p53 Regula Negativamente La Transcripción de La Piruvato Deshidrogenasa Quinasa PDK2

24/4/2014 p53 regula negativamente la transcripcin de la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

http://cancerres.aacrjournals.org/content/72/2/560.full 1/11

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Investigacin del Cncer

cancerres.aacrjournals.org

Publicado OnlineFirst 28 de noviembre 2011 ; doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1215Cancer Res. 15 de enero 2012 72; 560

p53 regula negativamente la transcripcin de

la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

Tanupriya Contratista 1 y Chris R. Harris 1 , 2 , 3

Afiliaciones de los autores

Autor correspondiente:Chris R. Harris, del Instituto del Cncer de Nueva Jersey, Room 3529, 195 Poco AlbanyStreet, New Brunswick, NJ 08901 Telfono:. 732-235-5590; Fax: 732-235-6618; E-mail:[email protected]

Abstracto

En las clulas cancerosas, la conversin aberrante de piruvato en lactato en lugar de

acetil-CoA en presencia de oxgeno se conoce como el efecto Warburg. Se conocen por

completo las consecuencias y los mecanismos de esta peculiaridad metablica. Aqu

mostramos que el estado de p53 es un factor determinante del efecto Warburg. De tipo

salvaje expresin de p53 disminucin de los niveles de piruvato deshidrogenasa quinasa-2

(PDK2) y el producto de su actividad, la forma inactiva del complejo piruvato

deshidrogenasa (P-PDC), ambos de los cuales son los principales reguladores del

metabolismo de piruvato. Disminucin de los niveles PDK2 y P-PDC, a su vez promueven

la conversin de piruvato en acetil-CoA en lugar de lactato. Por lo tanto, p53 de tipo

salvaje produccin de lactato limitada en las clulas cancerosas a menos PDK2 podra

ser elevado. En conjunto, nuestros resultados establecieron que p53 de tipo salvaje

impide manifestacin del efecto Warburg mediante el control de PDK2. Estos hallazgos

aclaran un nuevo mecanismo por el cual p53 suprime la tumorignesis actuando a nivel

del metabolismo celular del cncer. Cancer Res.; 72 (2); 560-7. 2011 AACR .

Introduccin

Las clulas cancerosas y no cancergenos pueden diferir en el metabolismo de la

glucosa. En lneas celulares de cncer, tanto como 90 por ciento de glucosa se convierte

en lactosa ( 1 ), mientras que las clulas no tumorales tienden a oxidar completamente la

glucosa en dixido de carbono. La alta produccin de lactato por las clulas tumorales se

produce incluso en presencia de oxgeno y se conoce como la gluclisis aerbica o el

"efecto de Warburg." Aunque observ en primer lugar por Otto Warburg ( 2, 3 ), la

gluclisis aerobia ha dibujado ms inters en la investigacin ltimamente, y se Se

espera que las drogas que atacan el efecto Warburg demostrarn ser eficaz en la lucha

contra la formacin de tumores. No est completamente claro por qu el efecto Warburg

se ve favorecida por las clulas tumorales, pero se supone, es beneficioso para la

proliferacin celular. La gluclisis produce ATP ms rpidamente que la fosforilacin

oxidativa, lo que puede favorecer el crecimiento rpido si la glucosa es abundante.

Adems, la interrupcin de la gluclisis puede desviar intermedios glicolticos hacia la

sntesis de molculas del ciclo celular importantes, tales como desoxirribonucletidos y

fosfolpidos, lo que sera favorable para la replicacin del ADN y la sntesis de la

membrana ( 4 ). Otra consideracin es que la oxidacin completa de la glucosa produce

especies reactivas de oxgeno (ROS;. Ref. 5 ), que conduce a la apoptosis ( 6 ), por lo

que las clulas tumorales pueden restringir la fosforilacin oxidativa como un mecanismo

de supervivencia.

En este estudio, hemos probado si la protena supresora de tumores p53 ayuda a

prevenir el efecto Warburg. Aproximadamente la mitad de todos los tumores albergar una

mutacin en el p53 gen ( 7 ), y los tumores restantes probable que tenga mutaciones en

una o ms de las muchas vas afectadas por p53. p53 desempea varios papeles clave

en la prevencin de tumores, tales como la induccin de la detencin del ciclo celular, la

senescencia, o la apoptosis en respuesta al dao del ADN ( 8 ). Ms recientemente, la

p53 se ha demostrado que afectan el metabolismo celular, tales como la va mTOR ( 9 ).

Clnicamente, p53 mutaciones se correlacionan con un aumento de la absorcin del

anlogo de la glucosa 18 FDG ( 10 ), que es un marcador para la gluclisis aerbica.

Estos datos sugieren que p53 podra reducir la absorcin de glucosa y / o catabolismo de

la glucosa por los tumores. De hecho, como se detalla en la seccin de discusin, p53

es conocido para aumentar la expresin de genes que debera disminuir la gluclisis ( 11,

12 ). Sin embargo, p53 tambin se sabe que aumenta la expresin de los genes que



deben aumentar el metabolismo de la glucosa ( 13, 14 ). Por lo tanto, el mecanismo

preciso por el cual metabolismo de la glucosa altera p53 no ha sido completamente

claro.

Decidimos probar el efecto de p53 en un punto de decisin clave en el metabolismo de la

glucosa: la conversin de piruvato, el producto final de la gliclisis, en acetil-CoA, que es

uno de los puntos de entrada en el ciclo del cido ctrico. Este punto de decisin es

controlado en gran parte por la enzima piruvato deshidrogenasa quinasa isoenzima-2

(PDK2), que inactiva la produccin de acetil-CoA mediante la fosforilacin de la PDC. Se

demuestra que la transcripcin de PDK2 es regulada negativamente por p53. Por lo tanto

p53 puede afectar la caracterstica ms singular del efecto Warburg, la produccin de

lactato.

Materiales y Mtodos

Los plsmidos

Un plsmido que expresa PDK2 bajo CMV el control del promotor se adquiri de Origene.

pCMV-wtp53 fue un regalo de Arnold Levine, y el plsmido de control pCMV-fsp53 fue

preparado mediante la insercin de 2 marco turno mutaciones en el p53 gen. plsmidos

pHA-E2F1, E2F2-pHA y pCMV-neo fueron regalos de Alain Nepveu. Pdk2/luciferase

humano se prepar mediante PCR de la PDK2 promotor a partir del ADN genmico

humano, usando los cebadores 5'-AAAAGGTACCCTATTGGTTCGCCCGGAGTT-3 'y 5'-

TTTCTCGAGCGGCCGCGACTTTGGTTGTGG-3'. El producto de PCR se insert en los

Kpn I y Xho I sitios de pGL3-Basic (Promega). Murino Pdk2/luciferase se prepar por

PCR de la PDK2 promotor a partir del ADN genmico de ratn, usando los cebadores 5'-

AAAAGGTACCGAGCACAGCCCAGGAA-3 'y 5'-

AAAAGGATCCGGCTCGGGCTTGGATCTCGCT-3'. El producto de PCR se digiri con

Kpn I y Bam HI, a continuacin, insertado en los Kpn I y Bgl II de los sitios pGL3-Basic.

Lneas celulares

MCF7 se obtuvo de la American Type Culture Collection. MCF7 CL.17 se construy

mediante la transfeccin de un plsmido que expresa PDK2 bajo el control del CMV

promotor. Colonias resistentes a G418 se seleccionaron para la expresin PDK2 en

presencia y ausencia de nutlin-3a. MCF7shp53 fue proporcionado amablemente por

Xinbin Chen. Las lneas celulares de EB y EB1 fueron regalos de Arnold Levine, y el

HCT116, HCT116 ( p53 - / - ) y HCT116 ( p21 - / - ) fueron regalos de Bert Vogelstein. Las

lneas celulares que no fueron autenticadas por los autores despus de la recepcin. Las

clulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) -10% de FBS

(MCF7, EB, y EB1) o en McCoys-10% de FBS (HCT116 y sus derivados). MCF7 CL.17 y

MCF7shp53 se cultivaron en DMEM-10% suplemento de FBS con 1 mg / ml de G418 o 1

mg / ml de puromicina, respectivamente. Medios se compraron de Invitrogen y FBS se

adquiri de Sigma-Aldrich. Las clulas se mantuvieron a 37 C en presencia de dixido

de carbono al 5%.

Transferencias de Western y RT-PCR

Para el anlisis de protenas, lisados fueron aislados por extraccin ensayo de

radioinmunoprecipitacin en presencia de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa

(Sigma-Aldrich). Veinte microgramos de extractos de protenas se separaron usando

NuPage 4% a 12% geles Bis Tris (Invitrogen). PDK2 y PDH E1 antisueros fueron

adquiridos de Novus Productos Biolgicos. P-PDH E1 antisueros fueron adquiridos de

Merck Biosciences. Antisueros PDK1 se adquirieron de Assay Designs. -actina y la

caspasa 7 antisueros fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. La caspasa 9 antisueros fueron

de Tecnologas de Sealizacin Celular. Para el anlisis de ARN, el ARN se extrajo

usando columnas RNeasy (Qiagen), despus se convierte en ADNc usando reactivos de

transcripcin inversa (Applied Biosystems). Todos los ensayos TaqMan fueron adquiridos

de Applied Biosystems. Los ensayos se leen en tiempo real utilizando un Applied

Biosystems 7500 y normalizado a -actina ARNm.

Ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina

Dos millones de clulas EB1 se trataron con cloruro de 200 mol / L de zinc, o tratado de

forma simulada, durante 7 horas. Las clulas fueron tratadas durante 10 minutos con

0,01% de formaldehdo a 37 C. Las clulas se lavaron y se lisaron, entonces la

cromatina se fragmentados utilizando una de Sonic Dismembrator 50 (Fisher Scientific)

en 30% a 40% de salida en 3 series de 15 segundos. Un kit para la inmunoprecipitacin

de la cromatina (ChIP) se adquiri de Millipore. Los antisueros contra E2F1 (Novus

Biologicals) y la histona acetil-H4 (Millipore) fueron utilizados para experimentos de

inmunoprecipitacin. La inmunoprecipitacin se llev a cabo segn lo recomendado por el

fabricante. Las cantidades relativas de PDK2 promotor en las muestras precipitadas se



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analizaron utilizando concentraciones de 70 nmol / L de 2 oligonucletidos, 5'-

CCGGAGTTGTTTGTGAGTGG-3 'y 5'-GCCTCCTCCCTACCCTTG-3'. Las cantidades

relativas de PDK2 promotor en las preparaciones de entrada (nonimmunoprecipitated)

tambin se determinaron y se usaron para la normalizacin. Verde SYBR se utiliza para

controlar amplificaciones por PCR en tiempo real.

Ensayos de lactato

Las clulas se colocaron en placas de 6 pocillos en placas de cultivo de tejido de

plstico a una densidad de 500.000 clulas. Despus de 24 horas, se aadi DMEM

fresco-FBS al 10% junto con 10 mmol / L de nutlin-3a (Sigma-Aldrich) o sulfxido de

dimetilo (DMSO) solo. Despus de 4 horas, se retiraron y se reemplazaron con medio

fresco que contena DMSO o nutlin-3a medios de comunicacin. Despus de 12 horas

adicionales, se retiraron y se centrifugan a travs 10K spin columnas (BioVision) para

eliminar los restos celulares y las enzimas que contaminan los medios de comunicacin.

El flujo de bajo peso molecular a travs de lactato fue ensayada utilizando el kit de

ensayo de lactato II (BioVision). Un control sin clulas se utiliza para obtener un nivel

basal de lactato en los medios de comunicacin. Cada condicin de ensayo se tomaron

muestras en los pocillos por cuadruplicado. La cantidad de lactato se normaliz al

nmero de clulas viables en los mismos pozos, tal como se determin por ensayo de

guayaba ViaCount (Millipore).

Luciferasa y otros experimentos de transfeccin transitoria

HCT116 ( p53 - / - ) las clulas se colocaron en placas de 6 pocillos en placas de plstico

de cultivo de tejidos a una densidad de 500.000 clulas. Una cantidad de 0,8 g de pPdk2-

luciferasa (ya sea humano o murino PDK2 promotor) se transfect junto con 0,8 g de

purificado nativo de Renilla luciferasa (Prolume Ltd). Nativo de Renilla se utiliz debido a

Renilla reporteros fueron sensibles a E2F1 aadido, E2F2 y p53. Tambin se ha aadido

fue de 0,8 g de pCMV-p53wt, pCMV-p53fs, pha-E2F1, E2F2-pHA o pCMV-neo.

Lipofectamina 2000 (Invitrogen) se utiliz para la transfeccin como se recomienda por el

fabricante. Despus de 24 horas, las clulas transfectadas se lisaron y se ensayaron

para la luciferasa utilizando un kit de luciferasa dual GLO (Promega). Todos los siRNAs

se compraron de Ambion y se transfectaron con Siport, segn lo recomendado por el

fabricante. Para la precipitacin de p21, HCT116 ( p53 - / - ) se transfectaron clulas y 24

horas ms tarde, las clulas se tripsinizaron y se volvieron a sembrar para los

experimentos de luciferasa. Para la precipitacin de p53, MCF7 fueron transfectadas y 24

horas ms tarde, las clulas se tripsinizaron y se replated para el tratamiento nutlin-3a.

Experimentos con ratones

De tipo salvaje o isognica p53 ( - / - ) ratones machos fueron irradiados con 10 Gray

gamma de una fuente de cesio. Los ratones no tena problemas de salud visibles en el

momento del ensayo. Se utilizaron tres ratones de ambos fondos, y tambin se

estudiaron 3 ratones no tratados de ambos orgenes. Seis horas despus de la

irradiacin, los ratones fueron sacrificados con dixido de carbono, de acuerdo con el

Comit de la Universidad de Rutgers Animal Institucional de Cuidado y Uso. Bazo o

revestimiento epitelial de cncer de colon se aislaron y se extrajo el ARN, convertidos en

ADNc, y se cuantificaron por tiempo real PCR transcriptasa inversa (RT-PCR) como se

describe anteriormente.

Resultados

El lactato se produce a partir de piruvato, el producto final de la gliclisis. Como se

muestra en la figura. 1 , piruvato tambin se puede convertir en acetil-CoA, que puede

entrar en el ciclo del cido ctrico. Produccin de acetil-CoA es catalizada por el PDC,

cuya actividad est controlada por la accin de varias quinasas y fosfatasas. Pdc puede

ser inactivado por la fosforilacin, que debe causar la produccin de ms de lactato.

Debido a que la produccin de lactato es un componente clave del efecto Warburg en las

clulas cancerosas, decidimos probar si p53 puede influir en la fosforilacin de PDC.

Figura 1.

Un punto de decisin en el

metabolismo del piruvato. En el

tenedor a la izquierda, el piruvato

se convierte en lactato, que

regenera NAD + , que puede ser

utilizado para conducir ms la

gluclisis y la produccin de ms

de piruvato. En el tenedor









derecho, piruvato se convierte en

acetil-CoA, que se puede convertir en dixido de carbono por el ciclo del

cido ctrico. El tenedor derecho es catalizada por la CDP, el cual es

regulado negativamente por fosforilacin. PDK2 es el principal inactivador de

la CDP, pero PDK1, Pdk3 y PDK4 son empleados por ciertos tipos de

clulas. La fosforilacin de PDC puede ser revertida por cualquiera de las 2

fosfatasas, PDP1 o PDP2.

Corrimos nuestros experimentos en la lnea celular de carcinoma de mama humano

MCF7, que codifica p53 natural de su promotor natural. Para probar los efectos de p53 en

la produccin de lactato, desafiamos a la lnea celular mediante la adicin de nutlin-3a,

un compuesto que aumenta la actividad de p53 al interferir con la interaccin entre p53 y

su regulador negativo Mdm2 ( 15 ). Como se muestra en la figura. 2A , la adicin de

nutlin-3a disminuy la cantidad de fosforilados Pdc, sin alterar la cantidad de no

fosforilada PDC.

Figura 2.

Western blots de protenas

implicadas en el metabolismo de

piruvato. A, las clulas MCF7 se

trataron con 10 mmol / L de nutlin-

3a o maqueta tratada con DMSO

durante 24 horas. La protena se

extrae luego borr Western

utilizando antisueros contra fosfo-

PDC (P-PDC), PDC PDK2 o

PDK1 o -actina. B, clulas MCF7

transfectadas con ARNsi de control negativo o de p53 fueron tratados con 10

mmol / L de nutlin o DMSO durante 24 horas, despus se lisaron y

transferencia Western para PDK2.

La fosforilacin de PDC puede ser controlado por 4 PDKs diferentes, es decir, PDKs 1 a

4 y 2 por fosfatasas piruvato deshidrogenasa (diferentes . Fig. 1 ). PDKs 1, 3, y 4 se

expresan slo en determinados tipos de clulas, o en momentos de estrs celular ( 16 ).

PDK2 es ms frecuente, con la expresin en todos los tejidos. De hecho, en condiciones

normales, PDK2 es visto como el punto de control clave en la conversin de piruvato a

acetil-CoA reaccin porque responde alostricamente a los rpidos cambios locales en el

sustrato y el producto: aumenta la actividad PDK2 especficos si los niveles de acetil-

CoA y NADH aumentan, pero disminuye si los niveles de piruvato aumentan ( 16 ).

Decidimos probar si afecta a la expresin de p53 PDK2.

Como se muestra en la figura. 2A , los niveles PDK2 cayeron tras el tratamiento nutlin-

3a. Debido nutlin-3a puede producir efectos fuera de la meta, as como se buscan efectos

cuando p53 es derribado utilizando siRNA. Tras la reduccin de p53, el efecto de nutlin-

3a sobre la protena PDK2 disminuy ( . Fig. 2B ). Tambin se examinaron la expresin

de PDK1 y vimos ningn efecto de nutlin-3a por Western blot ( Fig. 2A ) o RNA anlisis (

fig. 3A ). Los niveles de transcripcin de pdk3, PDP1 y PDP2 tampoco se modificaron (

Fig. 3A ), a pesar de que no fueron capaces de analizar estas protenas por Western blot,

ya sea debido a la falta de antisueros o baja expresin (no se muestra). MCF7 no pareca

expresar ARNm para PDK4.

Figura 3.

El anlisis de la transcripcin de

genes implicados en el

metabolismo del piruvato. A, se

midieron las concentraciones de

mRNA y mRNA normalizado a -

actina utilizando en tiempo real

RT-PCR tras 24 horas de

tratamiento con DMSO (D) o 10

mmol / L nutlin-3a (N). Ensayos

TaqMan se usaron para los

siguientes genes: Pdc fosfatasas

1 o 2 (PDP1, PDP2); PDK1,

Pdk3, o PDK2. Para las mediciones de PDK2, las clulas fueron tratadas

primero con cualquiera de control de siRNA (sicont) o p53 siRNA (sip53)






antes de DMSO o tratamiento nutlin-3a. B, EB ( p53 null) o EB1 (zinc-

inducible p53 clulas) fueron tratados con 200 mmol / L de zinc durante 8

horas, o bien tratarse de burla. ARNm para PDK2 se midi por tiempo real de

RT-PCR y ARNm normalizado a -actina. C, fusiones de promotor se

generaron entre un reportero de luciferasa de lucirnaga y, o bien secuencias

de PDK2 o el ratn PDK2 humanos. Estas fusiones, o vector vaco pGL3

bsico, se cotransfectaron en HCT116 ( p53 - / - ) las clulas con un plsmido

que expresa ya sea p53 de tipo salvaje (wtp53) o un plsmido de control en el

que el p53 gen se inactiv con 2 mutaciones marco turno (fsp53). Despus de

24 horas, la actividad de luciferasa se ensay y se normalizaron a un control

de transfeccin.

A diferencia de los otros mediadores de la CDP fosforilacin, PDK2 transcripcin

disminuy despus de la adicin de nutlin-3a ( Fig.. 3A ). Este efecto sobre los niveles de

ARNm de PDK2 es dependiente de p53, ya que la reduccin de p53 por el uso de ARNsi

impidi la regulacin transcripcional por nutlin-3a ( Fig.. 3A ). Tambin hemos probado los

efectos de p53 en PDK2 estabilidad de la protena, pero el tratamiento nutlin-3a de MCF7

no alter PDK2 vida media de protenas (datos no presentados). La transcripcin PDK2

es downregulated por p53 en otras lneas celulares, como se muestra en la figura. 3B .

La lnea de clulas de colon humano EB1 expresa p53 de un promotor inducible por zinc

y zinc disminuy la transcripcin de PDK2. En la lnea celular de EB, que codifica p53

pero no es lo contrario isognicas, cinc no afecta a la transcripcin de PDK2.

Tambin fusionamos un pequeo segmento del promotor PDK2 humano para el gen de la

luciferasa de lucirnaga ( . Fig. 3C ). Esta fusin del promotor mostr la actividad del

promotor en ausencia de p53, pero fue fuertemente reprimida en presencia de p53. Un

ratn promotor Pdk2/luciferase fusin tambin se downregulated por p53 ( . Fig. 3C ).

A continuacin, hemos probado si p53 puede controlar la expresin de PDK2 in vivo . De

tipo salvaje y isognicas p53 nula ratones fueron irradiados para activar p53. Seis horas

despus de la irradiacin, los ratones fueron sacrificados, y el colon y el bazo fueron

aisladas de 3 tratada o de 3 animales no tratados. La respuesta a p53 a la irradiacin es

muy rpida en estos tejidos ( 17 ). Como se muestra en la figura. 4A y B , la cantidad de

PDK2 ARNm tanto en el colon y el bazo disminuy tras la irradiacin de ratones de tipo

salvaje, pero no tras la irradiacin de p53 knockout mice. Por lo tanto p53 disminuye

PDK2 la transcripcin in vivo . Curiosamente, para ambos tejidos el nivel de ARNm PDK2

fue mayor en los ratones de tipo salvaje no tratados que en los no tratados de p53

ratones nulos.

Figura 4.

Anlisis de PDK2 la transcripcin

en ratones. La cantidad de ARNm

en PDK2 de tipo salvaje o p53

ratones knockout dos puntos (A) o

el bazo (B) se mide 6 horas

despus de la irradiacin y se

normaliz a ARNm de -actina.

Se muestran los datos de 3

ratones. Tambin se examinaron

no irradiados (NT) ratones.

Regresamos a los sistemas de clulas cultivadas para investigar el mecanismo de la

represin de la PDK2 promotor de p53. p53 puede reprimir la transcripcin de ciertos

promotores al unirse directamente al ADN, pero el PDK2 promotor no tiene motivos de

unin a p53 tampoco se ha observado unin a la p53 PDK2 promotor de chip (datos no

presentados). Otro mecanismo comn mediante el cual p53 reprime promotores se

muestra en la figura. 5A , en la que p53 inhibe la actividad de factores de transcripcin

E2F ( 18, 19 ), que activan mediante la promocin de la acetilacin de histonas ( 20, 21 ).

Este tipo de regulacin depende de la activacin transcripcional de p53-dependiente de la

p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, cuya expresin impide la fosforilacin

de las protenas de la familia de retinoblastoma (Rb, p107, p130 y), que reprime factores

E2F ( fig. 5A ). Anlisis de la PDK2 promotor revel muchas secuencias ricas en GC que

podran servir como sitios de unin a E2F (datos no presentados).









Figura 5.

La prueba de un modelo de

represin dependiente de p53

mediante fusiones

transcripcionales PDK2. A,

modelo de represin: P53 induce

p21, que inhibe las quinasas

dependientes de ciclina que

fosforilan protenas de la familia

del retinoblastoma. Protenas Rb

hipofosforilada inhiben activadores

de la transcripcin de la familia E2F, lo que resulta en la desacetilacin de

las histonas tales como la histona H4 y la disminucin de la actividad del

promotor. B, el HCT116 ( p53 - / - ) lnea celular se trat primero con siRNA

desmontables expresin de p21, o bien se trata con un control de siRNA.

Luego, las clulas fueron transfectadas con un reportero Pdk2/luciferase

humana junto con un plsmido que expresa p53 o p53 marco de cambios.

Doble-represin es la relacin de la actividad transcripcional en ausencia

frente a la presencia de p53. C, los plsmidos que expresan el E2F1 o

transcripcin E2F2 factores o vector pCMV-neo vacas se cotransfectaron con

la fusin transcripcional Pdk2/luciferase humano. La cantidad de luciferasa se

midi despus de 24 horas. D, el promotor humano de fusin Pdk2/luciferase

se cotransfect ya sea de tipo salvaje de p53 o p53 marco desplazada.

Despus de 17 horas, la tricostatina A (TSA) se aadi para inhibir la

desacetilacin de histonas, o bien los cultivos fueron tratados mock con

DMSO. La luciferasa fue ensayada 7 horas despus de la adicin de TSA.

Doblar la represin es la relacin de la transcripcin en ausencia frente a la

presencia de p53.

El uso de un Pdk2/luciferase fusin transcripcional reportero construir, hemos probado 3

partes del modelo en la figura. 5A : la influencia de la expresin de p21 en PDK2

promotor de la represin, el efecto de los factores E2F E2F1 y E2F2 en PDK2 la

activacin del promotor, y el efecto de la desacetilacin de histonas en la represin. En

primer lugar, derribaron la expresin de p21 utilizando siRNA. Reduccin de p21

disminuy la represin de Pdk2/luciferase por p53 ( . Fig. 5B ). Siguiente, la

cotransfeccin con plsmidos que expresan bien E2F1 o E2F2 activa Pdk2/luciferase la

transcripcin ( . Fig. 5C ). Finalmente, un inhibidor de la histona desacetilasa, tricostatina

A, impidi parcialmente la represin de la transcripcin PDK2 por p53 ( Fig.. 5D ).

Los datos de fusiones transcripcionales deben tomarse con cautela debido a que estas

construcciones carecen de secuencias ms distales, que tambin pueden influir en la

transcripcin. Por lo tanto, as como se buscan los efectos de p21, E2F1, y la

desacetilacin de histonas en PDK2 genmica. Para la prueba de p21 efectos, se utiliz

3 versiones de la lnea de clulas de colon humano HCT116. La lnea parental tiene de

tipo salvaje de p53 y p21 , mientras que las versiones isognicas son eliminados de

ambas copias de p53 o de ambas copias de p21 . Se compar la cantidad de PDK2

mRNA en cada lnea celular con y sin tratamiento con nutlin-3a. La lnea de clulas de

tipo salvaje mostr que el 60% de represin de la transcripcin PDK2 despus del

tratamiento nutlin-3a, pero PDK2 transcripcin no fue reprimido, ya sea en el p53 o p21

knockout lneas ( . Fig. 6A ). Estos datos mostraron que tanto p53 y p21 se requieren

para la represin de la transcripcin por PDK2 nutlin-3a.

Figura 6.

Pruebas de mecanismo de p53

dependiente de la represin de

PDK2 genmico. Una, la cantidad

de PDK2 ARNm en relacin con

-actina se determin tras el

tratamiento 24 horas nutlin-3a (o

tratamiento simulacro de DMSO)

de 3 lneas celulares isognicas: HCT116, HCT116 ( p53 - / - ), o HCT116 (

p21 - / - ). Doblar la represin se determin mediante la comparacin de la

cantidad de ARNm normalizado en ausencia de la cantidad de ARNm en

presencia de nutlin-3a. B y C, la lnea de clulas de colon EB1 humano tiene

de p53 inducible por zinc y se trat con cinc durante 7 horas o tratado de

forma simulada. Protena / cromatina enlaces cruzados se forman por






tratamiento con formaldehdo. La presencia de PDK2 promotor en complejo

con cualquiera de E2F1 (B) o H4-acetil histona (C) se determina mediante

inmunoprecipitacin de los complejos protena / de la cromatina, seguido por

cuantificacin de PDK2 secuencias promotoras en tiempo real por PCR.

Para la prueba de la importancia de E2F1 y la desacetilacin de histonas en PDK2

genmico, se realiz un experimento de chip en las clulas EB1, que reprimen PDK2

transcripcin de una manera dependiente de p53 ( . Fig. 3B ). E2F1 unida menos bien a

la PDK2 promotor de p53 cuando se induce con el zinc ( . Fig. 6B ). Esto sugiere que la

activacin de la transcripcin E2F1 de PDK2 est bloqueada por p53. Por otra parte,

cuando EB1 se trata con zinc, la acetilacin de la histona H4 disminuy, lo cual es

consistente con la cromatina ms compacta y disminucin de la transcripcin ( . Fig. 6C

). Compactacin de la cromatina puede liberar E2F1 de la PDK2 promotor.

Por ltimo, para determinar las consecuencias funcionales de la regulacin a la baja de

PDK2 por p53, hemos diseado una lnea celular en la que la expresin PDK2 est bajo

control de un promotor, por CMV , que es menos reprimida por p53. La nueva lnea

celular, MCF7 CL.17, expresa niveles casi fisiolgicos de PDK2 en la presencia de

DMSO, pero conserva su expresin PDK2 incluso en la presencia de nutlin-3a ( Fig.. 7A

). Luego ensay la produccin de lactato. Como se muestra en la figura. 7B , la

produccin de lactato por MCF7 disminuy ms de 2 veces tras el tratamiento nutlin-3a,

pero la produccin de lactato fue restaurada en su mayora MCF7 CL.17. La produccin

de lactato no disminuy en absoluto en otra lnea celular, MCF7shp53, en el que la

expresin de p53 es derribado por el ARN corto horquilla. Estos datos mostraron que p53

disminuye la produccin de lactato por MCF7 por la disminucin de la transcripcin de

PDK2.

Figura 7.

Las consecuencias funcionales de

regulacin a la baja de PDK2 por

p53. Una, MCF7 CL.17 fue

diseado para expresar de forma

estable PDK2 bajo el control del

CMV promotor como se describe

en Materiales y Mtodos. MCF7 y

MCF7 CL.17 se trataron con

DMSO o 10 mmol / L de nutlin-3a

durante 16 horas y se lisaron. El

lisado se utiliz para generar una

transferencia de Western contra

PDK2 y -actina, como se

muestra. B, MCF7, MCF7 CL.17, y MCF7shp53 se trataron con DMSO o 10

mmol / L de nutlin-3a durante 16 horas, seguido por el ensayo de lactato en

los sobrenadantes de cultivo de tejidos. Se muestra disminucin veces en la

produccin de lactato tras tratamiento nutlin-3a. Las diferencias en la

disminucin veces entre MCF7shp53 y MCF7, y entre MCF7 CL.17 y MCF7,

estaban decididos a ser estadsticamente significativa ( P valor inferior a 0,01)

por el de Student de dos colas t prueba. C, MCF7 o MCF7 CL.17 se trataron

con DMSO o con 10 mmol / L de nutlin-3a durante 72 horas y despus

lisadas. Transferencias de Western contra caspasas procesados 7 o 9, o

control de carga--actina se muestran.

Una posible consecuencia de la disminucin de la expresin PDK2 se incrementa la

fosforilacin oxidativa, que puede producir ROS a travs de la cadena de transporte de

electrones ( 5 , 22 ). ROS puede daar el ADN, y un importante mecanismo de supresin

tumoral por p53 es la induccin de la apoptosis en presencia de alta ROS. De hecho,

PDK2 ha sido previamente demostrado para reducir ROS y para disminuir la apoptosis (

23 ). Decidimos probar si la apoptosis dependiente de p53 requiere regulacin a la baja

de PDK2. Debido MCF7 no expresa caspasa 3 ( 24, 25 ), no hemos podido ver los

eventos finales de apoptosis en esta lnea celular. Sin embargo, un paso temprano clave

en la apoptosis es el procesamiento proteoltico de procaspases 7 y 9, que son aguas

arriba de la caspasa 3 ( 26 ). Cuando tratamos MCF7 con nutlin-3a, transformacin de las

caspasas 7 y 9 ocurrido ( . Fig. 7C ). Por el contrario, las caspasas 7 y 9 no se procesan

cuando MCF7 CL. 17 se trat con nutlin-3a. Estos datos indican claramente que los

eventos apoptticos tempranas no ocurren a menos que p53 puede regular negativamente

la transcripcin de PDK2.



Discusin

Un papel de p53 en la regulacin negativa del efecto Warburg se supuso anteriormente,

principalmente debido al efecto de p53 en la transcripcin de genes implicados en la

glicolisis y la fosforilacin oxidativa. Por ejemplo, p53 activa la transcripcin de proyecto

TIGAR, cuyo producto gnico puede reducir la cantidad de fructosa 2/6 bifosfato ( 11 ),

que es un regulador positivo de enzimas glucolticas fosfofructoquinasa y piruvato

quinasa. P53 tambin disminuye la transcripcin de las isoenzimas del transportador de

glucosa 1 y 4 ( 12 ). Pero el efecto preciso de p53 en la gluclisis aerbica no era cierto

porque algunas actividades de p53 probablemente aumentaran la gluclisis. Una

actividad clave requerida para la absorcin de glucosa, hexoquinasa-2, es en realidad

upregulated por p53 ( 13 ). El glicoltica mutasa enzima fosfoglicerato tambin est

regulada positivamente por p53 ( 14 ).

Se demuestra que la activacin de p53 causa una disminucin en la produccin de

lactato por la lnea celular de carcinoma de mama humano MCF7. Debido a que la

produccin de lactato en presencia de oxgeno es el paso clave en la gluclisis aerbica,

este estudio proporciona un enlace crtico entre la p53 y la regulacin a la baja del efecto

Warburg. Tambin ponen de manifiesto que la activacin de p53 en los resultados de una

mayor cantidad de la forma activa, no fosforilada del PDC y cantidades reducidas de

PDK2, un importante quinasa del PDC. Por ltimo, se muestra que la adicin de nuevo

PDK2 bajo el control de un promotor heterlogo impide p53 de la regulacin negativa de

la produccin de lactato. PDK2 ha sido siempre visto como el guardin principal sobre el

metabolismo de piruvato. Por lo tanto p53, que ha sido llamado el controlador de acceso

celular para el crecimiento y la divisin ( 27 ), parece regular a la baja el efecto Warburg

mediante el control de la expresin del controlador de acceso de metabolismo del

piruvato.

Anteriormente, se pensaba que la actividad PDK2 para ser modulados de una manera

estrictamente postraduccional, a travs de la inhibicin por piruvato o la activacin por la

acetil-CoA ( 16 ). El nuestro es el primer estudio que sugieren que el control de la

transcripcin PDK2 tambin puede ser importante en el metabolismo de piruvato. P53

disminuye la cantidad de PDK2 la transcripcin. En experimentos separados, se muestra

que se requiere para p21 dependiente de p53 represin de tanto una fusin

transcripcional PDK2 ( . Fig. 5B ) y genmico PDK2 ( Fig.. 6A ). E2F1 puede activar la

transcripcin de Pdk2/luciferase ( . Fig. 5C ) y tambin se une a la activa, pero no a la

forma menos activa de la genmica PDK2 promotor ( . Fig. 6B ). Finalmente, un inhibidor

de histona desacetilasa reduce la represin de la fusin Pdk2/luciferase ( Fig.. 5D ),

mientras que la acetilacin de la histona H4 en el PDK2 promotor disminuye tras la

activacin de p53 ( . Fig. 6C ). Estos datos apoyan el modelo en la figura. 5A , en la que

p53 previene la activacin de la transcripcin PDK2 mediante la inhibicin de un activador

de E2F. Aunque el modelo de la figura. 5A sugiere que otra protena clave supresor de

tumores, Rb, tambin puede estar implicado en el efecto Warburg travs del control sobre

PDK2 transcripcin, no apareci directamente el papel de Rb en PDK2 transcripcin.

Sigue siendo posible que uno de los otros miembros de la familia de la protena del

retinoblastoma miembro, p107 o p130, es ms importante que Rb en PDK2 la

transcripcin; Alternativamente, un mecanismo independiente de la familia de protenas

Rb no se puede descartar en este momento. Sin embargo, es de destacar que el control

Rb/E2F sobre otro Pdk gen, PDK4 , se ha demostrado ( 28 ).

Adems de disminuir la transcripcin PDK2, p53 tambin puede disminuir la actividad

PDK2 indirecta y despus de la traduccin. Por ejemplo, en ratones p53 promueve la

expresin del transportador de tiamina ( 29 ). Mayor absorcin de tiamina pirofosfato de

tiamina aumenta celular, que es un cofactor de la PDC y que es tambin un inhibidor de

la fosforilacin de PDC PDK2 ( 30 ). Adems, la acetil-CoA activa PDK2, as que ms

rpida conversin de acetil-CoA en citrato durante el ciclo del cido ctrico puede servir el

mismo papel que la regulacin negativa PDK2 transcripcin. Esto se podra lograr

mediante la aceleracin de pasos intermedios de la oxidacin de piruvato. En efecto, en

el msculo de p53 parece controlar la gluclisis aerbica a travs de la regulacin

positiva de SCO2 ( 31 ), que codifica una protena que ayuda en el montaje del

componente de la oxidasa del citocromo C de la va de la fosforilacin oxidativa. Actividad

SCO2 Superior puede disminuir acetil-CoA y inactivar PDK2. En el hgado, p53 tambin

puede regular al alza la glutaminasa-2, lo que puede acelerar el ciclo del cido ctrico

mediante la conversin de la glutamina en el ciclo del cido intermedio -cetoglutarato

ctrico ( 32 ). As, el mecanismo por el cual la p53 regula a la baja la actividad PDK2

puede diferir dependiendo del tipo de clula y tejido, as como las fuentes de carbono

disponibles.

El laboratorio de Michelakis ha demostrado previamente que PDK2 es importante para el

crecimiento de algunas lneas celulares humanas, y que un inhibidor de PDK2, cido



dicloroactico (DCA), puede bloquear el crecimiento de tumores en modelos de

xenoinjerto ( 23 ). Por otra parte, el DCA puede haber disminuido la progresin de los

glioblastomas en un pequeo ensayo en humanos de 5 pacientes ( 33 ). Nuestro trabajo,

que une PDK2 a factores clave de cncer tales como p53, p21, E2F1, y, posiblemente,

Rb, refuerza la idea de que PDK2 juega un papel en la biologa del tumor. Otras

isoenzimas Pdk se han relacionado con los genes del cncer. Como se mencion

anteriormente, PDK4 puede ser activado por la va Rb/E2F1 ( 28 ). PDKs 1 y 3 se activan

por HIF-1 ( 34-36 ), que puede permitir que los tumores para controlar el metabolismo de

la glucosa en condiciones de limitacin de oxgeno. Por estas razones, parece probable

que la fosforilacin de la PDC llegar a ser importante en la formacin de tumores o la

progresin.

El control sobre la expresin PDK2 puede ser central para algunos aspectos de la

biologa de p53. En primer lugar, la induccin de la apoptosis no se produjo cuando la

p53 no podra regular negativamente PDK2 ( Fig.. 7C ). Se cree que el dao del ADN para

activar la p53 para activar la transcripcin de genes que producen ROS, que causan ms

dao en el ADN que desencadena an ms la actividad de p53, creando as un bucle de

realimentacin positiva que eventualmente conduce a la apoptosis ( 37, 38 ). Regulacin

a la baja de PDK2 por p53 puede ser suficiente para producir ROS en los niveles

requeridos para la apoptosis. En segundo lugar, otro papel de p53 es disminuir la

metstasis tumoral mediante la prevencin de la invasin (revisado en Muller y colegas;.

Ref. 39 ). Por el contrario, la secrecin de lactato, que acidifica el microambiente del

tumor, se cree que aumenta la invasin ( 40, 41 ). Por lo tanto, la capacidad de disminuir

la produccin de lactato a travs de la represin de PDK2 puede ayudar a explicar el

efecto de p53 sobre la metstasis.

Divulgacin de potenciales conflictos de inters

No se revelaron los posibles conflictos de inters.

Reconocimientos

Los autores agradecen a la Fundacin Raymond y Beverly Sackler para la financiacin de

este estudio y tambin agradecen a Arnold Levine, Robert Harris, y Evan Vosburgh de

valiosos consejos, y Angie Teresky y Rich Clausen para la asistencia tcnica.

Los gastos de publicacin de este artculo fueron sufragados en parte por el pago de

cargos por pgina. Este artculo debe ser, por tanto, por la presente marcado anuncio de

conformidad con 18 USC Seccin 1734 exclusivamente para indicar este hecho.

Recibido 17 de abril 2011.Revisin recibida 10 de noviembre 2011.Aceptado 21 de noviembre 2011.

2011 Asociacin Americana para la Investigacin del Cncer.

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p53 Regula Negativamente La Transcripción de La Piruvato Deshidrogenasa Quinasa PDK2