8/16/2019 Pruebas Rápidas Para La Obtención de Microorganismos

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PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCIONUna de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicaciónde una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismoscon el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del procesoinfeccioso y para conocer las implicaciones patológicas, la evolución clínica, yaplicar una terapia antimicrobiana eficaz, un pilar fundamental en la práctica de lamicrobiología clínica lo constituye la asignación de especie a un aislamientomicrobiano.

MÉTODOS FENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodosconvencionales, basados en las características fenotípicas, puesto que surealización y coste los ace más asequibles. !os métodos genotípicos suelenreservarse para las bacterias que no se pueden identificar con métodosconvencionales.

1. IDENTIFICACIÓN1.1. Característ cas ! cr"sc#$ cas.

"l estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la forma, la manera deagruparse, la estructura de las células y su tama#o. !as tinciones son el primer paso, y ocasionalmente el $nico, para la identificación bacteriana. !as tincionesmás utilizadas e imprescindibles son la del azul de metileno y la de %ram. !atinción de %ram es, a menudo, la primera y $nica erramienta de la que nosservimos para acer un diagnóstico provisional en el proceso de identificación dela mayoría de las bacterias teniendo en cuenta también el tipo de muestra y eldiagnóstico presuntivo del proceso infeccioso. "stos son algunos de los términosutilizados para preparaciones te#idas& ' tinción& uniforme, irregular, unipolar,bipolar, etc. ' forma& cocos, bacilos, cocobacilos, filamentosos, bacilos curvos, etc.' cápsula& presente o ausente ' endosporas& ovales, esféricas, terminales,subterminales ' tama#o& cortos, largos, etc. ' bordes laterales& abultados,paralelos, cóncavos, irregulares ' e(tremos& redondeados, puntiagudos 'disposición& parejas, cadenas, tétradas, racimos, etc. ' formas irregulares&variación en forma y tama#o, ramificados, fusiformes, etc. "n algunos casos, lainformación derivada de las tinciones puede comunicarse inmediatamente alclínico, siendo de gran relevancia y utilidad como en tinciones del !)* en el

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requisitos pero en muc as ocasiones se necesitan además otras sustanciasadicionales como vitaminas, factores o aminoácidos esenciales.

Pr*e,as -*e se *t ' a/ e/ 'a 0e/t & cac #/ $re' ! /ar c"/ 'ect*ra/!e0 ata2

Cata'asa. !a catalasa es un enzima presente en la mayoría de losmicroorganismos que poseen citocromos. !as bacterias que sintetizancatalasa idrolizan el peró(ido de idrógeno en agua y o(igeno gaseosoque se libera en forma de burbujas. "l principal objetivo de esta prueba esseparar Micrococacceae 1positiva2 deStreptococcus spp . y Enterococcusspp . 1 egativa2

• O3 0asa. "sta prueba sirve para determinar la presencia de enzimaso(idasas. !a reacción de la o(idasa se debe a la presencia de un sistemacitocromoo(idasa que activa la o(idación del citocromo el cual es reducidopor el o(ígeno molecular produciéndose agua o peró(ido de idrógenoseg$n la especie bacteriana. "l o(ígeno act$a por tanto como aceptor finalde electrones en la cadena transportadora de electrones. -or lo general, elsistema citocromoo(idasa solo se encuentra en las bacterias aerobias,algunas anaerobias facultativas y, e(cepcionalmente, en algunamicroaerófila 1;ibrio fetus2, pero las bacterias anaerobias estrictas carecende actividad o(idasa. Asimismo, la presencia de o(idasa va ligada a laproducción de catalasa, ya que ' galactosidasas2, no pueden actuar sobre ellaporque les faltan las enzimas e(tracelulares apropiadas 1permeasas2. -araconocer si un microorganismo es productor de >'galactosidasa, basta

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a#adir el compuesto orgánico @'nitrofenil' >'='galactopiran sido 1@ -%2que es incoloro. 3i la bacteria posee las enzimas idrolizantes 1>'galactosidasa2, el compuesto se transforma en ortonitrofenol, un derivadocromogénico de color amarillo. :odas las bacterias fermentadoras lentas dela lactosa son > 'galactosidasa positivas.

• A! /"$e$t 0asa2 P;R. !a !pirrolidonil'>'naftilamida sirve como sustratopara la detección de pirrolidonil peptidasa. 3e utiliza principalmente en laidentificación de Streptococcus pyogenes y "nterococcus spp. :ambién enla diferenciación de Staphylococcus lugdunensis de otros estafilocoscoagulasa negativa.

• LAP. 3e utiliza para la detección de la enzima leucina aminopeptidasa1!A-2 y es una de las pruebas para la identificación de cocos grampositivoscatalasa negativa+ diferencia específicamente los géneros Aerococcus yLeuconostoc de Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus , y ediococcus.

• Ureasa. =etermina la capacidad de un organismo de desdoblar la ureaformando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. "staactividad enzimática es característica de todas las especies de -roteus y seusa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que

dan negativo o positivo retardado. !a prueba también se utiliza paradiferenciar hysobacter phenylpyruvicus de Mora!ella spp . "elicobacter pylori y #rucella spp . :ambién idrolizan la urea. "sta prueba puede ayudar en la identificación deCryptococcus spp . Bue produce un resultado positivodespués de una incubación prolongada.

• I/0"'. 5ediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivobacteriano. =ic a liberación se debe a la degradación del aminoácidotriptófano mediante el enzima triptofanasa.

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Pr*e,as 'e/tas c"/ 'ect*ra 0e 1< a =" 0e !et '" . "l rojo de metilo es un indicador de p?. Act$a entre p? 9,8y C,D variando desde rojo 1p? 9,82 a amarillo 1p? C,D2. 5ediante estaprueba se comprueba la capacidad de un microorganismo de producir ymantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de laglucosa por la vía de la fermentación ácidomi(ta. 3e utiliza como parte de laidentificación a nivel de especie de los bacilos entéricos gramnegativos.

• ?"(es8Pr"s@a*er. -ermite observar si el microorganismo fermenta laglucosa por la vía butanodiólica. 3i es así, se forma un producto intermedio

1acetoína2 que forma un complejo de color rojizo con el E'naftol. 3e usa enla identificación a nivel de especie de bacilos entéricos gramnegativos, Aeromonas spp., y $ibrio spp .

• A(ar 6 err" 0e ' ('er. 5ediante esta prueba se puede determinar&a. !a capacidad de un microorganismo de metabolizar un idrato de

carbono específico 1en este caso glucosa, lactosa o ambas2 incorporadoen un medio de crecimiento básico.

b. -roducción o no de gases& )@8 e ?8 como productos finales delmetabolismo de los idratos de carbono.

c. -roducción de ácido sulf 4drico 13?82. "l medio de Fligler contiene comoidratos de carbono la glucosa y la lactosa. "(iste otro medio, el triple

sugar iron 1:3G2 que posee un tercer idrato de carbono, la sacarosa.

• Fer!e/tac #/ 0e a cares . !as bacterias anaerobias o anaerobiasfacultativas a menudo fermentan carbo idratos ácidos orgánicos y gas 1?8o )@82. "stos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador dep?.

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• ) 0r#' s s 0e 'a esc*' /a. ?ay microorganismos con capacidad deidrolizar la esculina en esculetina y glucosa. !a esculetina reacciona con

una sal de ierro para formar un compuesto casta#o oscuro o negro. "lcitrato férrico act$a como indicador de la idrolisis de la esculina. 3i sea#ade bilis al medio se in ibe el crecimiento de la mayoría demicroorganismos del género Streptococcus pero no de la especieStreptococcus bovis y tampoco in ibe el crecimiento de microorganismosde los géneros Enterococcus y Listeria.

• C"a(*'asa. -ermite determinar la capacidad de coagular el plasma por laacción de la enzima coagulasa. 3e utiliza para diferenciar S. aureus1coagulasa positivo2 de otras especies de Staphylococcus. !a prueba de lacoagulasa en tubo se puede leer tras incubación de 9 , pero si es negativadebe incubarse asta 89 .

• Fe/ 'a'a/ /a80esa! /asa. "sta prueba determina la capacidad de unmicroorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácidofenilpir$vico por la actividad enzimática de la fenilalanina desaminasa, conla consiguiente acidez resultante. "sta actividad enzimática escaracterística de todas las especies de los géneros -roteus, -rovidencia y5organella por lo que se utiliza para separar estos tres géneros de otrosgéneros de enterobacterias.

• ADNasa. 3e basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias paraidrolizar enzimáticamente el A= produciendo una mezcla de mono y

polinucleótidos.

• ) 0r#' s s 0e 'a (e'at /a . "sta prueba muestra la capacidad de ciertosmicroorganismos para idrolizar la gelatina a péptidos y aminoácidos,mediante la acción de enzimas específicas denominadas gelatinasas.

• Descar,"3 'asas . !a descarbo(ilación es un proceso en el cual lasdescarbo(ilasas atacan el e(tremo carbo(ilo de los aminoácidos, formandola correspondiente amina. !os tres aminoácidos que se ensayan en laidentificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. !adescarbo(ilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina 1diaminas2,

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mientras que la descarbo(ilación de arginina da citrulina por acción de unade idrolasa. "sta prueba se debe realizar con un tubo control que contieneel medio base sin aminoácido. )omo la descarbo(ilación es una reacciónanaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril."l proceso se produce en dos etapas& por fermentación de la glucosa se

produce una acidificación del medio 1p? H C,I2, apareciendo color amarillo.!a acidificación es necesaria para que ocurra la descarbo(ilación. "ste$ltimo proceso da lugar a la formación de las aminas que elevan el p? con

el consiguiente viraje del indicador a color violeta. "sta prueba se utilizatanto en la identificación de bacilos gramnegativos como de bacilos y cocosgrampositivos.

• L $asa. 3e basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias dedescomponer las grasas en ácidos grasos y glicerol, por acción de laenzima lipasa.

• Lec t /asa. !a prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción dedic a enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar sobrela lecitina, sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenidaprincipalmente en la yema de uevo.

• Ut ' ac #/ 0e c trat". "sta prueba sirve para determinar si unmicroorganismo es capaz de utilizar citrato como $nica fuente de carbono ycompuestos amoniacales como $nica fuente de nitrógeno en sumetabolismo, provocando una alcalinización del medio. "ntre lasenterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros&Enterobacter , %lebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de3almonella. 3in embargo, Escherichia, Shigella, &ersinia, Salmonella typhi ySalmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como nicafuente de carbono.

• Ut ' ac #/ 0e !a'"/at" . -one de manifiesto la capacidad que poseendeterminadas bacterias de utilizar el malonato de sodio como $nica fuentede carbono, con la consiguiente liberación del catión, que en presencia deiones agua produce alcalinidad. 3olamente los microorganismos quepueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de carbono ysulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de ejercer unaacción tampón produciendo idró(ido de sodio. "l aumento de la alcalinidadresultante ace que el azul de bromotimol cambie de verde a azul. !osmicroorganismos malonato negativos que fermentan glucosa acen que el

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indicador cambie de verde a amarillo. 3e utiliza en la diferenciación deespecies entre las "nterobacteriaceae. !a mayoría de las especies de"nterobacter y Flebsiella utilizan malonato de sodio.

•

Pr*e,a 0e CAMP . 3irve principalmente para determinar la capacidad de unmicroorganismo para producir una proteína conocida como factor )A5-. !aproteína produce un efecto sinérgico con la >' emolisina de 3. aureussobre eritrocitos ovinos y bovinos que se observa como un fenómeno líticoen la intersección de los dos microorganismos cuando se siembran enpro(imidad. )omo alternativa se puede utilizar el )A5- inverso. "n estaprueba la emólisis producida por algunos microorganismos se in ibe por la>' emolisina de 3. aureus 1por ejemplo, la producción de fosfolipasa = de

Arcanobacterium aemolyticum o la fosfolipasa " de * odococcus spp.2

Pr*e,as ,asa0as e/ 'a res ste/c a a c ertas s*sta/c as • O$t"-* /a. "l clor idrato de etil idro(icupre4na 1optoquina2 in ibe a muy

baja concentración 1/ JgKml o menos2 el crecimiento de 3. pneumoniae,mientras que no afecta al crecimiento de otros 3treptococcus alfa'

emolíticos.

• Bac trac /a. "sta prueba puede utilizarse como diagnóstico presuntivo enla identificación de 3treptococcus beta emolítico del grupo A de !ancefield,ya que, a diferencia de la mayoría de los estreptococos, suelen ser sensibles a bajas concentraciones de bacitracina.

• S"'*, ' 0a0 e/ , ' s. 3e basa en la capacidad de determinadas especiesbacterianas de lisarse en presencia de sales biliares, las más utilizadas delas cuales son el taurocolato y el deso(icolato de sodio. Ambas provocan undescenso de la tensión superficial, que, unido a la actuación de enzimasautolíticos, destruyen la célula. "l efecto de esta enzima autolítica se ponede manifiesto sobre colonias de 3. pneumoniae crecidas en medios sólidos,en las que se aprecia una umbilicación central, y también en coloniasmucoides.

• Crec ! e/t" e/ ca'0" 6 $ersa' /". =etermina la capacidad de algunosmicroorganismos de desarrollarse en medios de cultivo con unaconcentración de cloruro sódico del C,/L.

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B ,' "(ra&ía2

• Mernández, A. %arcia.).3aéz, N O ;aldezate, 3. 18I6I2. 5etodos deidentificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. 5ayo 68, 8I6C,de seimc 3itio Peb&

ttps&KKPPP.seimc.orgKcontenidosKdocumentoscientificosKprocedimientosmicrobiologiaKseimc'procedimientomicrobiologiaDQ.pdf