Universidad Industrial de SantanderFacultad de Salud

Escuela de microbiologíaFisiología microbiana 2015

INTEGRANTES:María Kamila Prieto Monsalve 2140321Viviana Marcela Vaca Celis       2140321Karen Natalia Villamizar Ojeda 2140327

27-07-2015IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES EN AGUAS RESIDUALESPROTOCOLO DE LABORATORIO

Pruebas bioquímicas para identificación de Coliformes.Bacilos Gram negativos.

Pruebas bioquímicas

TSI LIA citrato de

Simmons

SIM fenilala-nina (PPA)

Motili-dad

rojo de

metilo

Voges Proskau

er

malonato

caldo nitrato

Klebsiella A/A Gas: + H2S: -

k/k + - - - +

Citrobacter K/A o A/A

gas + y H2S +

K/A H2S +

+ + + -

Enterobacter

A/A Gas: + H2S: -

k/k + + - +

Fundamentos y siembra.

LIA (Lisina hierro agar)Tocar el centro de una colonia pura, realizar punción del medio hasta el fondo dos veces y estriar en el pico de flauta, dejar sin asegurar la tapa del tubo. Incubar a 351C por 18-24 horas.

Fundamento: Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.Sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina descarboxila y la lisina desaminasa, además la presencia de sales de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.El indicador del PH del medio es PÚRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez viraal color amarillo y en alcalinidad al color púrpura. Por contener pequeña cantidad deGlucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.

RESULTADOS

1- Decarboxilación de la lisina:-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminación de la lisina:Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)

SIM:

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias. INDOL•Para identificar el Indol, el medio tiene peptonas, y el aminoácido triptófano el cual si las bacterias tienen la enzima triptofanasa hace que se libere el indol (Grupo funcional del triptófano). Si se libera el indol, éste reacciona con Paradimetil Benzaldehído (Kovac)RESULTADOS

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

•Color Rojo: positivo•Color Amarillo: Negativo(No se liberó indol porque la bacteria no tiene triptofanasa)ÁCIDO SULFHÍDRICO H2S•El medio tiene tiosulfato, el cual libera ácido sulfhídrico que es un gas. Éste reacciona con la Sal de Hierro y forma un precipitado negro que es sulfuro ferroso•Color Negro: Positivo (debido al precipitado)•Sin precipitado Negro: Negativo

MOVILIDAD•Movilidad Negativa: Si la cepa crece solo en la picadura es inmóvil• Movilidad Positiva: Si crece en todo el medio, es móvil.Siembra: Por picadura. Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.

FENILALANINA (PPA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.

Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inóculo denso estriando la superficie del medio.

Incubación: Incubar de 18 a 24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Luego, se debe realizar el revelado: agregar unas gotas de una solución acuosa de cloruro férrico al 10%

Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por acción de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a producir una acidificación del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la aplicación de 0,2 - 0,3 mL de Cloruro férrico al 10 %, si hay en el medio ác. fenilpirúvico aparece una coloración verde-azulada.

RESULTADOS

- Agregar 4 a 5 gotas de Fenilalanina Reactivo (REF B1550461).

- Rotar el reactivo con suavidad sobre el pico de flauta.

- Observar el color dentro de los primeros 5 minutos.

Positivo: desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación.

Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo.

CALDO NITRATO: REDUCCIÓN DE NITRATO A NITRITO.Con esta prueba se investiga la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos convirtiéndolos en nitritos o en nitrógeno, es decir se estudia la presencia de nitrato reductasa y nitrito reductasa.Se utiliza el medio de cultivo caldo nitrato. Para revelar la presencia de nitritos en el medio se emplearán dos reactivos: reactivo A (ácido sulfamínico al 0.8% en ácido acético glacial 5N) reactivo B (α-naftilamina al 0.5% en ácido acético glacial 5N) se añadirán tras la incubación.

procedimiento: El medio de cultivo líquido se inocula introduciendo en él una carga de bacterias de la cepa en estudio mediante el asa bacteriológica. Se incuba a 37ºC durante 24 horas y tras la incubación se añaden dos gotas de los reactivos A y B de nitratos que revelarán la presencia de nitritos en el medio.Si los nitratos han sido reducidos, el caldo de cultivo virará a un color rojo intenso por la presencia de nitritos. Si todo el nitrato ha sido reducido hasta nitrógeno, no se revelará la presencia de nitritos, pero se observará la aparición de burbujas de nitrógeno que se desprenden dentro del tubo (similar a burbujas de cava).

MOTILIDAD

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.

En el medio de cultivo, la tripteína, que es un digesto pancreático de caseína, constituye la fuente de nitrógeno, aminoácidos y carbono necesarios para favorecer el crecimiento bacteriano. Además es una fuente importante de triptófano, lo cual permite la detección de la enzima triptofanasa. Esta enzima, actua sobre el triptofano y se libera indol, el cual se combina con el aldehido presente en el reactivo revelador (reactivo de Kovacs o de Erlich), originando un compuesto de color rojo. El cloruro de sodio permite mantener el balance osmótico del medio. El agar es el agente solidificante, el cual se encuentra en una concentración que le da la características de medio semisólido, util para evidenciar la motilidad bacteriana.

Resultados

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.