (Bárbara). En la variedad suscepti-ble (Delphi), hacia el último día demuestreo, se observaron diferencias que,aunque significativas (p = 0,5) con res-pecto al control, son mucho menores quelos valores inducidos presentados por lavariedad tolerante. Es interesante obser-var que, en general, los niveles de activi-dad de la enzima son mayores en la varie-dad tolerante a lo largo de todo el ensayoy, en adición a la inducción pronunciadaobservada a las 48 h pos-inoculación, es-tos resultados son un indicio de la rela-ción de la actividad POD con la respuestade defensa de la planta y con la resistenciaa la enfermedad. Resultados similares, deinducción temprana (72 h), se encontra-ron en estudios del modelo Lupine amari-llo (Lupinus luteus L.)-Fusarium oxyspo-
rum, que indican la posible participaciónde la enzima POD en mecanismos de de-
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. Evolución de la actividad POD en tallos durante el ensayo in vivo desarrollado con esquejes de va-riedades tolerantes y susceptibles al marchitamiento vascular. Se realizaron triplicados de extracción paracada tratamiento en cada uno de los tiempos y duplicado de la actividad para cada extracto. Los tratamientosque presentan diferencias significativas se presentan con letras diferentes.
fensa por parte de la planta debido al evi-dente aumento de la actividad de la enzi-ma junto con niveles altos de sacarosaendógena que limitan la infección y el de-sarrollo del patógeno (9). Yamunarani ycols., 2004 (30), reportan aumento de ac-tividad peroxidasa en tomate, un día des-pués de inducir resistencia en la planta,con extracto de agallas de Quercus infec-
toria. En otro modelo planta-patógeno,algunas isoenzimas de POD se indujeronen raíces y hojas de pimienta luego de ino-culación con esporas de Paenibacillus
illinoisensis (31). Por otro lado, Luhová ycols., 2006 (32), realizaron un análisis deactividades enzimáticas, entre ellas la deperoxidasa, en raíces de 2 genotipos dePisum sativum con diferente susceptibili-dad a Fusarium oxysporum y Fusarium
solani, y encontraron un aumento de acti-vidad para esta enzima en raíces infecta-das a partir del día 2 y hasta el 28 pos-ino-culación. Según dichas consideraciones,los resultados obtenidos en el presente es-tudio coinciden con los encontrados enotros modelos planta-patógeno y permi-ten proponer que la enzima POD está re-lacionada con los mecanismos de defensadel clavel y por ende con resistencia almarchitamiento vascular.
in vivo
Se ha postulado que la actividad peroxida-sa podría ser importante en resistencia ala penetración de patógenos en plantaspor estar involucrada en el depósito de ex-tensina en la pared celular, mediar en elentrecruzamiento de ésta en presencia deH2O2 (33) y participar en la polimeriza-ción oxidativa de alcohol hidroxicinamíli-
co para formar lignina (34), procesos queconducen a dar rigidez a la pared celular ycolocar barreras a la infección del patóge-no (35). Teniendo en cuenta la importan-cia que tienen las peroxidasas en la bio-síntesis de lignina, es de esperar que lainducción de POD esté relacionada conun aumento en el contenido de lignina.Esta correlación se observa en el modeloLupine amarillo (Lupinus luteus L.)-Fu-
sarium oxysporum, en el que la síntesis delignina aumenta a tiempos tempranos deinfección (24 h) (9). Se han reportadoisoenzimas específicas de peroxidasas depared celular que se creen son responsa-bles de la etapa final de la lignificación(36-38) la cual está asociada a mecanis-mos de defensa.
La Figura 7 presenta los resultados delcontenido de lignina obtenido de los tallosde clavel del ensayo in vivo. Se observaque para la variedad tolerante, hay un au-mento de lignina a partir de las 48 h posi-noculación que se mantiene hasta las 72h. La inducción de la enzima POD con-cuerda con el aumento en el contenido delignina a 48 h, lo cual confirma el papelque esta enzima desempeña en la defensadel clavel al patógeno causal del marchi-tamiento vascular. Es importante tener encuenta que no es solamente esta enzima laque está involucrada en la biosíntesis delignina, ya que enzimas como las polife-noloxidasas cumplen también este papel,que en este modelo planta-patógeno tam-bién han sido correlacionadas con defen-sa a nivel del tallo (4).
Estudios realizados por Dalisay y Kuc(39), reportan aumento de actividad pero-xidasa y del proceso de lignificación, lomismo que la depositación de extensina,procesos que se asocian con resistencia
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sistémica inducida en la interaccióncohombro-Colletotrichum lagenarium.La acumulación de lignina y compuestosfenólicos se ha correlacionado con resis-tencia a la enfermedad en varias interac-ciones planta patógeno como son los mo-delos Arroz-Xanthomonas oryzae y Co-hombro-Trichoderma harzianum (40).Los resultados obtenidos en el presentetrabajo permiten proponer que una induc-ción diferencial de la enzima peroxidasaen la variedad tolerante de clavel con res-pecto a la susceptible en tiempos tempra-nos pos-inoculación, está relacionada conla acumulación de lignina durante la acti-vación de los mecanismos de defensa aso-ciados con la resistencia del clavel al pa-tógeno causal del marchitamientovascular.
A la Universidad Nacional de Colombia,dependencia DIB, y a Colciencias por lafinanciación.
1. Pizano, M. Clavel (Dianthus car-
yophyllus L.). 2000. Bogotá, D.C.,Ediciones Hortitecnia Ltda.
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