Instituto Tecnolgico Superior de Abasolo
Fecha : 17/marzo/2015
Formato de prcticas de laboratorio
Nombre de la practicaMateriaCarrera Nmero de Alumnos
Tincin de GramBiotecnologa Ambiental IIng. Ambiental6
1.- Introduccin:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que
resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que
la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la
clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos
pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la
clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el
protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para las
bacterias la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y
alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas
que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con
el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de
tincin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen
alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
La tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans
Christian Gram, quien la desarrollo en 1884, es una tincin
diferencial, puesto que no tie igualmente todas las clulas. Sobre
la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, Gram + y Gram -.
Gram +: se tien de color violeta, esto se debe a que la pared
esta formada por una gruesa capa de peptidoglicano (un polmero
complejo de amino-azcares, tambin llamado murena).
Gram -: se tien de color rosado, la pared de estas bacterias
consiste en una capa delgada de peptidoglicano y una capa exterior,
la membrana externa con lipoprotenas y lipo-polisacridos. Debido a
esta estructura el primer colorante es extrado luego del lavado con
etanol, fijndose posteriormente el segundo colorante.
NOTAS: La solucin de Violeta cristal y Fucsina (o Safranina) son
irritantes en contacto con la piel, ojos y mucosas. La solucin de
alcohol-acetona y la solucin de Fucsina (safranina) son inflamables
por lo tanto se deben de tomar los cuidados requeridos para el
manejo de productos inflamables. El mal uso de la solucin
Alcohol-acetona puede llegar a decolorar los grmenes Gram +.
Cultivos y muestras viejas pueden dar resultados atpicos. Por ello
se recomienda usar muestras de 18 a 24 hrs como mximo o recientes.
Es importante controlar la fijacin por calor (dos o tres pasadas de
un segundo por llama suave), un exceso del mismo puede dar
coloraciones errneas. Agua altamente clorada puede debilitar la
coloracin de contraste.
2.- Objetivo:
Relacionar la practica con el tema de Aislamiento y
caracterizacin de moos de importancia ambiental visto en clase
Aprender una de las tcnicas de tincin ms utilizadas en el
laboratorio: la tincin de Gram Adquirir destreza en la realizacin
de observaciones microscpicas de moos. Apreciar de forma visibles
las diferentes formas microbianas Distinguir bacterias Gram + y
Gram
3.- Material:
Violeta Cristal (Violeta de genciana)LugolAlcohol Acetona
(80-20),se debe de preparar ya que no hay en el laboratorio, un
solo equipo puede hacerlo para todosFucsina bsica SafraninaAgua
destiladaAcetonaAlcohol del 96
Microscopio5Porta y cubreobjetos (por equipo)4 Pizetas4 Mechero
Bunsen con mangueraCronometro o timer4 Goteros (por equipo)2 Asas
bacteriolgicas(o palillos de dientes)1 Frasco de vidrio c/taparosca
para 100 mL(solo el equipo que va a preparar la solucin)1 Frasco de
vidrio c/taparosca para 25mL(por equipo)1 Probeta de 100
mLEtiquetas para marcarServilletasMuestras a utilizar:
yogurt,soful, yakult, saliva, alimento en descomposicin Encendedor
o cerillos
4.- Desarrollo de la prctica:
1.- Realizar un frotis: colocar una gota de agua destilada sobre
un portaobjetos limpio y desengrasado, enseguida con el asa
bacteriolgica previamente esterilizada tomar un alcuota de la
muestra y dispersarla sobre la gota de agua, dejar secar al aire
por 1 minuto. 2.- Posteriormente fijar por calor, para esto se pasa
3 veces, lentamente el lado inferior del portaobjetos (la parte del
frotis queda arriba) por la parte superior de la flama del
mechero.2.- Dejar enfriar por 1 minuto3.- Cubrir la preparacin
fijada en el portaobjetos con una o dos gotas de Cristal violeta
(Violeta de Genciana) y dejar secar al aire por 1 minuto.4.- Lavar
con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma
paulatina (de gota en gota), esto solo es para eliminar el exceso
de Cristal violeta que no se fijo5.- Dejar secar al aire, por 1
minuto6.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una
servilleta, solamente toca las gotas de agua (procura no tocar con
la servilleta el frotis)7.- Cubrir con una o dos gotas de lugol,
dejar secar al aire por 1 minuto8.- Lavar con agua destilada (usa
la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en gota),
solo es para eliminar el exceso de lugol que no se fijo9.- Dejar
secar al aire, por 1 minuto10.- Eliminar el exceso de agua, usando
el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas de agua
(procura no tocar con la servilleta el frotis)11.- Decolorar la
placa con Alcohol-acetona (80-20), durante 15 a 30 segundos hasta
que la placa decolore totalmente (usa otra pizeta para agregar la
solucin, de la misma forma ve agregando de gota en gota)12.- Lavar
con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma
paulatina (de gota en gota), solo es para eliminar el exceso de
Alcohol-acetona que no se fijo13.- Dejar secar al aire, por 1
minuto14.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una
servilleta y solamente toca las gotas de agua (procura no tocar con
la servilleta el frotis)15.- Cubrir la preparacin con Fucsina bsica
(o Safranina), dejar secar al aire por 1 minuto.16.- Lavar con agua
destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de
gota en gota), solo es para eliminar el exceso de Fucsina bsica (o
Safranina), que no se fijo17.- Dejar secar al aire, por 1
minuto18.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una
servilleta y solamente toca las gotas de agua (procura no tocar con
la servilleta el frotis)19.- Agregar una gota de aceite de inmersin
al preparado20.- Cubrir con un cubreobjetos21.- Examinar al
microscopio usando el objetivo de inmersin (100X)22.- Reportar tus
observaciones
4.- Preguntas
1.- Qu importancia posee la tincin Gram en el rea de Ingeniera
Ambiental? La tincin Gram es muy importante en el rea de ingeniera
ambiental, ya que es muy importante conocer los microorganismos que
estn presentes en el medio, y como conviven en los ecosistemas y en
base a esto saber cmo podemos utilizar a favor del medio ambiente,
o cmo podemos mejorar la eficiencia en los procesos que estos
realizan Como es la investigacin la forma en que actan ciertos
antibiticos, como la penicilina sobre la pared celular
bacteriana.
2.- Investigar la forma en que actan ciertos antibiticos, como
la penicilina sobre la pared celular bacteriana. Algunos
antibiticos actan sobre los componentes moleculares de la pared;
por ejemplo, la lisozima (presentes en las lgrimas, moco nasal y en
la mayora de los tejidos y secreciones) que actan rompiendo los
enlaces glucosdicos de los pptidoglucanos, lo que provoca la lisis
por osmosis de la bacteria; otros como la penicilina, son
antibiticos bacteriostticos porque inhiben la sntesis de los
pptidoglucanos y, por ello, interrumpen el crecimiento
bacteriano.
3.- Qu otras tinciones existe y como se realizan?, Cul es la
diferencia con la tincin Gram? La coloracin simple consiste en la
incorporacin de azul de metileno, u otro colorante, a la muestra
aproximadamente durante un minuto; luego se descarta el colorante,
se enjuaga y se seca. La observacin al microscopio permite
distinguir y diferenciar las diversas formas microbianas. La
coloracin de ZiehlNeelsen es tambin una coloracin diferencial. Un
grupo de bacterias son difcilmente coloreables, pero una vez
coloreadas retienen tan fuertemente el colorante que la accin de
los decolorantes es prcticamente nula. La tcnica consiste en
someter la preparacin a al tincin con fucsina fenicada con
calentamientos y enfriamientos que garanticen la entrada del
colorante al interior de la clula. Luego se decolora con
alcohol-acido; finalmente se aade un colorante de contraste como el
azul de metileno. Las bacterias alcohol-cido resistentes quedan
coloreadas de fucsina, mientras que las alcohol-cido sensibles
toman la coloracin azul. Son alcohol-acido resistentes las del
genero Mycobacterium. La tincin Gram es para identificar las
bacterias Gram positivas (color violeta) y Gram negativas (color
rosado), esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana
ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias. En cuanto a la coloracin simple es para
distinguir y diferenciar las diferentes formas microbianas. Y la
coloracin de ZiehlNeelsen es para identificar a las bacterias
alcohol-cido resistentes (color fucsina) y a las
bacteriasalcohol-cido sensibles (color azul). Estas tres tinciones
su desarrollo es diferente aunque su similitud es en el uso de los
mismos colorantes.
4.- Para qu reas de la biotecnologa se puede aplicar la tincin
Gram? Biotecnologa roja: Se aplica a la utilizacin de biotecnologa
en procesos mdicos. Biotecnologa blanca: Conocida como biotecnologa
industrial, es aquella aplicada a procesos industriales.
Biotecnologa verde: Es la biotecnologa aplicada a procesos
agrcolas. Biotecnologa gris: Se encarga del estudio del medio
ambiente.
5.- Resultados:
Tincin Gram en muestra de saliva.Muestra de saliva, como se
muestra en la imagen (figura 1) no se alcanza a apreciar nada esto
pudo haber sido porque al pasar el portaobjetos con la muestra
sobre el mechero no se fijaron bien las bacterias y por ende no
tomaron ninguna coloracin.
Figura 1 Muestra de saliva
Tincin Gram de bacterias presentes en Yakult.En la muestra del
Yakult como se muestra en la imagen 2 se puede observar que hubo
poca aparicin de bacilos Gram negativos y con agrupaciones de
streptobacilos y en cantidades menores de bacilos individuales.
Figura 2 Bacterias presentes en muestra de Yakult
Tincin Gram de bacterias presentes en carne descompuesta.La
muestra de carne descompuesta se puede apreciar en la imagen
siguiente y se identificaron algunas bacterias como cocos,
diplococos y estreptococos. Y al observar en elmicroscopio las
bacterias fueron teidas por la safranina que es un colorante de
contraste por lo que de esta forma se define el color rosceo, esto
quiere decir que las bacterias de la muestra de carne descompuesta
han sido identificadas como Gram negativas y a continuacin se
muestra en la Figura 3.
Figura 3 Bacterias presentes en muestra de carne
descompuesta
Tincin Gram en bacterias presentes en yogurt.Al observar las
bacterias existentes en la muestra de yogurt pudimos distinguir que
son bacterias gram negativas ya que el colorante con que se tiieron
fue con la safranina y su aspecto es rosa. La morfologa que podemos
apreciar es en forma de bacilos, y los que permanecen juntos se
aprecian como estreptobacilos, diplobacilos y mayormente en forma
de v.
Figura 4 Bacterias presentes en muestra de yogurt
Tincin Gram en bacterias presentes en sofult.Como se puede
observar en la figura 5 tomada mediante microscopio elctrico, se
analizo una pequea muestra de sofult en la cual se puede observar
que las bacterias presentes en la muestra son Gram negativas, adems
de que la forma las cuales presentan son cadenas de estreptobacilos
y en mayor cantidad diplobacilos.
Figura 5 Bacterias presentes en muestra de Soful
6.- Conclusiones:
La tincin Gram nos permite saber identificar a los dos grupos
diferentes de las bacterias por medio de su pared ya sea Gram
positivas o Gram negativas, esto depende del color que se tian,
puede ser color azul o violeta para las Gram positivas o rosa/rojo
para el caso de las Gram negativas. Adems nos permite ver por medio
del microscopio su tamao, morfologa celular y su clasificacin
taxonmica. Lo que no nos permite conocer es el gnero o la especie a
la que pertenece la bacteria.
La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y es una de sus
caractersticas ms importantes. Es por eso que esta tcnica se vuelve
fundamental en el estudio de la microbiologa. Acerca de la tincin
de Gram nos permite tener una introduccin para poder diferenciar
frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos.
Algunas dificultades que se pueden presentar durante el
desarrollo de la tincin de Gram son: realizar una errnea fijacin de
la muestra en el mechero durante un tiempo escaso tiempo o
prolongado, al momento de realizar la decoloracin con
alcohol-cetona no debe realizarse durante un tiempo extenso ya que
conllevan a una decoloracin de bacterias, as como al momento de
realizar la tincin puede ocasionar excesos de coloracin.
Las paredes celulares de bacterias de tipo Gram negativo poseen
una capa lipdica externa la cual se tie con cristla violeta al
igual que la pared de las clulas de tipo Gram positivo pero con la
diferencia de que estas no tienen una capa lipdica, que al ser
tratada con alcohol desaparecen (debido a que el alcohol es un
disolvente orgnico y disuelve la pared lipdica) y por lo tanto la
clula queda de nuevo sin teir y para poder observarla es necesario
aadir safranina.
Este tipo de tincin tiene una amplia aplicacin en trminos
microbiolgicos, ya que permite la identificacin y caracterizacin de
bacterias que pueden ser utilizadas en procesos biotecnolgicos.
INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE ABASOLO
Ingeniera Ambiental
Asignatura: Biotecnologa Ambiental
Ttulo: Prctica de tincin Gram
Presenta: Mayra Gonzlez Carren Nancy Edith Navarro Magdaleno Ana
Gabriela Quezada Morales Salvador Cisneros Guardado Juan Antonio
Cabrera Cuellar Samuel Noriega Zavala
Nombre del profesor: Erick Rodolfo Lpez Almanza
17 de Marzo del 2015
