P.F. Almaida Pagán Tesis Doctoral

UNIVERSIDAD DE MURCIA

Departamento de Fisiología

Unidad Docente de Fisiología Animal

CARACTERIZACIÓN DEL POTENCIAL METABÓLICO Y REGULADOR DE LA

INGESTA DEL SARGO PICUDO (Diplodus puntazzo).

Pedro Francisco Almaida Pagán

2008

P.F. Almaida Pagán Tesis Doctoral

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La presente Tesis Doctoral ha sido concebida como compendio de las siguientes

publicaciones:

1. Almaida-Pagán, P.F., Rubio, V.C., Mendiola, P., de Costa, J., Madrid, J.A., 2006.

Macronutrient selection trough post-ingetive signals in sharpsnout seabream fe don

gelatina capsules and challenged with protein dilution. Physiol. Behav. 88, 550—558.

2. Almaida-Pagán, P.F., Seco-Rovira, V., Hernández, M.D., Madrid, J.A., de Costa, J.,

Mendiola, P., In Press. Energy intake and macronutrient selection in sharpsnout

seabream (Diplodus puntazzo) challenged with fat dilution and fat deprivation using

encapsulated diets. Physiol. Behav. doi:10.1016/j.physbeh.2007.10.006.

3. Almaida-Pagán, P.F., Hernández, M.D., García García, B., Madrid, J.A., de Costa, J.,

Mendiola, P., 2007. Effects of total replacement of fish oil by vegetable oils on n-3

and n-6 polyunsaturated fatty acid desaturation and elongation in sharpsnout

seabream (Diplodus puntazzo) hepatocytes and enterocytes. Aquaculture 272, 589—

598.

4. Almaida-Pagán, P.F., Hernández, M.D., Madrid, J.A., de Costa, J., Mendiola, P.

Sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) ability for different oil sources

discrimination using encapsulated complete diets. Enviado a Physiol. Behav.


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Este trabajo ha sido financiado gracias a

fondos del CICYT concedidos al proyecto

AGL2004-08137-CO4-02/ACU, bajo el título:

“Regulación de la ingesta de alimento en

peces. Papel del sistema circadiano” y del

Ministerio de Educación y Ciencia (MEC) (beca

AP2002-1368 concedida a P.F. Almaida-

Pagán).


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Agradecimientos

Aunque exista una carrera diseñada para obtener un título, y mucha gente siga los

mismos pasos y, al final, pueda denominarse de la misma forma lo que han hecho en el tiempo

empleado, sin duda cada persona recorre un camino propio y, no sólo son diferentes los

resultados obtenidos en el plano profesional, sino también en el personal que, en definitiva, es

el que importa y con el que uno se queda cuando cierra un capítulo y se acerca la hora de abrir

uno nuevo.

En este momento en que me encuentro, cerrando el trabajo realizado en los últimos

años, encaramado en lo alto del camino que he venido recorriendo para llegar a presentar esta

Tesis Doctoral, y, antes de decidirme a seguir andando por una nueva senda dentro de mi

proyecto de vida, es momento de devolver, en estas líneas, parte de todo lo que he recibido, de

agradecer los momentos que realmente han definido mi camino hacia ese título de Doctor que

puede parecer siempre el mismo, pero que para cada uno presenta connotaciones muy

distintas, pues se compone de muchos momentos vividos, con muchas personas distintas, que

serán las que, en definitiva, lean estas palabras y se vean reflejadas como parte de este

proyecto que culmina.

Siguiendo un orden cronológico, quiero agradecer en primer lugar a mis compañeras

de carrera, Masé, Toñi, Mar, Mariade y Sonia por haberme aportado parte de esa serenidad

con que afrontaban las clases, las prácticas, las interminables jornadas en la Facultad. Sin

ellas, sin ese ambiente disciplinado, habría sido para mí muy difícil llegar siquiera a finalizar la

carrera. Fueron sin duda el contrapeso a mis inquietudes más irreverentes y mi rebeldía

autodestructiva. Sabéis que cada cierto tiempo me lo planteaba todo y sí, al final tuve que

reconocer que el problema no estaba tanto en cambiar lo que estaba haciendo sino el cómo lo

estaba llevando a cabo, sosegarme para no perder la perspectiva y, con ella, la paciencia. Por

todo ello, gracias.


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En segundo lugar, quiero referirme a dos personas cuyo brillo me ha mantenido dentro

de este Departamento, cuya presencia en mi vida ha marcado un antes y un después. Ellos me

han permitido canalizar todo lo que llevaba dentro y poder creer que podía trabajar en esto de

la ciencia a pesar de mis altibajos. Me refiero a Pilar Mendiola y Jorge de Costa, mi hogar en la

Facultad de Biología, el espacio donde puedo sentarme, charlar y pedir consejo. Creo que no

hay nada mejor que sentir ese lugar del que uno forma parte y al que puede recurrir cuando las

cosas se tuercen. Mi agradecimiento hacia vosotros es enorme, espero que con estas palabras

podáis entender el orgullo que siento de defender nuestro trabajo, siendo vosotros dos los

directores de este proyecto que termina y sigue a la vez, pues espero continuar formando parte

de este equipo increíble que hemos creado. Gracias.

Al resto de profesores del Departamento de Fisiología Animal de la Facultad de

Biología, quiero darles las gracias por haberme arropado y enseñado tantas cosas,

especialmente a Francisco Javier Martínez, José Ángel López, Juan Antonio Madrid y Marian

Rol, todos ellos bajo la dirección de Salvador Zamora, quien ha hecho posible este equipo.

Espero haber dejado, durante este tiempo, algo bueno en vosotros y que me tengáis por

compañero y amigo.

También, tengo mucho que agradecer a todos mis compañeros de Departamento. Creo

que, juntos, hemos conformado un ambiente genial donde aunar trabajo y amistad, un

ambiente que uno echa de menos cuando pasa tiempo alejado y al que vuelve feliz por formar

parte de él. Desde que me incorporé al Departamento he tenido unos compañeros geniales,

empezando por Diego y Luisa , con los que me batí con todos los problemas posibles durante

la experimentación y establecí una conexión especial. También ha estado Vicente Seco, que

poco a poco se ha ido convirtiendo en mi compañero de fatigas con los sargos. Gracias por

haber estado ahí todo este tiempo. Igualmente, quiero dar las gracias a los, por entonces, “casi

doctores”, que respondían a las preguntas que iban surgiendo en los comienzos, a Vera, mi

maestra en el mundo de las cápsulas; a Manolo y Pepa, y a todos los que han ido

sucediéndose después, manteniendo ese espíritu maravilloso: Ronald, Hamilton, Pablo, Víctor,


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Fátima, María Jesús, Laura, José Fernando, Catarina, José Antonio, Bea, Tere, Juan Antonio,

Alejandro...Muchas gracias a todos, os llevaré siempre conmigo.

Quiero hacerles llegar mi cariño a la gente del Departamento de Biología Animal de la

Facultad de Biología de la Universidad de la Laguna, Tenerife, por haberme recibido tan bien

durante los dos meses de estancia que permanecí con ellos y, en los que me sentí parte de

ese grupo humano increíble. Gracias Cova, Pepa, Mercedes, Noe, Lupe, Virginia, Ana Bolaños,

Marga, Melo... Sois luz.

También quiero agradecer al IMIDA de San Pedro del Pinatar por haberse mostrado

siempre tan receptivos con nosotros y habernos permitido usar sus instalaciones. Gracias Lola.

Una parte esencial de lo que soy la conforman mi familia y mis amigos, con los que

comparto mi vida y con los que siempre puedo tomar una cerveza y echar unas risas, apartar

las penas y dar paso a la alegría, disfrutando de las cosas cotidianas. Gracias mamá y papá,

hermanos. Gracias Domingo y Javi, siempre seréis mis amigos, gracias Keko, Franber, David,

Martín, Julio, y todos los que me habéis demostrado que merece la pena seguir luchando, que

estamos en ello y que aún nos queda mucho por hacer.

Por último, quiero dar las gracias a mi preciosa compañera, mi Otra Parte, la luz que

encontré ya iniciado en este proyecto y que me está enseñando a afrontar la vida con una

calma y una paz nuevas. Desde que te conocí guardo esa ágata conmigo y por muy lejos que

esté, frente al mar o mirando las estrellas, sonreiré con el corazón contento pues, dos caminos

que anduvieron tan distantes el uno del otro, al fin convergieron y, en medio del universo, he

podido encontrarte. Mila, gracias por existir.


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Nombres comunes y científicos de las especies citad as

Nombre común Nombre científico Nombre inglés

Anguila europea Anguilla anguilla, Linnaeus 1758 European eel

Bacalao de Murray Maccullochella peelli peeli, Mitchell 1838 murray cod

Barbo Ictalarus punctatus, Rafinesque 1820 catfish

Barbo africano Clarias gariepinus, Burchell 1822 African catfish

Besugo Pagellus bogaraveo, Brünnich 1768 blackspot seabream

Carpa común Cyprinus carpio, Linnaeus 1758 common carp

Carpín dorado Carassius auratus, Linnaeus 1758 goldfish

Dentón Dentex dentex, Linnaeus 1758 dentex

Dorada Sparus aurara, Linnaeus 1758 gilthead seabream

Hurta Pagrus auriga, Valenciennes 1843 redbanded seabream

Lubina Dicentrarchus labrax, Linnaeus 1758 European sea bass

Lucio Esox lucius, Linnaeus 1758 pike

Pargo Pagrus pagrus, Linnaeus 1758 red porgy

Pez depredador, rape Lophius piscatorius, Linnaeus 1758

Lophius budegassa, Spinola, 1807

white anglerfish

black anglerfish

Rodaballo Scophthalmus maximus, Rafinesque 1810

Psetta maxima, Linnaeus 1758

Turbot

Rodaballo de cola

amarilla, limanda

Limanda ferruginea, Storer 1858 yellowtail flounder

Salmón del atlántico Salmo salar, Linnaeus 1758 Atlantic salmon

Salmón plateado Oncorhynchus kisutch, Walbaum 1792 coho salmon

Sargo blanco Diplodus sargas, Linnaeus 1758 white seabream

Sargo picudo Diplodus puntazzo, Cetti 1777

Puntazzo puntazzo, Gmelin 1789

sharpsnout seabream

Tilapia Oreochromis mossambicus, Peters 1852 tilapia

Trucha arco iris Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792

Salmo gairdneri, Richardson 1836

rainbow trout

Trucha marina Salmo trutta, Linnaeus 1758 brown trout


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Abreviaturas

∆-9, ∆-6 y ∆-5: Delta-9, delta-6 y delta-5 desaturasas.

+C2: elongasa.

5-HT: serotonina.

AA : ácido araquidónico, 20:4n-6.

AG: ácidos grasos.

ApoAIV : apolipoproteína A-IV.

CCK: colecistoquinina.

CD: dieta completa.

CH: carbohidratos.

DA: dopamina.

DHA: ácido docosahexaenoico, 22:6n-3.

EFA: ácidos grasos esenciales.

EPA: ácido eicosapentaenoico, 20:5n-3.

F: grasa.

FAME: metil-ésteres de ácidos grasos.

FFA: ácidos grasos libres.

FO: aceite de pescado.

GABA : ácido gammaaminobutírico.

GAL : galanina.

GH: hormona del crecimiento.

GLP-1: péptido tipo glucagón-1.

GLUT1/GLUT3 : transportadores de glucosa 1 y 3.

GRP: polipéptido liberador de gastrina (bombesina).

GRPR: receptor del péptido librador de gastrina (GRP).

HUFA: ácidos grasos altamente insaturados.

IGFs: factores de crecimiento tipo insulina.

IGF-1: factor de crecimiento tipo insulina tipo 1.


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LA : ácido linoleico, 18:2n-6.

LNA : ácido α-linolénico, 18:3n-3.

LO: aceite de linaza.

MUFA: ácidos grasos monoinsaturados.

n-3: ácidos grasos n-3 (ω-3).

n-6: ácidos grasos n-6 (ω-6).

NE: noradrenalina.

NFE: extracto libre de nitrógeno.

NMRBR: receptor de la neuromedina-B.

NPY: neuropéptido-Y.

P: proteína.

PUFA: ácidos grasos poliinsaturados.

SAFA : ácidos grasos saturados.

SNC: sistema nervioso central.

SO: aceite de soja.

SSs: somatostatinas.

T3: triiodotironina.

T4: tiroxina.

TG: triglicéridos.

TGI: tracto gastrointestinal.

TH: hormonas tiroideas.

TSH: hormona estimulante del tiroides.


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Índice

1. INTRODUCCIÓN.

1.1. Comportamiento alimentario.

1.2. Búsqueda de alternativas a las fuentes de pescado.

1.3. El sargo picudo: una nueva especie para la acuicultura mediterránea.

2. OBJETIVOS.

3. MATERIAL Y MÉTODOS.

3.1. Diseño experimental general.

3.2. Instalaciones.

4. TRABAJO EXPERIMENTAL.

4.1. Macronutrient selection through post-ingestive signals in sharpsnout

seabream fed gelatina capsules and challenged with protein dilution.

4.2. Energy intake and macronutrient selection in sharpsnout seabream

(Diplodus puntazzo) challenged with fat dilution and fat deprivation

using encapsulated diets.

4.3. Effects of total replacement of fish oil by vegetable oils on n-3 and n-6

polyunsaturated fatty acid desaturation and elongation in sharpsnout

seabream (Diplodus puntazzo) hepatocytes and enterocytes.

4.4. Sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) ability for different oil

sources discrimination using encapsulated complete diets.

5. DISCUSIÓN GENERAL.

6. CONCLUSIONES.

7. RESUMEN GENERAL.

8. REFERENCIAS.

9. ANEXO.


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Hasta hace muy poco, la gran mayoría de los trabajos que componían la bibliografía acerca

de los mecanismos implicados en la regulación de la ingesta de alimento por parte de los

peces, estaban exclusivamente enfocados al contenido energético de la misma. Sin embargo,

la creciente aportación científica en este campo durante los últimos años, está ampliando

enormemente la visión de este sistema de regulación. Los nuevos estudios realizados

muestran que la regulación de la ingesta involucra una compleja red de mecanismos

interaccionando entre sí, que determinan, no sólo el establecimiento de una ingesta constante

de energía por parte del animal, sino también un patrón estable de selección de

macronutrientes, que defiende en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, la

regulación de la ingesta por parte del animal, no sólo incluiría el componente energético de la

misma, sino también el aporte de nutrientes específicos que supone para el organismo

(Thibault y Booth, 1999).

Las necesidades nutricionales de una especie, así como las capacidades metabólicas en

las que estas subyacen, son parte de un proceso de adaptación del animal al hábitat que

ocupa. De este modo, es de esperar que aquellos animales que viven en un hábitat

caracterizado por la presencia de una fuente de alimento con una composición determinada,

también se hayan adaptado a lo largo de las generaciones y hayan evolucionado hacia un

óptimo aprovechamiento del alimento del que disponen y que, a la hora de trabajar en la

elaboración de dietas artificiales con diferente composición para estos animales, nos

encontremos con unas barreras constitutivas que vendrán dadas por el acervo metabólico y

regulador de la especie. De este modo, si se tiene en cuenta que los peces marinos presentan,

en su mayoría, una dieta rica en proteínas y lípidos de alta calidad, fáciles de utilizar por su

organismo, parece lógico pensar que la maquinaria enzimática encargada de la transformación

de estos nutrientes se muestre menos funcional que la de aquellos peces que presentan dietas

más deficitarias en proteínas y lípidos de alta calidad y que, por lo tanto, deben ser

compensadas por el metabolismo del animal.


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1.1. Comportamiento alimentario.

Para estudiar en profundidad estas capacidades, se han diseñado diferentes

metodologías de auto-alimentación basadas, en unos casos, en la utilización de dietas

granuladas en comederos auto-demanda y, en otros, en el empaquetado de las dietas en el

interior de cápsulas de gelatina (Aranda et al., 2000, 2001; Rubio et al., 2003, 2004, 2005,

2006; Sánchez-Vázquez et al., 1998, 1999; Torrejón Atienza et al., 2004; Vivas et al., 2006). En

todas ellas, se trata de poner a disposición de los peces un sistema de alimentación “a la

carta”, en el que éstos pueden seleccionar entre distintas dietas e ingerir la cantidad de

alimento que deseen. De este modo, se puede caracterizar muy bien el comportamiento

alimentario de los animales, obteniendo información acerca de qué, y cuánto comen y, en el

caso de los comederos a demanda, de cuándo prefieren hacerlo. A partir de estos estudios se

ha demostrado que los peces, no sólo son capaces de seleccionar entre distintas fuentes de

alimento para alcanzar un patrón de selección de macronutrientes, sino que ese patrón

constituye una dieta completa equilibrada que se adapta perfectamente a las necesidades

fisiológicas de la especie, así como a sus hábitos alimentarios (carnívoros u omnívoros). Esa

dieta constituye, pues, una “diana” para los peces, la cual defienden aunque varíen las

condiciones experimentales.

El proceso de auto-selección implica la conexión del comportamiento alimentario del animal

con los mecanismos fisiológicos que subyacen a la captura y utilización del alimento. Para

poder comprender los mecanismos implicados en tal regulación, es necesario estudiar todos

los pasos existentes desde que una posible fuente de alimento es detectada como tal por el

animal hasta que éste toma la decisión de ingerirla o rechazarla. El comportamiento alimentario

es, pues, el resultado de la integración de la información que alcanza el sistema nervioso

central (SNC) del animal, por un lado, desde los receptores sensoriales rostrales y

orofaríngeos, mecanoceptores y quimiorreceptores de la mucosa intestinal, así como desde

redes neuroendocrinas que implican numerosos órganos y, por otro, de la información acerca

del estatus energético del animal (señales de adiposidad) e incluso de pautas no aprendidas,


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inherentes a la especie, hacia ciertas sustancias presentes en las posibles fuentes de alimento

(Kasumyan, 1997; Lamb, 2001) (Figura 1).

La captura e ingesta de un alimento genera, por tanto, una ingente cantidad de estímulos

que serán integrados por el SNC y que, en caso de no existir preferencias innatas de la

especie, determinarán el establecimiento de un aprendizaje asociativo por parte del animal, que

le permitirá ir ajustando en todo momento la ingesta con las necesidades nutricionales y

energéticas (Rubio et al., 2003) (Figura 2).

Sistema NerviosoCentral

Ingesta

Tracto Gastrointestinal

Distensión estomacal

PéptidosGastrointestinales

Nervio Vago

Factores externos

Factores socialesFactores fisiológicos

SISTEMADE

SACIEDADPERIFÉRICO

ReservasEnergéticas(adiposidad)Gasto

energético

Figura 1. Esquema simplificado del sistema de regulación periférica de la ingesta en peces, donde intervienen el

intestino y los órganos asociados. La presencia de quimio y mecanorreceptores así como de toda una variedad de

células endocrinas, determinan una compleja red de señalización que producirá efectos a nivel local, gastrointestinal y

sobre otros órganos, sobre todo el cerebro, donde llegan señales vía aferencias vagales o mediante vías endocrinas

sensibles a la distensión gástrica y al contenido intestinal de nutrientes (Figura modificada de Cerdá-Reverter et al.,

2006).


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Las técnicas de auto-selección basadas en la utilización de comederos a demanda para el

estudio de la regulación de la ingesta, plantean una duda fundamental consistente en la

importancia relativa que la información orosensorial del alimento (sabor, olor, textura) puede

tener en dicha selección. Mediante esta metodología no se puede saber hasta qué punto la

selección de los peces responde a sus requerimientos nutricionales y no a preferencias

alimentarias (Rubio et al., 2003). Para acercar al máximo ambos conceptos, se dio un nuevo

paso en las técnicas de alimentación a demanda en peces, empleando una metodología

basada en el empaquetado del alimento en cápsulas de gelatina, con el objetivo fundamental

de eliminar la información orosensorial de la dieta. Los animales deben tragar las cápsulas para

poder acceder al alimento y la selección sólo es posible basándose en diferencias de color

entre las cápsulas como única señal externa. Las cápsulas atraviesan el tracto digestivo hasta

llegar al estómago, donde la pared de gelatina se deshace liberando su contenido. Por tanto,

los mecanismos de regulación observados mediante esta técnica se iniciarían a nivel post-

ingestivo y/o post-absortivo, sin la mediación de factores tales como el sabor, el olor o la

textura (Rubio et al., 2003, 2004, 2005, 2006).

Tras la comprobación de que una especie puede ser utilizada como modelo de estudio

usando esta técnica, es posible desarrollar diseños experimentales de menor a mayor

complejidad, en los que se puede ir profundizando en el conocimiento de la capacidad del

animal para defender una dieta, comparando con los resultados obtenidos con dietas

granuladas.


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.

P

CHF

?

P

F CH

APRENDIZAJE ASOCIATIVO

IDENTIDAD SENSORIAL DE LAS DIETAS

EFECTOS POST-INGESTIVOSESPECÍFICOS

INGESTA

COMPORTAMIENTO ALIMENTARIO

.

Figura 2. Premisas que se han de cumplir para que tenga lugar la selección específica de dietas con distinto contenido

en macronutrientes. La existencia de una característica sensorial distintiva por parte de la dieta y la existencia de

efectos post-ingestivos específicos permitirá el establecimiento de una ingesta selectiva mediante la modificación del

comportamiento alimentario. Si un animal sin experiencia previa decide ingerir el alimento, la nueva experiencia influirá

en la próxima ocasión mediante la asociación de esos efectos post-ingestivos con las características sensoriales que

permitan distinguir la composición del alimento.

La selección de macronutrientes resulta ser un factor de gran importancia para los

animales, apuntando hacia la existencia de mecanismos de selección nutriente-específico s

basados en la detección de las características propias de los macronutrientes, señales que

serían integradas dentro de la actividad neural del animal. En peces, con la excepción del

carpín dorado, especie omnívora, la proteína es el macronutriente seleccionado en mayor

cantidad, tanto en experimentos con dietas granuladas (Sánchez-Vázquez et al., 1999; Aranda

et al., 2000, 2001; Yamamoto et al., 2001; Torrejón Atienza et al., 2004) como encapsuladas

(Rubio et al., 2003, 2004, 2005, 2006). Estos resultados sugieren la existencia de una

regulación flexible, que no tiene por qué ser de igual relevancia para los tres macronutrientes y

que estaría actuando a cuatro posibles niveles, según propusieron Seeley y Berthoud (2000)

(Tabla 3) (Figura 3):


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1. Señales sensoriales cefálicas (visión, olfacción, gustación,

mecanorrecepción).

2. Señales generadas durante la digestión y/o absorción (señales

gastrointestinales, hepáticas y pancreáticas).

3. Transducción neural. Generación de señales nerviosas que informan de la

disponibilidad de los diferentes macronutrientes en los tejidos (liberación de

neurotransmisores y péptidos capaces de actuar en diferentes regiones

cerebrales).

4. Integración nerviosa que como resultado final, produce la activación de

efectores (sistemas motor, autonómico, endocrino y comportamental) que

en última instancia serán los responsables de la selección dietaria.

1.1.1. Señales sensoriales cefálicas

Un requisito fundamental para que se establezca una regulación nutriente-específica es

que los diferentes macronutrientes posean propiedades distintivas que permitan al animal

establecer esa diferenciación a través de sus órganos sensoriales (visión, olfacción, gustación,

mecanorrecepción) (Thibault y Booth, 1999). En mamíferos, las señales ópticas procesadas por

el córtex visual podrían confluir en la amígdala, o en el hipotálamo lateral, con señales de

receptores gustativos (procesadas por el núcleo del tracto solitario) y con señales olfativas

procedentes del bulbo olfatorio. Estas señales sensoriales, podrían verse integradas con otras

señales de origen post-ingestivo y, en conjunto, permitirían la elaboración de un

comportamiento alimentario tendente a controlar la ingesta de macronutrientes (Rolls, 2000;

Rubio, 2004).


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Señales del TGI y órganos asociados

Sistemas efectores

Figura 3. Diagrama esquemático mostrando el flujo de información y los mensajeros potencialmente implicados en el

sistema regulador macronutriente-específico de la ingesta de alimento. Las señales portadoras de la información

específica de los macronutrientes son generadas por las fases cefálicas y gastrointestinal/vísceras asociadas durante

la ingestión, y por los procesos metabólicos. Estas señales son transducidas e integradas dentro del sistema nervioso,

el cual determina la selección presente y futura, así como las actividades nerviosa autónoma (SNA) y endocrina.

También aparece indicada la posibilidad de una información no específica de los macronutrientes, en el control de la

ingesta de alimento, procedente de la producción energética del hígado. Abreviaturas: CCK, colecistoquinina; GLP-1,

péptido similar al glucagón tipo 1; AG, ácidos grasos libres; TG, triglicéridos; ApoAIV, Apolipoproteína A-IV; 5-HT,

serotonina; NE, noradrenalina; GABA, ácido gammaaminobutírico; DA, dopamina; NPY, neuropéptido Y; NO, óxido

nítrico; Glut1/Glut3, transportadores de glucosa 1 y 3; GRP, polipéptido liberador de gastrina (bombesina); GRPR,

receptor del GRP; NMBR, receptor de la neuromedina-B; GAL, galanina (Seeley y Berthoud, 2000; Redibujado de

Rubio, 2004).


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1.1.2. Señales gastrointestinales y hepáticas.

1.1.2.1. Mecanorreceptores del tracto gastrointestinal (TGI).

Cuando el alimento llega al estómago puede estimular terminaciones mecanosensitivas

vagales que informan a los centros reguladores de la ingesta del grado de distensión de la

pared estomacal. Esta señal mecanorreceptiva, rápida, puede servir como un primer nivel de

regulación del volumen de alimento ingerido. Sin embargo, aunque esta regulación esté

presente en peces, estos vertebrados parecen regular más la energía que el volumen, como lo

prueban los experimentos de dilución de dietas con celulosa (Sánchez-Vázquez et al., 1998;

Vivas et al., 2006) y la aparente pérdida de la regulación de volumen en especies como la

trucha, en la cual la ingesta de cápsulas llegó a alcanzar niveles incluso superiores a un 8% de

su peso corporal en una sola comida (Rubio, 2004).

1.1.2.2. Quimiorreceptores del TGI.

Pruebas electrofisiológicas y comportamentales sugieren que el estómago y el intestino

son capaces de suministrar información sobre la composición en macronutrientes de una

comida. La pared del estómago e intestino está tapizada de quimiorreceptores sensibles a

determinados componentes de la dieta (Höfer et al., 1996; Covasa y Ritter, 2000). En

mamíferos, los registros electrofisiológicos de fibras nerviosas que inervan el intestino, han

mostrado sensibilidad a la presencia de aminoácidos, glucosa y ácidos grasos (Mei, 1978;

Jeanningros, 1982; Melone, 1986). Estas señales convergen con señales gástricas

mecanorreceptivas e información exteroceptiva en el metencéfalo-mielencéfalo, suministrando

una vía mediante la cual las señales viscerales pueden influir sobre las señales orosensoriales

en la selección de macronutrientes (Covasa y Ritter, 2000).


33

Tabla 3. Hormonas y otras sustancias activas estudiadas en peces por estar relacionadas con efectos nutriente-específicos.

Especies Efectos observados Referencias

Colecistoquinina (CCK) Mamíferos.....................................

Lubina..........................................

Influencia sobre la ingesta selectiva de macronutrientes. Variabilidad de efectos

observados.

Reducción de la ingesta.

Croos-Mellor et al., 1999; Peyon et

al., 1999; Rubio, 2004.

Hormonas

pancreáticas

Trucha marina alimentada............

Trucha marina en ayunas.............

Trucha arco iris.............................

Peces alimentados………………………

Inyecciones de glucosa aumentan la insulina circulante.

Aumento de la concentración plasmática de insulina, así como de su unión a hígado.

Inyecciones de arginina aumentan insulina circulante y potencian su unión a hígado.

Disminuye la extracción por parte del hígado de glucagón e insulina.

Inyección de arginina produce hipoglucemia. Más activa estimulando la producción de

insulina.

Complementos de arginina en la dieta aumentan la insulina y reducen el apetito.

Ablett et al., 1983; Carneiro et al.,

1993; Gutiérrez y Plisetskaya,

1991; Ince, 1980; Machado et al.,

1988; MacKenzie et al., 1998;

Plisetskaya et al., 1991.

Hormonas Tiroideas Trucha arco iris alimentada………….

Salmónidos…………………………………

Trucha arco iris en ayunas.............

Dieta con baja proteína produce bajas concentraciones plasmáticas de T4, una conversión

reducida de T4 a T3 y reducidas tasas de crecimiento.

Dietas con alta proteína producen altas tasas de conversión de T4 a T3.

Dietas ricas en CH no aumentan ni las concentraciones de T3 en plasma ni el crecimiento.

Sí aumenta la T4 plasmática. La proteína activa la producción de T3.

Una sola dieta rica en CH o una inyección de glucosa producen rápidas elevaciones de T4

plasmática.

Eales et al., 1990, 1992, 1993;

Higgs y Eales, 1979; Higgs et al.,

1992; Himick y Eales, 1990;

Himick et al., 1991; Leatherland et

al., 1984; Riley et al., 1993.

Hormona del

crecimiento (GH)

Dorada……………………………………….

Tilapia……………………………………….

Dietas con bajo contenido en proteína provocan concentraciones más altas de GH en

plasma pero menos de GH unida a hígado, así como de IGF-1.

Mismo efecto del bajo contenido en proteína que el ayuno.

En pituitarias incubadas in vitro, la cantidad de GH es inversamente proporcional a la

concentración de glucosa o de aminoácidos del medio.

Pérez-Sánchez et al., 1995;

Rodges et al., 1992; Thissen et al.,

1994.

Serotonina (5-HT) Mamíferos………………………………….

Lubina……………………………………….

Administración central de 5-HT produce una reducción dosis-dependiente de la ingesta de

CH. Amplia variedad de efectos sobre P y F. Posible sistema de retroalimentación negativa

entre la ingesta de GH y los niveles de 5-HT.

Administración oral de serotonina induce descenso en la ingesta de F y un leve

Burton-Freeman et al., 1999;

Rubio, 2004; Rubio et al., 2006.


34

Especies Efectos observados Referencias

incremento en la de P, sin efectos significativos sobre la de CH. Aparente dependencia de

las preferencias previas del animal por P y F (baja capacidad de usar los CH por parte de

la lubina).

Administración de 5-HT oral aumenta 5-HT cerebral. Efectos promovidos por mecanismos

periféricos y centrales. Interacción con CCK, Insulina y melatonina.

Melatonina

Mamíferos y peces........................

Carpín..........................................

Lubina..........................................

La síntesis de melatonina por células enterocromafines del TGI es importante y parece

depender de la presencia de factores nutricionales y del comportamiento alimentario más

que del fotoperiodo.

Pinealectomía no causa alteración de la cantidad y distribución de la melatonina del TGI y

plasma durante el día.

La pinealectomía acompañada de enucleación bilateral no disminuye la concentración

plasmática de melatonina durante el periodo de iluminación.

Administración oral de melatonina induce aumento en la proporción de grasa ingerida.

Posible relación con cambios estacionales del ciclo biológico y con la necesidad de ingerir

nutrientes ricos en energía en periodos de baja temperatura (fotoperiodos cortos).

Bubenik et al., 1996; Huether,

1994; Kezuka et al., 1992; Martin

et al., 1998; Pickett y Pawson,

1994; Rubio, 2004.

Cortisol

Trucha..........................................

Actuación muy dependiente de las concentraciones plasmáticas así como del estatus

fisiológico previo del animal.

Altísima variabilidad entre individuos.

Rubio, 2004.

Neuropéptido Y (NPY) Carpín.......................................... Peces alimentados con dietas ricas en F exhiben cambios en la expresión del NPY

cerebral.

Dietas con diferentes concentraciones de proteína no muestran ningún efecto.

Narnaware y Peter, 2001.

Somatostatinas (SSs) Trucha arco iris.............................

Trucha arco iris, salmón, barbo,

salmón coho, anguila europea, pez

depredador...................................

Trucha..........................................

En ayuno provoca hiperglucemia.

Inyecciones de glucosa inducen aumento de la concentración plasmática de SS.

La glucosa eleva la SS tanto in vivo como in vitro, influyendo en la síntesis y la secreción.

Los aminoácidos y la grasa también afectan a la secreción de SS

Altas concentraciones de SS en plasma están asociados con elevados niveles de ácidos

grasos.

Eilertson y Sheridan, 1995;

Harmon et al., 1991; Ince y So,

1984; Melroe et al., 2000; Nelson

y Sheridan, 2005; Ronner y

Scarpa, 1987; Sheridan y Kittilson,

2004.


35

1.1.2.3. Señales endocrinas nutriente-específicas del TGI.

Mediante la utilización de diferentes protocolos, se ha encontrado que la

colecistoquinina (CCK), el péptido similar a glucagón de tipo 1 (GLP-1), la enterostatina, la

insulina y la amilina, entre otras hormonas, son liberadas diferencialmente en respuesta a los

distintos macronutrientes (Seeley y Berthoud, 2000). No obstante, este tipo de estudios plantea

una gran dificultad a la hora de interpretar los resultados ya que, alteraciones de un

componente de la dieta, tales como el contenido de proteína o la fuente de lípidos,

frecuentemente motivan cambios incontrolados en otras propiedades de la dieta (MacKenzie et

al., 1998). Los efectos endocrinos observados pueden ser también respuestas secundarias de

acciones de la dieta sobre el metabolismo o el crecimiento. Pero, a pesar de los

inconvenientes, estos trabajos en mamíferos están dando lugar a un nuevo campo de estudio,

incorporando otro punto de partida para futuras investigaciones acerca de los efectos de

nutrientes específicos e identificando la importancia de determinados componentes de la dieta

tales como la proteína o la energía total, sobre la expresión de genes específicos en sistemas

neuroendocrinos (Beck et al., 1994; White et al., 1994; Wester et al., 1995).

1.1.2.4. Señales post-absortivas.

Un último nivel de detección de los nutrientes tiene lugar una vez han sido absorbidos.

Diferentes tejidos, entre los que destaca el hígado, poseen sensores que monitorizan

continuamente las concentraciones disponibles de nutrientes. Los nutrientes percibidos por la

boca y el estómago no restauran las reservas nutricionales del cuerpo hasta que los nutrientes

no alcanzan el hígado, que es el primer órgano en detectar la presencia de nutrientes

absorbidos por el intestino, induciendo saciedad (Carlson, 1998).


36

1.1.3.Transducción neural e Integración nerviosa.

Determinados neurotransmisores y hormonas, una vez liberados en respuesta a

señales procedentes del TGI o metabólicas, pueden actuar sobre áreas cerebrales específicas

modificando las preferencias selectivas por macronutrientes. De este modo, podríamos

establecer un esquema de regulación nutriente-específico sobre el esquema general, tal y

como se muestra en la Figura 3. Como ejemplo de esta transducción nerviosa nutriente-

específica, tenemos las evidencias aportadas recientemente en peces por Rubio et al. (2004,

2006), quienes estudiaron los efectos de la hormona melatonina y de un neurotransmisor

precursor de la síntesis de melatonina, como es la serotonina, sobre la selección de

macronutrientes.

Como ya se ha señalado, la adaptación a un estilo de vida determinado, caracterizado

por la presencia de unas fuentes nutricionales concretas, puede marcar las características

metabólicas del animal, que evolucionarían hacia la utilización óptima de los ingredientes que

componen su dieta habitual. Este hecho se verá reflejado en las actividades enzimáticas

implicadas en el metabolismo de los diferentes macronutrientes y definirá una barrera

constitutiva de la especie. De este modo, se podrían establecer los patrones de alimentación

propios de los principales hábitats acuáticos, esto es, el medio dulceacuícola y el medio

marino. Los peces que se desenvuelven en ambientes de agua dulce suelen presentar dietas

más variadas en las que están presentes algas, insectos, plantas, pequeños peces etc., con

una proporción importante de alimentos de origen terrestre, mientras que los animales marinos

suelen presentar una dieta eminentemente carnívora/piscívora, propia del medio. Por lo tanto,

es necesario caracterizar el metabolismo de cada especie para poder diseñar dietas que sean

compatibles con sus posibilidades a nivel metabólico y, de este modo, optimizar el

aprovechamiento de las mismas por parte del animal. Este hecho es, a su vez, de vital

importancia a la hora de abordar uno de los mayores desafíos a los que se enfrenta la

acuicultura en la actualidad, consistente en la necesidad urgente de encontrar alternativas a las

fuentes tradicionales de nutrientes, fundamentalmente harinas y aceites de pescado,


37

procedentes de la pesca extractiva. Una actividad como la acuicultura, que crece a un ritmo

muy acelerado, necesita solucionar este problema.

1.2. Búsqueda de aternativas a las fuentes de pesca do.

Como se puso de manifiesto en el Congreso de la European Aquaculture Society (EAS)

celebrado en Trondheim, Noruega, en agosto de 2005, la producción global de harina de

pescado en la actualidad resulta insuficiente para satisfacer las necesidades de la acuicultura,

en proceso de continua expansión. Los sustitutos más prometedores a las fuentes de pescado,

son los productos vegetales, dada su elevada disponibilidad y su bajo coste, si bien presentan

problemas en cuanto a su utilización por parte del animal: composición, digestibilidad,

presencia de sustancias antinutritivas o la presencia de ciertos carbohidratos no digeribles (De

la Gándara, 2006). En el planteamiento de una sustitución, total o parcial, de la harina de

pescado por harinas vegetales, es necesario conocer las posibles consecuencias fisiológicas

de un cambio tal en la composición de la dieta.

Los datos disponibles muestran que, cerca de un 30-50% de la harina de pescado,

puede ser sustituida con éxito por fuentes de origen vegetal en las dietas de animales de

acuicultura (Francis et al., 2001), aunque existen importantes diferencias entre especies.

Algunos estudios revelan que la sustitución total es posible, al menos en la trucha arco iris

(Kaushik et al., 1995; Watanabe et al., 1998), mientras que no existen datos concluyentes en

otras especies como la dorada (Robaina et al., 1995, 1998), donde se ha alcanzado un nivel de

sustitución en torno al 45% (Martínez, 2005). Hernández et al. (2007) abordaron la sustitución

parcial de la harina de pescado por harina de soja en el sargo picudo, obteniéndose una buena

tolerancia hasta una sustitución del 60%, sin efectos negativos de importancia, relacionados en

su mayoría con la menor digestibilidad de la proteína de soja. Los coeficientes económicos

reflejaron menores costes de producción, con la obtención de un producto en el que no se

vieron afectadas sus propiedades organolépticas.


38

La utilización de aceite de pescado como fuente lipídica supone del mismo modo, un

factor limitante para el desarrollo de una acuicultura sostenible (Barlow, 2000). El crecimiento

acelerado del cultivo de especies carnívoras europeas como la dorada o la lubina, hace que las

expectativas de futuro pasen por buscar alternativas al aceite de pescado como fuente lipídica

(Sargent y Tacon, 1999; Tacon, 2004). Los principales candidatos son los aceites vegetales,

con los que existe el problema de su composición, muy diferente de la que poseen los aceites

de pescado, lo cual requiere de la colaboración del metabolismo del animal para ser

compensada. Los peces que mantienen una alimentación de tipo dulceacuícola, son capaces

de convertir los ácidos grasos 18:3n-3 (ácido linolénico, LNA) y 18:2n-6 (ácido linoleico, LA),

con los que arrancan las principales series de ácidos grasos poliinsaturados, hacia sus

correspondientes formas multi-insaturadas y de cadenas más largas (HUFA): 20:5n-3 (ácido

eicosapentaenoico, EPA), 22:6n-3 (ácido docosahexaenoico, DHA) y 20:4n-6 (ácido

araquidónico, AA), respectivamente (Figura 4). Sin embargo, los que mantienen un tipo de

alimentación marina, tienen muy poca capacidad para elongar y desaturar los ácidos grasos,

por lo que, para ellos, los HUFA se consideran también esenciales y deben ser aportados en la

dieta (NCR, 1993; Tocher et al., 2001, 2003).

La caracterización del metabolismo del animal constituye, pues, un paso fundamental

en el estudio de una especie de piscifactoría. A la hora de elaborar piensos para su producción,

constituirá un factor esencial conocer los requerimientos energéticos y nutricionales de la

especie, así como la flexibilidad de que ésta dispone a la hora de abordar posibles

sustituciones en las fuentes de nutrientes tradicionales. Este conocimiento nos ayudará a

optimizar el proceso de cultivo así como la calidad del producto final para el consumo humano.


39

Figura 4. Series de biosíntesis de ácidos grasos, donde se indican las enzimas implicadas, tanto elongasas (+C2) como

desaturasas (∆-9, ∆-6 y ∆-5).

En la presente Tesis Doctoral se utilizó la alimentación a demanda y, concretamente, la

alimentación mediante cápsulas de gelatina para caracterizar el potencial regulador de la

ingesta del sargo picudo (Diplodus puntazzo), una especie marina omnívora de interés en

acuicultura y que resulta, por sus características nutricionales, un buen modelo para llevar a

cabo estudios de regulación de la ingesta y selección de macronutrientes (Sala y Ballesteros,

1997; Mena Sellés y García García, 2002). De este modo, se profundizó en el comportamiento

alimentario de la especie y se pudo establecer una hipótesis acerca de los mecanismos que

estarían operando para que esa selección tenga lugar. Este tipo de estudios se enlazó con

otros de carácter más aplicado, basados en la caracterización del potencial de la especie para

el metabolismo lipídico a la hora de afrontar la sustitución del aceite de pescado tradicional por

aceites vegetales.

Síntesis de novo

16:016:1n-7∆-9

+C2

18:0

∆-9

18:1n-9

∆-6

18:2n-9

+C2

20:2n-9

∆-5

20:3n-9

+C2

22:3n-9

DIETA

18:2n-6 18:3n-3

∆-6

18:3n-6 18:4n-320:2n-6

20:3n-6+C2

20:4n-3

20:3n-3

∆-520:4n-6ARA

20:5n-3EPA

22:4n-6

+C2

22:5n-3

24:4n-6 24:5n-3+C2

24:5n-6 24:6n-3∆-6

Β-OXIDACIÓN

22:5n-6 22:6n-3DHA

∆-6 ∆-6

+C2 +C2


40

1.3. El sargo picudo: una nueva especie para la acu icultura mediterránea.

Tradicionalmente, las actividades

acuícolas en el Mediterráneo han estado

cimentadas en la producción de dos especies,

la lubina (Dicentrarchus labrax) y la dorada

(Sparus aurata). La saturación de los

mercados para estas especies ha provocado

la necesidad de abrir la oferta de especies

cultivables. Buena parte de las especies candidatas pertenecen al orden de los espáridos, este

es el caso del dentón (Dentex dentex), el pargo (Pagrus pagrus), la hurta (Pagrus auriga), el

besugo (Pagellus bogaraveo), el sargo blanco (Diplodus sargus) o el sargo picudo (Diplodus

puntazzo). Todas ellas son especies relacionadas, en las que se pueden aplicar, con pequeñas

modificaciones, los conocimientos adquiridos en la producción de la dorada, con el problema

subyacente de la competencia entre ellas (Basurco y Abellán, 1999; Abellán, 2006).

1.3.1. Nomenclatura y morfología.

El sargo picudo (Diplodus puntazzo, Cetti 1777 = Puntazzo puntazzo, Gmelin 1789),

también denominado localmante morruda o cántara, pertenece a la familia de los espáridos. Su

característica más patente es una cabeza con perfil cóncavo con un hocico puntiagudo y

saliente, boca pequeña con ocho incisivos prominentes en la parte frontal de las mandíbulas y

una sola fila de molares, sin colmillos. Ojos de tamaño mediano. Cuerpo alto, oval y

comprimido, de hasta 60 cm de longitud. Coloración gris plateada, con unas 6 a 8 bandas

transversales no completas, negras y estrechas, entre las que se pueden observar otras más

estrechas y menos marcadas. También presenta un anillo en el pedúnculo caudal, una ancha

banda negruzca en la frente, una ancha banda negra en la base de las aletas pectorales y en

las aletas caudal, anal y la porción blanda de la dorsal orladas de negro. Aleta dorsal alargada,


41

ventrales pequeñas, pectorales largas y en punta y caudal escotada (Calvín, 2006; Hernández,

2006).

1.3.2. Distribución geográfica y hábitos alimentarios.

El sargo picudo habita en fondos rocosos cercanos a la costa, con algas y, a veces,

con praderas de Posidonia oceánica. Se encuentra en el Mediterráneo y en el Atlántico.

Se trata de una especie de hábitos omnívoros (Sala y Ballesteros, 1997; Mena Sellés y

García García, 2002), con una dieta variada basada fundamentalmente en pequeños

crustáceos, moluscos y algas. A diferencia de las especies estrictamente carnívoras, como la

dorada, el sargo picudo presenta un mayor desapego de la proteína animal y una alta

capacidad para la utilización de lípidos e hidratos de carbono como fuentes alternativas de

energía (Hernández et al., 2001a). Las poblaciones naturales de esta especie sacian una parte

importante de sus necesidades proteicas con proteínas vegetales (Mena Sellés y García

García, 2002), habiendo sido demostrado que contenidos de hasta el 60% de harina de soja en

dietas experimentales no afectan de forma significativa a su crecimiento así como su valoración

por parte del consumidor (Rondán et al., 2004b; Hernández et al., 2007). Además, la

composición en ácidos grasos del músculo del sargo picudo, después de la sustitución, resulta

satisfactoria para el consumo humano (Rondán et al., 2004a).

1.3.3. Nutrición y Comportamiento.

Usando piensos comercialmente disponibles para espáridos, se ha comprobado que

los mejores rendimientos para el sargo picudo se obtienen con piensos con una relación de

alrededor de 22g de proteína por MJ de energía (Hernández et al., 2001a). En experiencias

previas, también se ha observado que las dietas hiperenergéticas (en las que el exceso de

energía es aportado principalmente por la grasa) no son una buena opción para el sargo picudo

(Hernández et al., 2005). Se ha comprobado, a su vez, que esta especie es capaz de


42

seleccionar a partir de dietas con diferentes composiciones nutricionales, componiendo una

dieta completa, en la que, no sólo es regulada la ingesta diaria de energía (que apoya los datos

obtenidos sobre la demanda energética), sino también la composición nutricional de la misma,

mostrando un claro patrón de selección que es defendido en diferentes condiciones

experimentales (Torrejón Atienza et al., 2004; Vivas et al., 2006). En estos experimentos, el

sargo picudo seleccionó una dieta eminentemente proteica, lo cual podría indicar la similitud en

las preferencias de proteína entre especies marinas con distintos hábitos alimentarios,

estableciéndose la divergencia entre especies carnívoras y omnívoras, en la capacidad de

estas últimas para usar proteínas de origen vegetal y carbohidratos como fuente de energía. En

un estudio reciente se ha puesto de manifiesto que el sargo picudo presenta una dotación de

enzimas digestivos adecuada para la digestión de la proteína pero también con un alto

potencial para digerir polisacáridos vegetales, de acuerdo con sus hábitos omnívoros (Tramati

et al., 2005).

Todos los autores están de acuerdo en señalar la necesidad de producir dietas

específicas para el sargo picudo, aprovechando sus condición de especie omnívora. Una dieta

adaptada al sargo picudo podría contener altas cantidades de carbohidratos como fuente de

energía. De hecho, ha sido demostrado por Hernández et al. (2001a) que esta especie es

capaz de alimentarse con una dieta que contenga un 40% de proteína (P) y hasta un 36% de

carbohidratos (CH) sin perjudicar su crecimiento y su calidad nutricional. Por ello, estas dietas

serían más baratas que las elaboradas actualmente para dorada, lubina y otras especies

carnívoras.

Además, la sustitución de la harina de pescado por harina de soja no produce grandes

variaciones en los perfiles lipídicos del sargo picudo, aunque sí que se detecta una pérdida en

ácidos grasos n-3, que deberían ser compensados con alguna fuente rica en este tipo de

ácidos grasos. En un estudio sobre la sustitución de P por CH como fuente de energía, no se

produjo una modificación significativa del perfil lipídico de la especie (Rondán et al., 2004b).


43

Por otro lado, se ha observado que la sustitución total del aceite de pescado por aceite

de soja o linaza en la dieta del sargo picudo, no afecta al crecimiento ni al índice de conversión

de ésta especie tras tres meses de alimentación (Piedecausa et al., 2007). A pesar de que el

consumo de dietas con aceites vegetales como fuente lipídica redujo los porcentajes de los

principales HUFA, el 20:4n-6 (ARA), el 20:5n-3 (EPA) y el 22:6n-3 (DHA) en el músculo del

animal, esta reducción fue menor de la que cabía esperar analizando la composición de las

dietas, determinándose que la dieta que contenía aceite de soja era la de mejor índice de

conversión económico.

Vera et al. (2006) pusieron de manifiesto, mediante el uso de comederos a demanda y

fotocélulas, que el sargo picudo es una especie con un patrón de alimentación estrictamente

diurno. Su actividad locomotora, no obstante, muestra variaciones, apuntando a que, en esta

especie, la actividades alimentaria y locomotora presentan fases independientes.

Por último, desde el punto de vista del producto final, el sargo picudo es, hasta la fecha,

un desconocido en los grandes mercados y se consume de forma local, en zonas donde es

capturado por pescadores con caña o con artes de pesca tradicionales características de

determinadas zonas, como por ejemplo sería el caso del arte de pesca de la paranza, en el Mar

Menor. Estudios de palatabilidad realizados por Hernández et al. (2001b) han mostrado que el

sargo picudo aportaba a las personas encuestadas una impresión positiva al degustarlos. No

obstante, el desconocimiento que los grandes mercados tienen de ésta especie es

prácticamente el mismo que, hace tan solo 10 años, se tenía de la dorada. Los esfuerzos de

comercialización que se han realizado, sin embargo, han contribuido a que la dorada sea hoy

una de las especies más demandada en todos los mercados españoles. Además, hay que

tener en cuenta que el sargo picudo es muy apreciado en otros países mediterráneos, como

Italia, donde se obtienen altos precios de venta y no se debe descartar su producción para la

exportación hasta que los mercados locales acepten el producto a gran escala (Hernández,

2006).


44


45


46


47

Objetivo general

Profundizar en el conocimiento de las pautas que rigen el comportamiento alimentario de

los peces y caracterizar el potencial metabólico y regulador de la ingesta del sargo picudo para

afrontar la sustitución de aceites de pescado por aceites vegetales.

Objetivos específicos de cada trabajo experimental

Art.1.1.

1. Comprobar la capacidad del sargo picudo para ser alimentado con dietas

encapsuladas.

2. Detectar posibles preferencias por el color o la posición de las cápsulas en el tanque.

3. Dilucidar la necesidad de las propiedades orosensoriales de la dieta para la

regulación de la ingesta de energía así como para la selección de macronutrientes en esta

especie.

Art.1.2.

Analizar la capacidad del sargo picudo para regular la ingesta de energía y

macronutrientes cuando es sometido a la dilución de la proteína con dietas encapsuladas.

Art.2.1.

Investigar el efecto de la dilución de grasa y el ayuno de grasa sobre la ingesta de

energía y el patrón de selección de macronutrientes encapsulados por parte del sargo picudo.

Art.2.2.

Validar la técnica de encapsulación mediante un estudio de digestibilidad.


48

Art.4.1.

Analizar la capacidad del sargo picudo para la discriminación de dietas completas

encapsuladas que divergen en la presencia o no de grasa.

Art.4.2.

Determinar la habilidad del sargo picudo para la discriminación y selección entre dietas

completas encapsuladas que difieren únicamente en la fuente de lípido.

Art.3.

Analizar el efecto de la sustitución total del aceite de pescado por aceites vegetales

sobre:

1. La composición de ácidos grasos de hepatocitos y enterocitos del tracto digestivo,

2. Las actividades de desaturación/elongación de aislamientos primarios de

hepatocitos y enterocitos,

3. Las actividades de β-oxidación en hepatocitos y enterocitos del sargo picudo.


49


50


51

3.1. Diseño Experimental General.

Una vez fijadas las bases sobre las que se asienta la presente Tesis Doctoral y

planteados los objetivos, se procedió al diseño de los experimentos de la misma. La Figura 5

representa este proceso, en el cual se dio gran importancia al establecimiento de una línea

argumental sólida, una unidad temática que vinculase todos los trabajos y sirviera de argamasa

entre los distintos temas tratados. Esta unidad es la que se quiere resaltar en esta memoria,

dado el carácter individual de cada uno de los artículos que la contienen.

1. INTRODUCCIÓN

EL SARGO PICUDO

3. DISEÑO EXPERIMENTAL

CONOCIMIENTO PREVIOMETODOLOGÍA

2. OBJETIVOS

METABOLISMOLIPÍDICO

4. TRABAJO EXPERIMENTAL

COMPORTAMIENTO ALIMENTARIOMEDIANTE DIETAS ENCAPSULADAS

METABOLISMOGLUCÍDICO

SUSTITUCIÓN ACEITE DE PESCADO PORACEITES VEGETALES

4.1. AUTOSELECCIÓN MACRONUTRIENTESDILUCIÓN PROTEICA

4.2. DILUCIÓN DE GRASAAYUNO GRASA

4.4. SELECCIÓN ACEITES

4.3. SUSTITUCIÓN TOTAL DE ACEITE DE PESCADO POR ACEITES VEGETALES.

DESATURACIÓN/ELONGACIÓN

INTEGRACIÓN

5 Y 6. DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES

METABOLISMOPROTEICO

Figura 5. Unidad temática de la presente tesis.

Desde un principio se quiso destacar el porqué de la elección del sargo picudo como

especie para el estudio del comportamiento alimentario y el metabolismo lipídico, situando la

Tesis en el contexto biológico en el que se desarrollan los experimentos que se describen a

continuación (Apartado 1.2.).


52

En los Artículos 1, 2 y 4 se profundiza en el estudio de los mecanismos implicados en

la selección de macronutrientes en el sargo picudo. Para ello, se utiliza la metodología descrita

anteriormente por Rubio et al. (2003), consistente en el empleo de dietas empaquetadas en

cápsulas de gelatina. Estos trabajos continúan con la línea abierta por nuestro grupo de

investigación acerca de la utilización de sistemas de alimentación a demanda y vienen a

ampliar el conocimiento de los procesos participantes en la regulación de la ingesta en peces.

En un primer paso (Artículo 1, primera parte) se constata al sargo picudo como un buen modelo

para utilizar esta técnica y, a continuación, se pone de manifiesto su capacidad para

seleccionar, a partir de dietas de macronutrientes puros, y componer una dieta completa y

equilibrada, adaptada a sus necesidades fisiológicas (Artículo 1). A partir de ahí, se puso a

prueba la consistencia de la selección mediante la realización de experimentos de dilución y

ayuno selectivos de aquellos macronutrientes cuya regulación parece ser la más importante en

peces, la proteína y la grasa (Artículos 1 y 2). Con la información aportada por estos trabajos,

se podía caracterizar la capacidad del sargo picudo para compensar el déficit parcial o total de

un macronutriente y, de este modo, poder inferir la importancia relativa de cada uno de ellos,

siempre asociando los resultados obtenidos con los hábitos alimentarios propios de la especie.

En un trabajo aún no publicado, se quiso estudiar hasta qué punto las propiedades

orosensoriales del alimento influyen en la selección de dietas completas en las que se usan

distintos aceites como fuente de grasa. De este modo, se ampliaban las posibilidades de la

técnica de encapsulación, a la vez que se profundizaba en los niveles de actuación de los

mecanismos implicados en la regulación de la ingesta en peces. La discriminación entre dietas

completas que sólo divergían en la composición de la fuente de grasa utilizada, sería

únicamente posible si ésta se producía a nivel de los componentes de la grasa, es decir, de los

ácidos grasos (Artículo 4).

El procedimiento a seguir en todos estos protocolos experimentales fue similar. Los

animales eran alimentados una vez al día a saciedad. Para ello, las cápsulas eran dispuestas

durante treinta minutos en comederos flotantes situados en los tanques. Transcurrido ese

tiempo, las cápsulas no consumidas eran retiradas con un salabre y contabilizadas. Cuando se


53

utilizaban en un mismo tanque diferentes tipos de dietas encapsuladas, con diferentes colores,

se usaba siempre el mismo número de cada una de ellas, número que correspondía a la

máxima ingesta alcanzada por el animal. La ingesta de los peces era controlada a diario y el

número de cápsulas que se les ofrecía variaba en función de esas ingestas máximas,

permitiendo al animal ingerir un solo tipo de cápsulas para suplir sus demandas.

Dado que las distintas dietas encapsuladas poseían las mismas propiedades

organolépticas, éstas fueron codificadas mediante el color de la pared de las cápsulas. Se

establecía una misma relación color-dieta para cada tanque y se mantenía a lo largo de todo el

experimento para ese tanque (a excepción de la fase 5 del primer experimento del Artículo 1).

Sin embargo, esa relación se variaba entre tanques para eliminar posibles preferencias innatas

por el color de las cápsulas.

El posible efecto de la posición de las cápsulas en el tanque sobre la selección fue

analizada en el Artículo 1 y, al comprobarse que ésta no interfería en dicho proceso, las

cápsulas fueron dispuestas todas juntas en un mismo flotador en los siguientes experimentos

con dietas encapsuladas (segundo experimento del Artículo 1 y Artículo 2), salvo en el trabajo

de selección de aceites (Artículo 4), donde se usaron pares de dietas completas encapsuladas,

localizadas en sendos flotadores.

Con el fin de validar la técnica de encapsulación como técnica eficaz para llevar a cabo

los estudios de auto-selección en peces, era necesario realizar un estudio de digestibilidad de

las dietas encapsuladas en comparación con la de las dietas granuladas, al mismo tiempo que

dilucidar si la gelatina de la pared de las cápsulas constituía una fuente útil de proteína para los

peces. Para ello, se utilizó una dieta comercial para dorada (Skretting D2 Excel), que era

presentada a los peces en forma granulada o encapsulada (2 grupos experimentales). Al igual

que se hacía en los experimentos anteriores, las cápsulas eran dispuestas en los tanques en

comederos flotantes durante treinta minutos a saciedad y, transcurrido ese tiempo, eran

retiradas. Se usaron tanques dotados de sistemas de válvulas que permitían la recogida diaria


54

de las heces. Los piensos utilizados así como las heces recolectadas fueron analizadas tal y

como se describe en el Artículo 2 (segunda parte) de la presente Tesis.

En el Artículo 3 se describe la metodología a través de la cual se estudió el

metabolismo del sargo picudo en lo que respecta a la utilización de los lípidos de la dieta. Los

peces fueron alimentados tres veces al día a saciedad, los siete días de la semana, con una de

las tres dietas completas granuladas (grupo FO: alimentado con dieta con aceite de pescado;

grupo LNO: con dieta con aceite de linaza; grupo SO: con dieta con aceite de soja). Al cabo de

nueve meses de alimentación, un total de catorce animales fueron sacrificados y tomadas las

muestras correspondientes. Se obtuvieron aislamientos primarios de hepatocitos y enterocitos,

del hígado y el tracto digestivo de los animales, los cuales fueron divididos en tres grupos

(control: no radiactivo; LNA: incubado con el isótopo radiactivo [1-14C]linolénico; LA: incubado

con el isótopo radiactivo [1-14C]linoleico), que fueron sometidos a la extracción del lípido total y,

a partir de éste, a técnicas de cromatografía y seguimiento de las actividades enzimáticas

implicadas en la elongación y desaturación de las cadenas alifáticas de los ácidos grasos:

1. Muestras no radiactivas

— Trans-esterificación del lípido total de muestras no radiactivas para la

obtención de metil-ésteres de ácidos grasos (FAME) para su identificación y

relativización por cromatografía de gases.

2. Muestras radiactivas

— Obtención de FAMEs de lípido radiactivo y separación mediante

Cromatografía de Capa Fina impregnada con nitrato de plata (AgNO3-TLC).

— Identificación de los ácidos grasos radiactivos mediante la incubación de la

AgNO3-TLC con una película sensible y escaneado con un sistema de

análisis de imagen calibrado para la emisión del 14C (Personal Molecular

Imagen FX, Biorad, Madrid, Spain).


55

— Determinación de las actividades de β-oxidación de hepatocitos y

enterocitos.

De este modo, se trató de detectar preferencias del animal por un tipo de aceite en la

dieta y, además, conocer cómo ese aceite (su composición) afecta a los enzimas responsables

de su metabolismo (desaturasas y elongasas). A través de estos trabajos, de auto-selección y

metabólicos, es posible responder a las preguntas sobre qué “prefiere” comer el pez, cuánto y

cómo la composición de ese alimento afecta al metabolismo del animal y, por lo tanto, cuánto

se está forzando su maquinaria enzimática.

Finalmente, en la Discusión General de la presente Tesis Doctoral, los resultados

obtenidos de estos trabajos son discutidos dentro de la unidad temática establecida y extraídas

las principales conclusiones.


56

3.2. Instalaciones.

Para la realización de los experimentos que componen la presente Tesis Doctoral,

fueron usados los Laboratorios de Crononutrición de Peces del Departamento de Fisiología,

U.D. Fisiología Animal, situado en la Facultad de Biología de la Universidad de Murcia, así

como los Laboratorios del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agroalimentario

(IMIDA) de San Pedro del Pinatar, Murcia.

(a) (b)

Figura 6. Laboratorios empleados para llevar a cabo los experimentos que componen la presente Tesis Doctoral: (a)

Departamento de Fisiología de la Universidad de Murcia y (b) IMIDA San Pedro del Pinatar.

En los Laboratorios de Crononutrición de la Universidad de Murcia, se utilizó una

instalación consistente en tres líneas de quince acuarios de 60-l de capacidad cada una,

ubicados en un circuito cerrado de agua marina sintética. Cada línea es independiente del

resto, dotada con sistemas de filtración física (perlón + foam), química (carbón activo) y

biológica (biobolas + sustrato de microorganismos), lámpara ultravioleta, skimmer y sistemas

de aireación e iluminación individuales, basados en la existencia de soplantes y lámparas

temporizadas para cada acuario. Los parámetros físico-químicos del agua eran mantenidos

dentro de un rango de valores constante. La temperatura del agua fue mantenida mediante la


57

utilización de aire acondicionado en la sala y refrigeradores asociados a los tanques

reservorios (Figura 6a).

Los laboratorios del IMIDA de San Pedro del Pinatar utilizados consisten en hileras de

tanques troncocónicos ubicados en un circuito cerrado con renovación de agua marina (Figura

6b y 7). Estos tanques formaban parte de un sistema de recirculación dotado con filtros

biológicos, lámparas ultravioletas y un termostato para mantener una temperatura constante a

lo largo de todo el experimento. El flujo de agua era regulado de forma constante para

mantener unos niveles de saturación de oxígeno disuelto del 70%. Los animales eran

mantenidos con el fotoperiodo natural a temperatura constante.

(a) (b)

Figura 7. Fotografías del laboratorio del IMIDA de San Pedro del Pinatar donde fueron realizados los experimentos de

digestibilidad, selección de dietas completas encapsuladas, con diferente composición lipídica, y de sustitución de

aceites un tanque mostrando: (a) tanques en los que fue realizado el trabajo de digestibilidad y (b) válvulas del sistema

de decantación con el que estaban dotados los tanques.

Para los experimentos de selección de dietas encapsuladas, fueron usados tanques de

70-l donde los peces eran mantenidos de forma individual. Por su parte, los experimentos de

digestibilidad y alimentación con dietas completas granuladas con diferente fuente de grasa, se

realizaron en tanques de 360-l de capacidad con grupos de animales. Los tanques eran

provistos de flotadores para localizar las cápsulas (Figura 8).


58

3.3. Animales empleados.

Todos los experimentos fueron realizados con sargos picudos procedentes del criadero

de Valle Ca Zuliani Societa Agrícola S.R.L. (Pila di porto Tolle, Italia) y mantenidos en las

instalaciones del IMIDA de San Pedro del Pinatar.

(a) (b)

Figura 8. Fotografía de un tanque mostrando: (a) los comederos flotantes donde se situaba el alimento encapsulado;

(b) dibujo que muestra las diferentes modalidades en las que las cápsulas eran presentadas a los peces según el

experimento: en un solo flotador, en un triple comedero flotante o en dos.

3.4. Elaboración de dietas

En los experimentos de selección de dietas encapsuladas se utilizaron, dependiendo

de la fase experimental, una dieta completa granulada, una dieta completa encapsulada y

dietas de macronutrientes puros encapsulados, con las modificaciones relativas a los diferentes

experimentos (dilución proteica, dilución grasa, ayuno grasa, selección entre dietas completas

con diferente composición lipídica). En todos los experimentos, salvo en el de digestibilidad, se

emplearon los mismos ingredientes para elaborar las dietas y se hicieron análisis de

composición de macronutrientes, representados tal y como se muestra en la Tabla 2. Como

fuente proteica se utilizaron caseína libre de vitaminas y gelatina (5:1) y, como fuente de grasa,

aceite de hígado de bacalao y aceite de soja (3:1), los cuales se incluían en una matriz de sílice

coloidal con el objetivo de obtener una grasa sólida fácil de encapsular. La fuente de

carbohidratos utilizada fue la dextrina. Todas las dietas contenían suplementos vitamínicos y


59

minerales adecuados para la especie. En las dietas completas granuladas, se utilizaron la

celulosa y el alginato sódico como aglutinante. Para la dilución del contenido de proteína se

usó celulosa y para la dilución de la grasa, se aumentó la proporción de dióxido de sílice.

Tabla 2. Ingredientes y composición de las cápsulas por análisis aproximado de macronutrientes (n=4).

CD P F CH

Ingredientes del contenido de las cápsulas (g kg-1 peso seco)

Caseína 430 783 - -

Gelatina 90 157 - -

Aceite hígado bacalao 158 - 705 -

Aceite soja 52 - 235 -

Dextrina 210 - - 940

Vitaminas y minerales 20 20 20 20

CaCO3/CaPO4 40 40 40 40

Análisis aproximado de las cápsulas (% materia seca)

Materia seca 90,1 91,2 97,9 88,5

Proteína bruta 57,9 91,9 19,9 18,3

Extracto de éter 11,5 1,8 55,0 1,3

NFE 24,2 0,6 1,7 74,7

Cenizas 6,4 5,7 21,3 5,7

Energía bruta (kJ g-1) * 23,7 22,2 35,6 17,6

CD: Dieta Completa; P: proteína; F: grasa; CH: carbohidratos; NFE: Extracto Libre de Nitrógeno. *Calculado a partir de las medias de los porcentajes de macronutrientes usando los siguientes coeficientes de energía: 23,6 kJ g-1 para P; 38,9 kJ g-1 para F; y 16,7 kJ g-1 para CH (Miglavs y Jobling, 1989)

Las dietas encapsuladas fueron realizadas por rellenado de cápsulas de gelatina dura

de 0,2 ml de volumen, nº 4, (Roig Farma, Barcelona), con el polvo correspondiente a las

diferentes dietas experimentales, usando para ello una máquina encapsuladora semi-

automática (Tecnyfarma, Miranda de Ebro). Las cápsulas proporcionadas a un tanque dado

eran almacenadas refrigeradas en una misma bolsa para evitar cualquier efecto de posibles

contaminantes externos en la selección.


60

Para el experimento de digestibilidad se empleó una dieta comercial (Skretting D2

Excel) para dorada.

Para el experimento de sustitución del aceite de pescado por aceites vegetales, se

elaboraron dietas completas isoenergéticas, con un contenido lipídico del 20%, variando entre

ellas la fuente de lípido (aceite de hígado de bacalao: dieta FO; aceite de soja: dieta SO y

aceite de linaza; dieta LO). Para obtener la composición deseada se usó harina de pescado,

harina de trigo, gluten de trigo y una mezcla de vitaminas y minerales apropiada para la

especie. Los ingredientes fueron mezclados y las dietas granuladas por extrusión.

3.5. Análisis de las dietas

El análisis de la composición en macronutrientes de las dietas, se realizó mediante los

siguientes procedimientos: la humedad fue determinada mediante desecación de las muestras

a 110ºC durante 24 h hasta peso constante; la proteína cruda fue calculada por el método de

Kjeldahl, utilizando el factor 6,25 para la conversión de nitrógeno en proteína; la grasa cruda se

obtuvo por extracción con dietil éter; las cenizas por incineración a 450ºC durante 24 h hasta

peso constante y el porcentaje de extracto libre de nitrógeno (NFE) fue calculado por

sustracción de la suma de los porcentajes de proteína cruda, grasa cruda y cenizas.

A causa de la naturaleza proteica de las cápsulas, una vez que están rellenas,

aproximadamente el 18-20% de su composición, expresada como materia seca, se

corresponde con la proteína procedente de su pared (Tabla 2).

El contenido energético de las dietas fue calculado a partir del porcentaje medio de

macronutrientes, utilizando los siguientes coeficientes de energía: 23,6 kJ/g para proteína, 38,9

kJ/g para grasa y 16,7 kJ/g para carbohidratos (Miglavs y Jobling, 1989).


61


62


Las páginas 63-71 de esta Tesis Doctoral se corresponden con el trabajo “Almaida-Pagán, P.F.,

Rubio, V.C., Mendiola, P., de Costa, J., Madrid, J.A., 2006. Macronutrient selection trough post-ingetive signals in sharpsnout seabream fed on gelatina capsules and challenged with protein

dilution. Physiol. Behav. 88, 550—558.”, que se encuentra publicado en la revista Physiology and

Behavior y al cual se puede acceder on line a través del enlace:

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T0P‐4KBVVHG‐

1&_user=1595293&_coverDate=07%2F30%2F2006&_alid=1329181752&_rdoc=3&_fmt=high&

_orig=search&_cdi=4868&_sort=r&_st=4&_docanchor=&_ct=3&_acct=C000053930&_version

=1&_urlVersion=0&_userid=1595293&md5=9ef91bbe687226005aecf9572f052507


72



Seco-Rovira, V., Hernández, M.D., Madrid, J.A., de Costa, J., Mendiola, P., 2008. Energy intake and macronutrient selection in sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) challenged with fat dilution

and fat deprivation using encapsulated diets. Physiol. Behav. 93, 474-480.”, que se encuentra

publicado en la revista Physiology and Behavior y al cual se puede acceder on line a través del

enlace:

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T0P‐4PWF0S7‐



=1&_urlVersion=0&_userid=1595293&md5=dffae0a1fd96530cf91a14ab224b1646


80



Hernández, M.D., García García, B., Madrid, J.A., de Costa, J., Mendiola, P., 2007. Effects of total replacement of fish oil by vegetable oils on n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acid desaturation and elongation in sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) hepatocytes and enterocytes. Aquaculture

272, 589—598.”, que se encuentra publicado en la revista Aquaculture y al cual se puede

acceder on line a través del enlace:

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4D‐4PD4XB7‐



=1&_urlVersion=0&_userid=1595293&md5=c42b36b75e7d046b2e09ec7f47fb844a


91

SHARPSNOUT SEABREAM ( Diplodus puntazzo ) ABILITY FOR DIFFERENT OIL SOURCES

DISCRIMINATION USING ENCAPSULATED COMPLETE DIETS.

P.F. Almaida-Pagána,* , M.D. Hernándezb, J.A. Madrida, J. De Costaa & P. Mendiolaa.

aDepartment of Physiology. Faculty of Biology. University of Murcia. 30100 Murcia, Spain.

bIMIDA-Acuicultura, Consejería de Agricultura y Agua de la Región de Murcia, Apdo.65.30740, San Pedro

del Pinatar, Murcia, Spain.

* Corresponding author:

Present address: Department of Physiology.

Faculty of Biology, University of Murcia.

Campus de Espinardo, 30100 - Murcia.

Spain.

Phone: + 34-968-364 931

Fax: + 34-968-363 963

E-mail: [email protected]

Running title: Selection of encapsulated complete diets with different oils by sharpsnout

seabream.


92

Abstract.

Sharpsnout seabream ability for different oil sources discrimination was studied using

gelatine capsules containing complete diets, only differing in the origin of their fat content.

Twelve fish with an initial body weight of 330.8±45.0 g (mean±SD) were challenged to an

experiment in three experimental phases. In Phase 1 (Control, 29 days) fish were offered two

colours of capsules containing the same complete diet (CD) and placed separately. Afterthat,

capsules content was changed and fish were fed with the two capsules colours containing an

encapsulated complete diet with fish oil (FCD) and the same diet with cellulose substituting lipid

content (NFD), respectively (Phase 2, 32 days). Finally, in Phase 3, fish were divided in two

experimental groups, seven fish were fed on FCD diet plus the complete diet with linseed oil

(LNCD) and five animals on FCD diet plus soybean oil (SCD) during 28 days. Obtained results

showed sharpsnout seabream capacity for FCD and NFD discrimination. In Phase 2,

sharpsnout seabream increased their FCD capsules intake until reach a percentage of 66.8%,

changing their ingestion pattern with respect to Phase 1. During Phase 3 fish did not show any

significant preference for any of the experimental diets, showing similar intake percentages for

fish oil diet (FCD) and the vegetable oils ones (LNCD and SCD).Summarizing, fish were able to

discriminate when fat was absent from diet without using orosensorial information, associating

the colour of capsules with their post-ingestive and/or post-absorptive repercussions. With

vegetable oils diets (Phase 3), fish did not reject these alternative lipid sources, showing similar

intake percentages to those of FCD.

Keywords: sharpsnout seabream, fish, self-selection, gelatine capsules, post-ingestive

mechanisms, associative learning, vegetable oils, complete diets discrimination.


93

1. Introduction.

Sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo, Cetti 1777) is a promising species for

broadening the Mediterranean aquaculture. Previous studies have shown this sparid qualities to

be cultured as an alternative to gilthead seabream (Sparus aurata) and European sea bass

(Dicentrarchus labrax), the two most commonly farmed species in this region [1]. The

sharpsnout seabream omnivorous feeding habits [2,3], so as their lower protein dependence

and greater acceptance of vegetable proteins than carnivorous species [4] make them too an

interesting model to study the different mechanisms implied in food intake regulation.

Several works on fish self-feeding have been performed using self-feeders with

granulated diets [5-10] or encapsulated foods [11-16]. These protocols have shown that fish are

capable to defend a complete and balanced diet, perfectly matched to their physiological

demands and nutritional habits (carnivorous or omnivorous), when they are fed with pure and

separated macronutrients diets. Studies with encapsulated foods have demonstrated that

oropharyngeal information from food is not an essential factor for that regulation to occurs.

Moreover, by means of self-selection methodologies, fish preferences by different food sources

can be known and then characterizing fish ability to use different macronutrients.

In spite of their omnivorous habits, sharpsnout seabream show a high preference by

protein (62.7% protein, 21.3% carbohydrate and 16.0% fat) with a very strong ability to sustain

their level intake [10,11], only differing with carnivorous fish in sharpsnout seabream ability to

utilize vegetable origin proteins so as their ability to use carbohydrate as an energy source [17].

Moreover, in a recent study, it has been demonstrated that sharpsnout seabream is

capable to maintain energy intake so as macronutrient selection pattern with very low fat

quantities and, only when fat is totally deprived, fish respond increasing protein and

carbohydrate intake [12].

Encapsulation methodology can provide an important information in relation to current

search of vegetable alternatives to fish oils for farmed fish diets, one of the most important

challenges for aquaculture to be sustainable [18].

Using encapsulated diets, it is possible to avoid the interference of substances rejected

by fish due to their palatability and analyze fish ability to discriminate and select among diets


94

containing fish oil (FCD) and fat deprived diet (NFD) or different plant oils: soybean oil (SCD)

and linseed oil (LNCD).

In previous studies performed in rainbow trout with pelleted diets [19,20], it was

demonstrated fish ability for distinguishing a diet containing fish oil from a diet containing a plant

oil. Rainbow trout have a general preference for the fish oil diet and from the three vegetable

oils tested, linseed oil was the most avoided, followed by sunflower oil and rapeseed oil. Thus,

with sea bass, Luz et al. demonstrated this species capacity to get this discrimination, being

soybean and rapeseed oils the most selected vegetable oils [21]. However, in these studies

conducted with pelleted diets is not possible to exclude diets sensorial characteristics

interference and further works are necessary.

The main aims of present study were firstly to analyze sharpsnout seabream ability for

distinguishing between fish oil and fat deprived diets (FCD vs. NFD), associating the colour of

the capsules to the nutritive value of their content. The other objective was to study fish ability

for different origin oils discrimination using encapsulated complete diets in order to avoid food

orosensorial characteristics interference. This methodology let us to study fish self-selection

based in nutritional utilization of the diets and connect behavioural works with those involved in

metabolic use of diet components.


95

2. Materials and methods.

1.4. Animal housing.

This experiment was carried out at the IMIDA aquaculture facilities (San Pedro del

Pinatar, Murcia) on sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo C.) hatched and raised at Valle

Ca Zuliani Societa Agrícola S.R.L. (Pila di Porto Tolle, Italy). Fish were allowed to acclimatize in

raceway-type open circuit seawater in 93-l tanks, feeding on commercial diet manufactured for

gilthead seabream (Skretting D2 Excel). Afterwards, fish were located individually in 70-l

cylindro-conical tanks supplied with running seawater (salinity: 37g/l; NO2-:<0.1 mg/l; NO3

- :<0.1

mg/l; NH3:<0.5 mg/l; pH:7.7). The tanks were equipped with a recirculating system that included

biological filtration, an ultraviolet lamp, and a thermostat to ensure a constant temperature

(21±1ºC). The water flow was regulated to maintain dissolved oxygen at 70% of the saturation

level. The animals were subjected to a natural photoperiod, and were allowed to consume

experimental diets (Table 1) once a day, six days a week. The experiment lasted 90 days (from

October to January). The fish were weighed at the beginning and at the end of the experiment.

Encapsulated diets manufacture.

Fish were allowed to acclimate to encapsulated diets, during which time they were fed a

standard complete diet (CD), packaged into gelatin capsules of two different colours (yellow and

orange), containing the macronutrient proportions self-selected by them in previous published

experiments: 57.9% P, 24.2% CH and 11.5% F. After that, sharpsnout seabream were

challenged to lipid source discrimination in three different experimental Phases in which the

same proportions of macronutrients were used with the only difference of the lipid source used:

fish oil and soybean oil (3:1) in CD, fish oil in FCD, no fat in NFD, soybean oil in SCD and

linseed oil in LNCD (see Table 1). Vitamin-free casein and gelatin (5:1) were included as P

source, and dextrin as CH source. All diets included mixtures of vitamins and minerals, as well

as sodium alginate and cellulose as binder and filler, respectively.


96

Encapsulated diets were made by filling nº. 4, 0.2-ml gelatin capsules (Roig Farma,

S.A., Barcelona, Spain) with the respective powdered diets (CD, FCD, NFD, SCD and LNCD),

using a semi-automatic encapsulator (Tecnyfarma, Miranda de Ebro, Spain). All capsules

supplied to a given tank were first stored in a single bag for at least 10 days, in order to prevent

the fish from distinguishing their contents based on the chemical properties of any potential

external contamination.

Diet moisture was determined by drying samples for 24 h at 110ºC to constant weight.

Crude protein was calculated using the Kjeldahl method (N x 6.25%), crude fat by means of

diethyl ether extraction, ash by heating at 450ºC for 24 h, and nitrogen free extract (NFE) as the

remainder of crude protein + crude fat + ash.

Experimental design.

The same twelve individually located fish, with an initial body weight of 330.8±45.0 g

(mean±SD), were subjected to three consecutive experimental phases, whole experiment

lasting for 90 days, as shown in Figure 1. In Phase 1, fish were fed once a day with the same

standard complete diet (CD) packaged into two different colours of capsules (yellow and

orange) placed separately in two floating containers. Capsules were made available in the water

from 12:00 to 12:30 h and food intake was calculated by counting the remaining uneaten

capsules. This phase lasted 29 days and was designed as a control phase in which fish

reached a steady energy intake. The same colour-diet relationship was maintained in a given

tank throughout all the experimental phases, but this relationship was balanced between the

tanks.

In Phase 2, which lasted for 32 days, fish were fed with the two colours of capsules

containing a complete diet with fish oil as only lipid source (FCD) or a not fat diet (NFD), with the

same protein and carbohydrates proportions but with cellulose replacing lipid proportion. This

phase was a first step to analyze sharpsnout seabream ability to discriminate between diets

with the highest difference in lipidic composition, FCD and NFD. Finally, in Phase 3 fish were

separated in two experimental groups during 28 days (Figure 1). One of them had to select


97

between fish oil diet (FCD) or soybean oil diet (SCD) (n=5), the other one was fed with the two

colours of capsules with FCD or linseed oil diet (LNCD), respectively (n=7). It was analyzed if

sharpsnout seabream were able to discriminate between encapsulated complete diets only

differing in their lipidic fraction composition (fish oil vs. vegetable oils).

The fish were weighed at the beginning and at the end of the experiment.

Data analysis.

Gross energy intake (GE) was estimated using the following coefficients: 23.6 kJ/g for P,

38.9 kJ/g for F and 16.7 kJ/g for CH [22], and was expressed as kJ/100g BW/day.

Statistical differences between daily intake means from Phases 2 and 3, % FCD ingestion

from Phases 1 and 2, FCD and vegetable oils diets (LNCD or SCD) intake percentages from

Phase 3, were contrasted using a paired samples t-test.

Statistical analysis was performed using SPSS, version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL.).


98

3. Results.

Fish challenged to an adaptation period in which they were fed with the same standard

complete diet (CD) packaged in two colours of capsules (orange and yellow) placed

separately (Figure 1), quickly begun to increase the number of capsules intake since the

very first day they were offered to them. However, after the first three weeks, daily energy

intake decreased and mean values reached 5.2±0.9 kJ/100 gBW (end of Phase 1) due to

an accidental temperature decrease. When it was corrected, energy intake increased again

and reached a mean value of 8.9±2.3 kJ/100 gBW (end of Phase 2)(Figure 2).

in Phase 3, sharpsnout seabream were assigned to two experimental groups in which

fish oil diet (FCD) plus one of the plant oils diets, soybean oil diet (SCD) or linseed oil diet

(LNCD), were provided packed separately in gelatine capsules (yellow and orange): seven

fish were fed with FCD and LNCD, while other five animals were supplied with FCD and

SCD (Figure 1). Daily energy intake did not significantly changed respect Phase 2,

maintaining values of 11.3±3.0 and 10.2±5.9 kJ/100 gBW, respectively for LNCD group

(P=0.324), and 8.9±2.7 and 7.7±4.4 kJ/100 gBW, respectively for SCD group (P=0.653)

(Figures 3 and 4).

In all experimental Phases data were represented to show possible selection patterns.

When fish were fed with CD (Phase 1), the selection pattern obtained was used as control

to compare with the follow experimental phases. When fish could choose between fish oil

complete diet (FCD) and free-fat diet (NFD) (Phase 2), they changed this previous pattern,

increasing their selection percentage of FCD (in grams) until 66.8%, clearly different to that

calculated from the end of Phase 1, 28.9 % FCD (P=0.001) (Figure 5).

Finally, in Phase 3, capsule intake patterns obtained were compared with those of the

end of Phases 1 and 2 in order to analyze if selection by fish was significantly different to

those of previous experimental phases. In first group (FCD vs. LNCD), fish maintained a

similar selection pattern during first week but this pattern changed since the second one,

showing a non significant difference between intake of two diets at the end of the

experiment (P=0.937) (Figure 6). In second group (FCD vs. SCD), fish changed previous


99

pattern since the very first day, showing a non significant preference by any of two

experimental diets during the last week (P=0.056) (Figure 7).

Fish were weighed at the beginning and at the end of experiment showing a body

weight increase through the experiment (90 days) of 40.0±91.6g (mean±SD).

5. Discussion.

Sharpsnout seabream are able to discriminate when fat is absent from diet (Phase 2)

and they do not reject alternative to fish oil diets. When they are challenged to select between

FCD and free-fat diet (NFD), fish mainly ingest FCD capsules reaching values of 66.8% (in

grams). Without using orosensorial information from diets, fish are able to distinguish between a

complete diet and a free-fat diet associating the colour of capsules with their post-ingestive

and/or post-absorptive consequences.

It has been previously pointed in fish [11,12] that receptors in the gastrointestinal tract

and associated organs may detect the energy and macronutrient content in the diet during

digestion, as it has been seen in mammals [23]. These receptors would trigger signals (neural

activity and active peptides) that inform to brain centers about the nutritional properties of the

food, and have influence on feeding behaviour.

Encapsulation methodology was used to analyze fish ability to discriminate among

complete diets made from different fat sources (Phase 3). When fish were fed with FCD

capsules plus encapsulated complete diets with one of the vegetable oils (SCD or LNCD), fish

reached very similar intake quantities for two colours of capsules, without mainly selecting any

of two experimental diets (FCD versus SCD, FCD versus LNCD) after 28 days.

Due encapsulation avoids orosensorial properties from diets, feds self-selection by fish

only can occur through post-ingestive signals, not being affected by presence of substances

rejected by animals at oropharyngeal level. Present results point to post-ingestive signals for not

producing discriminatory responses in sharpsnout seabream fed on fish oil diet plus one of the


100

plant oils diets and remarks the role played by feeds palatability in short-term selection of

different oils diets by fish.

Moreover, these data could confirm the secondary role played by fat in sharpsnout

seabream food intake regulation, a species with a similar protein preference to that of

carnivorous [4,8]. In spite of their omnivorous habits [2,3], it has been demonstrated sharpsnout

seabream inability for C18 fatty acids (PUFA) desaturation and/or elongation to their

corresponding highly unsaturated fatty acids (HUFA) when they were challenged to total

substitution of fish oil by vegetable oils in their diet [24]. This is a similar characteristic to those

reported for carnivorous species like sea bass (Dicentrarchus labrax), gilthead seabream

(Sparus aurata) and turbot (Scophthalmus maximus) [25-31], which have an absolute dietary

requirement for C20 and C22 HUFA, presumably due to these marine species adaptation to a

carnivorous/piscivorous diet, naturally rich in n-3 and n-6 HUFA, that it would have resulted in

an evolutionary down-regulation of involved enzyme activities.

On the other hand, Piedecausa et al. [32] described that sharpsnout seabream tissues

reflect diet composition when fish oil is totally replaced by soybean or linseed oils and, in a

previous work, it was shown this species ability for energy intake regulation and macronutrient

selection with very low fat levels in diet (about 13%) [12]. Sharpsnout seabream appear for

being capable to preserve their fatty acid composition with both low fat concentrations and with

low HUFA levels in their diet [24]. This fact has been shown in others marine species like sea

bass and haddock where HUFAs are rapidly stored in tissue membranes while C18 PUFA act as

readily oxidative substrates [27,33].

Summarizing, these studies with encapsulated diets let us to avoid oropharyngeal

chemosensitivity interferences in self-selection studies. According to this, selection patterns

obtained with separate macronutrient diets would be near of representing the nutritional

requirements for the animals [15] and could connect traditional behavioural works, with pelleted

diets, and others about the metabolic utilization of food. When orosensorial information from

diets is absent, sharpsnout seabream are able to detect fat absence from diet, selecting the fish

oil complete diet (FCD) in a 66.8% (in grams). Differences between these diets produce a

discriminatory response in fish, based in their capacity to associate the post-ingestive effects of


101

diets with the colour of capsules. However, fish challenged to different oils discrimination, do not

discriminate and then fed next to 50% of their final diet in form of vegetal oil diet. All these data

point to the importance of diets palatability for short-term discrimination to occurs and

sharpsnout seabream´s capacity to supply its physiological demands in a long-term with very

low fat and HUFA levels in diet.

Acknowledgements

This research was supported by grants from CICYT (AGL2004-08137-CO4-02/ACU to JA

Madrid) and the “Ministerio de Educación y Ciencia (MEC)” (AP2002-1368 to P.F. Almaida-

Pagán). We are also grateful to the “Centro de Recursos Marinos (IMIDA) de San Pedro del

Pinatar” for kindly sharing their installations and providing the animals.


102

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106

Figure legends

Figure 1. Schematic drawing of the different experimental phases, according to the main

objectives and feeding conditions. The same fish were subjected to the different experimental

phases. Each Phase lasted the time necessary for the fish to reach a steady energy intake and

diets selection pattern, also considering the discomfort of the treatment for the animals. In all of

them, two colours of capsules (yellow and orange) were provided separately in two floating

containers. Phase 1 (29 days): adaptation to encapsulated complete diet (CD) to obtain daily

energy intake and possible capsule colour preferences. Phase 2 (FCD vs. NFD, 32 days):

sharpsnout seabream ability to discriminate between the diets with the highest difference in

lipidic composition. Phase 3 (FCD vs. Vegetable oils diets, 28 days): fish capacity to different oil

sources discrimination.

Figure 2. Average daily energy intake (kJ/100 gBW) of sharpsnout seabream fed two colours of

capsules placed separately in two floating containers and containing both the same standard

complete diet (CD vs. CD, Phase 1) or fish oil complete diet versus free-fat diet (FCD vs. NFD,

Phase 2). Values represent the meanS.E.M of 12 fish. Horizontal arrows represent

temperature values throughout the experimental phases.


capsules containing fish oil diet (FCD) versus free-fat diet (NFD) (Phase 2) or FCD versus

linseed oil diet (LNCD) (Phase 3). Values represent the mean S.E.M of 12 fish in Phase 2 and

7 fish in Phase 3.


capsules containing fish oil diet (FCD) versus free-fat diet (NFD) (Phase 2) or FCD versus

soybean oil diet (SCD) (Phase 3). Values represent the mean S.E.M of 12 fish in Phase 2 and

5 fish in Phase 3.


107

Figure 5. Food intake expressed as percentage of weight in grams for sharpsnout seabream fed

two colours of capsules containing both a standard complete diet (Phase 1) or fish oil complete

diet (FCD) versus free-fat diet (NFD) (Phase 2). Horizontal lines represent each diet intake

means for the corresponding days (indicated by their length). Values represent the

meanS.E.M of 12 fish.


two colours of capsules containing both a standard complete diet (Phase 1), fish oil complete

diet (FCD) versus free-fat diet (NFD) (Phase 2) or FCD versus linseed oil diet (LNCD) (Phase

3). Values represent the meanS.E.M of 12 fish from the last week of Phase 1 and 2 as

controls; and the meanS.E.M of. 7 fish throughout entire Phase 3. Horizontal lines represent

each diet intake means for the corresponding days (indicated by their length).


two colours of capsules containing both a standard complete diet (Phase 1), fish oil complete

diet (FCD) versus free-fat diet (NFD) (Phase 2) or FCD versus soybean oil diet (SCD) (Phase

3). Values represent the meanS.E.M of 12 fish from the last week of Phase 1 and 2 as

controls; and the meanS.E.M of. 5 fish throughout entire Phase 3. Horizontal lines represent

each diet intake means for the corresponding days (indicated by their length).


108

Table 1. Ingredients and capsule composition by proximate analysis (n=3).

CD FCD LNCD SCD NFD

Capsule content ingredients (g kg-1 dry weight)

Casein

391.4

391.4

391.4

391.4

391.4

Gelatin 78.3 78.3 78.3 78.3 78.3

Cod liver oil 104.1 138.8

Soybean oil 34.7 138.8

Linseed oil 138.8

Dextrin 130.5 130.5 130.5 130.5 130.5

Minerals y Vitamins 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0

Cellulose 155.0 155.0 155.0 155.0 293.8

Sodium alginate 46.0 46.0 46.0 46.0 46.0

CaCO3/CaPO4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0

Proximate analysis of the capsules (% dry matter)

Dry matter

90.1

91.3

89.9

88.5

92.1

Gross protein 57.9 55.6 58.9 56.2 57.5

Ether extract 11.5 12.7 12.6 13.3 1.1

NFE 24.2 26.3 22.9 24.4 35.6

Ash 6.4 5.4 5.6 6.1 5.8

Gross energy (kJ g-1) * 22.2 22.5 22.6 22.5 19.9

CD: Standard complete diet; FCD: Fish oil complete diet; LNCD: linseed oil complete diet; SCD: Soybean oil complete

diet; NFCD: No fat complete diet; NFE: Nitrogen-free extract.

*Calculated from the macronutrient percentage mean using the following energy coefficients: 23.6 kJ g-1 for P; 38.9 kJ g-

1 for F; and 16.7 kJ g-1 for CH [22].


109

Figure 1

PHASE 1(CONTROL)

CD : CD

(n=12)

PHASE 2(F vs. NF)

FCD : NFD

(n=12)

PHASE 3(F vs. VOs)

FCD : SCD

(n=5)

FCD : LNCD

(n=7)

Almaida-Pagán et al.


110

Figure 2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64

Time (days)

Ene

rgy

(kJ/

100g

BW

)

PHASE 1

CD vs. CD

PHASE 2

FCD vs. NFD

21ºC 18ºC 16ºC 21ºC



111

Figure 3

PHASE 3

FCD vs. LNCD

0

5

10

15

20

25

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33

Time (days)

Ene

rgy

(kJ/

100g

BW

)

PHASE 2

FCD vs. NFD



112

Figure 4

0

5

10

15

20

25

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33

Time (days)

Ene

rgy

(kJ/

100g

BW

)

PHASE 3

FCD vs. SCD

PHASE 2

FCD vs. NFD



113

Figure 5

0102030405060708090

100

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Time (days)

Foo

d in

take

(%

g)

NFCD

FCD

M

Mn

PHASE 1

CD vs. CD

PHASE 2

FCD vs. NFD

NFD



114

Figure 6

PHASE 1

CD vs. CD

PHASE 3

FCD vs. LNCD

PHASE 2

FCD vs. NFD

0102030405060708090

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Time (days)

Food

inta

ke (%

g)

FCD

M

LNCD

M



115

Figure 7

PHASE 1

CD vs. CD

PHASE 2

FCD vs. NFD

PHASE 3

FCD vs. SCD

0102030405060708090

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Time (days)

Food

inta

ke (%

g)

FCD

M

SCD

M



116


117


118


119

Una vez presentados los artículos que componen la presente Tesis Doctoral, cada cual con

su correspondiente discusión, se trata en este apartado de realizar un ejercicio de integración

para continuar con la línea argumental propuesta, reflejo de la unidad temática propia del

presente trabajo, donde los artículos aportados se incorporen para extraer nuevas conclusiones

en relación con las cuestiones planteadas al principio y, a partir de ahí, ubicarnos ante una

nueva situación que orientaremos hacia distintas posibilidades de futuro.

A lo largo de esta memoria y, haciendo honor al título de la Tesis, se trata de abordar no

sólo la caracterización de los mecanismos implicados en el control de la ingesta en peces, sino

que se introduce el término de potencial regulador de la ingesta, algo muy importante dada la

situación actual de la acuicultura, en la que la búsqueda de alternativas a las harinas y aceites

de pescado utilizadas tradicionalmente, constituye uno de los grandes retos a corto plazo. En

este sentido, se trata de estudiar en primer lugar, el hábitat de la especie, así como las fuentes

de alimento propias de éste, algo que servirá para entender el comportamiento alimentario del

animal y profundizar en el conocimiento de los mecanismos de regulación con que enfrenta las

distintas situaciones experimentales. En segundo lugar, los estudios de comportamiento

alimentario (Artículos 1, 2 y 4) nos permiten indagar en los mecanismos que operan en el

control de la ingesta de alimento en peces, conocer las preferencias por las distintas dietas de

los animales y llegar, incluso, a acercarnos a los requerimientos nutricionales de una especie.

Finalmente, la introducción de estudios metabólicos (Artículo 3), permite caracterizar el

funcionamiento de la maquinaria enzimática de la especie en presencia de diferentes fuentes

de alimento. Agregar ese componente metabólico es fundamental para entender cuánto se

fuerza al animal con cada cambio de dieta y cómo ésta puede afectar a los tejidos de la

especie a medio y largo plazo.

La especie elegida para llevar a cabo esta caracterización del potencial metabólico y

regulador de la ingesta, fue el sargo picudo, una especie que, por su carácter omnívoro (Sala y

Ballesteros, 1999; Mena Sellés y García García, 2002), constituye un magnífico modelo para

llevar a cabo estudios de comportamiento alimentario pero, sobre todo, se trata de un buen


120

modelo para indagar en esa “potencialidad” para ser alimentado con distintas fuentes

nutricionales.

5.1. Estudios de comportamiento alimentario.

Los trabajos realizados acerca del comportamiento alimentario del sargo picudo (Artículos

1, 2 y 4), ponen de manifiesto la extraordinaria capacidad de los peces para defender una dieta

completa adaptada a sus necesidades nutricionales, aún cuando son sometidos a las más

exigentes condiciones experimentales, apuntando a que estos mecanismos en los peces no

difieren en complejidad de los, mejor estudiados, de mamíferos.

A su vez, estos estudios remarcan el carácter multifactorial de la regulación de la ingesta

de alimento en peces, donde el componente energético de la dieta es sólo uno de los factores

participantes. La técnica de encapsulación de alimento se ha unido a las metodologías de

alimentación auto-demanda en peces, permitiendo profundizar en el conocimiento de los

mecanismos reguladores de la ingesta. La utilización de dietas encapsuladas abre una nueva

perspectiva para enfocar la regulación de la ingesta y permite apreciar con claridad la enorme

complejidad de mecanismos que subyacen en tal proceso.

5.1.1. Utilización de dietas de macronutrientes puros.

En el Artículo 1 de esta Tesis, se puso de manifiesto que el sargo picudo constituye un

buen modelo para la alimentación con dietas encapsuladas, lo cual abrió la posibilidad de llevar

a cabo toda una serie de experimentos que completaran el conocimiento cosechado con el

empleo de otras metodologías de alimentación auto-demanda (Aranda et al., 2000, 2001; Rubio

et al., 2003, 2004, 2005, 2006; Sánchez-Vázquez et al., 1998, 1999, Torrejón Atienza et al.,

2004; Vivas et al., 2006), las cuales han permitido estudiar la capacidad de los peces para

seleccionar entre distintas fuentes de alimento y observar hasta dónde pueden llegar en el


121

mantenimiento de una dieta completa que se adapta perfectamente a sus necesidades

nutricionales, así como a sus hábitos alimentarios.

La utilización de esta metodología basada en la encapsulación del alimento para peces,

hizo posible la utilización de dietas de macronutrientes puros, algo complicado con dietas

granuladas. De este modo, se puso de manifiesto que la regulación de la ingesta tiene lugar,

también, a nivel de nutriente, y que la composición cualitativa (concentración relativa de los

diferentes macronutrientes) de la dieta supone un factor de suficiente envergadura como para

ser tenido muy en cuenta. Es más, los resultados obtenidos usando esta metodología,

demuestran que los factores orosensoriales de la dieta no son imprescindibles para que esta

regulación tenga lugar y que, por lo tanto, esa cascada de mecanismos fisiológicos que hemos

mencionado anteriormente, puede comenzar a través de señales activadas a nivel post-

ingestivo y/o post-absortivo (Artículo 1).

El sargo picudo fue capaz de seleccionar entre las dietas de macronutrientes puros,

componiendo una dieta completa muy rica en proteína (62,7% proteína, 21,3% carbohidratos y

16,0% grasa) que defendió a lo largo de las distintas fases experimentales. En peces, con la

excepción del carpín dorado, especie omnívora, se ha observado que la proteína es el

macronutriente seleccionado en mayor proporción, tanto en experimentos utilizando dietas

granuladas (Aranda et al., 2000, 2001; Sánchez-Vázquez et al., 1999; Torrejón Atienza et al.,

2004; Vivas et al., 2006; Yamamoto et al., 2001) como encapsuladas (Rubio et al., 2003, 2004,

2005, 2006). Además, en el segundo experimento del Artículo 1 de la presente Tesis, se

observó cómo el sargo picudo, compensaba la reducción del contenido proteico de las

cápsulas correspondientes, incrementando su ingesta de cápsulas de proteína, lo cual apunta a

que la ingesta de proteína está fuertemente regulada en peces marinos, tanto en los carnívoros

como en los omnívoros. Y es que, precisamente en los animales omnívoros, la ingesta de

proteína debe estar más finamente regulada que en los carnívoros, puesto que la dieta de

éstos es, en cierto modo, un seguro de cantidad y calidad de proteina. Respecto a la grasa y

los carbohidratos, los peces marinos mantienen unos porcentajes de selección relativamente


122

cercanos, pareciendo existir para estos dos macronutrientes, un sistema de regulación más

débil. En el Artículo 2 de esta Tesis, el sargo picudo no cambió su comportamiento alimentario

cuando se le sometió a la dilución del contenido de grasa de las cápsulas de este

macronutriente y sólo cuando las cápsulas de grasa fueron completamente retiradas, los

animales respondieron incrementando su ingesta, tanto de proteína como de carbohidratos.

La utilización de dietas de macronutrientes puros permitió, a su vez, observar la

existencia de mecanismos de regulación específicos de nutriente , mecanismos que ya han

sido observados en mamíferos (Gietzen, 2000; Simpson y Raubenheimer, 2000; Smith et al.,

1999) y que podrían estar actuando también en peces. En la Introducción General de la

presente memoria, se hacía referencia a que estos mecanismos nutriente-específicos podían

actuar a cuatro niveles distintos (orosensoriales, gastrointestinales y órganos asociados,

neurales y efectores) y se señalaban las posibles vías a través de las cuales podían operar. No

obstante, es muy complicado pretender que la comprensión de los mecanismos a través de los

cuales los nutrientes actúan sobre la función endocrina en peces, nos permita formular dietas

que activen estos sistemas endocrinos, debido fundamentalmente a la naturaleza multifactorial

de dichos sistemas (MacKenzie et al., 1998).

Bass et al. (1992) han identificado al menos 10 localizaciones sensibles a aminoácidos

concretos en el eje GH-IGFs de mamíferos, desde el hipotálamo hasta los receptores de IGFs.

Dentro de cualquier sistema endocrino, coexisten múltiples puntos para la regulación, incluidos

la síntesis de la hormona, su liberación, transporte vascular, metabolismo periférico, unión a

receptor, aclarado y regulación neural (Eales, 1985). En peces, la mayoría de los estudios

están enfocados hacia una pequeña parte de este sistema, fundamentalmente hacia los niveles

de hormona en sangre y su unión al receptor. Muy pocos estudios se han realizado acerca de

la función directa de un nutriente sobre un tejido endocrino, y los componentes específicos de

las dietas capaces de influir sobre la función endocrina no han sido aún identificados para la

mayoría de las hormonas. A pesar de eso, existe un número de mecanismos potenciales a

través de los cuales los nutrientes podrían actuar sobre la función endocrina en peces. La


123

Tabla 4 muestra estos mecanismos, ilustrando que la mayoría de los estudios en peces se han

centrado más en los efectos periféricos que en los efectos centrales (MacKenzie et al., 1998).

Tabla 4. Mecanismos potenciales a través de los cuales la glucosa, los aminoácidos y los ácidos grasos

pueden influir en la función endocrina en pecesa

a La mayoría de los mecanismos han sido identificados en estudios realizados en mamíferos. * Significa que existen evidencias de un mecanismo equivalente en peces (Modificado de MacKenzie et al., 1998).

La integración de todas estas señales culminaría en el establecimiento de un

comportamiento alimentario nutriente-específico o, lo que es lo mismo, una selección dietaria .

Como se ha indicado en la Introducción General, las premisas fundamentales para que tenga

lugar la selección dietaria son: a) existencia de una característica sensorial distintiva por parte

de la dieta y b) la existencia de mecanismos post-ingestivos específicos.

Mecanismos periféricos

Estimulación directa de la síntesis y secreción de la hormona (ej. Hormonas pancreáticas e

intestinales*).

Modulación de la disponibilidad del receptor a la hormona (receptor de GH en hígado*)

Alteración del transporte de la hormona y su eliminación (proteínas de unión a IGF

plasmáticas*).

Alteración del sistema de transducción de la señal en la célula diana (activación de GH en

células hepáticas*).

Efectos sobre la activación de la hormona (desyodación de la tiroxina en el hígado*).

Modulación de la producción de hormona tiroidea o pancreática por hormonas periféricas

estimuladas por nutriente (efectos de la insulina sobre la desyodación, CCK sobre la insulina).

Mecanismos centrales (SNC e hipófisis) Estimulación directa sobre la producción del neuropéptido regulador (NPY).

Proveyendo precursores para la síntesis de neurotransmisor (serotonina, dopamina).

Activación directa de la liberación hipofisiaria (GH*).

Modulación de la regulación hipotalámica sobre la producción hipofisiaria (TSH).

Estimulación autónoma nutriente-inducida de la secreción hormonal (Insulina).

Modulación de la producción hormonal en la hipófisis o el hipotálamo por hormonas

periféricas estimuladas por nutriente (CCK y GH, Insulina y NPY).


124

Dado que la inclusión de macronutrientes puros en cápsulas duras de gelatina conlleva

la eliminación de las diferencias quimiosensoriales y de textura de los mismos, evitando su

posible interferencia en la selección y, puesto que tal proceso sólo es posible si la dietas

presentan alguna propiedad química o física particular que pueda ser detectada por al animal

antes de proceder a su ingestión (Thibault y Booth, 1999), las dos únicas características que

podrían ser utilizadas por los peces para diferenciar entre las distintas dietas encapsuladas son

el color de las mismas y su localización en el tanque (Rubio, 2004). En el Artículo 1 de esta

Tesis fue demostrado, tal y como había ocurrido previamente con la lubina (Rubio et al. 2003),

que, de esas dos posibles señales externas, el color es la más importante para que la selección

tenga lugar, puesto que, al suministrar los tres tipos de cápsulas mezcladas en un mismo

flotador, ésta se mantiene.

Además, considerando que, en este tipo de experimentos, todas las características

externas de las dietas, salvo el color, son idénticas y que éste no constituye una característica

diferencial de los macronutrientes en la naturaleza, los peces deben desarrollar un aprendizaje

asociativo del tipo condicionado clásico (Pauloviano), para poder llevar a cabo la selección,

donde el tipo de macronutriente actúa como estímulo incondicionado y el color de la cápsula

como estímulo condicionado (Rubio et al., 2003).

Los animales deben ser capaces, por tanto, de asociar el color de las cápsulas con su

contenido, lo que implica necesariamente el análisis del contenido de las cápsulas mediante

algún mecanismo post-ingestivo. Si eliminamos la detección rostral y orofaríngea, permanecen

como posibilidades las señales nerviosas (quimiorreceptores del TGI), las concentraciones

circulantes de nutrientes, las señales metabólicas y las endocrinas (Rubio, 2004) que, en

cualquiera de los casos, estarían enviando información al cerebro del pez. Finalmente, sería el

cerebro quien conectaría ambas informaciones, la pre-ingestiva (color) con la post-ingestiva.

Una vez producida esta asociación, la selección puede ocurrir a dos escalas temporales

distintas: intraprandial e interprandial. La selección intraprandial únicamente es posible si las

comidas duran el tiempo suficiente para que los nutrientes puedan ser detectados en el TGI y/o


125

absorbidos. Para que se produzca la selección intraprandial los nutrientes deben estimular

receptores específicos del estómago y el intestino o, una vez absorbidos, ser detectados por

tejidos sensibles a sus niveles circulantes, o bien producir la liberación de hormonas de un

modo rápido que permita la decisión de seguir o no consumiendo un determinado tipo de

alimento (Thibault y Booth, 1999). En los experimentos realizados en esta Tesis, parece muy

complicado que este tipo de selección tenga lugar, debido a la corta duración de la comida

(treinta minutos) y a que la cápsula tarda en disolverse en el estómago y liberar su contenido.

Por lo tanto, la selección debe realizarse mayoritariamente a nivel interprandial , es decir, el

animal debe asociar los efectos post-ingestivos de una dieta ingerida en el pasado con las

señales pre-ingestivas que recibe en el presente, e integrar toda esa información con la que se

refiere al estado nutricional de su organismo y demás parámetros anteriormente citados. El

resultado será el establecimiento de una respuesta motora que definirá su comportamiento

ante las distintas dietas que se le ofrecen.

Estos mecanismos post-ingestivos son activados en presencia de los diferentes

macronutrientes y, sin la necesidad de la información quimiosensorial rostral y orofaríngea,

inician toda una cascada de señalización que abarca múltiples tejidos e informa al cerebro de la

composición nutricional de la dieta. Los animales presentan una alta capacidad para

discriminar el contenido de las diferentes dietas así como para detectar cambios en el

contenido de las cápsulas. El sargo picudo defiende la dieta seleccionada aunque sea

sometido a la dilución o al ayuno selectivos de un determinado macronutriente (Artículos 1 y 2),

permitiendo un mayor acercamiento a los requerimientos nutricionales de la especie, unos

requerimientos que, sin la interferencia de factores como el sabor, el olor o la textura de la

dieta, siguen acompañados de un comportamiento alimentario preciso, perfectamente

adaptado a las necesidades fisiológicas del animal.

Visto que esta metodología constituye una herramienta útil para llevar a cabo estudios

de selección en peces, aboliendo la influencia de la palatabilidad de las dietas, es posible

desarrollar nuevos experimentos para ampliar el conocimiento de los mecanismos específicos


126

de nutriente en esta especie, como podría ser el estudio del efecto de la administración de

distintos péptidos reguladores, o de inhibidores metabólicos, sobre la selección de

macronutrientes.

5.1.2. Utilización de dietas completas encapsuladas.

Como ya se ha mencionado, la incorporación de nuevas fuentes de proteína y de grasa

de origen vegetal constituye uno de los grandes retos a los que se enfrenta la acuicultura actual

con el fin de alcanzar la sostenibilidad. Recientemente, se han llevado a cabo estudios de

selección de dietas completas con diferentes fuentes de grasa en lubina y trucha arco iris

(Geurden et al., 2005; Luz et al., 2004), poniéndose de manifiesto la habilidad de ambas

especies para discriminar entre los distintos aceites empleados. Sin embargo, este tipo de

estudios nutricionales, enfocados en la búsqueda de fuentes alternativas, tanto de grasa como

de proteína, se pueden ver influidos por la presencia, en dichas fuentes, de sustancias

rechazadas por los peces, debido a su palatabilidad, lo que hace difícil diferenciar entre la

capacidad de los peces para aprovechar metabólicamente esos nutrientes y el rechazo que

generan las nuevas dietas. La encapsulación constituye un buen sistema para evitar la barrera

ingestiva en este tipo de estudios.

En el Artículo 4 de la presente Tesis Doctoral, se puso de manifiesto que, en ausencia

de las propiedades orosensoriales de las dietas completas, con distintos aceites como fuente

de grasa (aceite de pescado, aceite de soja y aceite de linaza), los animales se alimentan

indistintamente de cada una de ellas, por lo que, a corto plazo, los animales no rechazan

ninguna dieta. Con este tipo de protocolo experimental, además, sería posible, con tiempos

más largos de experimentación, indagar en la capacidad de los peces para seleccionar entre

estas dietas completas encapsuladas, estableciéndose un paso más en el análisis de los

mecanismos de regulación de la ingesta y selección dietaria, pues ya no estaríamos trabajando

a nivel de macronutriente sino de sus elementos constituyentes (aminoácidos, ácidos grasos).


127

5.2. Estudios metabólicos.

Los peces se pueden clasificar, según sus hábitos alimentarios, en animales

carnívoros/piscívoros y animales omnívoros, pudiendo ser, a su vez, y según su hábitat,

dulceacuícolas y marinos. De este modo, se hace referencia al tipo de dieta que ingieren en su

medio natural, que estará caracterizada, entre otros factores, por una composición más o

menos definida. Es lógico pensar que los peces asociados a un tipo de hábitat determinado, el

cual presentará unas fuentes de alimento disponibles peculiares, se hayan adaptado a la

óptima utilización de esos ingredientes y que su metabolismo refleje, en cierto modo, la

composición de su dieta. Por este motivo, a la hora de abordar la sustitución de unos

ingredientes por otros de la dieta, nos encontraremos con barreras constitutivas de la especie y

deberemos caracterizar las capacidades metabólicas de ésta para no perjudicar su bienestar y

su crecimiento.

La grasa de la dieta es utilizada por los peces, no sólo como sustrato energético, sino

también como fuente de ácidos grasos esenciales, por lo que, el tipo de aceite empleado en la

elaboración de una dieta para ellos, tiene que ser rico en ácidos grasos poliinsaturados de 18

carbonos (PUFA C18) con los que arrancan las principales series de ácidos grasos (n-3 y n-6)

(Figura 4). También debe contener ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), que suponen un

sustrato energético óptimo, y baja cantidad de ácidos grasos saturados (SAFA), ya que los

peces tienen problemas de digestibilidad con ellos (NCR, 1993; Storebakken, 2002). Los

aceites de pescado reúnen estas características, por lo que se han venido utilizando

tradicionalmente en acuicultura. También es importante la cantidad de lípido que se incorpora

en la dietas y, en esto, debemos distinguir entre animales carnívoros y omnívoros.

En los peces carnívoros, como es el caso de la lubina, existe una fuerte presión

evolutiva por asegurar un determinado aporte de proteína, sin el cual son incapaces de crecer y

regenerar sus tejidos de forma adecuada tras una agresión (Rubio, 2004). El siguiente

macronutriente en importancia para los animales carnívoros es la grasa. En dos estudios


128

realizados en la lubina, se observó que ésta necesita que la grasa esté presente en su dieta

para regular su ingesta (Rubio et al., 2005; Vivas et al., 2003). Estas especies parecen

presentar una deficiente utilización de los carbohidratos. Por este motivo, junto con sus altas

necesidades energéticas, una práctica generalizada durante años ha sido utilizar proporciones

muy elevadas de grasa en el pienso. Sin embargo, éste puede ser un hecho controvertido,

porque se han descrito algunos efectos secundarios, como una inhibición de la ingesta o un

engrasamiento excesivo y, por lo tanto, una deficiente calidad del filete (Johansen et al., 2003).

Además, se ha observado que las dietas ricas en grasa inhiben las rutas lipogénicas en peces

(Lin et al., 1977; Likimani y Wilson, 1982; Arnesen et al., 1993; Días et al., 1998), pudiendo

llegar a producir una inhibición casi total de las actividades de desaturación/elongación

responsables de la síntesis de ácidos grasos (Rollin et al., 2003). Otro efecto observado en

animales alimentados con dietas ricas en grasa, concretamente en trucha arco iris, es una

posible estimulación de la síntesis de la glucosa en el hígado (Panserat et al., 2002), lo cual

corroboraría la impresión general sobre la mala utilización de los carbohidratos por parte de los

peces carnívoros.

En el caso del sargo picudo, considerado omnívoro (Sala y Ballesteros, 1999; Mena

Sellés y García García, 2002), aparece una mayor capacidad de utilización de los

carbohidratos de la dieta (Hernández et al., 2001a), apreciándose que la verdadera diferencia

entre los animales marinos, carnívoros y omnívoros, no radica en sus preferencias por la

proteína de la dieta sino en la menor dependencia de estos últimos de la proteína de origen

animal, así como por su mayor habilidad para utilizar los CH como fuente de energía.

Según se obtuvo en el Artículo 2 de esta Tesis, el sargo manifiesta una menor

dependencia de la grasa, pudiendo regular su ingesta tras una fuerte dilución de la misma. Sólo

modificó su comportamiento alimentario cuando las cápsulas de grasa fueron completamente

retiradas de la dieta, incrementando rápidamente su ingesta total de energía así como de

proteína y carbohidratos.


129

En cuanto a las consecuencias metabólicas de la sustitución de aceites en el sargo

picudo, podríamos esperar que ocurriese algo parecido a lo observado con la proteína. El

carácter omnívoro de esta especie la convertía en un modelo muy interesante para caracterizar

su metabolismo lipídico, así como su respuesta ante el cambio de la composición de la grasa

de la dieta. No obstante, los resultados arrojados por esta Tesis (Artículo 3) no dejaron lugar a

dudas y el sargo picudo mostró un patrón metabólico propio de las especies marinas

carnívoras, con una deficiencia manifiesta de las actividades de desaturación/elongación en

dos de los tejidos más activos, el hígado y el tracto digestivo.

Aún así, a pesar de que las actividades de desaturación/elongación no se vieron

modificadas con la sustitución del aceite de pescado por aceites vegetales (soja y linaza), sí

que se pudo observar cierta respuesta del sargo picudo al cambio de aceites en la dieta. A

pesar de que los perfiles de ácidos grasos de los tejidos estudiados reflejaron la composición

de la dieta, los cambios observados, tanto en el hígado como en el tracto digestivo, resultaron

estar moderadamente atenuados después de un periodo de alimentación experimental de

nueve meses, al igual que se había observado con anterioridad en el músculo (Piedecausa et

al., 2007). Estos resultados apuntan, al igual que se ha observado en otras especies marinas,

hacia la existencia de una alta capacidad para conservar los ácidos grasos de alto número de

dobles enlaces (HUFA), que para ellos resultan esenciales, acudiendo a la oxidación del

exceso de PUFA C18 de la dieta, para obtener energía, así como, a la bioacumulación selectiva

de los HUFA (MacKenzie et al., 1998; Bell et al., 2001a,b, 2002; Turchini et al., 2003).

P.F. Almaida Pagán Tesis Doctoral 130

Tabla 5. Resumen de estudios realizados sobre la sustitución de aceites de pescado (FO) por aceites vegetales (VO) en peces.

Especies

dulceacuícolas

Efectos de la sustitución de FOs por VOs. Referencias

Salmónidos

Trucha arco iris.....

Sustitución total de FOs por aceite de soja, maíz, linaza o colza sin afectar el crecimiento.

Aumento de actividades desaturación/elongación.

Variaciones entre poblaciones de una misma especie, con diferentes hábitos alimentarios.

En peces alimentados con aceite de oliva, se intensifican actividades de desaturación.

En huevos y larvas, la inclusión de VOs modifica la composición de ácidos grasos pero sin

afectar el desarrollo reproductivo.

Bell et al., 1997, 2001a,b, 2002, 2003; Buzzi et al., 1996; Bencze Røra et al.,

2003; Caballero et al., 2002; Geurden et al., 2005, In Press; Labbe et al., 1993;

Menoyo, 2004; Olsen y Ringo, 1992; Richard et al., 2006a. Tocher et al., 1997;

2000, 2001, 2003; Torstensen et al., 2000; Zheng et al., 2004b.

Barbo africano Peces alimentados con dietas que contenían aceite de girasol y aceite de palma, mostraron

una ganancia de peso y una eficiencia de utilización de la dieta mayores que aquellos

alimentados con dietas que contenían aceite de bacalao.

La diferente composición de las dietas no afectó a los perfiles lipídicos del animal completo

ni del músculo.

Ng et al., 2004.

Bacalao de Murray Es posible sustituir una alta proporción del FO de la dieta usando dietas basadas en la

caseína.

Francis et al., 2006.

Especies

marinas

Rodaballo La sustitución total de FO por aceite de soja o linaza, no produjo efectos sobre la

composición del cuerpo completo del animal.

Bajo contenido lipídico del músculo (1-2%).

En hígado y músculo, altos niveles de LA en peces alimentados con aceite de soja y altos

niveles de LNA en peces alimentados con aceite de linaza

Baja actividad desaturasa/elongasa, sin diferencias entre grupos experimentales.

Después de un periodo de aclarado, se produjo un crecimiento similar en todos los grupos

pero los efectos de los VOs persistieron después de ocho semanas.

Bell et al., 1995; Mørkøre et al., 2007; Rodríguez et al., 2002; Regost et al., 2003.

P.F. Almaida Pagán Tesis Doctoral 131

Efectos de la sustitución de FOs por VOs. Referencias

Dorada Se ha conseguido una sustitución de los FOs por diversos VOs de hasta el 60% sin afectar al

crecimiento, aunque es más difícil de conseguir a largo plazo. Para esto, el contenido lipídico

de la dieta debe ser elevado.

Las desaturasas y elongasas no se ven afectadas por la sustitución.

El DHA y AA del músculo reflejan la composición de la dieta pero se recuperan después de

60 días de aclarado. El EPA se reduce más que éstos y no se recupera totalmente después

de un periodo de aclarado de 90 días.

Es posible alcanzar altos niveles de sustitución combinada de harina y aceites de pescado,

por fuentes vegetales.

Alexis, 1997; Benedito-Palos et al., 2007; Caballero et al., 2004; Izquierdo et al.,

2003, 2005; Kalogeropoulos et al., 1992; Montero et al., 2003.

Lubina En la sustitución parcial de FO por aceite de colza, linaza y oliva, no se observaron efectos

negativos sobre crecimiento y supervivencia.

Es posible la sustitución de hasta un 60% del FOs por aceite de soja o de linaza. La

sustitución a largo plazo afecta al crecimiento.

El hígado y el músculo reflejaron la composición de la dieta.

Sin estimulación de las desaturasas.

Después del aclarado de 14 semanas, la mayoría de los perfiles lipídicos fueron restaurados.

Montero et al., 2005; Mourente et al., 2005; Mourente y Bell, 2006; Mourente y

Dick., 2003; Parpoura y Alexis, 2001; Izquierdo et al.; 2003; Richard et al.,

2006b; Sargent et al., 1999; Tibaldi et al., 2006: Yldiz y Sener, 1997.

Rodaballo de cola

amarilla

Es posible la sustitución de hasta un 60% de FO por VOs sin afectar el crecimiento. Watanabe, 2002.


132

El seguimiento de las actividades enzimáticas implicadas en el metabolismo lipídico de

peces, así como la observación de los perfiles lipídicos de los principales tejidos del animal,

después de ser alimentados con dietas con diferente composición de ácidos grasos, constituye

, pues, una magnífica herramienta, no sólo para abordar la sustitución de los aceites de

pescado por aceites vegetales, sino también para seguir aprendiendo acerca de los

mecanismos que participan en el mantenimiento de las funciones del organismo y la

incorporación de nutrientes del medio. Este fue el primero de los trabajos de este tipo que fue

llevado a cabo por nuestro grupo, por lo que esta línea queda abierta a futuros experimentos en

los que se pretende una mayor caracterización de todos los procesos que culminan en la

composición lipídica de los principales tejidos del animal, ya sea por ser la porción comestible

de los mismos (músculo), como por lo activas que se muestran sus membranas (branquias,

cerebro). En esta caracterización, no sólo es posible trabajar a nivel de ácidos grasos

individuales, sino que existe toda una batería de técnicas de fraccionamiento y cromatográficas

que nos permiten obtener los perfiles de las diferentes clases lipídicas y, de este modo, saber

cuál es el destino de los diferentes ácidos grasos en el interior de la célula. Además, es posible

llevar a cabo medidas enzimáticas para obtener información acerca del estrés oxidativo que

sufren las células en especies que compensan la sustitución de aceites incrementando sus

actividades de desaturación/elongación, especialmente aquellas que se muestran más activas

en la transformación de ácidos grasos, como es el caso de los enterocitos y hepatocitos. Es

importante conocer hasta qué punto se está forzando al animal con la sustitución, así como el

efecto que este hecho podría tener sobre sus tejidos a medio y largo plazo.

La determinación del potencial metabólico de una especie, en lo que se refiere a la

utilización de los lípidos de la dieta, también está siendo abordada desde un punto de vista

genético. Los estudios sobre la sustitución de aceites en las dietas de piscifactoría, empiezan a

incluir perfiles de expresión de los genes involucrados en la síntesis de las desaturasas y

elongasas, perfiles que están siendo realizados para numerosas especies de peces marinos y

dulceacuícolas (Agaba et al., 2005; Zheng et al., 2004a) y que están ampliando enormemente

las posibilidades de actuación en este tema.


133

En definitiva, todos estos trabajos pueden ser utilizados de forma conjunta para llegar,

en última instancia, a la caracterización del potencial de la especie para ser alimentada con

diferentes dietas, variando su composición nutricional. Para ello, será importante tener en

cuenta que esa nueva dieta no debe ser rechazada por el animal, que pueda ser utilizada por

éste para suplir sus demandas fisiológicas y que, en el caso de que se fuerce la maquinaria

enzimática de la especie, que este hecho no produzca una degeneración de los factores que

determinan la salubridad del producto para el consumo humano.


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1. El sargo picudo es un buen modelo para el estudio de los mecanismos implicados en la

regulación de la ingesta, usando cápsulas de gelatina. En ausencia de la información

orosensorial de las dietas, esta especie es capaz de discriminar y seleccionar una dieta

completa a partir de macronutrientes puros encapsulados, desarrollando para ello un

aprendizaje asociativo entre los efectos post-ingestivos ocasionados por la ingesta de un

macronutriente y el color de la cápsula que lo contiene.

2. La encapsulación del alimento no ocasiona disminución en los coeficientes de digestibilidad

de las dietas y los macronutrientes y la gelatina de la cápsula puede ser considerada como

una fuente útil de proteína que es absorbida con facilidad por los animales.

3. El sargo picudo defiende una ingesta diaria de energía (17,4 kJ/100 gPC), así como un

patrón de selección de macronutrientes (62,7% proteína, 21,3% carbohidratos y 16,0%

grasa), estables. Al igual que ocurre en especies estrictamente carnívoras como la lubina o

la dorada, esta especie marina omnívora, selecciona una dieta eminentemente proteica,

sosteniendo una alta ingesta relativa de proteína tras una dilución del contenido de las

cápsulas de este macronutriente de cerca del 40%, manifestando una alta capacidad para

regular la ingesta de proteína.

4. La ingesta de grasa posee un papel secundario dentro de los mecanismos de regulación

del sargo picudo. La especie no muestra cambios en su comportamiento alimentario

cuando el contenido de grasa de las cápsulas es reducido en un 40% y, únicamente ante el

ayuno selectivo de este macronutriente, el animal responde aumentando la ingesta total de

energía y del número total de cápsulas. Este hecho pone de manifiesto que esta especie es

capaz de mantener sus funciones con concentraciones muy bajas de grasa en la dieta.

5. El sargo picudo es capaz de detectar la ausencia de grasa cuando es sometido a la

selección entre cápsulas con una dieta completa y cápsulas con la misma dieta, en la que


138

se ha sustituído la grasa por celulosa, manifestando una alta capacidad de asociación entre

los efectos post-ingestivos de éstas y el color de las cápsulas.

6. Cuando la especie es alimentada con dietas completas encapsuladas, conteniendo

diferentes fuentes de grasa, la cantidad seleccionada de cada dieta tiende a igualarse sin

aparecer preferencias por ninguna de ellas. La ausencia de los factores orosensoriales de

las dietas propicia que los peces puedan ingerir indistintamente dietas con fuentes

alternativas de grasa que, de otro modo, podrían ser rechazadas.

7. El sargo picudo es incapaz de compensar la diferencia de composición de los aceites

vegetales con respecto al aceite de pescado, mostrando actividades de

desaturación/elongación hepáticas y digestivas insignificantes. Los tejidos del animal

reflejan claramente la composición de las dietas, aunque el descenso en las

concentraciones de los principales ácidos grasos (ácido eicosapentaenoico, EPA, y ácido

docosahexahenoico, DHA) se ven atenuadas. La hipótesis más razonable para explicar

estos datos parece estar en la existencia de una gran capacidad para la bioacumulación de

los ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) en los peces marinos, así como para su

preservación de la β-oxidación, en detrimento de los ácidos grasos poliinsaturados de 18C

(PUFA C18), en exceso tras ingerir las dietas con aceites vegetales.


139

Conclusión general

El sargo picudo es capaz de componer, seleccionando entre preparaciones encapsuladas de

macronutrientes puros, una dieta completa y equilibrada que se ajusta a sus necesidades

fisiológicas, aún en ausencia de la información orosensorial del alimento. La técnica de

encapsulación ha permitido comprobar este último extremo, que resalta la complejidad de los

mecanismos implicados en la regulación de la ingesta en peces al implicar también, y de manera

relevante, a la información post-ingestiva. Los resultados obtenidos indican que esta especie

muestra una clara preferencia por la proteína de la dieta, a pesar de su carácter omnívoro, para

cuya ingesta presenta una alta capacidad de regulación, posiblemente debido a ese carácter

omnívoro. Sin embargo, los carbohidratos y la grasa parecen jugar un papel secundario en tal

regulación, apuntando hacia la existencia de mecanismos específicos de macronutriente que

actuarían por separado. Así pues, el perfil omnívoro de la especie estaría caracterizado por una

menor dependencia de la proteína de origen animal y una mayor aceptación de la proteína

vegetal, así como por una alta capacidad para la utilización de los carbohidratos de la dieta como

sustratos energéticos. Además, el sargo picudo manifiesta una gran capacidad para mantener

sus funciones en presencia, tanto de bajas concentraciones de grasa en la dieta, como de bajas

cantidades de HUFA, recurriendo en tales casos, no a un aumento de las actividades de

desaturación/elongación de ácidos grasos, sino a una alta bioconservación de los HUFA en

detrimento de los PUFA C18, que serían encaminados hacia la β-oxidación.


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1. Objetivos.

El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue profundizar en el

conocimiento de las pautas que rigen el comportamiento alimentario de los peces, relacionando

este tipo de información con la caracterización del metabolismo de macronutrientes que éstos

presentan. Con este fin, utilizamos una especie candidata para abrir el mercado piscícola del

mediterráneo, el sargo picudo (Diplodus puntazzo) que, por su condición omnívora, representa

un buen modelo para ampliar el estudio de los procesos de auto-selección de macronutrientes

en peces, así como para abordar la sustitución del aceite de pescado de las dietas de

piscifactoría por aceites vegetales.

Objetivos específicos de cada trabajo experimental

Art.1.1.

1. Comprobar la capacidad del sargo picudo para ser alimentado con dietas

encapsuladas.

2. Detectar posibles preferencias por el color o la posición de las cápsulas en el tanque.

3. Dilucidar la necesidad de las propiedades orosensoriales de la dieta para la

regulación de la ingesta de energía así como para la selección de macronutrientes en esta

especie.

Art.1.2.

Analizar la capacidad del sargo picudo para regular la ingesta de energía y

macronutrientes cuando es sometido a la dilución de la proteína con dietas encapsuladas.

Art.2.1.

Investigar el efecto de la dilución de grasa y el ayuno de grasa sobre la ingesta de

energía y el patrón de selección de macronutrientes encapsulados por parte del sargo picudo.


144

Art.2.2.

Validar la técnica de encapsulación mediante un estudio de digestibilidad.

Art.4.1.

Analizar la capacidad del sargo picudo para la discriminación y selección de dietas

completas encapsuladas que divergen en la presencia o no de grasa.

Art.4.2.

Determinar la habilidad del sargo picudo para la discriminación entre dietas completas

encapsuladas que difieren únicamente en la fuente de lípido.

Art.3.

Analizar el efecto de la sustitución total del aceite de pescado por aceites vegetales

sobre:

1. La composición de ácidos grasos de hepatocitos y enterocitos del

tracto digestivo,

2. Las actividades de desaturación/elongación de aislamientos

primarios de hepatocitos y enterocitos,

3. Las actividades de β-oxidación en hepatocitos y enterocitos del

sargo picudo.


145

2. Metodología.

2.1. Diseño experimental.

Mediante los diferentes trabajos experimentales que componen la presente Tesis

Doctoral, se siguió una línea argumental en la que se quiso resaltar las cualidades que hacen

del sargo picudo una especie de interés, no solo para abrir el mercado de especies cultivables

en el Mediterráneo, sino también, para llevar a cabo estudios metabólicos y de selección de

dietas que permitan seguir avanzando en el conocimiento de los mecanismos implicados en la

regulación de la ingesta en peces. Con este fin, se llevaron a cabo los diferentes trabajos

experimentales que componen los artículos incluidos en esta Tesis. Los artículos 1, 2 y 4 se

corresponden con trabajos realizados utilizando la técnica de empaquetado de dietas en el

interior de cápsulas de gelatina. Ésta metodología supone un paso adelante en lo que se

refiere a las técnicas de alimentación auto-demanda, ya que permite abolir de la selección las

caracteristicas orosensoriales de la dietas, que inevitablemente actúan con las dietas

granuladas.

En los Artículos 1 y 2 de esta Tesis, fue evaluada la capacidad del sargo picudo para

componer una dieta completa y equilibrada usando dietas de macronutrientes puros

encapsulados separadamente (Artículo 1, primera parte), así como analizar el potencial de la

especie para regular la ingesta de los diferentes macronutrientes tras la dilución del contenido

proteico de las cápsulas de proteína (Artículo 1, segunda parte), la dilución del contenido

lipídico de las cápsulas de grasa y el ayuno específico de grasa (Artículo 2, primera parte).

Así mismo, la segunda parte del Artículo 2 consistió en la validación de la metodología de

encapsulación mediante el análisis de los coeficientes de digestibilidad de dietas granuladas y

encapsuladas. Se trató de comprobar si el proceso de encapsulación modificaba la

digestibilidad de las dietas y, también, si la gelatina que compone la pared de las cápsulas

podía ser considerada como una fuente útil de proteína.


146

En un trabajo aún no publicado, los animales fueron sometidos a la discriminación entre

pares de dietas completas encapsuladas (Artículo 4). En un primer experimento, los animales

tenían que seleccionar entre una dieta completa con aceite de pescado como fuente de grasa

(FCD) y la misma dieta en la que el porcentaje correspondiente a la grasa había sido sustituido

por celulosa (NFD). En segundo lugar, se establecieron dos grupos a partir de los mismos

peces de la fase anterior, uno de los cuales fue alimentado con la dieta de aceite pescado

(FCD) y la misma dieta completa donde el contenido lipídico fue alcanzado con aceite de soja

(SCD), mientras que el otro fue alimentado con la dieta FCD y la misma dieta completa donde

se utilizó aceite de linaza como fuente de grasa (LNCD).

Por último, la información aportada por los trabajos de auto-selección, fue

complementada con un estudio acerca del metabolismo de lípidos de la especie, usando una

metodología consistente en el seguimiento de las actividades de desaturación/elongación

implicadas en la transformación de los ácidos grasos esenciales de 18C (PUFA C18), en sus

correspondientes derivados de cadenas más largas y con mayor número de dobles enlaces

(HUFA). La caracterización de las capacidades metabólicas de la especie y de cómo éstas

quedan reflejadas en la composición de los principales tejidos del animal, constituyen

elementos de gran importancia a la hora de interpretar los resultados aportados por los trabajos

anteriores, a la vez que proyectan los datos arrojados por la presente Tesis Doctoral hacia una

posible aplicación en la elaboración de dietas para la especie, bien adaptadas a sus

requerimientos y ajustadas a su potencial para compensar la posible introducción de

alternativas a las materias primas utilizadas tradicionalmente.

2.2. Animales empleados.

Se utilizaron sargos picudos procedentes del criadero de Valle Ca Zuliani Societa

Agrícola S.R.L. (Pila di porto Tolle, Italia) y mantenidos en las instalaciones del IMIDA de San

Pedro del Pinatar.


147

2.3. Instalaciones.

Los experimentos se realizaron en los Laboratorios de Crononutrición de Peces del

Departamento de Fisiología, U.D. Fisiología Animal, situados en la Facultad de Biología de la

Universidad de Murcia, así como en los Laboratorios del Instituto Murciano de Investigación y

Desarrollo Agroalimentario (IMIDA) de San Pedro del Pinatar, Murcia.


148

3. Resultados y Discusión.

Durante el primer experimento de esta Tesis Doctoral (Artículo 1), quedó demostrado que

el sargo es un buen modelo para ser alimentado con dietas encapsuladas. Casi desde el primer

día en que las cápsulas les fueron ofrecidas, los peces comenzaron a ingerirlas, tragándoselas

enteras, e incrementando progresivamente la ingesta diaria de energía hasta alcanzar unos

niveles constantes, así como un patrón de selección de macronutrientes estable. Este hecho

permitió continuar con el protocolo de encapsulación y desarrollar nuevas fases experimentales

en las que los animales fueron alimentados con tres dietas de macronutrientes puros

encapsulados individualmente y dispuestos en tres flotadores separados cuya posición era

rotada cada diez días o todas juntas en un mismo flotador, para abolir cualquier posible

influencia de la posición de las cápsulas. Incluso, la relación color de la cápsula-

macronutriente, que era mantenida para un mismo tanque a lo largo de todo el experimento,

fue alterada para demostrar que el factor fundamental en la selección era el contenido de las

cápsulas y no la posible existencia de preferencias innatas por el color.

Los peces alcanzaron y defendieron una dieta completa conformada por un 62,7% de

proteína (P), un 21,3% de carbohidrato (CH) y un 16,0% de grasa (F), muy similar a la obtenida

en un trabajo previo con dietas granuladas y comederos a demanda (Vivas et al., 2006). De

este modo, quedó demostrado que la regulación de la ingesta, no sólo ocurre a nivel

energético, sino también de los nutrientes que la integran y que las propiedades orosensoriales

de las dietas no constituyen el único factor para que dicha regulación tenga lugar. A su vez,

parece demostrada la existencia de mecanismos que estarían actuando a nivel post-ingestivo

y/o post-absortivo, probablemente involucrando señales nerviosas y péptidos reguladores en

una compleja red que implicaría al tracto gastrointestinal y vísceras asociadas, tejidos

periféricos y el sistema nervioso central. Esta información sería asociada por parte del animal

con el color de las cápsulas, estableciendo un aprendizaje asociativo que haría posible la

selección.


149

Cuando el contenido de las cápsulas que contenían la dieta de proteína pura fue

reducido en un 40% con celulosa, los peces siguieron manteniendo su ingesta de energía, así

como su patrón de selección, el cual defendieron incrementando su ingesta de cápsulas de

proteína (Artículo 1). Estos resultados pusieron de manifiesto la importancia de la proteína para

esta especie quien, a pesar de sus hábitos omnívoros (Sala y Ballesteros, 1997; Mena Sellés y

García García, 2002)y, posiblemente, debido a ellos, selecciona una dieta fundamentalmente

proteica, muy similar a aquella seleccionada por especies carnívoras como la lubina y la trucha

arco iris (Aranda et al., 2000; Sánchez-Vázquez et al., 1999).

El carácter omnívoro del sargo picudo no radicaría, por lo tanto, en una preferencia

menor por la proteína sino en un mayor desapego de la proteína animal y una mayor capacidad

para utilizar proteínas de origen vegetal, así como para usar los carbohidratos como fuente de

energía (Hernández et al., 2001a). Este hecho fue respaldado por los resultados del

experimento en el que el contenido de las cápsulas de grasa fue rebajado hasta el 13,4%,

incrementando la proporción de dióxido de sílice en la mezcla y donde, a continuación, los

peces fueron privados de las cápsulas de grasa (Artículo 2). Los resultados obtenidos

señalaron la capacidad del sargo de mantener sus funciones vitales con muy bajas cantidades

de grasa en la dieta. Únicamente cuando ésta fue retirada por completo, el animal respondió

incrementando la ingesta total de energía, así como el número de cápsulas ingeridas de

proteína y carbohidratos.

Como parte del Artículo 2 de la presente Tesis, fueron realizadas medidas de

digestibilidad de las dietas encapsuladas en contraposición a la de dietas granuladas. Los

resultados de estos análisis concluyeron que la encapsulación no produce alteraciones de la

digestibilidad de las dietas y apuntaron a que la gelatina de la pared de las cápsulas es una

proteína que es absorbida rápidamente por los peces y puede ser considerada como proteína

útil.


150

Siguiendo con la línea de regulación de la ingesta por parte del sargo picudo, se realizó

un nuevo experimento con dietas encapsuladas donde se analizó la capacidad de la especie

para discriminar entre una dieta completa encapsulada, con aceite de pescado como fuente de

grasa (FCD), y una dieta similar en la que se había sustituido la proporción correspondiente a

la grasa por celulosa (NFD). Los animales pusieron de manifiesto su capacidad de

discriminación, seleccionando la dieta FCD en un 66,8% (Artículo 4). En un segundo

experimento de este trabajo, los peces fueron separados en dos grupos en función de los pares

de dietas con que fueron alimentados. Uno de ellos fue alimentado con la dieta FCD y con una

dieta completa con aceite de soja (SCD), el otro con la dieta FCD y con una dieta completa con

aceite de linaza (LNCD). El resultado fue que los animales modificaron su patrón de selección

con respecto a la fase anterior (FCD vs. NFD) y comieron indistintamente ambos tipos de dietas

(FCD y dietas con aceites vegetales) demostrando que, si se eliminan los factores

orosensoriales de estas dietas, no existe rechazo por parte de los peces. Los animales, en el

tiempo que duró el experimento, no discriminaron entre los distintos aceites (a nivel de su

composición de ácidos grasos) algo que parece lógico basándonos en los resultados

anteriores, puesto que el sargo es capaz de mantener sus funciones vitales con muy bajas

concentraciones de grasa en su dieta.

Por último, se cambió por completo de metodología para llevar a cabo un trabajo más

aplicado, caracterizando la capacidad del sargo picudo para ser alimentado con dietas con

aceites vegetales. Se estudió la capacidad de la especie para compensar los cambios de

composición de los aceites vegetales con respecto al aceite de pescado. Los datos obtenidos

pusieron de manifiesto la incapacidad del sargo picudo para desaturar y elongar los PUFA C18 ,

abundantes en los aceites vegetales, hacia los correspondientes HUFA, necesarios para un

adecuado funcionamiento del organismo y para alcanzar un producto de alta calidad para el

consumo humano. No obstante, los perfiles de ácidos grasos obtenidos en los animales

alimentados con las dietas SCD y LNCD mostraron que, si bien reflejaban la composición de la

dieta, las concentraciones de PUFA C18 eran menores de las esperadas, mientras que ocurría

lo contrario con los HUFA. En otros estudios, se ha observado que los peces marinos


151

presentan una alta capacidad para preservar los HUFA de la β-oxidación, en detrimento del

exceso de PUFA C18 producido por la ingesta de aceites vegetales (Mourente et al., 2005).

En nuestro caso, las medidas de β-oxidación no arrojaron diferencias significativas salvo

para enterocitos inoculados con ácido [1-14C] linoleico procedentes de animales alimentados

con dieta de linaza con respecto de aquellos animales alimentados con dieta FCD.


152

4. Conclusiones.

1. El sargo picudo es un buen modelo para el estudio de los mecanismos implicados en la

regulación de la ingesta, usando cápsulas de gelatina. En ausencia de la información

orosensorial de las dietas, esta especie es capaz de discriminar y seleccionar una dieta

completa a partir de macronutrientes puros encapsulados, desarrollando para ello un

aprendizaje asociativo entre los efectos post-ingestivos ocasionados por la ingesta de un

macronutriente y el color de la cápsula que lo contiene.

2. La encapsulación del alimento no ocasiona disminución en los coeficientes de digestibilidad

de las dietas y los macronutrientes y la gelatina de la cápsula puede ser considerada como

una fuente útil de proteína que es absorbida con facilidad por los animales.

3. El sargo picudo defiende una ingesta diaria de energía (17,4 kJ/100 gPC), así como un

patrón de selección de macronutrientes (62,7% proteína, 21,3% carbohidratos y 16,0%

grasa), estables. Al igual que ocurre en especies estrictamente carnívoras como la lubina o

la dorada, esta especie marina omnívora, selecciona una dieta eminentemente proteica,

sosteniendo una alta ingesta relativa de proteína tras una dilución del contenido de las

cápsulas de este macronutriente de cerca del 40%, manifestando una alta capacidad para

regular la ingesta de proteína.

4. La ingesta de grasa posee un papel secundario dentro de los mecanismos de regulación

del sargo picudo. La especie no muestra cambios en su comportamiento alimentario

cuando el contenido de grasa de las cápsulas es reducido en un 40% y, únicamente ante el

ayuno selectivo de este macronutriente, el animal responde aumentando la ingesta total de

energía y del número total de cápsulas. Este hecho pone de manifiesto que esta especie es

capaz de mantener sus funciones con concentraciones muy bajas de grasa en la dieta.


153

5. El sargo picudo es capaz de detectar la ausencia de grasa cuando es sometido a la

selección entre cápsulas con una dieta completa y cápsulas con la misma dieta, en la que

se ha sustituído la grasa por celulosa, manifestando una alta capacidad de asociación entre

los efectos post-ingestivos de éstas y el color de las cápsulas.

6. Cuando la especie es alimentada con dietas completas encapsuladas, conteniendo

diferentes fuentes de grasa, la cantidad seleccionada de cada dieta tiende a igualarse sin

aparecer preferencias por ninguna de ellas. La ausencia de los factores orosensoriales de

las dietas propicia que los peces puedan ingerir indistintamente dietas con fuentes

alternativas de grasa que, de otro modo, podrían ser rechazadas.

7. El sargo picudo es incapaz de compensar la diferencia de composición de los aceites

vegetales con respecto al aceite de pescado, mostrando actividades de

desaturación/elongación hepáticas y digestivas insignificantes. Los tejidos del animal

reflejan claramente la composición de las dietas, aunque el descenso en las

concentraciones de los principales ácidos grasos (ácido eicosapentaenoico, EPA, y ácido

docosahexahenoico, DHA) se ven atenuadas. La hipótesis más razonable para explicar

estos datos parece estar en la existencia de una gran capacidad para la bioacumulación de

los ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) en los peces marinos, así como para su

preservación de la β-oxidación, en detrimento de los ácidos grasos poliinsaturados de 18C

(PUFA C18), en exceso tras ingerir las dietas con aceites vegetales.


154

Conclusión general

El sargo picudo es capaz de componer, seleccionando entre preparaciones encapsuladas de

macronutrientes puros, una dieta completa y equilibrada que se ajusta a sus necesidades

fisiológicas, aún en ausencia de la información orosensorial del alimento. La técnica de

encapsulación ha permitido comprobar este último extremo, que resalta la complejidad de los

mecanismos implicados en la regulación de la ingesta en peces al implicar también, y de manera

relevante, a la información post-ingestiva. Los resultados obtenidos indican que esta especie

muestra una clara preferencia por la proteína de la dieta, a pesar de su carácter omnívoro, para

cuya ingesta presenta una alta capacidad de regulación, posiblemente debido a ese carácter

omnívoro. Sin embargo, los carbohidratos y la grasa parecen jugar un papel secundario en tal

regulación, apuntando hacia la existencia de mecanismos específicos de macronutriente que

actuarían por separado. Así pues, el perfil omnívoro de la especie estaría caracterizado por una

menor dependencia de la proteína de origen animal y una mayor aceptación de la proteína

vegetal, así como por una alta capacidad para la utilización de los carbohidratos de la dieta como

sustratos energéticos. Además, el sargo picudo manifiesta una gran capacidad para mantener

sus funciones en presencia, tanto de bajas concentraciones de grasa en la dieta, como de bajas

cantidades de HUFA, recurriendo en tales casos, no a un aumento de las actividades de

desaturación/elongación de ácidos grasos, sino a una alta bioconservación de los HUFA en

detrimento de los PUFA C18, que serían encaminados hacia la β-oxidación.


155


156


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Producción científica

El contenido de la presente Tesis Doctoral ha dado lugar a la siguiente producción

científica:

1. Publicaciones:

1.1. Almaida-Pagán, P.F., Rubio, V.C., Mendiola, P., de Costa, J., Madrid, J.A., 2006.

Macronutrient selection trough post-ingetive signals in sharpsnout seabream fed on

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Sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) ability for different oil sources

discrimination using encapsulated complete diets. Enviado a Physiol. Behav.


174

2. Comunicaciones a Congresos:

2.1. Almaida-Pagán, P.F., Rubio, V.C., Madrid, J.A., Mendiola, P., de Costa, J.,

2004. Ability of sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) to select

macronutrient by feeding on gelatine capsules. Aquaculture Europe 2004,

“Biotechnologies for Quality”. Barcelona, España, Special Publication nº 34, pp.

112—113.

2.2. Almaida-Pagán, P.F., Seco-Rovira, V., Madrid, J.A., de Costa, J., Mendiola, P.,

2005. Selección de macronutrientes a través de señales postingestivas: Efecto

de la dilución de proteína, dilución de grasa y ayuno de grasa en el sargo

picudo (Diplodus puntazzo). X Congreso Nacional de Acuicultura, Gandía

(Valencia) 2005. Libro de Resúmenes, pp. 164—165.

2.3. Almaida-Pagán, P.F., Hernández, M.D., García García, B., Madrid, J.A., de

Costa, J., Mendiola, P., 2007. Efecto de la sustitución total de aceite de

pescado por aceites vegetales sobre las actividades de

desaturación/elongación de hígado y digestivo del sargo picudo (Diplodus

puntazzo). XI Congreso Nacional Acuicultura, Vigo 2007. Libro de Resúmenes,

pp. 1221—1224.

2.4. Seco-Rovira, V., Almaida-Pagán, P.F., de Costa, J., Mendiola, P., 2007. Efecto

de inhibidores metabólicos: Mercaptoacetato y 2-Desoxi-D-Glucosa, sobre la

ingesta de alimento en el carpín. XI Congreso Nacional Acuicultura, Vigo 2007.

Libro de Resúmenes, pp. 75—78.


175

3. Becas y contratos de investigación.

3.1. Beca de Postgrado para la Formación de Profesorado Universitario (FPU) del

Ministerio de Educación y Ciencia. Convocatoria 2002. Referencia: AP2002-

1368. Duración 4 años. Transcurridos tres años y cinco meses de la misma se

convirtió en el contrato que se señala a continuación.

3.2. Contrato de trabajo en prácticas con la Universidad de Murcia a través del

programa FPU del Ministerio de Educación y Ciencia. Duración: 7 meses.

3.3. Contrato de trabajo de duración determinada con la Universidad de Murcia para

la Colaboración en el Proyecto de Investigación “Red temática de investigación

cooperativa en envejecimiento y fragilidad. RETICEF”. Duración: 4 meses.

4. Participación en tareas docentes.

Participación en tareas docentes haciendo uso de la venia docendi del programa FPU del

Ministerio de Educación y Ciencia. 120 horas. 2004-06.

5. Estancias breves.

Estancia breve dentro del programa FPU del Ministerio de Educación y Ciencia, en el

Departamento de Biología Animal de la Facultad de Biología, Universidad de la Laguna,

Tenerife, con el fin de trabajar en técnicas de determinación de lípidos a partir de muestras

biológicas, así cómo de caracterización del metabolismo de ácidos grasos y seguimiento de

actividad desaturasa en peces. Mayo-Julio 2004.


176

Apéndice

1. Índice de impacto de las revistas donde han sido publicados los artículos que

componen esta Tesis Doctoral.


177

2. Autorización de los co-autores que han participado en las publicaciones.


178


179

Documents

P.F. Almaida Pagán Tesis Doctoral