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UniversidadMiguelHernández

Dpto.deBioquímicayBiologíaMolecularFacultaddeMedicina

PrácticasdeBioquímicaI

Práctica1:LaBioquímicaenInternet-Biomoléculasen3DPráctica2:Actividadesenzimáticas.ColinesterasadelsueroPráctica3:IntroducciónalLaboratoriodeBioquímica

Apellidos..................................................................Nombre....................................................................Nºexpediente.........................................................

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NORMASGENERALESPARALAREALIZACIÓNYEVALUACIONDELASPRÁCTICASDEBIOQUIMICA

Normasgenerales.Introducciónalassesionesprácticas.

Consideracionesprevias.EncadalaboratorioesnecesariopreverquecualquierincidentequepuedaafectaralfuncionamientodelaUniversidad,tengaunaincidencianulaomínimasobrelaspersonas,lasinstalacionesy/ola continuidad de las actividades. La organización del laboratorio debe permitir la correcta gestión de laprevencióndelriesgo,imbuidaenlospropiosprocedimientosdetrabajo,prácticasyactividades.

Cualquierpersonaquerealicesusactividadesenellaboratoriodebeconocer:

Reglamentodefuncionamientodellaboratorio.Riesgosparalaseguridadylasaluddelosproductosquímicosexistentes.Riesgobiológicodelosagentesbiológicoempleados.ManualdeAutoproteccióndeemergenciasdelaUMH.Itinerariosysalidasdeemergenciageneralesyparticulares.Localización y señalización de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su funcionamiento yadecuación)einterruptoresdesuministroeléctrico.Localizacióndelosbotiquines.Riesgosparaelmedioambientedelosproductosquímicosexistentes.

Enestaintroducciónsepretendequeelalumnotomecontactoconellaboratorio,paralocualseleindicaránlasnormasgeneralesdecomportamientoenelmismo, lasreglasdeseguridadquehayqueobservar, lasnormasespecíficas en caso de accidente, así como las normas generales para la realización de las prácticas de laasignatura.

Normasgeneralesdellaboratorio

1. Elalumnotienelaobligacióndeleeryestudiarconanticipaciónlasexperienciasarealizarenellaboratorio.

Elfundamentoteórico,silodesconoce,deberábuscarloenloslibrosadecuados.2. Alahoraseñaladaparaelcomienzodelasprácticaselalumnodeberáestarenellugarcorrespondienteyen

supuesto.Seráobligatoriousarunabatablanca.Nodisponerdelabatablancaimplicanopoderrealizarlaprácticadeesedía.

3. Duranteelhorariodeprácticasnosepodrásalirdellaboratoriosinpermisodelprofesor.4. Estáprohibidorealizarpruebasdiferentesalasindicadasenestecuadernodeprácticas.Elalumnoseceñirá

escrupulosamentealmismo.5. Sevalorará laactitudyel comportamientogeneralquecadaalumnoadoptedurante la realizaciónde las

prácticas,aspectoéstedeterminantedelanotafinal.

Reglasdeseguridad Cuandosetrabajaenellaboratorio,tantodeprácticascomodeinvestigación,unosepuedeexponeraunaseriede sustancias cuya característicamás importante, desde el punto de vista de la seguridad, es su toxicidad ypeligrosidad. Una actitud de vigilancia y atención es imprescindible en todo momento, aunque no se estéhaciendonada.Pensaryactuardeformaseguraesparteintegraldelaeducaciónquímica.Nodeberealizarseningúnexperimentoantesdeestarsegurodequesecomprendebienloquesevaahacer,ytrasdarrespuestaaestasdospreguntas:¿Quéeslopeorquepuedepasar?¿Cómolopuedosolucionar?Preguntaralosprofesores,en caso de duda, es una buena costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario elextremarlasprecauciones.Elseguimientoestrictodelassiguientesnormasevitaráalmáximolaposibilidaddeaccidentesenellaboratorio.1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados (protección frente a

salpicadurasyderrames).2. Nollevarpulseras,colgantesomangasanchasquepuedanengancharseenlosmontajes.Deberánlavarselas

manosantesydespuésdeentrarysalirdellaboratorioysiemprequehubieracontactoconalgúnproductoquímico.

3. Seevitarállevarpantalóncorto,faldascortas,sandalias,zapatosabiertos,etc.,porrazonesdeproteccióndelapiel.

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4. Enellaboratorioestáprohibidocomer,beberofumar.Nosedebeencenderningunallamanimecheroenellaboratorio.

5. Noconectaraparatoseléctricossinasegurarsedequenohaypeligrodevaporesdedisolventespróximos.Nocolocar jamás productos inflamables cerca de fuentes de calor. Muchas sustancias orgánicas inflamablesoriginanvaporesmásdensosqueelaire,capacesdedesplazarsedistanciasconsiderablesporencimadelamesadelaboratorio.

6. Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitaraccidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se deberá de utilizar mascarillafundamentalmente en el momento de la pesada para evitar su inhalación. Como norma general, parapipetear disoluciones o sustancias nocivas líquidas o en caso de duda, se utilizará una propipeta. Losdisolventes orgánicos no se verteránpor las pilas, sino quese almacenaránen los recipientes dispuestosparatalfin.Losácidosybasesconcentradosseneutralizarán,yladisoluciónsalinaresultanteseverteráconlosgrifosabiertos.

7. Unanormageneralpara lapreparacióndedisolucionesdeácidos fuertesesquesiempreseadicionaráelácidosobreelaguaodisoluciónacuosa,alfindeevitarlaproyeccióndeestaúltimacomoconsecuenciadelcalentamientobruscoalmezclarseambasdisoluciones.Sifueranecesariocalentarelcontenidodeuntubodeensayoalallama,seharáconeltuboalgoinclinado,agitandosuavementeyconlabocadeltubodirigidahaciaunlugarenquenohayaningunapersona.

8. Evitarelcontactofísicocondisolventesorgánicos.Norespirarvaporesdedisolvente.(Verapartadosobre"riesgosasociadosalosdisolventes").Cuandoseutilicensustanciasvolátiles(disolventesorgánicoscomoelcloroformo,éter,etc.)semanipularánenlacampanadegasesutilizando,siesnecesario,unamascarilla.

9. Lasgafasdeprotecciónsonobligatoriascuandoelprofesorasíloindique.Nousarnuncalentesdecontacto(losvaporesorgánicospodríandañarlas;porotrolado,losreactivoscáusticosnopuedensereliminadosdelojosilaslentillasestánpuestas).Fíjatedóndeestánsituadoslosbañoslavadoresdeojos.

10. Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de productos corrosivos oirritantesverindicacionesmásabajo.

11. El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias anteriores. Losresiduossetratarándelasiguienteforma:

A)Materialdecristalroto,papelesyotros.Setiraráenlosrecipientesdestinadosespecialmenteaestefin.B) Productos químicos tóxicos. Se tirarán en contenedores especiales para este fin. No tiresdirectamentealfregaderolosproductosespecialmentetóxicos.C) Sustancias líquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se diluiránpreviamente,sobretodosisetratadeácidosydebases.Notiresalfregaderoproductosoresiduossólidosquepuedanatascarlas.Enestoscasosdepositalosresiduosenrecipientesadecuados.

Enelcasoquesegenereunderramederesiduospeligrososdurantelarealizacióndelapráctica,elpapelqueseutiliceparasurecogidatambiénserádepositadoenelcontenedorestablecidoparaesegrupoderesiduospeligrosos.Encasodeduda,preguntaraalgúnresponsablecómoproceder.

12. Unanormageneralqueseañadealascitadasyquecontribuyealaseguridadenellaboratorioesladelrigoryordenenellaboratorio.Conelloqueremosresaltarqueentodomomentosehademantenerunalimpiezayordenadecuadosenellaboratorio.

13. Antecualquierdudaosiseproducealgúnaccidente,avisarrápidamentealprofesor.

Normasdeactuación Ordenylimpieza.Elordenesfundamentalparaevitaraccidentes.Mantenereláreadetrabajoordenada,sinlibros,abrigos,bolsas,excesodebotesdeproductosquímicosycosasinnecesariasoinútiles.Mantenerlasmesassiempre limpias. Se tienen que limpiar inmediatamente todos los productos químicos derramados. Limpiarsiempreperfectamenteelmaterialyaparatosdespuésdesuuso.Responsabilidad.Trabajar sin prisas, pensandoen cadamomento lo queestás haciendo, y conelmaterial yreactivos ordenados.No se debe gastar bromas, correr, etc. en el laboratorio.No realizar un experimento noautorizado. Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar laexpulsióninmediatadellaboratorio.Atención a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningún recipiente de reactivos que no lleve etiqueta.Entregadlo inmediatamenteal profesor.No sustituir nunca, sinautorizaciónprevia del profesor, un productoquímico por otro en un experimento. No utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente sufuncionamiento.Nousarunapipetadirectamenteconlaboca,sinoatravésdeunsistemadeaspiración.

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Manipulacióndelvidrio.Noforzaruntubodevidrio,yaque,encasoderuptura,loscortespuedensergravesNousarnuncaequipodevidrioqueestéagrietadooroto.Depositarelmaterialdevidriorotoenuncontenedorparavidrio,noenunapapelera.Manipulacióndeproductosquímicos.- Los productos químicos pueden ser peligrosos por sus propiedades tóxicas, corrosivas, inflamables oexplosivas.Muchosreactivos,particularmentelosdisolventesorgánicos,ardenenpresenciadeunallama.Transportedereactivos.Notransportarinnecesariamentelosreactivosdeunsitioaotrodellaboratorio.Lasbotellassetransportansiemprecogiéndolasporelfondo,nuncadeltapón.

Actuacionesencasodeaccidente 1. En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad llamar al 112, o al

teléfono de la universidad 8665 (966658665 para llamada externa). No llevar a cabo actuacionesinseguras;siserealizanprimerosauxilios,hayqueestarseguro/adenoempeorarelestadodelaccidentado(protección)yasegurarseunomismodenosufrirriesgo(autoprotección).

2. Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones del profesor y laseñalización existente en elmismo. Si el fuego es pequeño y localizado, apagadlo utilizando un extintoradecuado,arena, ocubriendo el fuego conun recipiente de tamañoadecuadoque lo sofoque. Retirad losproductosquímicosinflamablesqueesténpróximosfuego.Noutilizarnuncaaguaparaextinguirunfuegoprovocadoporlainflamacióndeundisolvente.Encasodequeelfuegoseaimportante,accionarelpulsadordealarma

3. Fuegoenlaropa.Siseincendialaropa,pedirayudainmediatamente.Tumbarseenelsueloyrodarsobretimismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el fuego) ni intentar llegar a la ducha deseguridadsinoestámuycerca.Ayudadaalguienqueseestéquemando.Cubridleconunamantaantifuego,conducidle hasta la ducha de seguridad, si está cerca, o hacedle rodar por el suelo.No utilizar nunca unextintorsobreunapersona.Unavezapagadoel fuego,mantenera lapersonatendida,procurandoquenocojafríoyproporcionarlelosprimerosauxilioshastalallegadadelaasistenciamédica.

4. Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantascalefactoras,etc.,setrataranlavandolazonaafectadaconaguafríadurante10-15minutos.Desinfectar(porej.conyodo)ycubrircongasas.Noaplicarungüentososustancias(pastadedientes,lejía,etc.)nipuncionesoretirarlasampollassiaparecen.Lasquemadurasmásgravesrequierenatenciónmédicainmediata.

5. Cortes.Loscortesproducidosporlaroturadematerialdecristalsonunriesgocomúnenellaboratorio.Sedebenlavarbien,conabundanteaguacorriente,durante10minutoscomomínimo.Sisonpequeñosydejande sangrar en poco tiempo, lavadlos con agua y jabón,aplicar un antiséptico y taparlos con una venda oapósito adecuados. Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia médicainmediata.Noretirarnimanipularunposiblecuerpoextrañoenclavado.

6. Actuaciónencasodeinhalacióndeproductosquímicos.Conducirinmediatamentealapersonaafectadaaunsitioconairefresco.Requerirasistenciamédicainmediata.Alprimersíntomadedificultadrespiratoriadebeiniciarselarespiraciónartificialbocaaboca.Identificar,siesposible,elgascausante,usarlamáscaraadecuadaysinolahay,aguantar larespiraciónmientrasseextingueelvapor(abriendoventanas,usandocampanas,etc.).Tratardenoexponerseencualquiercaso.

7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos.Antes de cualquier actuación concreta pedirasistenciamédica.Sielpacienteestáinconsciente,ponerlotumbado,conlacabezadelado.Taparloconunamantaparaquenotengafrío.Nodejarlosólo.Nodarlelíquidos,niprovocarelvómito.

8. Derrame o proyección de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayanvertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimodurante15minutos.Enelcasodeproductoscorrosivos,ademásdeloanterior,tambiénseretiraráocortarálo más rápidamente posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas deseguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada delcuerposeagrandeynoseasuficienteellavadoenunfregadero.Esnecesariosacartodalaropacontaminadaalapersonaafectadaloantesposiblemientrasestébajoladucha.Recuerdaquelarapidezenellavadoesmuyimportanteparareducirlagravedadylaextensióndelaherida.Proporcionarprimerosauxilioshastalallegadadeasistenciamédicaa lapersonaafectada.Avisara tuprofesor.Siunproductoquímicoentraencontactocontusojos,eltiempoesesencial,sobretodosielproductoescorrosivo(actuadenmenosde10segundos). Cuanto antes se lave el ojo,menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con aguacorrienteabundantedurante15minutoscomomínimoenunaduchadeojos,y,sinohay,conunfrascoparalavar los ojos. Es necesariomantener los ojos abiertos con la ayudade los dedos para facilitar el lavadodebajodelospárpados.Esnecesariorecibirasistenciamédica,porpequeñaqueparezcalalesión.Cuidado:nousardemasiadapotenciadechorrodeagua,paraevitarlesionesalojo.

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Normasgeneralesparalarealizacióndelasprácticas

1 Antesdecomenzarlaprácticadeberárevisarquedisponedetodoelmaterialyproductosnecesariosparala

misma,yqueseencuentratodolimpioyenorden.Senotificaráalprofesorcualquieranomalía.Alfinalizarlaprácticadejarátodoelmaterialperfectamentelimpioyordenado,avisandoalprofesordehaberterminadoantesdeabandonarellaboratorio.

2 Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipetaadecuada.Nopipetearentrevariaspersonas.

3 Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que seconfundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcaradecuadamenteutilizandorotuladores,lápicesdeceraoetiquetas.Encadacasoseindicarálasustanciadequesetrataysuconcentración,asícomolafechadepreparación.

4 Sedebendeanotarenelcuadernodeprácticaslasdisolucionespreparadasysuconcentración,asícomoelvolumenpreparadodecadauna.

5 Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberán situarse en el fondo de labancadaomesadetrabajo,evitandodejarlosenlosbordes.

6 Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias personas) deberápresentaruninformederesultadosdecadaprácticaenlaformaindicadaporelprofesor.

7 Antecualquierdudapreguntaralprofesordeprácticas.8 Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prácticas. Las prácticas son

obligatoriasylanoasistenciaalasmismas,salvocausadefuerzamayor,implicalanecesidaddesuperarlasenunaPRUEBATEÓRICAY/OPRÁCTICA,DEACUERDOCONLASDIRECTRICESDELAASIGNATURA.

Riesgosasociadosalosdisolventes

Esesencialrecordarquelamayoríadelosdisolventesorgánicossoninflamables,yardensiestánexpuestosaunallama.Además,muchossontóxicosocarcinógenos.Porejemplo,muchosdisolventesclorocarbonados,siseacumulanenelorganismo, causanundeteriorodelhígadosimilara la cirrosisoriginadaporusoexcesivodeetanol. El cloroformo y el éter son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, losdisolventesorgánicossontanpeligrososcomoloscompuestosquímicoscorrosivos(p.ej.elácidosulfúrico).Acontinuaciónsecitanalgunosejemplos:

•Ácidoacéticoglacial:essuficientementecorrosivoparacausarquemaduras.Susvaporespuedenirritarlosojosylosconductosnasales.

•Acetona:noesmuytóxicacomparadaconotrosdisolventes.SinembargoesMUYinflamable.•Benceno:seabsorbefácilmenteatravésdelapiel,ypuedeafectara lamédulaóseayprovocarleucemia.

Estáconsideradocomoagentecarcinógenoyafectaalhígadoylosriñones.Ademásesmuyinflamable.•Diclorometano:noesinflamableynoestáconsideradocomocarcinógeno.Siseingierepuededeteriorarel

hígado,ysusvaporespuedenoriginarsomnolenciaynáuseas.•Etanol:esunconocidoagentetóxicoyesextremadamenteinflamable.•Éteretílico:esextremadamente inflamableypuedeoriginarexplosiones (presenciadeperóxidos).Noes

particularmentetóxico,peroengrandesconcentracionespuedeoriginarsomnolenciaynáuseas.•Hexano,pentano,éterdepetróleo:pueden irritarel tracto respiratorioy lapiel.Tambiénpuedenactuar

comotóxicoydepresivosdelsistemanerviosocentral.Sonaltamenteinflamables.•Metanol:mástóxicoqueeletanol,provocaporingestióncegueraymuerte.Esmuyinflamable.•Tolueno:noestáconsideradocomoagentecarcinógeno,peroestantóxicocomoelbenceno.Puedeactuar

comoanestésico,yafectaralsistemanerviosocentral.

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He leído y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos Asociados al laboratorio Nombre:_________________________ Apellidos: _____________________________ Curso Académico:_________________ Grado:________________________________

Firma:

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PRÁCTICA1:LaBioquímicaenInternet-Biomoléculasen3D.

Prof.responsable:LuisMiguelGutiérrezPérez(luisguti@umh.es)

INTRODUCCIÓN

Esevidenteparacualquierestudiantequeseacerqueconcuriosidadalasnuevastecnologíasde la información, que se están abriendo un buen número de posibilidades en apoyo delestudioycomprensióndelabioquímica.Esporelloqueestaprácticaestadedicadaaconocerymanejarestosnuevosrecursos.La Internet(WWWosimplementeWeb)esantetodounafuente inmensa de todo cuanto el ser humano piensa que merece ser enseñado (sea o nohonesto, esto hay que advertirlo), y por ello existen una variedad casi incatalogable deinformaciónenrelacióncon labioquímica. Enprincipiopodríamosdividirestas fuentesencuantosuinterésennuestrocampoencuatrotipos:A.DireccionesconinterésparalocalizarinformaciónsobrecualquieraspectodelaBioquímicay Biología molecular. Éstas serían la base de partida para localizar otras direccionesespecíficas. Sería el caso de las direcciones URL(Universal Resource Locator):http://www.cellbio.comohttp://www.ncbi.nlm.nih.gov. Todasellasorganizanlabúsquedade direcciones (links) en secciones como: Enseñanza de Bioquímica y BiologíaMolecular,Protocolosexperimentales,basesdedatos,fuentesdeprogramas,revistasespecializadasetc.B.DireccionesdebasesdedatosconrelevanciaeninvestigaciónydocenciaenBioquímicayBiología Molecular. Éstas pueden ser de especial utilidad para la utilización de recursosdidácticos complejos como la representación de biomoléculas en 3-D o la utilización derecursosdeinvestigacióncomolabúsquedaoalineamientodesecuenciasodelosvaloresdeseparación de proteínas en 2D-PAGE. Estas fuentes se especificarán en más detalle conposterioridad. A este tipo de direcciones pertenecen por ejemplo la dirección:http://www.rcsb.org/pdb/.C.Direccionesdeinterésespecíficoenaspectosdeinvestigación.Seríaelcasodedireccionesqueproveendeprotocolosexperimentales,odeforosdediscusiónsobretemasespecíficosdeuncampodeinvestigaciónoinclusolaspertenecientesarevistasespecializadas.Ejemplosdeeste tipo serían las direcciones: http://www.protocol-online.net , ohttp://bioinformatics.weizmann.ac.il/D.Finalmentesepodránencontrardireccionescuyointerésprincipalseaeldelaeducaciónencampos biológicos o bioquímicos. Un ejemplo de este tipo sería http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio.Dado que este seminario tiene por objeto el mostrar la utilidad de estas fuentes deinformación en el apoyo de la docencia e investigación se centrará en un aspecto concretocomoeslasposibilidadesde larepresentaciónymanipulacióndemoléculasbiológicasen3dimensiones.

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2.BASESDEDATOSDEESTRUCTURASDEBIOMOLÉCULASACCESIBLESENINTERNET.Enlosúltimosañosjuntoalostradicionalesbancosdeestructuraprimariadeproteínasydesecuencia de nucleótidos han aparecido los bancos de estructura tridimensional debiomoléculas. Tantoenladocenciaenbioquímicadondelavisualizaciónymanipulacióndeunamoléculaentresdimensionespermitelamejorcomprensiónderelacionesestructuralescomoen investigacióndonde las relacionesestructura-funciónestán siendo la claveparaelmejor entendimiento del diseño molecular, la existencia de extensos bancos de estructuraespacial de biomoléculas (especialmente de proteínas) son un apoyo inestimable para elbioquímico. Laestructurade lasproteínaspuedealmacenarseen archivosde coordenadasespacialesdesusátomosconstituyentes,siendoelmásextendidoel tipodearchivoproteindatabase(nombre.pdbonombre.ent).Estosarchivospuedenobtenersedediferentesfuentessiendo los bancos más importantes los correspondientes al Protein Data Bank en EE.UU.(http://www.rcsb.org/pdb/ )y a laSwiss3DImageCollection (http://expasy.hcuge.ch ) enSuiza.Enestosbancosdeestructurasepuedenhacerusodesistemasdebúsquedamuyversátilesqueincluyenlaposibilidaddeincluircamposdenombrescompletosoparciales,familiasdeproteínas, organismos, técnicas experimentales de obtención de estructura, referenciasbibliográficas(autoresetc.),e incluso fórmulaso laclasificaciónde laComisióndeEnzimas.MientrasqueelProteinDataBankconstituyeunbancomuycompletodearchivospdb(Hayunas20.000estructuras),elbancodelaColecciónSuizadebiomoléculasseespecializaenladirectavisualizacióndelasproteínasensupáginaWeb.conimágenesdetipoGIFyporelloselimitaaunas5000imágenes.Ademásdeestasfuentesprincipalesexistenotrosbancosparala localización de archivos pdb que representan moléculas sencillas como el agua en susdiferentes formas, glúcidos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, fármacos etc.(http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library).UnavezdescargadoatravésdeInternetlosarchivosdeseadosdeberemosdedisponerdelosprogramasadecuadosparasuvisualizaciónymanipulación.3. PROGRAMASPARALAVISUALIZACIÓNDEBIOMOLÉCULASEN3D.Existen una gran diversidad de programas para la representación tridimensional debiomoléculas,sinembargopocosdeelloshansidoaceptadoscomostandarddeuso(aceptanarchivos *.pdb)ydesde luegomuchosmenoshan sidodesarrolladosaltruistamenteparaeluso ydisfrute libre de la comunidad científica. Entre los últimos10 años se desarrollaronestosprogramasparautilizarenunPCdotadodelsistemaoperativoWindowsycabecitarelprogramapioneroRasmoldesarrolladoporRobertSayledelaUniversidaddeEdimburgo(sepuedeobtenerhttp://www.umass.edu/microbio/rasmol , o susprogramasgemelosProteinExplorer o Chemscape Chime (http://www.mdli.com), este último desarrollado para serincorporadoennavegadoresInternet(NetscapeyExplorer)yelprogramaSwissPDBViewerdesarrollado por Nicolas Guex de la empresa Glaxo-Wellcome(http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm ) para PC y Apple Mackintosh. Centraré miinterés inicialmente en el primero de éstos, mucho más extendido en uso y con menosrequisitos a la hora de poder utilizarlo (el programa Swiss PDB Viewer requiereQuickdraw3D, obtenible de Apple en su dirección web: http://www.apple.com pero eltamañodeesteprogramadeunas8MBhacemásdifícilsuobtención).

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Hoy en día se utilizan versiones integradas derivadas de Rasmol como Jmol, estas estánintegradasenelnavegadorypresentande formamás intuitivatodas lascapacidadesde losprogramasoriginales.4. UTILIZACIÓNDEJMOLPARAELESTUDIODEUNAPROTEINAMODELO.Primero necesitaremos una proteína que sea un modelo interesante para estudiar lascapacidades de dichos programas nosotros propondremos el estudio de la estructuratridimensionaldeHemoglobina.Primero entre en la página del banco de datos de estructuras del Protein Databank(http://www.rcsb.org/pdb/), y haga una búsqueda de las estructuras almacenadas sobredichaproteína.Seconscientedelavariabilidaddeformasalmacenadasysusdiferencias.Una vez elegida una molécula es el momento de comprender las diferentes opciones derepresentación estructural (átomos, esqueleto, cartoons etc), de color o incluso lasposibilidadesderepresentacióndelassuperficies.El siguiente aspecto del programa será analizar las partes fundamentales de la estructurarelacionadasconlafuncióndelaproteínaparaelloutilizaremosotrasopcionescomoLigandsoLigandsandpocket.También se aprenderá a la utilización de estos programas para la determinación dedimensionesmolecularesydistanciasentreátomos,paraello seospropondrádimensionalalgunasdelasproteínasdeinterésenmetabolismocondimensionesmasextremas.5. EXTENSIONDELOSPROGRAMASALESTUDIODEOTRASBIOMOLECULAS.Hasta ahora hemos mostrado el empleo de la visualización 3D a proteínas pero es muysencilloimportararchivosestructuralesdeotrasmoléculasdeinterésbiológico.Paraellosepuede partir de bases de datos conocidos como la indicadahttp://www.nyu.edu/pages/mathmol/library, o simplemente utilizar una búsqueda deInternetdecaráctergeneralizado(empleandoeltipodemoléculaabuscaryeltipodearchivopdbcomoguíaenlabúsqueda).RealizaremoslabúsquedadeunarchivoestructuraldelADNyrealizaremosunestudiodesuscaracterísticas dimensionales fundamentales como las dimensiones de los surcos mayor ymenorolasdistanciasentrebasesemparejadas.6. REALIZACIONDEGRAFICOSDEMOLECULASENALTACALIDADExisten programas que aunque sean menos intuitivos permiten posibilidades de análisis yrepresentación de biomoléculas muy interesantes. Este es el caso del programaSwissPDBViewer (http://www.expasy.org/spdbv/), que constituye una herramienta deinvestigación para el estudio de distanciasmoleculares y de parámetros estructurales. LacapacidaddeesteprogramaresideenlaseleccióndeunaminoácidoparaexplorarsuentornoverFigura1),ymásaúnparainclusomutardiversosresiduosparaposteriormenteentendercomodichasmutacionesafectanalaestructuradelaproteína.Elprogramapermiteasímismouna diversidad de cálculos que incluyen la realización de diagramas de Ramachandran, talcomosemuestraenlamismaFigura1.

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Lacombinacióndeesteprogramaconelrepresentador tridimensional (renderización3D) denominado Povray(Http://www.povray.org), permite larepresentación de moléculas en el sistemagráfico de más calidad de cuantos se hanmencionado en este trabajo, la viveza deluces y texturas obtenida con dichosprogramaspuedeserobservadaen laFigura 2,representando dos moléculassimultáneamente.En la práctica realizaremos algunasrepresentaciones de alta calidad conmoléculas de interés biológico comofármacos, aminoácidos, proteínas, ácidosgrasos,etc.

Figura 1. Copia de pantalla de la ejecución del programa SWISS-3D PDBVIEWER. Se muestra la capacidad de éste para la observación de las relaciones entre aminoácidos en una región concreta del complejo protéico de fusión vesicular (SNARE complex), formado por 4 cadenas pertenecientes a 3 proteínas (sintaxina, SNAP-25 y sinaptobrevina). En el recuadro se observa el diagrama de Ramachandran de éstas.

Figura 2. Moléculas de glúcido y ácido graso tratadas por Swiss 3D Viewer y representadas por Povray, incorporando fuentes de luz y texturas.

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CUESTIONES-INFORMEPRÁCTICANº1NOMBREYAPELLIDOS............................................................................................NºMATRICULA..............................................................................................................FECHADELAPRÁCTICA...........................................................................................GRUPO...............................................................................................................................

1. ¿Las bases de datos manejadas poseen únicamente proteínas o estructuras deotrassustancias?,indiquequeotrostiposdemoléculassepuedenencontrar.

2. Utilizando la hemoglobina comomolécula ejemplo, que número de estructurasson accesibles para su estudio estructural. Indique el porqué de dichavariabilidad.

3. Utilizandolasfuncionesdemediciónindique:Tamañoaproximadodelahemoglobina.AnchoxlargoxprofundidadDeunadelascadenasquelaforman.DistanciasentreelátomodeFedelgrupoHemoylosaminoácidosmáscercanosdelacadenadeglobinayelOmascercanotransportado.4. Busque dos proteínas de relevancia en el estudio del metabolismo con lasdimensiones mas extremas y determine su tamaño tal como hizo con lahemoglobina.Proteínamásgrande;Proteínamáspequeña;4. Obtener un archivo pdb representativo de la estructura del ADN y realizar las

medicionesquecaracterizandichaestructura.5.Localicelosarchivosdeestructurayrepresenteenaltacalidadlasmoléculasqueleindiqueelprofesor,salvandolosarchivosgráficosobtenidos.

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PRÁCTICA 2: Separación y purificación de proteínas. Cromatografía.

Prof. responsable: Juan Antonio Reig Maciá (jareig@umh.es)

RESUMEN Y OBJETIVOS.

Esta práctica, consta de dos actividades distintas: Una cromatografía y una cuantificación de proteínas en solución. Se pretende inicialmente que el alumno comprenda y aplique los conceptos de separación de moléculas mediante técnicas cromatográficas. Para ello los alumnos, en grupos de dos, realizarán la separación en una cromatografía de filtración en gel (PARTE 1) de diferentes moléculas que serán detectadas por colorimetría. Además los alumnos, una vez iniciada y controlada la cromatografía, cuantificarán una solución proteica (PARTE 2) mediante un reactivo que desarrolla color en presencia de proteínas como es el reactivo de Biuret mediante una recta de calibrado.

PARTE 1: CROMATOGRAFÍA. INTRODUCCIÓN:

La cromatografía se emplea para separar los componentes de una mezcla de moléculas. La separación puede tener una finalidad cualitativa, es decir de análisis o cuantitativa, cuando queremos recuperar alguno de los componentes para proseguir el estudio. Muchas veces se hace primero una cromatografía analítica y después en otra escala, se realiza una cromatografía cuantitativa pa rescatar y estudiar el componente deseado.

¿En que se basa la cromatografía?: La cromatografía tiene su fundamento en la diferente velocidad de las moléculas disueltas en la que denominaremos fase móvil al atravesar la fase fija o fase estacionaria. Esta diferente velocidad de migración de las moléculas se produce por la diferente afinidad de las moléculas por ambas fases. La cromatografía más simple y cotidiana aparece en forma de círculos coloreados al caer una mancha de tinta o de vino en un mantel.

Según sean la fase móvil y la fase estacionaria existen distintos tipos de cromatografía. La

más sencilla es la cromatografía en papel para separar moléculas pequeñas. Para la separación de proteínas las más utilizadas son tres: la cromatografia de filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografia de afinidad. La cromatografía de gases se utiliza para separar sustancias volátiles que se adhieren a una columna y son arrastradas por una fase gaseosa.

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La cromatografía de filtración en gel que se va a utilizar en la práctica, permite la separación de los componentes en base a su diferente tamaño. Tal como ocurre en las otras cromatografías de proteínas, la fase estacionaria está constituida por un relleno granuloso o resina que se encuentra en el interior de una columna de vidrio. En la cromatografía de filtración en gel la resina esta constituida por unas partículas esféricas porosas microscópicas que en suspensión acuosa se encuentra en el interior de la columna. Una placa porosa en la parte inferior retiene el gel mientras que el eluyente o fase móvil puede ir descendiendo por la acción de la gravedad. La muestra de moléculas a separar, se coloca en la parte superior de la resina en el menor volumen posible, por la acción de la gravedad la muestra va penetrando en el gel. Una vez penetra la muestra en el gel se añade una cierta cantidad del mismo eluyente en la parte superior y se conecta a un erlenmeyer lleno con el fin de que la cromatografía siga su curso sin riesgo a que se seque la columna. Los diferentes componentes de la mezcla descienden a lo largo de la columna a diferentes velocidades, separándose unos de otros a medida que vamos recogiendo lo que gotea de la columna en volúmenes iguales (de unos 3ml en nuestro caso), en tubos de vidrio (ver figura adjunta):

¿Cual es la explicación de la diferente velocidad de migración? La razón de la diferente

velocidad de las moléculas en función de su tamaño a lo largo de la cromatografía reside en la estructura del gel. Los geles utilizados son polímeros glucídicos porosos esféricos que suponen en la columna un verdadero entramado o red molecular. El tamaño de los poros es tal que las moléculas muy pequeñas quedarán retenidas completamente ya que se introducirán en todos los poros, siendo su recorrido hacia el final de la columna mas largo que el de las moléculas grandes. Si las moléculas son muy grandes contrariamente no cabrán en los poros y pasarán por los intersticios del gel, por la parte externa de las esferas, empujadas por el eluyente, siendo las primeras moléculas de la mezcla en aparecer. Las moléculas de tamaño intermedio quedarán parcialmente retenidas pues entrarán en algunos poros y en otros no. El tamaño de los poros de un gel no es exactamente el mismo, dentro de un rango de tamaño cada tipo de gel tiene dos valores limite a considerar, un valor máximo que hace referencia al peso molecular a partir del cual son excluidas las moléculas completamente por ese gel y un valor mínimo por debajo del cual son retenidas todas las moléculas, ya que son tan pequeñas que hay un 100% de probabilidad de que penetren en todos los poros del gel. Este valor mínimo y máximo definen el rango de exclusión del gel y nos permite conocer que moléculas puedo separar con dicho gel.

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Existen muchos tipos de geles y de distinto rango de exclusión, nosotros usaremos en la práctica los que se conocen con el nombre comercial de Bio-Geles P ya que se utiliza poliacrilamida en su fabricación (ver tabla):

TIPOS DE GEL Y RANGOS DE EXCLUSIÓN

Hay muchos tipos nosotros emplearemos el Bio-Gel P4 (rango exclusión= 800-4.000). Si quisiera separar una proteína de 50kDa de otra de 70kDa y de otra de 250kDa estos no serian buenos geles seria preferible utilizar el Bio-GelP100 cuyo rango es 5000-100.000, en este gel la proteína de 250 quedaría excluida y las otras dos parcialmente retenidas. Nosotros vamos a incluir en la columna una molécula muy pequeña, concretamente la Vitamina B12 cuyo peso molecular es 1.355. Además del rango de exclusión nos podemos fijar en otras características como por ejemplo el tamaño de las microparticulas que constituyen el gel, la textura puede ser media, fina o extra fina, cuanto mas grande es la partícula mayor es el flujo cromatográfico es decir los ml/min que caen por la columna.

¿Como expresamos los resultados de la cromatografía? Los resultados de una cromatografía en columna se expresan en forma de un diagrama o perfil de elución donde se representa la aparición del soluto (mg, unidades de aborbancia etc) en función del volumen de eluyente que sale por la columna arrastrando la muestra. El volumen de elución (Ve) para una sustancia determinada (EN NUESTRO CASO LA VIT B12) corresponde al volumen de eluyente que he recogido en los tubos desde la aplicación de la muestra hasta la aparición del máximo de absorbancia (color rojo-anaranjado) de esa sustancia. Además de este valor Ve propio de cada componente de la mezcla, existen dos parámetros de cada columna de filtración en gel importantes: En primer lugar el volumen de exclusión (Vo) o volumen muerto es el volumen que queda en el exterior del gel bañando la resina, o en otras palabras el volumen de elución de las moléculas que son excluidas por el gel. Para su determinación se suele emplear una sustancia coloreada (color azul) de alto peso molecular como el azul dextrano (PM= 2.000.000). V0 VE

TUBO Nº è 1, 2 , 3 , 4, 5……………12, 13,14..

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Bastará medir el volumen eluido de la columna desde la aplicación de la muestra hasta la aparición en los tubos del color azul característico del dextrano para determinar V0. El volumen de elución de las sustancias depende de las características propias de cada columna. Para normalizar el comportamiento de la cromatografía para la elución de la vit B12 incluída en el lecho cromatográfico, emplearemos un cociente don de el Ve se expresa en función de carcaterísticas propias de la columna, el V0 y el Vt Siendo VT el volumen del lecho cromatográfico, determiona el diametro de la columna y multiplica el área de la base (pr2) por la altura (usa una regla!) Ve -Vo Kav ------------ Vt – Vo

METODOLOGIA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACION EN GEL

El objetivo de la práctica consiste en separar mediante una cromatografía de filtración en gel

dos moléculas: azul dextrano (PM 2.000.000) y vitamina B12 (PM =1355). Igualmente se dibujará el perfil cromatográfico y se normalizarán los resultados contestando las cuestiones del cuestionario adjunto. -Materiales: Columna de vidrio rellena con un Bio-Gel P (P4), tubo eppendorf con la mezcla a separar (0.7ml), pipeta Pasteur, gradilla metálica conteniendo tubos de ensayo, pinza y colorímetro. Como eluyente se utilizará agua destilada. -Método: Destapar la columna y con la pipeta Pasteur extraer el eluyente que queda en la parte superior del gel con cuidado de no distorsionar la parte superior. A continuación depositar la muestra en la parte superior del gel con la ayuda de la pipeta Pasteur dejando resbalar la muestra en círculos por la pared de la columna. Una vez aplicada la muestra liberar la pinza de retención en la parte inferior y empezar a recoger en los tubos de la gradilla a razón de 3ml por tubo, haz una marca indicando este volumen en tubo aparte como referencia. Estar atentos a la inclusión de la muestra en el interior del gel, una vez dentro añadir unos 5 ml de eluyente en la parte superior del gel para ayudar a que la muestra termine de penetrar en el lecho cromatográfico, finalmente añadir nuevamente 5ml de eluyente y conectar la columna al erlenmeyer situado en el estante superior que contiene el eluyente para el desarrollo completo de la cromatografía. Durante su desarrollo se harán visibles dos franjas coloreadas en la columna, una azul del dextrano y otra rojiza de la vitamina B12, iremos recogiendo eluyente en los tubos hasta que salga el último componente.

El calculo del Vo lo haremos considerando los tubos recogidos desde la aplicación de la muestra hasta la aparición del tubo con el máximo de intensidad de color azul. Para determinar el perfil de elución y el Ve de la Vit B12, mediremos la absorbancia de los tubos a continuación del dextrano hasta el final con el coloríimetro a 540nm. Representando en el papel milimetrado abajo adjuntado, la absorbancia en función del volumen de eluyente. Finalmente se determinará el Kav. Todos los datos se harán constar en el cuestionario adjunto que se entrega antes de salir del laboratorio

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PARTE 2: METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA. El objetivo de esta parte de la práctica consiste en la determinación de la concentración de proteína en una muestra de plasma. Materiales: • Solución de proteína de concentración desconocida en tubo eppendorf, • Solución de Reactivo Biuret, • Solución de albúmina estándar (10mg/ml), • pipetas de vidrio de 1, 2 y 5 ml., • gradilla • tubos de ensayo. • colorímetro. Metodologia: Para realizar la recta patrón añadir en 6 tubos: TUBO DISOLUCIÓN

ALBÚMINA REACTIVO 1 REACTIVO

BIURET 1 (0 mg) 0 2.6 ml 0.9 ml 2 (1 mg) 0.1 ml 2.5 ml 0.9 ml 3 (3 mg) 0.3 ml 2.3 ml 0.9 ml 4 (5 mg) 0.5 ml 2.1 ml 0.9 ml 5 (8 mg) 0.8 ml 1.8 ml 0.9 ml 6 (10 mg) 1.0 ml 1.6 ml 0.9 ml. El volumen final de todos los tubos es de 3.5 ml Para determinar la proteína en la solución plasmática pondremos en un tubo dos muestras M1 y M2 para poder hacer después el valor promedio:

TUBO SOLUCIÓN PLASMÁTICA

REACTIVO 1

REACTIVO BIURET

Muestra (M1)

0.1 ml

2.5 ml

0.9 ml

Muestra (M2) 0.1 ml

2.5 ml

0.9 ml

Mezclar bien el contenido de los tubos , mantener durante 15 min a temperatura ambiente y tomar lecturas de absorbancia de cada tubo a 540 nm utlizando como blanco el primer tubo (tubo 1) con 0 proteína. El Reactivo 1 consiste en una solución: NaOH 0.4 M Tartrato sódico-potásico 64mM El Reactivo Biuret consiste en una solución: NaOH 0.4 M Tartrato sódico potásico 64 mM Ioduro potásico IK 61 mM Sulfato de Cobre 24.3 mM

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CUESTIONES-INFORME DE LA PRÁCTICA Nº3 (ENTREGAR AL SALIR DEL LAB) NOMBRE Y APELLIDOS(mayúsculas)............................................................................................ Nº MATRICULA..............FECHA DE LA PRÁCTICA...................GRUPO............................ PARTE 1: CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL. 1.- Explica brevemente en qué se basa la separación cromatografica que estás usando. 2.- ¿Qué tipo de gel estás usando y cuál es el rango de fraccionamiento o de exclusión molecular? 3.- ¿Cuál es el volumen total Vt del lecho cromatográfico? Vt= πr2xh= 4.- ¿Cuál es aproximadamente el flujo de elución (ml/min)? 5.- ¿Cuál es el valor de Vo obtenido con el azul dextrano? Vo= 6.- ¿Cuál es el diagrama o perfil de elución de la cromatografía?(Absorbancia vs número de tubo.

Ve-Vo 7.- ¿Cuál es el valor de Ve y Kav? (Kav= --------) Vt-Vo PARTE 2: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA 8.- Representa la recta de calibración para la determinación de proteína. (Absorbancia vs mg proteína).

9.- ¿Qué cantidad de proteína tiene la muestra de plasma? Valor promedio:[M]= mg/ml.

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PRÁCTICA3:CINÉTICAENZIMÁTICA:Colinesterasadelsuero.

Prof.Responsable:JavierSaezVelero(j.saez@umh.es)

INTRODUCCIÓN En los vertebrados existen dos tipos de colinesterasas, enzimas que hidrolizan preferentemente los ésteres de colina, la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BuChE). Son codificadas por genes distintos, y se distinguen por la preferencia de sustrato (acetilcolina y butirilcolina), sus características cinéticas, y el efecto de inhibidores: iso-OMPA (tetraisopropil pirofosforamida), inhibe preferente BuChE, y BW (dibromuro de 1,5 bis (4-alildimetilamoniofenil) pentan-3-ona) inhibe AChE.

La AChE es una enzima vital, por su papel en la hidrólisis de la acetilcolina liberada en las sinapsis colinérgicas, aunque posiblemente desempeña otras funciones, ya que está presente en tejidos no colinérgicos. La función de la BuChE no ha sido aún totalmente establecida y no se conoce sustrato biológico específico, aunque también puede cumplir un papel en la hidrólisis de acetilcolina.

Para el ensayo de AChE y BuChE en el laboratorio, usamos tio-análogos de sus sustratos específicos (que no biológicos), en una reacción conocida como método de Ellman (*). *A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95

En el ensayo, la reacción se produce en presencia de DTNB (ácido ditiobis-nitrobenzoico), el cuál reacciona con la tiocolina que se libera. Apreciamos el curso de la reacción por el incremento de color, que nos indicará el incremento de producto con el tiempo. El aumento de color lo medimos en un colorímetro a una longitud de onda de 410 nm (determinaremos el incremento de absorbancia/unidad de tiempo).

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OBJETIVOS En esta práctica el alumno realizará la medición del curso temporal de una reacción enzimática y determinará los parámetros cinéticos de constante de Michaelis (KM) y velocidad máxima (Vmax). Como fuente de enzima se utilizará la butirilcolinesterasa (abreviada BuChE), también llamada colinesterasa plasmática. El alumno habrá de ser capaz de:

• Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas • Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linearidad del proceso • Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad

enzimática • Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración

de sustrato • Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk

MATERIALES y REACTIVOS

• Colorímetro • Tubos de ensayo y gradilla; micropipetas y pipetas de 5 y 10 ml, y diversos frascos • Material biológico: suero (contiene la enzima BuChE) • Butiriltiocolina (BuTCh) 6 mM en agua • Tampón fosfato 0.1M pH 7,4 • Ácido 5,5’-ditiobis nitrobenzoico (DTNB), 0.9 mM, en tampón fosfato 0.1M pH 7,4 • El alumno traerá: cronómetro, calculadora y regla para las gráficas.

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MÉTODO Ensayo de actividad enzimática El alumno va a observar: 1) La formación de producto con el tiempo.

2) El efecto de la concentración de sustrato. Preparación de disolución diluida de suero (enzima) El tubo de ensayo etiquetado "enzima" (distinto a todos los demás de la gradilla), contiene 1 ml de suero y 9 ml de tampón fosfato pH 7.4. Tener en cuenta que es una disolución 1:10 para realizar los cálculos del factor “f” (ver más adelante; ya que al pipetear 1ml, tomamos sólo 0.1 ml suero). Recordar mezclar bien cada vez que pipeteis. Procedimiento: 1) Disponer de tubos de ensayo pequeños utilizables en el colorímetro. Etiquételos del 1 al 6 (más un tubo para el cero o blanco).

2) A continuación, prepare los tubos 1 al 6 de acuerdo con el protocolo del esquema siguiente. Esquema protocolo ensayo actividad enzimática

B 1 2 3 4 5 6 Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0

Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0 DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1

No añadir el enzima hasta el momento de la medida Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1

Volumen total: 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Para ello:

• Añadir el volumen de sustrato (butiril-tiocolina o BuTCh) y de agua indicado para completar.

• Añadir 1 ml de disolución de DTNB (agitar y esperar 2 minutos hasta primera medida).

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3) Antes de la primera medida de actividad, usar el tubo “blanco” que contiene sólo 2 ml de agua y 1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro.

4) Ahora va a añadir la enzima. Tenga en cuenta que una vez añadida la enzima ya ha empezado la reacción enzima-sustrato. Tenga a mano: la disolución de enzima, un trocito de parafilm, una pipeta de 1 ml y un reloj o cronómetro con el que pueda medir segundos. Debe terminar la reacción en un tubo para añadir la enzima al siguiente.

El procedimiento es el siguiente:

• Añadir 1 ml de enzima, • mezclar dándole la vuelta tapando el tubo con parafilm, • poner en marcha el cronómetro, • inmediatamente después introducir el tubo en el colorímetro, • cada 20 segundos, durante 2 minutos, anote el valor de absorbancia (a 410 nm).

Entre las medidas de los distintos tubos, si otro compañero está esperando, cede el uso del colorímetro. * En general es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene dispararla con la enzima. Ello nos lleva a despreciar el valor de hidrólisis espontánea. Un inconveniente del método es la interferencia que producen los grupos tioles libres presentes en las proteínas de la muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida enzimática. Ello se evita, en parte, incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato, hasta que los grupos tioles se valoren convenientemente. La adición de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE, si sólo una de ellas está presente, como es el caso, se pueden omitir.

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CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Una Unidad Internacional de actividad enzimática (UI o U) es la cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por minuto (unidad de tiempo) en las condiciones de ensayo (1 U= 1 µmol/min)

Partimos de la Ley de Lambert-Beer, ya que la relación absorbancia / concentración sigue dicha Ley de Lambert-Beer:

Absorbancia = e×C×L Siendo:

e = coeficiente de extinción molar del cromóforo (litro / mol×cm) C = concentración molar de producto formado (moles / litro) L = longitud del paso óptico (para la cubeta de medida usada: 1 cm)

Por tanto podemos despejar la concentración del producto, y el resto de parámetros los conocemos:

C = Abs / (e×L) En nuestra reacción colorimétrica: e =1,36×104 (moles / litro) y L = 1 (cm).

Así, para calcular la actividad enzimática usaremos el valor del incremento de absorbancia (DAbs) frente al tiempo (aparición de producto coloreado).

Dicho de otro modo, debemos calcular la aparición de producto (o desaparición de sustrato) por tiempo. En la ecuación de Lambert-Beer dividimos entre tiempo… C/ Dt = (DAbs/ Dt) / (e×L) Y ya tendremos estimación de la actividad enzimática. Para los cálculos del DAbs lo primero se representa la absorbancia de cada tubo, en los tiempos sucesivos, frente al tiempo, y comprobamos si la misma es más o menos lineal. *para los cálculos debe usarse sólo su tramo lineal

La pendiente de la recta de Abs frente a tiempo nos proporcionaría el dato del incremento de absorbancia (DAbs) frente al tiempo (DAbs /seg o min), ya que en y = m×x + n; y la pendiente o m = Dy / Dx, en este caso y=Abs y x= tiempo. Para facilitar los cálculos sin la necesidad de obtener el valor numérico de la pendiente también podemos directamente calcular el DAbs por min yendo a valores obtenidos experimentalmente que se ajusten mejor a la recta [por ej. calcular la diferencia de Absorbancia entre los segundos 0 y 60 seg, o 20 y 80 seg, o 40 y 100 seg, etc. (siempre 1 min)]. Así, si sustituimos este dato (DAbs / min) en la ecuación: C/ Dt = (DAbs/ Dt) / (e×L), obtendremos el valor de actividad enzimática: DC/min (moles / Litro×min). Obviamente debemos considerar los volúmenes de muestra (y totales) que usamos. Así, en realidad para calcular la actividad enzimática por ml, empleamos la expresión:

Actividad en U/ml (µmol / min×ml) = [(DAbs/min)×103×Vt] / [1,36×104×1×Vm]

Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima). 103 es un factor de conversión [resultante de pasar de moles a µmoles (103), y de litros a ml (103]

Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que:

Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (DAbs/min) ×f

Calculad dicho factor f para nuestros ensayos. Así pues, debe comprobar la linealidad de DAbs gráficamente, calcular el DAbs/min y multiplicar este valor por el factor “f” para obtener la actividad (velocidad de reacción) en µmol/min /ml suero

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RESULTADOS *Entregar al Profesor esta hoja de manera individual o por parejas (marcar modalidad según elección) junto a las de cálculo después de la práctica y antes de abandonar el laboratorio CUESTIONES PRÁCTICA NOMBRE Y APELLIDOS: Nº MATRICULA: DNI: GRUPO (al que pertenece): nº puesto: FECHA DE LA PRÁCTICA: 1.1. ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de butirilcolinesterasa? 1.2. ¿Y por qué usar butiriltiocolina y no butirilcolina en este ensayo (método de Ellman)? 1.3. ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas para el ensayo de la butirilcolinesterasa en el suero de pollo? 2.1. En la práctica, y para realizar el ajuste manual en la gráfica de velocidad frente a [sustrato], asumimos que se cumple la ecuación de Michaelis – Menten, ¿a qué tipo de curva ajustamos dicha representación? ¿qué representa la KM en dicha gráfica? 2.2. ¿De qué grafica es más exacto realizar los cálculos de KM y Vmáx? (según gráfica representada más adelante) 3.- En las hojas siguientes deberá incluir los siguientes cálculos: - Las tablas de Abs y las gráficas de absorbancia frente a tiempo - Tabla con valores de DAbs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] para cada tubo - Gráfica de v frente a S y gráfica de 1/v frente a 1/S (realizadas con el ordenador) - Valor obtenido de KM y Vmáx (con unidades) A continuación se recogen los DATOS y CÁLCULOS (entregar sólo una copia por pareja de prácticas)

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REGISTRO DE LOS DATOS EXPERIMENTALES Comprobar la linealidad del incremento de Absorbancia y calcular el ∆Abs/min para al menos 2 intervalos de 1 min, usar el valor promedio como ∆Abs/min de cada tubo

TUBO 1 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 2 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 3 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

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(continuación)

TUBO 4 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 5 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

TUBO 6 T (sg) Abs410

0 20 40 60 80

100 120

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Calculad la actividad enzimática en U/ml suero (µmol/min×mL de suero) Con el cálculo del factor “f” es inmediato el cálculo de la actividad (v0, velocidad de reacción)

Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (DAbs/min) ×f

INDIQUE SU VALOR f= Realizar ahora el cálculo para cada tubo ([S0]): TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 DAbs/min V(µmol×min-1×ml-1) S (µM) *Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, debe aplicar la fórmula de que los equivalentes iniciales y finales de sustrato.

Vi × Si = Vf × Sf Por ejemplo, para el tubo 1: 0.05ml × 6mM = 3ml × S1 → (S1 = 0.1 mM)

B 1 2 3 4 5 6 Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0

Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0 DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1

Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1 Volumen total: 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml De la misma forma anterior, halle las concentraciones S2 hasta S6, y expresarlas en valores µM. Contamos pues con 6 pares de valores, v0, [S0], (uno por cada tubo) para la representación de Michaelis–Menten: v0 frente a [S0] Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten La representación se realizará en los ordenadores del laboratorio, bajo las indicaciones del profesor responsable. Una vez representados los puntos se realizará un “ajuste manual” a una hipérbola rectangular. Téngase en cuenta la dificultad del ajuste al representar tan sólo 6 puntos; por ello el cálculo de la Vmax ni la KM se realizará en la gráfica de dobles inversos.

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En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco preciso, por lo que usamos la representación de Lineweaber-Burk o de dobles inversos, por lo que primero calculamos 1/v y 1/[S] de la tabla anterior TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 1/V 1/S Con estos 6 pares de valores, 1/v0, 1/[S0], (uno por cada tubo) realizamos la representación de dobles inversos calculando los valores de Vmax y KM por los puntos de intersección con los ejes

De nuevo recurrimos al uso del ordenador para la representación de la gráfica y en este caso también para el ajuste de la recta y los puntos de corte con los ejes de donde obtendremos los valores de la Vmax y la KM (puntos de corte. Indicar dichos valores con sus unidades correspondientes.