R_biopharm_protocolos

5/17/2018 R_biopharm_protocolos - slidepdf.com

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Los productos RBR están elaborados bajo un sistema de Gestión de Calidad ISO 9001:2000

AFLAPREP ®

APLICACIÓN DE COLUMNAS DE INMUNOAFINIDADPARA LA PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO ALANÁLISIS DE AFLATOXINAS POR HPLC

INSTRUCCIONES DE USO CODIGO DE PRODUCTO: P07 POR FAVOR LEER CUIDADOSAMENTE ANTES DE USAR Versión P07/V15/26.01.05

CONTENIDOCOMPONENTES DEL KIT AFLAPREP

® ............................................. 1

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS....................... 1NOTAS IMPORTANTES....................................................................... 1Peligro................................................................................................... 1Decontaminación.................................................................................. 1

Almacenamiento............................................................................... 1Vida de anaquel.................................................................................... 2

Sensibilidad...................................................................................... 2Recuperación................................................................................... 2Muestreo.......................................................................................... 2

INTENCIÓN DE USO............................................................................ 2PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN................................................. 2Ejemplos de Procedimientos para la extracción de muestra................ 2Preparación de la columna................................................................... 3Captura de las Aflatoxinas.................................................................... 3Lavado.................................................................................................. 3Elusión.................................................................................................. 3CUANTIFICACIÓN DE AFLATOXINAS POR HPLC............................ 3CONDICIONES DEL HPLC RECOMENDADAS.................................. 3Uso del Kobra Cell................................................................................ 3Uso de derivatización Post columnas con Iodo.................................... 4

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES DE AFLATOXINA PARA ELANÁLISIS POR HPLC........................................................................... 4CALIDAD............................................................................................... 4SOPORTE TÉCNICO........................................................................... 4LINEA DE PRODUCTOS PARA MICOTOXINAS................................. 5REFERENCIAS..................................................................................... 5GARANTÍA............................................................................................ 5PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO CON AFLAPREP ® ....................... 6

COMPONENTES DEL KIT AFLAPREP ®

50 Columnas de Inmunoafinidad AFLAPREP ®

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOSBalanza de laboratorioLicuadora rotatoria con jarra de 1 l de capacidad(para usar con solventes)Agua destilada /deionizada* Tabletas de Buffer fosfato salino (PBS) (Prod: RP202)

Material de vidrio de laboratorio

Embudos de filtraciónCilindros adaptadores, 100 ml y 500 mlPipetas de 1ml, 5ml y 10mlVaso de precipitado* disponible en R-Biopharm Rhône Ltd.

NOTAS IMPORTANTES

Peligro

Las aflatoxinas son sustancias peligrosas. Solamente loslaboratorios equipados para el manejo de materiales tóxicosy solventes pueden realizar análisis de aflatoxinas. Debeutilizarse vestimenta protectora, incluyendo guantes de gomay anteojos de seguridad durante todo el ensayo.

Las columnas contienen 0.01% p/v de timerosal. Si sesalpican ojos ó piel, debe lavarse inmediatamente conabundante cantidad de agua.

DecontaminaciónEs importante que el vaso de la licuadora, las jeringas, losadaptadores y los embudos de filtración se lavenexhaustivamente luego de cada ensayo dado que losresiduos de ensayos previos pueden producir resultadosinadecuados. Todo el material y los reactivos debendecontaminarse sumergiéndolos por lo menos durante 30 minen una solución de hipoclorito de sodio (aprox. 5% (p/p))seguido de la adición de acetona (5% en v) por 30 minutos.

Luego de un enjuague exhaustivo con agua destilada, serealiza el lavado normal. Se recomienda que las jeringasutilizadas durante el ensayo se enjuaguen con metanol yluego con agua destilada al final de cada ensayo.

Nota: Las aflatoxinas se absorben fácilmente en la superficiedel material de vidrio, reduciendo la recuperación de lasaflatoxinas de cada muestra. Para solucionar este problema

i d l t i l t t t l




Vida de anaquel

El kit AFLAPREP ® es estable por 18 meses desde la fechade elaboración si se almacena a 2-8ºC. Las columnas

también son estables a temperatura ambiente (ver RBR paramás detalles)

Sensibilidad

La sensibilidad depende del sistema de detección empleadopor el analista. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sepuede mejorar si se requiere, simplemente aumentando elvolumen de muestra que se pasa a través de la columna deinmunoafinidad.

RecuperaciónSi el analista quiere considerar las pérdidas que ocurrendurante la extracción, se recomienda que una muestrafortificada de la misma matríz del material a analizar, seanalice siguiendo el procedimiento completo de extracción dela AFLAPREP ® como estándar de referencia.

Las recuperaciones obtenidas con la muestra fortificadadeben luego ser utilizadas para corregir los resultadosobtenidos para las muestras.

Muestreo

Se debe obtener una muestra representativa siguiendoalguno de los procedimientos de muestreo oficialesreconocidos. Se recomienda moler finamente como mínimo 1kg de muestra representativa y tomar de allí una muestra de50 g para el ensayo.

INTENCION DE USO

Las Aflatoxinas son sustancias carcinógenas producidas porlos hongos Aspergillus flavus y Aspergills parasiticus . Dadoque estos hongos crecen en una amplia gama de materiasprima como nueces, cereales, higos y especias, es necesariohacer análisis de dichos productos para controlar presenciade aflatoxinas antes de su incorporación a otros alimentos ypiensos. Se necesita un ensayo rápido y simple que puedaser utilizado para controlor un rango diverso de alimentos. Lascolumnas de inmunoafinidad AFLAPREP ® cumplen condichos requerimientos.

El procedimiento de las columnas AFLAPREP ® se basa en latecnología de anticuerpos monoclonales, que hacen que elensayo sea altamente específico, sensible, rápido y simple derealizar.Las columnas AFLAPREP ® contienen una suspensión en gelde anticuerpo monoclonal unido covalentemente a un soportesólido. El anticuerpo es específico para las aflatoxinas B1, B2,G1 G2 L d l t ió d l t i l t t d

extracción con acetonitrilo se recomienda para uso con frutassecas y especias. La extracción con cloroformo, aunqueconsume mucho tiempo y es peligrosa, sigue siendo elsolvente de preferencia para varios laboratorios, por lo quehemos incluido aquí el método. Además de los métodosdescriptos en las instrucciones de uso, RBR ha desarrolladomuchas Notas de Aplicación para matrices “difíciles”, queestán a disposición de los usuarios por pedido.

Ejemplos de Procedimientos de Extracción demuestras

a) Metanol

Pesar 50g de muestra bien molida y 4g de cloruro de sodio enun recipiente para licuar de 1 litro de capacidad, resistente asolventes. Agregar 250ml de metanol:agua (60:40v/v) calidadHPLC en el recipiente, tapar y licuar por 1 min a altavelocidad. Diluir el extracto con 250ml de agua destilada.Mezclar bien por agitación (no eléctricamente).Inmediatamente luego de agitar, filtrar aproximadamente 25-50ml de extracto de muestra por papel de filtro Whatman No.4ó No. 113. Transferir 10ml del filtrado (equivalente a 1g demuestra) a un cuerpo de jeringa de vidrio para pasar por lacolumna de inmunoafinidad (ver Preparación de Columnas).

Nota: Para varios tipos de nueces se ha encontrado que sepueden obtener mejores recuperaciones filtrando el extractode muestra previo a la dilución. Utilizando esteprocedimiento, se licuan 50g de nueces y 4 g de sal con 250ml de metanol:agua destilada (60:40 v/v) calidad HPLC. Sefiltra la muestra a través de papel de filtro Whatman No. 14 óNo. 113 y se colecta un volumen apropiado. Se diluye elfiltrado con igual volumen de agua destilada. Se transfieren10ml del filtrado diluido (equivalente a 1g de muestra) a uncuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna deinmunoafinidad (ver Preparación de Columnas).

b) Acetonitrilo

Este método es similar al protocolo de metanol, pero proveemejores recuperaciones para aflatoxina B1 para aquellosusuarios que están preocupados con esta toxina. Colocar 50gde muestra molida y 4g de cloruro de sodio en un recipientepara licuar de 1 litro de capacidad, resistente a solventes.Agregar 250ml de acetonitrilo 60% calidad HPLC, tapar ylicuar a alta velocidad por 1 min. Filtrar el extracto de muestra

por papel de filtro Whatman No.4 ó No. 113 y colectar 20 mldel filtrado. Diluir 5 ml del filtrado con 120ml de buffer fosfatosalino (PBS 0.01M). Asegurarse que los 125ml de la muestradiluida (equivalente a 1g de muestra) se transfieran a uncuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna deinmunoafinidad (ver Preparación de Columnas). Debe notarseque la concentración final de acetonitrilo que se pasa por lacolumna no debe ser mayor al 2.5% para evitar la




Preparación de la columna

Las columnas de inmunoafinidad deben estar a temperaturaambiente antes de su uso. Remover la tapa de la parte

superior de la columna, cortar el fondo sellado y volver acolocar. Ajustar firmemente la columna al cuerpo de vidrio de10 ml de la jeringa y colocar en un soporte apropiado paracolumnas de inmunoafinidad (rack ó clampstand). Asegúreseque el tapón inferior de la columna de inmunoafinidad estéaún en su lugar.

Captura de las Aflatoxinas

Luego de la aplicación de un procedimiento de extracciónapropiado, remover el tapón inferior de la columna y pasar el

volumen sugerido de muestra a través de la columna deinmunoafinidad a un flujo de 2-3ml/min. Es esencial unapequeña presión continua para la “captura” de las aflatoxinaspor el anticuerpo. El volumen de muestra debe ser de 10ml sise utiliza la extracción con metanol (equivalente a 1g dematerial original de la muestra), 125ml si se utiliza laextracción con acetonitrilo (equivalente a 1g de muestra y 50ml (equivalente a 2g de muestra) para aquellos analistas quedeseen utilizar el método de extracción con cloroformo. Esteprocedimiento debe realizarse manualmente utilizando una

bomba y un cuerpo de jeringa de vidrio, aunque es masapropiado utilizar un sistema Vac-Elut (JonesChromatography), una bomba peristáltica multicabezal ó unsistema ASPEC (Gilson) para el análisis de un gran númerode muestras. Con el objeto de mejorar el límite de detección,se pueden pasar volúmenes mayores de muestra a través dela columna de inmunoafinidad; para mayor información, porfavor contacte a R-Biopharm Rhône Ltd.

Lavado

Agregar 10ml de buffer fosfato salino (PBS) al cuerpo devidrio de la jeringa y pasar a través de la columna deinmunoafinidad a 5 ml por minuto. Repetir el procedimientode lavado, asegurándose que todo el PBS residual ha sidoexpelido de la columna antes del próximo paso.

Elusión

Colocar un vial color ámbar directamente debajo de lacolumna. Pipetear 1 ml de metanol grado HPLC (eluyente) enel cuerpo de vidrio. Eluir las aflatoxinas de la columna a un

vial de vidrio por pasaje lento del metanol a través de lacolumna a un flujo de 1 gota por segundo. Se recomienda lareversión de la dirección del flujo (back flushing) con eleluyente por 3 veces para asegurarse una completadesnaturalización del anticuerpo monoclonal y lasubsiguiente liberación de las aflatoxinas a la solución. Luegode la elusión, pipetear 1 ml de agua destilada en el cuerpo devidrio de la jeringa pasar por la columna y colectar en el vial

Reversión del flujo

Revertir el flujo subiendo ybajando lentamente el émbolo dela jeringa durante el pasaje del

eluyente a través de la columnade inmunoafinidad. Este procesova a revertir la dirección del flujodel eluyente asegurando unacompleta desnaturalización delanticuerpo. Debe repetirse tresveces durante el pasaje deleluyente a través de la columna.

CUANTIFICACIÓN DE AFLATOXINAS POR HPLC

Inyectar 100ul de la muestra en un HPLC. Cuantificar laconcentración de las aflatoxinas comparando las alturas óáreas de los picos de la muestra con la curva de calibraciónde estándares.

CONDICIONES RECOMENDADAS DEL HPLC

Usando un Kobra Cell

Kobra Cell seteo a 100µAPre Columna Inertsil ODS-3

5µm, 4mm x 10mn (Hichrom)

ó equivalente

Columna Inerstil ODS-3Vanalítica: 5µm, 4,6mm x 150mn (Hichrom)

ó equivalente

Fase móvil: 60:40 v/v agua:metanol

A 1 litro de fase móvil adicionar119mg de bromuro de potasio y350µl de ácido nítrico 4M

Bomba HPLC para dispensar la fase móvil

Veloc. de flujo: 1.0 ml/minuto

Detector de Excitación: 362nmFluorescencia: Emisión: 425nm (B1 y B )2

455nm (G y G1 2)

Horno: Mantiene la Precolumna y Columnaanalítica a 40ºC

Integrador: Del proveedor preferido

Inyector: Válvula Reodyne ó sampleador

Volumen de 100µl




La concentración real de aflatoxina se determina utilizando lasiguiente ecuación:

Derivatización Post columna utilizando Iodo

Pre Columna: Inertsil ODS-3[Aflatoxina], ng/ml = ABSORBANCIA 362 x 1000 x coeficiente5µm, 4mm x10mm (Hichrom) ó equivalente

En la cual el coeficiente para la toxina respectiva es:

Columna Inertsil ODS-3V – 14.31BB1Analítica: 5µm, 4.6mm x150mm (Hichrom)ó equivalente

Fase móvil: 60:40 v/v agua:metanol

Reactivo HPLC Disolver 40g de cristales de iodo en 1 litroPost columna de agua, agitar al menos 1 hora y almace-

nar en recipiente caramelo. Antes de usar,filtrar 500ml de la solución stock a través depapel de filtro Whatman No. 4 y colectar en

botella caramelo. Preparar solución frescadiariamente

Nota: Para rellenar la solución stocksaturada, llevar a 1 litro con agua destiladaó deionizada y agitar por 1 hora.

2 Bombas Para dispensar la fase móvil a un flujodel HPLC de 0.8ml/minuto y (b) solución saturada

de iodo a un flujo de 0.4ml/minuto

Detector de Excitación: 362nmFluorescencia: Emisión: 425nm (B1 y B2)

455nm (G1 y G2)

Horno: Mantiene la Precolumna y la columnaanalítica a 40ºC

Integrador: Del proveedor preferido

Inyector: Válvula Reodyne ó sampleador

Volumen de 100µlInyección:

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES DE AFLATOXINAPARA EL ANÁLISIS POR HPLC

Preparación de 1000ng/ml de Solución stock deAflatoxina

a) Solución de Estándar de Aflatoxina lista para usar (P22,1000ng/ml) está disponible en R-Biopharm Rhône Ltd.

ób) Aflatoxinas BB1, B2, G1 y G2, polvo cristalino, se puedenconseguir en Sigma. Cada polvo de aflatoxina se resuspendeen benceno:acetonitrilo (98:2 v/v) y se deja toda la noche atemperatura ambiente para dar una solución stockconcentrada conteniendo 1mg/ml. Estas soluciones sepueden almacenar a -20ºC hasta por 2 años sin pérdida de

BB2 – 13.08G1 – 18.53G2 – 17.10

Diluir cada toxina con metanol para dar 1000ng/ml. Mezclaralícuotas de 1ml de las soluciones de toxina para dar unamezcla de 1000ng de aflatoxinas totales por 1ml de metanol.

Para preparar una curva de calibración de estándares de 4

puntos, basado en la presunción que el equivalente a 1g sepasa por la columna de inmunoafinidad:

Tomar 80µl de solución 1000ng de aflatoxinas totales (a ó b)y llevar a 2ml con metanol:agua 1:1 v/v (=40ng/ml ó 80ppb)Tomar 1ml de 40ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1v/v (20ng/ml ó 40ppb)Tomar 1ml de 20ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1v/v (10ng/ml ó 20ppb)Tomar 400µl de 10ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1v/v (2ng/ml ó 4ppb)

Inyecta 100µl de cada solución en el HPLC. El orden deelusión es G , G2 1, B2 y B .1

CALIDAD

Los productos RBR están desarrollados, elaborados ydistribuidos bajo un sistema de manejo de la calidad ISO9001, garantizando productos de calidad consistente quesiempre cumplen nuestras especificaciones de rendimiento.Nuestros productos han sido utilizados en varios estudios

colaborativos para el desarrollo de métodos estándareuropeos e internacionales y son ampliamente utilizados porimportantes instituciones, compañías alimenticias ylaboratorios oficiales. Están disponibles referencias de losusuarios de los productos de RBR por pedido.

SOPORTE TECNICO

RBR ofrece a los usuarios de nuestros productos asistencia oasesoramiento cuando estos lo requieran. Por tal motivo noscomplace en ofrecer los siguientes servicios a los usuarios

de nuestros productos:Análisis de muestras problemasNotas de aplicación para muestras dificultosasReferencias bibliográficas de la Biblioteca RBRInstalación y asesoramiento del Kobra cellAsesoramiento de condiciones para HPLCAsesoramiento en preparación y tratamiento de estándares




ReferenciasLINEA DE PRODUCTOS PARA MICOTOXINAS

1. Commission Directive 98/53/EC, Laying down the samplingmethods and the methods of análisis for the oficial control ofthe levels for certain contaminants in foodstuffs, OficialJournal of the European Communities L201/93

A) Columnas de inmunoafinidad para análisis cuantitativo demicotoxinas por HPLC:-

DONPREP (P50B)EASI-EXTRACT Zearalenone (RP90) 2. Determination of the levels of aflatoxin in peanut butter

using Aflaprep Immunoaffinity column clean –up procedure:Collaborative trial, J. Assoc. Public Analysts. 1992, 28, 1-10.

FUMONIPREP (P31) ® (P07)AFLAPREP

EASI-EXTRACT Aflatoxin (RP70N)AFRAPREP M (P04) 3. Determination of the levels of aflatoxin in medicinal herbs

and plant extracts, Reif and Metzger, J. Chromatography A.692, 1995, 131-136.

OCHRAPREP (P14B)

B) Estándares y materiales de referencia 4. Candlish, A.A.G., Haynes, C.A., & Stimson, W.H.Detection and determination of aflatoxins using affinity

chromatography. Internacional Journal of Food Science andTechnology (1998) 23. 479-485.

RBR elabora una gama de estándares de micotoxinas para

uso en HPLC y un gran número de materiales de referencia.Para mas detalles, por favor contáctese con RBR.

5. Immunoaffinity Column Cleanup with LiquidChromatography using post column bromination fordetermination of aflatoxins in peanut butter, pistachio pasteand páprika powder: Collaborative Study. J.AOACInternacional Vol 83. No 2, 2000.

C) Kobra Cell para derivatización de aflatoxinas B1 y G1

Es la única celda electroquímica recomendada en métodosestándar de la EC. El equipo es utilizado por institutos dereferencia, empresas alimentarias y laboratoriosgubernamentales en todo el mundo.

6. Commission Regulation (EC) No 2174/2003. establixhingmaximum limits for aflatoxins in a variety of food productsD) Productos adicionales para el análisis de micotoxinas:-

RBR también provee un número de columnas deinmunoafinidad para tests de screening además de Aflacardsy sistemas de ELISA para la detección de una gama demicotoxinas.

Garantía

R-Biopharm Rhône Ltd. no garantiza ni expresa niexplícitamente, excepto que todos los productos elaboradospor R-Biopharm Rhône Ltd. están hechos con materiales decalidad apropiada. Si algún material está defectuoso, R-Biopharm Rhône Ltd. le va a proveer un producto dereemplazo. El usuario asume todos los riesgos yresponsabilidades que resulten del uso de los productos yprocedimientos de R-Biopharm Rhône Ltd. R-Biopharm

Rhône Ltd. no será responsable de cualquier daño, pérdida ógasto originado directa ó indirectamente del uso de losproductos ó procedimientos de R-Biopharm Rhône Ltd.



ctos RBR están elaborados bajo un sistema de Gestión de Calidad ISO 9001:2000

OPHARM RHÔNE LTDest of Scotland Science Park, Unit 3.06 Kelvin Campus, Maryhill Road, Glasgow Scotland G20 0SP

(0)141 945 2924 Fax: +44 (0)141 945 2925 e-mail : [email protected] Página 6 de 5

AFLAPREP ® PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO

Solvente de Extracción: MetanolAnalistas que deseen utilizar procedimientos alternativos de extracción (acetonitrilo o cloroformo) deberán consultar la sección

“Procedimientos de Extracción de Muestras (solventes a, b ó c)” en Aflaprep ®

Instrucciones de Uso.

Los produ

R-BIWTel: +44

μ

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