Puesta a punto de métodos de aislamiento y caracterización de eosinófilos de sangre periférica y de la línea eosinofílica AML14.3D10

PUESTA A PUNTO DE MÉTODOS IN VITRO PARA EL ESTUDIO DE LA RESPUESTA DEL EOSINÓFILO A MEDIADORES NEURO-HORMONALES

Eloísa Salvo-Romero

Grupo Neuro-Inmuno-Gastroenterología

Vall d’Hebron Institut de Recerca

Hospital Vall d’Hebron. Barcelona Noviembre 2012

Introducción: el eosinófilo

De la médula ósea…..

…. a residente de tejido

Vida media - sangre: 12-20 horas - tejidos: días-semanas

Población 100 veces mayor que la de sangre

Población mayoritaria

Rothenberg et al. Annu Rev Immunol. 2006

Introducción: función clásica

• Células pro-inflamatorias

– Efectoras cruciales en respuesta a parásitos, bacterias y células neoplásicas

– Una acumulación o activación inapropiada tiene efectos tóxicos y dañinos en los tejidos

– Papel importante en la enfermedad inflamatoria intestinal y en las reacciones alérgicas

Mediadores tóxicos pro-inflamatorios

• proteínas catiónicas básicas (MBP, EPO,ECP,EDN) • mediadores lipídicos • citoquinas, quimiocinas • especies reactivas de oxígeno

Giembyczi et al. Pharmacological Reviews.1999

Introducción: visión actual

Jacobsen et al. J Allergy Clin Immunol. 2007

Introducción: eosinófilos en el intestino Interacción con el SNE. Eje eosinófilo-mastocito

Powell et al.Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2010

Involucrados en:

• Homeostasis de la barrera epitelial

• Inmunidad contra patógenos luminales y mantenimiento del equilibrio de la flora

• Interacción con el sistema nervioso entérico(SNE)

Modelo murino Mayor infiltrado de eosinófilos intestinales por el estrés psicológico y expresión de CRH

Días con estrés

MBP CRH

MBP

Zheng et al. Gut. 2009

Colitis ulcerosa

Elevado número de eosinófilos intestinales y de expresión de la hormona liberadora de corticotropina (CRH)

EPO CRH

Wallon et al Gastroenterology 2011

Antecedentes

Linea de investigación

Fisiopatología de la disfunción intestinal mediada por el estrés

• Estudiar la respuesta in vitro del eosinófilo a moléculas neuromoduladoras Puesta a punto de las condiciones experimentales: – Caracterización de linea eosinofílica estable – Aislamiento y caracterización de eosinófilos de sangre periférica de

humanos

Materiales y métodos

• Línea AML14.3D10:

– eosinófilos diferenciados

– producen y almacenan proteínas

en los gránulos

– expresan IL5 y GM-CSF de forma

constitutiva

Curva de crecimiento y subcultivo

Caracterización

• Eosinófilos de sangre periférica:

Puesta a punto del aislamiento

Estudio de reproducibilidad

Caracterización

RT-PCR

Microscopía óptica

Microscopía electrónica

Expresión génica

Análisis morfológico

Expresión proteica

Inmunofluorescencia tinción MBP

Resultados Línea AML14.3D10

• Curva de crecimiento

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2,0E+05

2,0E+07

4,0E+07

6,0E+07

8,0E+07

1,0E+08

1 4 7 9 11 14 16 19

% Viabilidad Nº células

Dias después de la descongelación

Curva de crecimiento

Vivas

Muertas

% VIABILIDAD

1 2 3 4 5 6 7 8 Pase

Pérdida del 60% de células después de la descongelación Viabilidad óptima a partir del día 7 (pase 3) Tiempo de duplicación: 48 horas, 94% viabilidad (pase 7)

• Morfología y ultraestructura celular



• Expresión génica de diferentes pases

• Expresión proteica de MBP

0

1

2

3

4

5

6

7

CCR3 CLC RNASE2 CSF2 CSF3 TACRl TACRs IL5 CRH

RQ

Expresión génica en 3 pases diferentes

RQ pase7

RQ pase23

RQ pase26

Elevada expresión de CCR3, CLC y RNASE2 Baja expresión de CSF2 No expresión de IL5, CSF3, CRH, receptor de SP

Diferencias de expresión basal entre pases

0,0

50,0

100,0

2,3/1 2,3/1 1/11/1

1/11/2

1/4Tubo plastico 50mL

Tubo vidrio 10mL

Proporción sangre diluída/percoll

% pureza obtenida vs proporción sangre/percoll y tipo de tubo

% pureza EOS

% pureza PBPMN

Tipo de tubo

Dilución sangre:PBS 3:1 Proporción sangre-percoll 2,3-1

3 ciclos

Resultados Aislamiento eosinófilos de sangre Puesta a punto del protocolo

Gradiente densidad

•Tipo tubo

•Proporción sangre/percoll

•Dilución sangre

Lisis eritrocitos

•mL suspension PMN+eritrocitos por tubo

Columna magnética

•Tratamiento DNasa

Gradiente densidad

•Tipo tubo


•Dilución sangre

Lisis eritrocitos


Columna magnética


1) Separación gradiente percoll 3) MACS 2) Lisis eritrocitos

MNC

plasma

PMN

eritrocitos

PMN

Plástico Vidrio

0,0E+004,0E+058,0E+051,2E+061,6E+062,0E+062,4E+062,8E+063,2E+063,6E+06

1-11-2

1-4

Nº

Cé

ls/m

L

Proporción sangre-percoll (mL)

Rendimiento vs proporción sangre-percoll

Nº PMN obtenidos

Nº EOS obtenidos

Proporción sangre-percoll

0%

20%

40%

60%

80%

1:4 1:2 1:13:1 Dilución Sangre:PBS

% Recuperación vs dilución sangre

% Recuperación PMN

% Recuperación EOS

Dilución sangre: PBS

Gradiente densidad

•Tipo tubo


•Dilución sangre

Lisis eritrocitos


Columna magnética


0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

46

816 mL PMN+eritrocitos

% Recuperación vs mL PMN+eritrocitos

% recuperación PMN

% recuperación EOS

?


0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

sin tratamiento 1 tratamiento 2 tratamientos

% Recuperación de eosinófilos vs tratamiento con DNAsa

Gradiente densidad

•Tipo tubo


•Dilución sangre

Lisis eritrocitos


Columna magnética



Variabilidad intraindividual. N=2 2 aislamientos

Variabilidad interindividual. N=7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

1 2 1 2

1 2

% r

ecu

pe

raci

ón

EO

S

Aislamiento

Sujeto

% Recuperación EOS Media

recuperación DE CV%

Sujeto 1 (F, 25años)

22,75% 0,003 1,13

Sujeto 2 (F, 37años)

55,27%

0,043 7,82 0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

20 24 31 25 37 38 41

M F

% r

ecu

pe

raci

ón

EO

S

Edad

% Recuperación EOS

Media recuperación

DE CV%

Género M 11,48% 0,031 26,74

Género F 31,94% 0,179 56,18

Total 23,17%

0,168 72,70

Resultados Aislamiento eosinófilos de sangre

Estudio de reproducibilidad

GRADIENTE PERCOLL

-Tubo vidrio

-Proporción sangre-percoll

1-1

-Dilución sangre:PBS 1:1

LISIS

ERITROCITOS

- 2 alícuotas (4mL)

COLUMNA

MAGNÉTICA

- 2 tratamientos

DNAsa


Resultados Aislamiento eosinófilos de sangre

• Análisis morfológico y ultraestructura celular

Dextrano 4,5%

sangre:dextrano 5:1

30’

DEXTRANO:

Cantidad eritrocitos

Eficiencia en la etapa de lisis

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

38 29 36 50

F M

edad

% Recuperación EOS con dextrano

% recuperación EOS

Media

DE CV% Recuperación %

Total 70,10% 0,215 3,25

Resultados II Aislamiento eosinófilos de sangre

Aumento recuperación celular

Protocolo con dextrano • Análisis morfológico


Resultados II Aislamiento eosinófilos de sangre Aumento recuperación celular

Conclusiones

LÍNEA CELULAR AML14.3D10

• El crecimiento del cultivo es estable a partir del pase 7, con una viabilidad superior al 90% y tiempo de duplicación de 48 horas.

• Expresión génica inestable en el tiempo. No expresan IL5 y expresan poco GM-CSF (CFS2).

• La morfología es característica de un estado inmaduro (mielocitos eosinófilos)

EOSINÓFILOS DE SANGRE PERIFÉRICA

• Optimización del protocolo aislamiento: pureza del 99% y un rendimiento de recuperación de sangre del 70%

• La morfología es característica de células maduras

Documents

Puesta a punto de métodos de aislamiento y caracterización de eosinófilos de sangre periférica y de la línea eosinofílica AML14.3D10