Química de los Flavonoides, Aislamiento y caracterización de

Isoflavonas y su Actividad Biológica

Q.F Heinz Jungbluth Ganoza

Lima, UIGV, Junio 2013

Introducción

• Pigmentos naturales con una estructura carbonada C3-C6-C3 o mas, específicamente con un grupo fenilbenzopirano, dependiendo de la unión del grupo aromático con el núcleo benzopirano (cromano) serán, flavonoides 2-fenilbenzopirano, isoflavonoides 3-benzopirano, neoflavonoides 4-benzopirano

2-fenil Benzopirano

Isoflavonoides

Neoflavonoides

Flavonoides Minoritarios

Botánica

Isoflavonas

• Distribución: Las Isoflavonas se hayan presentes mayoritariamente en la familia de las leguminosas (Fabaceae) , preferentemente en la subfamilia papilionideae, existen grandes revisiones de investigaciones sobre la presencia de Isoflavonas en esta subfamilia como la de Veitch (2007, 2009). Se encuentran presentes en los frutos de esta familia (Legumbre) y en las raíces o rizomas (mecanismo de fijacion de Nitrogeno)

Química

Isoflavonas

• Características químicas resaltantes: Las isoflavonas difieren de sus respectivos flavonoides por la migración de un anillo aromático de C2 a C3. Mayores cambios en la estructura dependerán de su Hidroxilacion, metoxilacion, o metilendioxisustitucion, prenilacion y Glicosilacion.

Isoflavonas

Biosíntesis

BiosíntesisLas Isoflavonas proceden de la ruta de los Fenilpropanoides, pero el paso crucial para convertirse en Isoflavonas esta en la conversión de la respectiva flavanona en una Isoflavona, la enzima que realiza este proceso es la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS) luego se produce una dehidratación mediante la 2-hidroxiisoflavona dehidrasa convirtiéndola en una Isoflavona( todas estas enzimas ya han sido caracterizadas convenientemente)

Biosíntesis• Regulación: • La vía del ácido shikímico es dependiente de la luz.• La acción de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la vía biosintética de los

flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello está estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa es activada por la luz, y depende además de la concentración de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de estrés, como puede ser la falta de agua ("estrés hídrico"), infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV, y el frío (por esto último las plantas sometidas a bajas temperaturas suelen presentar coloraciones rojizas en tallos y hojas, y cuando los inviernos son muy fríos, las flores desarrollan colores muy intensos en la primavera siguiente).

• Hay isozimas dedicadas a la producción de flavonoides diferentes en respuesta a señales ambientales diferentes

Fitoquímica

OBTENCION DELMATERIAL

SECUENCIA DE INVESTIGACION

- Colectar planta completa, flor y fruto.- Por duplicado.- Anotar nombre vernáculo y científico.- Hábitat, tamaño, aspecto y color de los órganos recogidos- Clima, altitud, abundancia o escasez de la especie.- Una foto.

IDENTIFICACION

- Por un botánico de experiencia- Buen manejo de literatura- Guardar muestra herborizada

DESECACION

- Para eliminar H2O y evitar alteración.- Hacerle gradualmente-- cambios de lugares.- Aire libre, en el sol sobre papel que se cambia diariamente.- Estufa: temperatura controlada+ aire forzado

Obtención del material vegetal

Desecación y conservación

(estabilización)

Identificación taxonómica y

sus partes

Tamizaje fitoquimico

Extraccion P. activos

Aislamiento y caracterización

del P. A

Formulación

PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA

Aislamiento

• Existen muchas vias de aislar y separar una isoflavonas, lo mas importante es reconocer el material del cual se esta extrayendo (material vegetal, muestra biológica, Alimento), la presencia de carbohidratos y compuestos lipofilicos, afectara el desarrollo del metodo.

Aislamiento

• SPE: (Solid Phase Extraction): Para poder evitar la mayor cantidad de interrupciones en la matriz, como medio de purificación podemos utilizar cartuchos de SPE C1; eluyendo el extracto en el cartucho y luego pasando a través del mismo MeOH con pequeñas concentraciones de Acido acético.

Aislamiento

• Partiendo de una muestra vegetal: La utilización de Material Seco, podría hacer decrecer la presencia de Isoflavonas, de preferencia utilizar material fresco. Flavonoides altamente acilados suelen ser lábiles a temperaturas muy altas y frecuentemente son degradados durante el proceso de secado.

Aislamiento

• Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas)

• Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto.

• Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal

Aislamiento

• Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona.

• Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.

Aislamiento

Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas.Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RPFases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos

Solventes de desarrollo

Serie eluotropa

El poder eluyente aumenta con la

Polaridad del disolvente

-Hexano-Tetracloruro de carbono-Benceno-Diclorometano-Cloroformo-Eter dietilico -Acetato de etilo-Acetona-Isopropanol-Etanol-Metanol-Agua

Aumenta el poder eluyente

Polaridadcreciente

Extracción de Flavonoides

Maceración lixiviación

Filtración

Separación por resina AMBERLITE XAD2

Recuperar en MeOH

Rotaevaporar a 40C

Disolver en Agua

Aglicona

Someter a Hidrólisis acida a 60C

Glicosidos

Extraer en BuOH y redisolver en MeOH

Caracterización

• Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.

Características espectrales de las Isoflavonas

Espectroscopia UV

La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A

Características de las espectroscópicas:• Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de

absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A.

• La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.

Espectroscopia uv

Reactivos de Desplazamiento

Técnicas Espectrométricas

• Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C.

• El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.

Espectrometría de masas

Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta

iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas

convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se

separan al ser acelerados por un analizador de masa: la

separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.

Espectrometría de masas

ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Componentes del instrumento

Introducción de la muestra

Fuente de ionización

Separador de masas

Detector iónico

Procesador de señal

Registrador

El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante

Ionización por impacto electrónico

Ionización química

Fuente de bombardeo con átomos rápidos

Desorción con láser

Ionización a presión atmosférica:

- Electronebulización asistida con un gas: electrospray

- Ionización química a presión atmosférica

- Fotoionización a presión atmosférica

Fuentes de ionización

HPLC

Ionización por impacto electrónico

placa de repulsión

placas focalizadoras

haz de electrones (70 eV)

moléculas neutrasmoléculas neutras

placas aceleradoras (4000 V)

filamento de W

iones

M + e M.+ + 2e

ion molecular

Fragmentación del ion molecular

Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)

Fragmentación del ion molecular

ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+

Colisión seguida de fragmentación

ABCD.+ ADBC.+BC. + AD+

AD. + BC+

Reordenamiento seguido de fragmentación

ABCD + e ABCD.+ + 2 e

ABCD.+ A+ + BCD.

A. + BCD+ BC+ + D

CD. + AB+

AB. + CD+

B + A+

A + B+

D + C+

C + D+

Ionización química

CH4+ + CH4 CH5

+ + CH3

CH3+ + CH4 C2H5

+ + H2

CH5+ + MH MH2

+ + CH4

C2H5+ + MH M+ + C2H6

CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3

+

Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr)

Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito

Espectrómetro de masas de sector magnético

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo

Espectrómetro de masas de trampa iónica

Separador de masas

Espectrómetro de masas de sector magnético

¿cómo se separan los iones de distinta masa?

m : masa v : velocidad de la partículam : masa z : cargaV : diferencia de potencial

FM = Bzv

FC = mv2/r

mv2/r = Bzv

v = Bzr/m

FM : fuerza centrípetaFC : fuerza centrífuga B : campo magnético r : radio de curvatura

Bzr/m = (2zV/m)½

m/z = B2r2/2V

Ecinética = ½ mv2 = zV

v = (2zV/m)½

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Ø = 6 mm

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Pot

enci

al c

orrie

nte

dire

cta

tiempomasa

Pot

enci

al d

e ra

diof

recu

enci

a

Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)

pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

Espectrómetro de masas de trampa iónica

electrodo anular central

tapatapa

Vrf

Esquema detector de trampa iónica (ITP)

Espectros de masas

Energía de ionización de la molécula

Grupos funcionales de la molécula

Método de ionización

Presión y temperatura de trabajo

Diseño instrumental

Dependen de:

Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico

En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3

Etilbencenopico base

ion molecular (ion “parent”)

M+ → fragmento de mayor masa

molécula con número par de N → M+ con masa par

molécula con número impar de N→ M+ con masa impar

4 H → M-4 F → M-19CH3→ M-15 HF → M-20NH3 → M-17 C2H2 → M-26H2O → M-18

Átomos y grupos frecuentemente desplazados

Espectros de masas de cloruro de metileno

13C1H235Cl2 (m= 85)

12C1H235Cl37Cl (m= 86)

13C1H235Cl37Cl (m= 87)

12C1H237Cl2 (m= 88)

Picos isotópicos12C1H2

35Cl2 (m= 84)

pico base → pérdida de Cl

Impacto electrónico

El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue

Impacto electrónico

Espectros de masas de pentobarbital (sedante)

Ionización química

Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)

Ionización química

Impacto electrónico

Sistemas de acople

Cromatografía Gaseosa – Espectrometría de Masas

Separador de chorro (columnas rellenas)

desde el CG

constricción de salida

tubo de vidrio poroso

cámara de evacuación

hacia la bomba

collarín que se atornilla en el receptáculo de fuente iónica

constricción de entrada

A cámara de

ionización

Ensamblaje con columnas capilares

Sistema de acople

Cromatografía Líquida – Espectrometría de Masas

Sistema de ionización

Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución

Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI)

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

Fotoionización a presión atmosférica (APPI)

Ionización a presión atmosférica

Electronebulización asistida con un gas

Electrospray (ESI)

Electrospray (ESI)

1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)

2. El solvente de la fase móvil se evapora de las gotas (desolvatación)

3. La densidad de carga en las gotas aumenta hasta alcanzar el límite Raleigh (10e8 V/cm3) y luego la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.

4. Bajo la influencia de potenciales electrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.

Electrospray

líquido

aerosol

¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?

- Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de interés debe ser

capaz de portar carga en solución

Ejemplos:

a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas

b) Ácidos o bases

c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc

d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteinas,

oligonucleotidos)

e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida

A evitar: muestras con grupos no polares en los que la inducción de carga no

sea un proceso eficiente

Ionización química a presión atmosférica

APCI

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)

2. Las gotas se evaporan.

3. Las moléculas de fase móvil se ionizan por electrones provenientes de una descarga eléctrica.

4. Las moléculas de analito se ionizan por los iones de la fase móvil.

•La muestra y el solvente vaporizados entran en la región corona entre la aguja y el capilar

•Las moléculas de solvente se ionizan en la región corona de descarga, transformándose en iones gaseosos reactivos

•Estos iones reactivos reaccionan con las moléculas de muestra, ionizándolas

Ionización química a presión atmosférica

H3O+(H2O)16

¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI?

Muestras: Compuestos de peso molecular/polaridad intermedias: PAHs, PCBs,

ácidos grasos, ftalatos.

Compuestos que no contienen grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos,

alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)

Muestras con heteroátomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos

Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI

Parámetros en solución

Mucho menos sensible a las condiciones de disolución que ESI

Tolera mayores flujos que ESI

Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI

Muestras a Evitar

Debido a la evaporación previa: muestras térmicamente lábiles,

muestras cargadas en solución, biomoléculas (habitualmente no volátiles).

Fotoionización a presión atmosférica

APPI

APPI (modo positivo)

El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción.

• La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV

La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón).

El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar [M+H]+

Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones moleculares.

El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente

El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica

¿Cuándo usar APPI?

• Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI o APCI (ej: PAHs).

• Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos (THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no hidrosolubles).

• Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que APCI.

• Es robusto y altamente reproducible.

Selección del sistema CL/EM

1.000

No polar Muy polar

10.000

100.000

Pes

o m

olec

ular

Polaridad del analito

ESI

APCI

APPI

Registros gráficos CG-EM y CL-EM

Cromatograma de corriente iónica total

Cromatograma de ión seleccionado

Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información cromatográfica) y en función de la relación m/z (información espectroscópica)

CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH-

Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)

cromatograma EM pico 1 EM pico 2

1-butanol

1-bromobutano

Combustión de tela tratada con producto ignífugo

Cromatograma de corriente iónica total (TIC)

EM de pico 12 (benceno)

Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa

Cromatograma de corriente iónica total

EM del pico a 11.5 min

EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución

Cromatograma convencional con detección UV

Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas

Cromatograma de masas de corriente iónica total

Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311)

Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en modo barrido completo (full-scan)

Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)

MS en Flavonoides

• Cantidad de muestra necesaria: Menos de un 1mg, esta técnica junto con el análisis UV y los reactivos de desplazamiento.

• La técnica a escoger puede variar dependiendo de la matriz y tipo de flavonoides a analizar. (FAB, MALDI, TOF, EI)

• El análisis se debe llevar a cabo siempre con agliconas, esto debido a que los glucósidos son altamente termolábiles, incluso existiendo una gran presión de vacío (3 x10-5 Torr)

RMN

• Esta tecnica es muy usada para el analisis de flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser estructuras altamente metiladas.

• Ademas de ser muy solubles en el solvente que se utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se observa que el analisis de los glicosidos, disminuye la solubilidad en CDCL3

• Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de sobremanera el analisis de glicosidos.

• La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente derivados de estos.

Para la elucidación de la estructura tomaremos en cuenta los siguientes puntos:• Protones del Anillo A• Protones del Anillo B• Protones del Anillo C• Protones del

Glucósido• Metoxi y Acetoxi

Protones• Protones del

carbono 6 y 8

Nota: Tener en cuenta si se usa TMS, todos los OH terminales seran Trimetilsilil esteres.

Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que contengan sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2 dobletes (J: 2.5cps) en el rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes correspondientes a H-6 ocurren consistentemente mas altos que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7 la señal se desplaza en el espectro

Otro caso común es que la isoflavona presente una sustitución en el C-7 Cuando R=H, tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un doblete entre 7.9 y 8.2, El carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y 7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y 7.0, cuando la sustitución es diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven reducidos.

Anillo B: para nuestro interés en las isoflavonas, los desplazamientos como dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1, nos darán la explicación de un enlace =C-C= en la posición 3, corroborando la presencia de la estructura correspondiente a las Isoflavonas.

Farmacología

Isoflavonas

• Las Isoflavonas presentan una gran cantidad de actividades, aunque cabe resaltar que la mayor cantidad de Isoflavonas presentar actividad estrogénica, de ahí que reciben el nombre de Fitoestrógenos.

• Estos compuestos presentan una estructura estérica muy similar a la de esteroidal de los estrógenos, por lo cual se unen fácilmente a los receptores estrogénicos. De ahí que produces una infinidad de efectos estrogénicos o anti estrogénicos.

Absorción, Metabolismo y excreción

• Las isoflavonas son absorbidas a nivel de la parte superior del intestino delgado. Pasan la barrera hematica alrededor de una hora después de haber sido ingeridas.

• Son absorbidas bajo la forma de aglicona, por lo que previamente se realizada un hidrolisis enzimática, por la B-glicosidasa de la flora bacteriana o por la enzima instestinal, lactasa-florizina hidrolasa.

Absorción, metabolismo y excreción

• Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal son convertidas a la forma de B-glucoronico por la enzima UDP-Glucoroniltransferasa , convertida luego bajo la forma de sulfato catalizado por PAPS. Estos procesos ocurren a nivel del Hígado.

• Luego estos son excretados a nivel biliar, y reabsorbido en la porción final del intestino delgado, creando un ciclo entero-hepatico.

• Para ser luego excretado vía urinaria, bajo la forma de DMA (desmethylangolensin).

Mecanismo de AcciónSíntomas Menopaúsicos:Las isoflavonas con su estructura estérica similar a la del estrógeno, se une a sitio receptor de estrógenos, produciendo efectos vasomotores importantes, diversos estudios clínicos, dan como dosis diaria 135 mg de Isoflavonas expresadas como mg de Genisteina.

Efectos Benéficos

• Anticancerígeno: Uno de las posibles explicaciones, o modelos de mecanismo de acción es tan indicados a que las isoflavonas, evitan la proliferación de células cancerígenas activando las vías de apoptosis, inhibición de la Tirosina Quinasa, y regulación de los ciclos hormonales.

Efectos Benéficos

• Efectos sobre la cognición: El hecho de activar receptores hormonales, da como resultado un incremento en la producción de neurotransmisores, lo cuales van a producir una mayor actividad cerebral, llegando a mejorar los procesos cognitivos del cerebro.

Practica de Laboratorio

• Traer: • Mta problema (planta, material vegetal,

materia biologico), que contenga una cantidad y molecula conocida de Isoflavonas.

• Jeringas de 10 ml• Guantes• Guardapolvos• Muchas Ganas de trabajar

FIN

Gracias