LA REACIÓN

ANTÍGENO - ANTICUERPO

Mg. Benites Azabache Juan Carlos

Concepto de reacción Ag - Ac • Cuando un Ac entra en

contacto con un Ag contra el que está dirigido, ambos se unen formándose un complejo Ag-Ac.

• La unión Ag-Ac es reversible.

• La permanencia de la unión depende de: – Grado de adaptación entre

ambas moléculas.

– Fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen.

Características de la Interacción Antígeno - Anticuerpo

Específica

Reversible

Dependiente de pH

Sensible a la Temperatura

Sensible a la fuerza iónica

Enlaces que intervienen en la unión Ac-Ag

• No son covalentes. Son cuatro tipos:

1. Electrostáticos: Entre grupos iónicos

(NH3+ y -COO-) de Prots. distintas.

2. Puentes de hidrógeno entre grupos

polares hidrofílicos (-OH, -NH2, -COOH).

3. Hidrofóbicos: Gr. No polares hidrófobos

en medio acuoso (cadenas laterales de

algunos AA.)

4. De van der Waals: Fuerzas

intermoleculares débiles de origen

eléctrico que se ejercen a distancia entre

moléculas.

• Las fuerzas de unión de cada uno de ellos

son menores que en los covalentes, pero

en conjunto consiguen una considerable

energía de unión.

COMPLEMENTARIEDAD DE EPÍTOPE Y

PARATOPE • EPÍTOPE Y PARATOPE

han de tener estructuras

complementarias que

encajan entre sí.

• Se forman varios enlaces

no coovalentes

simultáneamente.

• La distancia entre Ag y

Ac es muy pequeña en el

punto de unión, lo que

incrementa la fuerza de

esa unión.

AFINIDAD DEL ANTICUERPO

• Es la fuerza de unión

entre el Ac con su Ag

• Determina la atracción

entre ellos.

• Esa fuerza es la suma de

las fuerzas de los

enlaces que intervienen

en la unión.

AVIDEZ DEL ANTICUERPO

• Es una medida de la fuerza de

unión y estabilidad del complejo:

Ag multivalente – Ac multivalente.

• Ac multivalentes: Tienen más de

un punto de unión para

Antígenos.

• Ag multivalentes: Tienen varios

determinantes antigénicos (más

de un punto de unión para los

Ac).

• La fuerza de unión es mayor que

la suma de las afinidades de

cada uno de los puntos de unión

Cinética de la Reacción (ecuación válida solo para moléculas monovalentes)

k’

Hapteno + Ac ( Hapteno-Ac)

k

k’

Ka= k

= (Hapteno-Ac)

(Hapteno)(Ac)

[Ac] la concentración de sitios libres de Ac

[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac

Equilibrio de diálisis

Para calcular Ka

ESPECIFICIDAD DEL

ANTICUERPO • Si un anticuerpo reacciona

solo con un Ag: Es muy

específico.

• Si un Ac reacciona con

varios Ag: Tiene una

especificidad baja. Se habla

de REACTIVIDAD

CRUZADA.

• Esto ocurre porque varios

antígenos tienen uno o más

determinantes antigénicos

iguales o similares, capaces

por tanto de unirse al mismo

Ac.

REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO

APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés

Especificidad

Sensibilidad

Estabilidad

Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, etc.

Tiempo de ejecución razonable: minutos a ~ hrs

Costo conveniente

Infraestructura mínima

Ventajas

Inmunización con Carrier-hapteno

Antisuero

Análisis de los Ac. unidos a:

Hapteno libre

Hapteno en otra Proteína

Hapteno al mismo carrier

Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés

Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc).

Técnicas Inmunoanalíticas

- Reacción de precipitación

En medio líquido

Floculación

Nefelometría

Precipitación de complejos Inmunes

En gel Inmunodifusión doble

Inmunodifusión radial

Inmunoelectroforesis

Rocket electroforesis

Contrainmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel

- Reacción de aglutinación

Aglutinación pasiva

Aglutinación directa

- Fijación y actividad hemolítica del complemento

- Reacciones en fase sólida

o ELISA

o Western blot

REACCIONES DE

INMUNOPRECIPITACION

CARACTERISTICAS:

Ag solubles

Ac de clase Ig G

Reacción poco sensible

Reacción muy específica

Intervienen Ac policlonales frente a Ag

polivalentes

• Modalidades:

• Inmunoprecipitación simple en tubo

• Inmunodifusión o Inmunoprecipitación en

medio sólido: Inmunodifusión simple: en tubo (Oudin)

En placa o Radial (Mancini)

Inmunodifusión doble o radial (Ouchterlony)

Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians)

Contrainmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel)

Inmunoelectroforesis bidimensional.

Reacciones de Precipitación y Floculación en solución

Equivalencia

Tiroglobulina agregada (mg)

Pre

cipit

ado

de

pro

teín

as (

mg

)

Reacciones de sueros humanos de pacientes con

Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.

Inmunodifusión Doble (o de Ouchterloni)

Ej: Mezcla de antígenos y suero polivalente

AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humano HSA: Albúmina humana purificada HIg: Inmunoglobulina humana purificada

Suero humano

HSA

Suero humano

HIg

Ensayo Immunoturbidimétrico

Suero + Ag complejos insolubles Aumenta turbidez de la solución y puede ser medida ópticamente Turbidez proporcional a la cantidad de proteínas en la muestra

Sensibilidad de método se puede incrementar con los anticuerpos Unidos a látex: mayores agregados

Inmunodifusión Radial

Anticuerpo incorporado al gel El tamaño de los halos es

proporcional a la concentración del

antígeno

Ag

• REACCIONES DE AGLUTINACION

• Características:

• Ag particulados, generalmente

poliantigénicos

• Ac de clase Ig M e Ig G

• Reacción con Ag superficiales.

• Reacción bastante sensible

• Reacción relativamente específica

• Intervienen Ac policlonales frente a Ag

polivalentes.

• Modalidades:

Aglutinación directa: Cualatitativa/cuantitativa

En tubo/en porta

Aglutinación pasiva: Prueba de Coombs directa e indirecta

Hemaglutinación pasiva

Prueba de Látex

Pruebas de coaglutinación

Reacciones de Aglutinación

Aglutinación Directa:

Las partículas o células

tienen un antígeno

intrínseco.

Aglutinación Pasiva:

partículas o células a las

cuales se le agrega el

antígeno

Se considera aglutinación cuando el antígeno es

particulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano

Reacciones mediadas

por Complemento

Lisis celular

REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO

Reacción positiva (No hemolisis)

Reacción Negativa (Hemolisis)

Reacciones en fase sólida

ELISA

Western blots

Inmunofluorescencia

Cromatografía de Afinidad

ELISA (Enzime linked immunosorbent assay )

Detección de anticuerpos Detección de Antígeno

Determinación de antígenos por ELISA

Competencia Sándwich

[ Ag ]

Den

sid

ad ó

pti

ca

[ Ag ]

Den

sid

ad ó

pti

ca

Caso de Haptenos Caso de Proteínas

Método indirecto

• También conocido como método Sándwich (Antígeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la fijación de un antígeno a la fase sólida, el cual atrapa los anticuerpos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

TMB

STOP

Antígeno en

Placa

P

Anticuerpos anti-IgG

Humana marcados con

Peroxidasa

TÉCNICA DE SANDWICH

Anticuerpos IgG en la

Muestra del paciente

Directo

• Detecta al antígeno y se basa habitualmente en

la captura de este por anticuerpos específicos

unidos a una fase sólida

• El antígeno presente en la muestra se combina

con el anticuerpo fijado.

• El antígeno se detecta con otro anticuerpo

específico conjugado a una enzima, se adiciona

un sustrato para la enzima y se mide la

intensidad de color.

POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

TMB

STOP

Antígeno en

La muestra

P

Anticuerpos IgG

marcados con

Peroxidasa

TÉCNICA DIRECTA

Placa con Anticuerpos

IgG contra el Ag

POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

TMB

STOP

Placa con Anticuerpos

De Captura

contra IgM Humana

Anticuerpos IgM en la

Muestra del

paciente

Antígeno en

solución

P

Anticuerpos

anti-antígeno

marcados con

Peroxidasa

TÉCNICA DE INMUNOCAPTURA

Método competitivo

• Se basa en la competencia que se establece entre un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. En estos casos la cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

Western blot

Anticuerpo específico

Anti-anticuerpo-Enzima

Sustrato

Precipitado producto enzimático

Quimioluminiscencia

Inmunofluorescencia indirecta

Anticuerpo anti-Acrosina

Anticuerpo anti-Ag de

embrión de ratón

Se puede hacer con células vivas o fijadas,

con o sin permeabilizar.

Cromatografía de Afinidad

Anticuerpo

Anticuerpo no unido

Buffer de elusión

Elución de Anticuerpo

Ej: Purificación de un anticuerpo uniendo el antígeno a una resina (sp). Sin embrago, también se puede hacer lo contrario.

Quimioluminiscencia

• Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas:

• una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente.

• (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)

• Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.

Quimioluminiscencia

Oxidante

(H2O2,, perborato Na)

Luminol

PO N2

Intermediario

electrónicamente

excitado

Luz,

425

nm

aminoftalato

Quimioluminiscencia

• Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los otros métodos enzimáticos.

• Se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa).

• Se detecta la señal quimioluminiscente Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas

Electroquimioluminiscencia

• Ej.: determinación de TSH

• Incubación a 37º

Muestra con TSH

Partícula magn

Streptavidina

Anti-TSH-biotina

•anti-TSH-Ru(bipy)3

Electroquimioluminiscencia

• Ejemplo: TSH

IMÁN

ELECTRODO

Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

Electroquimioluminiscencia

• Marca: Ru(bipy)2+3

• Ru 2+ Ru 3+

En presencia de N(Pr)3, en un

ánodo, el pasaje de la forma +3 a

+2 va acompañado de

quimioluminiscencia.,

Con partículas magnéticas y un

imán asociado al electrodo, se

realiza la reacción allí.