Neurología genómica personalizada: el futuro es ahora

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ARTICLE IN PRESSEUARG-184; No. of Pages 10

n e u r o l a r g . 2 0 1 4;x x x(x x):xxx–xxx

Neurología Argentina

www.elsev ier .es /neuro larg

rtículo original

eurología genómica personalizada: el futuro eshora

arta Córdobaa,b,∗, Dolores González Moróna,d, Sergio Alejandro Rodríguez-Quirogaa,c yarcelo Andrés Kauffmana,b

Consultorio de Neurogenética, Centro Universitario de Neurología «José María Ramos Mejía», División Neurología, Hospital J.M. Ramosejía, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, ArgentinaInstituto de Biología Celular y Neurociencias «Eduardo de Robertis», Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires-CONICET,uenos Aires, ArgentinaConsultorio de Movimientos Anormales, Centro Universitario de Neurología «José María Ramos Mejía», División Neurología, Hospital

.M. Ramos Mejía, Facultad de Medicina, UBA, Buenos Aires, ArgentinaSección de Neurooftalmología, FLENI, Buenos Aires, Argentina

nformación del artículo

istoria del artículo:

ecibido el 14 de enero de 2014

ceptado el 11 de marzo de 2014

n-line el xxx

alabras clave:

edicina personalizada

xoma

eucodistrofia

araparesia espástica

etraso mental no sindrómico

r e s u m e n

Introducción y objetivos: Las nuevas técnicas de secuenciación genómica masiva han revo-

lucionado el diagnóstico de las enfermedades neurológicas. Nuestro objetivo general es

ilustrar, mediante la presentación de 3 casos clínicos, el abordaje diagnóstico de la patología

neurológica desde la genómica. Para ello nos proponemos: explorar herramientas bioin-

formáticas de anotación e interpretación funcional de variantes, describir un algoritmo de

análisis para los datos obtenidos del exoma y con estos resultados correlacionar en nuestros

pacientes fenotipo-genotipo-vía funcional.

Material y métodos: Fueron incluidos 3 pacientes que concurrieron a la consulta con sín-

tomas neurológicos crónicos y progresivos. Secuenciamos el exoma en los 3. Mediante el

uso de herramientas bioinformáticas, utilizando un algoritmo de selección, se filtraron las

variantes por frecuencia poblacional, patogenicidad y modelo de herencia. Se estableció la

correlación funcional con el fenotipo en cada caso y finalmente se validaron las variantes

candidatas por Sanger en los afectados y se buscó su segregación en familiares.

Resultados: Se elaboraron algoritmos de aproximación diagnóstica genómica para cada caso.

En el caso 1 se llegó al diagnóstico de leucodistrofia asociada a POLR3A con las siguientes

mutaciones c.G3781A:p.E1261K y c.G3014A:p.R1005H. En el caso 2 el diagnóstico probable

fue de retraso mental sindromático secundario a la mutación p.Arg198* en homocigosis

para GRIK2. Y, finalmente, en el caso 3 la causa de paraparesia espástica hereditaria fue el

haplotipo patogénico en heterocigosis compuesta c.6763insA y c.6726A>T, p.Gln2242His en

Cómo citar este artículo: Córdoba M, et al. Neurología genómica personalizada: el futuro es ahora. Neurol Arg. 2014.http://dx.doi.org/10.1016/j.neuarg.2014.03.002

SPG11.

Conclusiones: La aproximación diagnóstica genómica en conjunto con una completa eva-

luación clínica resulta útil para el abordaje de la patología neurológica, permitiendo una

∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [email protected] (M. Córdoba).

ttp://dx.doi.org/10.1016/j.neuarg.2014.03.002853-0028/© 2014 Sociedad Neurológica Argentina. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

dx.doi.org/10.1016/j.neuarg.2014.03.002

http://www.elsevier.es/neurolarg

mailto:[email protected]

dx.doi.org/10.1016/j.neuarg.2014.03.002

ARTICLE IN PRESSNEUARG-184; No. of Pages 10

2 n e u r o l a r g . 2 0 1 4;x x x(x x):xxx–xxx

correlación fenotipo genotipo y vía funcional afectada, arribando a un diagnóstico molecular

sólido.© 2014 Sociedad Neurológica Argentina. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los

derechos reservados.

Personalized genomic neurology: Future is now

Keywords:

Personalized medicine

Exome

Leukodystrophy

Spastic paraparesis

Non syndromic mental

retardation

a b s t r a c t

Introduction and objectives: The new techniques of mass genome sequencing have revolutio-

nized the diagnosis of neurological diseases. Our overall objective is to illustrate the genomic

diagnostic approach of neurological pathology by presenting three cases. To do this we will:

explore bioinformatic annotation tools and functional interpretation of variants, describe

an algorithm for exome data analysis and to correlate these results with our phenotype-

genotype -functional pathway.

Material and methods: We included 3 patients who attended the talks with chronic and

progressive neurological symptoms. We sequenced the exome in all three. We performed

the analysis through annotation and functional bioinformatic tools

Results: Algorithms genomic diagnostic approach were developed for each case. In case 1

the diagnosis was reached Leukodystrophy associated with the following mutations POLR3A

c.G3781A: p.E1261K and c.G3014A: p.R1005H. In case 2 the diagnosis was probable syndromic

mental retardation secondary to homozygous mutation p.Arg198* for GRIK2. And finally in

case 3 the cause of hereditary spastic paraparesis was compound heterozygous pathogenic

haplotype c.6763insA and c.6726A > T, p.Gln2242His in SPG11.

Conclusions: The genomic diagnostic approach along with a complete clinical evaluation is

useful for addressing neurological pathology allowing genotype and phenotype correlation

with functional pathways arriving to a solid molecular diagnosis.

© 2014 Sociedad Neurológica Argentina. Published by Elsevier España, S.L. All rights

reserved.

objetivos específicos nos proponemos:

Introducción

El problema de la comprensión precisa y completa de las basesmoleculares de la patología neurológica ha sido la meta demuchos estudios genéticos. En este sentido, hasta hace pocoexistían 3 formas principales de abordaje a este problema:a) estudios de análisis de ligamiento genético; b) estudiosbasados en genes candidatos, y c) estudios epidemiológicosbasados en casos y controles. El uso de estos 3 enfoques diolugar a considerables éxitos, culminando en la identificaciónde muchos genes responsables de enfermedades con herenciamendeliana y otros tantos factores de riesgo para numerosasafecciones neurológicas con herencia compleja1. En los últi-mos 5 anos, las nuevas técnicas de secuenciación masiva delADN han revolucionado el campo de la genética y de las enfer-medades humanas y, por ende, el de la neurología también2.Actualmente, es posible determinar la secuencia codificantepara proteínas de todos los genes en el genoma de un indivi-duo (el exoma humano) en cuestión de días y la obtención delgenoma humano completo (secuencia codificante y no codifi-cante) ya es una realidad asible3. El impacto de estos avancestecnológicos está produciendo un cambio paradigmático en laaproximación al proceso salud-enfermedad, expresado bajoel concepto de medicina personalizada, donde se busca asesorar

Cómo citar este artículo: Córdoba M, et al. Neurología genómhttp://dx.doi.org/10.1016/j.neuarg.2014.03.002

acerca de riesgo, realizar diagnósticos e implementar trata-mientos de acuerdo con el fenotipo molecular de cada paciente4.

Sin embargo, todavía existen limitaciones asociadas aestas nuevas tecnologías. Se debe considerar la posibili-dad de errores técnicos en el análisis de secuencias, comotambién el hecho de que la validación de los hallazgoses dificultosa y laboriosa. En consecuencia, su introduccióndirecta en el diagnóstico debe ser cautelosa, a la esperade resultados que tienen que ser consistentes antes de suestablecimiento sistemático5. Por otro lado, el manejo y lacategorización de la gran cantidad de información inciden-tal o no buscada inherente implican un verdadero desafío6,7.Debe tenerse en cuenta que el análisis de la secuencia-ción de un exoma permite reconocer, en promedio, másde 70.000 variantes (posiciones en el genoma que se dife-rencian de la secuencia de referencia humana) y que deellas solo una o 2 serán la/s responsable/s de la sintoma-tología en un individuo con una enfermedad de herenciaautosómica dominante o recesiva, respectivamente. Enton-ces, la aproximación diagnóstica mediante estas nuevas ypoderosas herramientas conlleva tanto optimismo como unpensamiento cuidadoso.

En este trabajo, nuestro objetivo general es ilustrar mediantela presentación de 3 casos clínicos el abordaje diagnósticode la patología neurológica desde la genómica. Para ello, como

ica personalizada: el futuro es ahora. Neurol Arg. 2014.

– Explorar herramientas bioinformáticas de anotación e inter-pretación funcional de variantes genéticas.


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n e u r o l a r g . 2 0

A partir de dicha exploración, describir un algoritmo de aná-lisis aplicable a los datos obtenidos de la secuenciación delexoma.

Establecer una hipótesis diagnóstica en cada uno denuestros pacientes correlacionando fenotipo-genotipo-víafuncional.

acientes y métodos

acientes y procedimientos diagnósticos efectuados

ueron incluidos 3 pacientes con patología neurológica de pro-able origen genético. Cada uno de los sujetos fue interrogado

evaluado clínicamente. Por otro lado, se recabó informaciónemográfica, origen étnico familiar y presencia de comorbili-ades. A cada uno de los sujetos afectados se les realizó, comostudios complementarios comunes, resonancia magnéticaRM) de encéfalo de 1,5 T y electromiografía de 4 miem-ros. Todos los sujetos brindaron el consentimiento informadoediante formulario aprobado por el Comité de Ética Institu-

ional previamente a su participación en el estudio.

studios moleculares. Secuenciación completa del exomaumano

e purificó ADN genómico de una muestra de sangre periféricaerteneciente a cada uno de los sujetos incluidos utilizando unistema comercial y siguiendo instrucciones del fabricante. Aartir de 1 �g de ADN se construyeron 3 bibliotecas de secuen-iación según procedimientos estandarizados de Illumina, quencluyen fragmentación de la muestra por nebulización enamanos de 350-400 pb. Posteriormente, se enriqueció cadana de estas bibliotecas con aquellos fragmentos representa-ivos del exoma humano completo mediante la utilización den sistema de hibridación en solución (Nimblegen V3 o TruSeq),iguiendo instrucciones del fabricante. Luego, se amplificaronor PCR todos los fragmentos seleccionados siguiendo proce-imientos estandarizados. Finalmente, se secuenció el exomatilizando un equipo Illumina Hiseq 2000 siguiendo procedi-ientos estandarizados del fabricante.

nálisis bioinformático. Identificación de variantesandidatas e interpretación funcional

e alineó el producto de la secuenciación con la secuenciae referencia del genoma humano del Centro Nacional de

nformación Biotecnológica de los Institutos Nacionalese Salud de los Estados Unidos versión 37/hg19 utilizando

a herramienta BWA (v0.5.9; parámetro disponibles ante suequerimiento)8. Posteriormente, se identificaron variantes deucleótido único y pequenas inserciones/deleciones (INDEL)ediante la utilización de las herramientas picard (v1.59)

samtools (v0.1.18; parámetros utilizados disponibles anteu requerimiento)9. Cada una de las variantes identificadasue caracterizada utilizando la herramienta ANNOVAR10 y

11 12


MICIA , utilizando las bases de datos dbSNP 130 y 135 , 1.000enomas (versión febrero de 2012)13, knowngene de UCSC14,.400 exomas de NHLBI15, junto a las herramientas de pre-icción de patogenicidad SIFT16, Condel17, PhyloP y GERP++18.

x x(x x):xxx–xxx 3

Finalmente, se filtraron e identificaron aquellas variantes quecumplieran con los requisitos de: 1) frecuencia poblacionalmenor al 5% (prevalencia del desorden estimada en 0,00005 y fre-cuencia de portadores de mutación según modelo de herencia inferidoestimada en 0,007); 2) consistentes con un modelo de herenciaautosómico recesivo, y 3) probable patogenicidad19.

Finalizada esta primera etapa, se continuó con la inter-pretación funcional de las variantes candidatas mediante lasherramientas de interpretación biológica: BIOGRAPH20.

Validación por secuenciación de Sanger. Identificación devariantes candidatas por segregación familiar

Las variantes seleccionadas por el algoritmo descrito arribafueron secuenciadas en los 3 casos por método de Sanger,utilizando un sistema de electroforesis capilar, y método ABIBigDye terminator, siguiendo instrucciones del fabricante. Enlos casos 1 y 3 se realizó en otros miembros de la familia.En el caso 2 solo en el afectado porque todavía no se obtuvo elconsentimiento para estudio mediante exoma de otro miem-bro afectado en la familia. Esto tiene el objetivo de validar loshallazgos de la secuenciación masiva e identificar aquella/svariante/s probablemente responsables del fenotipo obser-vado investigando su segregación entre sujetos afectados yconsistencia mendeliana en la familia en padres, en caso deque fuera posible.

Informe de hallazgos incidentales

Se realizó informando las variantes con significado clínico par-tiendo de los siguientes preceptos6:

– El cambio genético debe ser conocido o previsto de tenerimportancia clínica urgente.

– El conocimiento del hallazgo debe tener un claro beneficiodirecto que se perdería si el diagnóstico se hiciera más tarde,es decir, el conocimiento de este factor de riesgo alteraríansustancialmente la toma de decisiones médicas o reproduc-tivas.

– El beneficio potencial de conocer que un trastorno genéticoexiste es claramente mayor que los riesgos potenciales aso-ciados con la ansiedad y las pruebas médicas posterioresque podrían resultar de este conocimiento.

– A menos que anadan un riesgo sustancial, los factores deriesgo de los trastornos multifactoriales no se reportan.

– Las mutaciones recesivas se informan solamente sí:1. La frecuencia de portación para mutaciones en ese gen

específico es > 1% (de manera que la incidencia de laenfermedad es mayor a 1/40.000).

2. El síndrome da lugar a una significativa morbilidad.3. El diagnóstico precoz y la intervención tendrían un bene-

ficio significativo.

La selección final se hizo de acuerdo con las recientesrecomendaciones de la Asociación Americana de GenéticaHumana7, donde se determina un panel de 57 genes acciona-


bles para los que sus variantes, previamente conocidas comopatogénicas o patogénicas por predicción bioinformática,deben ser informadas independientemente del consenti-miento del paciente (tabla 1).



Tabla 1 – Recomendaciones de reporte de hallazgos incidentales

Gen Fenotipo

BRCA, BRCA2 Cáncer de mama y ovario familiarTP53 Síndrome de Li-FraumeniSTK11 Síndrome de Peutz-JeghersMLH1, MSH2, MSH6, PMS2 Síndrome de LynchAPC Poliposis adenomatosa familiarMUTYH Poliposis asociada a MUTYH, adenomas múltiples

colorrectales, FAP tipo 2, poliposis adenomatosa colorrectal ARVHL Síndrome de von Hippel-LindeauMEN1 Neoplasia endocrina múltiple tipo 1RET Neoplasia endocrina múltiple tipo 2RET, NTRK1 Carcinoma de tiroides familiarPTEN Síndrome de tumor y hamartoma PTENRB1 RetinoblastomaSDHD, SDHDF2, SDHC, SDHB Síndrome del feocromocitoma paraganglionar hereditarioTSC1, TSC2 Esclerosis tuberosa complejaWT1 Tumor de Wilms asociado a WT1NF2 Neurofibromatosis tipo 2COL3A1 EDS tipo vascular FBN1FBN1, TGBR1, TGBR2, SMAD3, ACTA2, MYH11 Síndrome de Marfan y de Loeys-Dietz, y aneurismas y

disecciones de aorta torácica familiarMYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNT3, TPM1, MYL3, ACTC1, PRKAG2,

GLA, MYL2, LMNACardiomiopatía hipertrófica y dilatada

RYR2 Taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgicaPKP2, DSP, DSC2, TMEM43, DSG2 Síndrome de Romano Ward 1, 2 y 3 con QT prolongado y

síndrome de BrugadaLDLR, APOB, PCSK9 Hipercolesterolemia familiarRYR1, CACNA1S Susceptibilidad a la hipertermia

arilsulfatasa A (0,33 nm/min/mg Prot y 0,27 nm/min/mg Prot)y excreción de sulfátidos normal en la orina.

Tomado de Green et al.7.

Se brindó asesoramiento genético en cada caso particularde acuerdo con estos criterios, según los hallazgos particula-res.

Análisis estadístico

Las distintas herramientas bioinformáticas utilizadas involu-cran el uso de algoritmos particulares que incluyen pruebasestadísticas que habitualmente son no paramétricas y basa-das en permutaciones. Una descripción detallada de cadaalgoritmo puede encontrarse en cada una de las refe-rencias de las herramientas mencionadas arriba. Cuandocorrespondiera, para el cálculo de la significación estadísticadel análisis de la mutación individualizada se siguió la meto-dología descrita por Zhi y Chen5.

Resultados

Presentación de casos

Caso 1: leucodistrofiaUna mujer de 23 anos de edad fue derivada a nuestro con-sultorio por un cuadro clínico de 18 anos de evolución. Sinantecedentes familiares relevantes (fig. 1), tuvo un desarrollonormal hasta que a los 5 anos presentó sus primeros síntomas,


con torpeza en los movimientos. A los 14 anos fue evaluada porendocrinología por amenorrea y pubertad tardía. De acuerdocon los archivos médicos, en su primera evaluación endo-crinológica se evidenciaba retraso en el desarrollo puberal,

ausencia de caracteres sexuales secundarios, hipogonadismoconfirmado por ultrasonido e hipogonadotrofismo con nivelesde hormona luteinizante y hormona foliculoestimulante pordebajo de la normalidad. En los anos siguientes, evolucionócon mayor incoordinación en los movimientos y problemas deaprendizaje. El curso fue lentamente progresivo, excepto poruna importante exacerbación aguda a los 20 anos consistenteen ataxia y alteración de los movimientos oculares.

Fue estudiada con una RM de cerebro, que mostróafectación difusa de la sustancia blanca con patrón de hipo-mielinización y adelgazamiento del cuerpo calloso (fig. 2).Otros estudios diagnósticos fueron solicitados ante la sospe-cha de leucodistrofia. Los resultados mostraron bajos nivelesde la enzima arilsulfatasa A en leucocitos (0,14 nm/min/mgProt, VN: 0,40-2), con excreción urinaria normal de sulfátidos.Ambos padres también tenían bajos niveles de actividad de


CASO 1 CASO 2 CASO 3

Figura 1 – Familiograma.


n e u r o l a r g . 2 0 1 4;x x x(x x):xxx–xxx 5

Figura 2 – Afectación difusa de la sustancia blanca con patrón de hipomielinización y adelgazamiento del cuerpo calloso(

ns

CUcletdd

hancdl

cn

lv

C

Ptdredq

flechas).

Llegó a nuestra evaluación con un diagnóstico etiológicoo concluyente de leucodistrofia metacromática o portaciónintomática de seudodeficiencia de arilsulfatasa.

aso 2: retraso mental y epilepsian paciente varón de 31 anos fue traído por sus padres a laonsulta por presentar trastornos de aprendizaje y crisis epi-épticas de tipo atónicas desde los 13 anos, habiendo agregadon los últimos 2 anos distonía cervical y alteraciones conduc-uales. Mostraba el antecedente en una familia consanguíneae una única hermana con trastornos conductuales e historiae un evento comicial aislado (fig. 1).

En la evaluación neurológica, se constató: retraso mental,iperreflexia generalizada, distonía cervical en rotación lateral

derecha con componente en anteroflexión, asociada a disto-ía de tronco en lateralización a izquierda, temblor postural yinético mínimo bilateral y simétrico, además de la presenciae movimientos mioclónicos a nivel de miembros superiores

os cuales exacerbaban ante el estímulo táctil.La RM de encéfalo no mostró alteraciones. En la RM de

olumna se observó marcada escoliosis, sin alteraciones aivel medular. El electromiograma resultó normal.

Una biopsia muscular y estudios de laboratorio dirigidos aa búsqueda de enfermedad mitocondrial resultaron negati-os.

Llegó a nuestra evaluación sin diagnóstico etiológico.

aso 3: paraparesia espástica

aciente mujer, de 23 anos, que concurrió a la consulta presen-ando trastornos de aprendizaje y alteraciones de la marchae curso progresivo. Sin antecedentes patológicos ni familia-


es de relevancia, hasta que a los 10 anos inició con problemasn su desempeno escolar. Seis anos más tarde, agregó pérdidae equilibrio y dificultad para mantenerse de pie, síntomasue progresaron a lo largo del tiempo requiriendo apoyo para

caminar alrededor de los 19 anos. En los últimos 2 anos, agregótemblor cinético, intermitente, del miembro superior derecho,así como disartria y trastornos deglutorios.

En el examen físico, se constataron como hallazgos posi-tivos: disartria moderada, hipertonía espástica severa demiembros inferiores asociada a leve disminución de la fuerzamuscular en los miembros inferiores, hiperreflexia generali-zada con signos de piramidalismo y temblor cinético en ambosmiembros superiores.

En los estudios complementarios, la paciente presentó RMde encéfalo con lesiones de sustancia blanca en ambos hemis-ferios y en corona radiata, asociado a adelgazamiento de larodilla y tercio anterior del cuerpo calloso (fig. 3). El electromio-grama mostró hallazgos compatibles con una polineuropatíamotora de tipo axonal a predominio distal de miembros supe-riores e inferiores.

Llegó a nuestra consulta sin diagnóstico etiológico conclu-yente.

Análisis global de variantes y algoritmos propuestos

Luego de la exploración de las diferentes herramientas bioin-formáticas, se establecieron algoritmos de análisis. En lafigura 4 se ilustra un algoritmo general de análisis de variantes.Esto involucra:

1. Una primera etapa de filtrado por frecuencia poblacional.2. Una segunda etapa de filtrado por modelo de herencia.

Considerando que el modelo de herencia que mejor seajusta a lo observado en estos pacientes es el autosómicorecesivo, concentramos nuestro análisis en aquellos genesque tuvieran 2 variantes (heterocigota compuesta) o una


variante rara en homocigosis (fig. 1). En el caso 2, prioriza-mos nuestro análisis en aquellas variantes en homocigocisdebido a la presencia de consanguinidad entre los padres.



Figura 3 – Lesiones en sustancia blanca en amboshemisferios y en corona radiata asociadas a adelgazami-

Hipótesis de diagnóstico

Panel de genes

Exome sequencing

Análisis exómico

Mutación causal

Algortimo figura 2

Figura 5 – Algoritmo de análisis del caso 1.

Hipótesis de diagnóstico clínico

Hipótesis de diagnóstico molecular libre

Exome sequencing

Análisis exómico

Mutación causal

Algortimo figura 2

ento de la rodilla y el tercio anterior del cuerpo calloso.

3. Una tercera etapa de análisis, que combina una hipóte-sis etiológica «a priori» (determinada por la presentaciónclínica) y el análisis funcional de los productos proteicosde cada uno de los genes candidatos resultantes de las 2primeras etapas de filtrado junto con el análisis de pato-genicidad de cada una de sus variantes. En el primer caso(leucodistrofia) la hipótesis etiológica «a priori» incluyó unpanel de 64 genes conocidos como etiopatogénicos en lasleucodistrofias; en el caso 2 (retraso mental y epilepsia)se trató de una aproximación libre (sin genes candidatos«a priori») y en el caso 3 la búsqueda se orientó también aun panel amplio de 15 genes responsables de paraparesiaespástica hereditaria recesiva. En las figuras 5–7 se mues-tran los algoritmos de aproximación diagnóstica segúncada caso clínico.


Análisis de los 3 exomas

Un detalle del volumen de información nucleotídica obtenidoen los 3 exomas es presentado en las tablas 2–4. El análisis de

Resultados de la corrida

Herramientas de anotaciony filtrado de variantes

Analisis funcional y filtrado Biblografíay base de datos

Lista final de variantes y genes candidatos

Figura 4 – Algoritmo general


esta información muestra que en cada uno de los 3 exomas sehallaron alrededor de 75.000 variantes de nucleótido único y8.000 pequenas inserciones/deleciones.

Más de un 90% de estas variantes fueron previamente des-critas en la literatura o en bases de datos poblacionales con


una frecuencia poblacional mayor al 5% o por localizar enregiones no codificantes, por lo que se presumen sin valorpatogénico.

≈ 1400 variantes por frecuencia poblacional

DE ≈ 70000 variantes

≈ 120 variantes modelo de herencia

≈ 1-5 que podrían coincidir con la hipotesis etiológica

de análisis de variantes.



Hipótesis de diagnóstico

Panel de genes

Exome sequencing

Análisis exómico Algortimo figura 2

Mutación causal

erp

Tabla 3 – Resumen de la Información nucleotídica:exoma 2

Número de muestra 801Reads totales 93.706.974Yield totales (bp) 94.384.104,354Longitud de reads (bp) 1,010Regiones target (bp) 62.165.486Promedio de regiones target 132,6Reads iniciales mapeables (referencia al

genoma humano)93.645.894

% inicial de reads mapeables (sobre el totalde reads)

99,8%

Reads no redundantes (duplicados porPicards tools)

49.842.419

% de reads no redundantes (sobre los readsmapeables asignables)

53,1%

Reads únicos no redundantes (únicamentemapeados al genoma humano)

44.787.469

% de reads únicos no redundantes (sobrereads no redundantes)

90,3%

Reads en el blanco (mapeados en regionestarget)

30.427.278

% reads blanco (sobre reads no redundantes 67,2%


En el exoma 1 se destacan las siguientes mutaciones


n los genes ARSA Y POLR3A: ARSA: c.G190T:p.V64L, noeportada previamente y con predicción bioinformática deatogenicidad y c.A1055G:p.N352S, previamente reportada y

Tabla 2 – Resumen de la información nucleotídica:exoma 1

Número de muestra 800Reads totales 93.802.994Yield totales (bp) 94.474.102,394Longitud de reads (bp) 1.010Regiones target (bp) 62.085.286Promedio de regiones target 152,6Reads iniciales mapeables (referencia al



99,8%


49.742.419


53,1%


44.987.489


90,4%


30.727.578

% reads blanco (sobre reads non redundantesúnicos)

68,3%

% de cobertura en regiones target (mayor a1 X)

94,1%

Número de genotipos no target (mayor a 1 X) 54.440.617% de cobertura de regiones target (mayor a 10

X)85,0%

Número de genotipos no target (mayor a 10 X) 52.744.592Promedio de lectura de regiones target 40,3Número de SNP 72.141Número de coding SNP 19.747Número de synonymous SNP 10.271Número de non synonymous SNP 8.996Número de of Indels 7.658Número de coding Indels 356

únicos)% de cobertura en regiones target (mayor a

1 X)94,4%


X)84,0%

Número de genotipos no target (mayor a 10 X) 52.754.692Promedio de lectura de regiones target 40,1Número de SNP 72.314Número de coding SNP 19.647Número de synonymous SNP 10.172Número de non synonymous SNP 8.776Número de Indels 7.648
Número de coding Indels 366
causa conocida de seudodeficiencia de arilsulfatasa; POLR3A:c.G3781A:p.E1261K y c.G3014A:p.R1005H, ambas ausentes enlas bases de datos poblacionales y con predicción bioinformá-tica de patogenicidad.

En el exoma 2, dada la presencia de consanguinidad entrelos padres, el análisis se centró en variantes homocigotas. Des-taca la variante en homocigosis en el gen GRIK2: p.Arg198*, conpredicción de patogenicidad por herramientas bioinformáti-cas.

En el exoma 3 destacan 4 variantes en el gen SPG11 conrespecto a la secuencia de referencia. Una de ellas, en homo-cigosis, rs3759871, se encuentra presente en bases de datospoblacionales con una frecuencia para el alelo G de 49%.Se encontraron otras 3 en heterocigosis, no previamentereportadas: c.6763insA; c.6726A> T, p.Q2242H y c.617insT. Las 2primeras tienen predicción de patogenicidad según las herra-mientas bioinformáticas utilizadas.

Validación por Sanger

Las variantes en los genes POLR3A, SPG11 y GRIK2 fueronvalidadas por Sanger en cada uno de los pacientes correspon-


dientes. En el caso 1 para POLR3A, la búsqueda de las mismasen los respectivos padres mostró una segregación perfecta.


8 n e u r o l a r g . 2 0 1 4;x

Tabla 4 – Resumen de la información nucleotídica:exoma 3

Número de muestra 802Reads totales 93.714.994Yield totales (bp) 94.374.103,324Longitud de reads (bp) 1.010Regiones target (bp) 62.165.486Promedio de regiones target 132,6Reads iniciales mapeables (referencia al



99,7%


49.822.469


53,3%


44.776.457


90,2%


30.417.268

% reads blanco (sobre reads no redundantesúnicos)

67,1%

% de cobertura en regiones target (mayor a1 X)

94,6%


X)84,0%

Número de genotipos no target (mayor a 10 X) 52.774.782Promedio de lectura de regiones target 40,4Número de SNP 72.114Número de coding SNP 19.547Número de synonymous SNP 10.276Número de non synonymous SNP 8.674
Número de of Indels 7.658Número de coding Indels 357
Respecto a SPG 11, se buscó segregación en una muestrade madre y de hermano asintomático. No pudo investigarseen el padre por haber fallecido previamente. La madre soloes heterocigota para la variante c.6763insA, mientras que elhermano no es portador de ninguna de ellas. Se infiere queel padre portaría el haplotipo c.6726A> T, p.Q2242H y c.617insT.En este caso, los resultados obtenidos en las 3 muestras anali-zadas, junto a los hallazgos del análisis de segregación y a laspredicciones bioinformáticas de patogenicidad, indican que elprobable haplotipo patogénico, en heterocigosis compuesta,es c.6763insA y c.6726A> T, p.Q2242H.


En el caso 2, GRIK2, la validación se realizó en el pacientey en su hermana, confirmándose dicha mutación. Posterior-mente, también se confirmó la presencia de la variante en suspadres.

Tabla 5 – Hallazgos incidentales: exoma 1

Gen Fenotipo Variante encontrada

CACNAS1S Susceptibilidad familiara la hipertermia

c.4346T>C p.Val1499Glyhet non-sym

x x(x x):xxx–xxx

Hallazgos incidentales

El reporte de los hallazgos incidentales para cada paciente semuestran en las tablas 5–7.

Discusión

Para el abordaje genómico de la patología neurológica resultanecesaria la exploración de diferentes herramientas bioinfor-máticas con el objetivo de establecer algoritmos de utilidad enel manejo e interpretación de información. Diversos estudiosacuerdan en que, dada la gran cantidad de recursos dispo-nibles, no existe una manera unívoca de alcanzar un mismoresultado, pero que, sin embargo, resulta útil la propuesta deuna sistematización en el análisis de los datos3.

En el caso 1, se utilizó la secuenciación del exoma pararesolver el caso de un paciente con sospecha clínica deleucodistrofia y diagnóstico no definido por los métodoscomplementarios utilizados anteriormente. Partiendo de unahipótesis clínica y de la construcción de un panel de 64genes candidatos, esta técnica ha demostrado ser eficaz parael enfoque diagnóstico de esta condición, genética y feno-típicamente muy heterogénea, y con superposición en susformas de presentación, donde se estima que entre el 30y el 40% de los individuos permanecen sin un diagnósticodefinitivo después de una extensa evaluación21. Las mutacio-nes encontradas son consistentes con las hipótesis clínicasplanteadas anteriormente. Para el gen ARSA, la mutaciónc.A1055G:p.N352S es una causa conocida de seudodeficien-cia de arilsulfatasa. Dicho hallazgo también se correlacionacon los estudios neurometabólicos previos de la paciente22.POLR3A es un gen que codifica para la subunidad mayorde la ARN polimerasa iii humana23. Ocho mutaciones eneste gen se han reportado como patogénicas y asociadoal síndrome 4 H: leucodistrofia, ataxia, hipomielinización,hipodoncia, hipogonadismo hipogonadotrófico24-26. Las prin-cipales manifestaciones clínicas de este paciente coincidencon esta entidad. Una de las mutaciones encontradas enPOLR3A había sido recientemente identificada como pato-génica, mientras que c.G3014A:p.R1005H no estaba reportadapreviamente, pero con una alta patogenicidad predicha por lasherramientas bioinformáticas.

En el segundo caso, ante un diagnóstico clínico de retrasomadurativo, epilepsia y distonía pero sin hipótesis etioló-gica, se parte de una hipótesis de diagnóstico molecular


libre. GRIK2 codifica para el receptor ionotrópico de glutamatotipo 6. Mutaciones en GRIK2 han sido reportadas en 2 fami-lias con retraso mental no sindromático27,28. Está descrito elpapel de la neurotransmisión glutamatérgica en las funciones

Patogenicidad Significado clínico

Por predicciónbioinformática

Susceptibilidad a presentarhipertermia maligna con laexposición a determinadosfármacos y relajantesmusculares




Gen Fenotipo Variante encontrada Patogenicidad Significado clínico




Susceptibilidad a presentar hipertermiamaligna con la exposición a determinadosfármacos y relajantes musculares


Gen Fenotipo Variante encontrada Patogenicidad Significado clínico




Susceptibilidad a presentar hipertermiamaligna con la exposición a determinadosfármacos y relajantes musculares

MYBPC3 Miocardiopatía dilatada c.2992C>G p.Gln98Gluhet non-sym

Conocida Portador de esa variante. Se piensa que elmecanismo de herencia es recesivo.Implicaría un mayor riesgo de transmisióna la descendencia

meeeddst

dscedccedmcdveS

dpealagd

rnec

ltl

FenotipoGenotipo

Via funcional

Figura 8 – Círculo virtuoso de la aproximación diagnóstica

b

entales superiores y las consecuencias de su alteraciónn el retraso mental29. Por otro lado, puede destacarse queste es el primer caso reportado de mutaciones en GRIK2 enl contexto de retraso mental sindromático (plus epilepsia yistonía), quizás como consecuencia de la probable ausenciae expresión de GRIK2 merced a la presencia en homocigo-is de una mutación sin sentido (o de stop prematuro en laraducción proteica).

En el caso 3, nuestra hipótesis inicial diagnóstico fue lae una paraparesia espástica de herencia autosómica rece-iva. Si bien el hallazgo en la RM de adelgazamiento deluerpo calloso y la presencia de retraso mental reducen elspectro de diagnósticos diferenciales, existen mutacionesescritas en al menos 10 genes, que podrían coincidir con eluadro clínico de la paciente, siendo SPG11 y 15 indiferen-iables desde este punto de vista clínico30,31. Los hallazgosn el examen físico y los hallazgos imagenológicos coinci-en con los casos previamente reportados de pacientes conutaciones en SPG1132, quedando demostrada la utilidad y el

oste-efectividad del estudio mediante exoma de este grupoe patologías neurológicas cada vez más caracterizadas e indi-idualizadas molecularmente que hasta hace no mucho anosran consideradas dentro de un gran síndrome conocido comotrumpell Lorrain.

Es así que en cada paciente, mediante la aproximacióniagnóstica genómica, partiendo de una evaluación clínicarofunda, se pudo establecer un correlato sólido basado envidencia científica entre fenotipo, genotipo y vía funcionalfectada, otorgando a estos hallazgos validez y revalorizandoa importancia de la evaluación semiológica y la interpretaciónl momento de usar herramientas bioinformáticas de análisis;enerándose de esta manera un círculo virtuoso en el abordajee la enfermedad (fig. 8).

En relación con los hallazgos incidentales, si bien seealizó bajo las recientemente existentes recomendacio-es de la Asociación Americana de Genética Humana7,ste aspecto continúa siendo motivo de grandes debates yontroversias33,34.

Con la caída progresiva en los costes de secuenciación, la


legada masiva de estas tecnologías al sistema de salud noardará muchos anos. El campo de las enfermedades neuro-ógicas es uno de los más susceptibles a ser modificado por

genómica.

su implicación en investigación traslacional35. Los últimos20 anos han sido un momento emocionante en la gené-tica humana. Los recientes avances en la secuenciación vana transformar nuestro conocimiento de cómo la variacióngenética contribuye a la enfermedad humana. Seguirán repre-sentando un desafío el análisis de datos, el manejo de loshallazgos incidentales, el valor de las variantes de significadoincierto y los aspectos éticos en relación con la informaciónque se brinda a los pacientes.

Optimismo y prudencia. Paso a paso, el futuro es ahora.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

i b l i o g r a f í a

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Neurología genómica personalizada: el futuro es ahora