repositorioinstitucional.ceu.es · Facultad de Veterinaria Departamento de Producción y Sanidad Animal, Salud Pública Veterinaria y Ciencia y Tecnología de los Alimentos AUTORIZACIÓN

Universidad CEU Cardenal Herrera

CEINDO – CEU Escuela Internacional de

Doctorado

PROGRAMA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LA SALUD

Caracterización inmunopatológica de un

modelo de infección experimental

intradérmica por Staphylococcus aureus

en conejos

TESIS DOCTORAL

Presentada por: Asunción Muñoz Silvestre

Dirigida por: Dr. D. Juan Manuel Corpa Arenas Dr. D. David Viana Martín

VALENCIA

2018

Facultad de Veterinaria

Departamento de Producción y Sanidad Animal, Salud Pública Veterinaria y Ciencia y

Tecnología de los Alimentos

AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES DE TESIS PARA SU PRESENTACIÓN

Los Dres. D. JUAN MANUEL CORPA ARENAS y D. DAVID VIANA MARTÍN, como Directores

de la Tesis Doctoral realizada por la Doctoranda Dña. ASUNCIÓN MUÑOZ SILVESTRE,

titulada “Caracterización inmunopatológica de un modelo de infección experimental

intradérmica por Staphylococcus aureus en conejos”, autorizamos la presentación de la

citada Tesis Doctoral, puesto que reúne las condiciones necesarias para su defensa.

En Alfara del Patriarca, a 28 de noviembre de 2018.

Los Directores de la Tesis.

Fdo. Dr. D. Juan Manuel Corpa Arenas Fdo. Dr. D. David Viana Martín

Este trabajo ha sido financiado por proyectos de

investigación de las siguientes entidades: Universidad CEU

Cardenal Herrera (INDI-1505, INDI-1606 e INDI-1707) y la

Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología

(AGL2011-30170-CO2-02 y AGL2014-53405-C2-2-P).

Igualmente la doctoranda ha disfrutado de una beca de

investigación de la Universidad CEU Cardenal Herrera.

A mis padres y seres queridos

AGRADECIMIENTOS

Transcurridos cuatro años desde que comenzara mi andadura en el ámbito de la

investigación científica, reconozco que han pasado muy rápido. De esto me he dado

cuenta precisamente al finalizar la elaboración de esta tesis doctoral, no exenta de

algunos imprevistos y contratiempos que prolongaron en el tiempo su desarrollo y

ejecución. Por este motivo, en primer lugar quiero agradecer a la Universidad CEU

Cardenal Herrera y a la CEU Escuela Internacional de Doctorado la oportunidad de

disponer de un año más. Además, en esta primera posición también incluyo a los Dres.

Juan Manuel Corpa y David Viana por brindarme en su día la ocasión de iniciar el

doctorado bajo su dirección. Les agradezco el tiempo que me han dedicado durante

todo el periodo, aún más si cabe en la etapa final, en la cual se recogen y condensan al

máximo los conocimientos y experiencia aportados por los directores. Así pues, su

dedicación ha sido el pilar de este trabajo, por lo que reitero mi gratitud hacia mis

directores.

Por otra parte, durante este tiempo he conocido y he estado acompañada por personas

que, en su estilo y forma de ser, me han aportado sensaciones y ejemplos para vivir,

además de consejos prácticos y habilidades. Debo hacer especial mención a dos de estas

personas, a mis compañeras Sara Pérez y Elena Moreno, con quienes más tiempo he

compartido. Juntas hemos trabajado en equipo y nos hemos apoyado, en las penas y

alegrías, de las vivencias del doctorado y de la vida misma. A Sara la conocí en el primer

año del doctorado, momento en el que ella, alumna de quinto de veterinaria, era

becaria de colaboración en nuestro grupo de investigación y estaba realizando su TFG.

Elena se incorporó al grupo a finales de mi segundo año de doctorado, y recuerdo

perfectamente que pasó a conocer el laboratorio y nuestras rutinas el día de mi

cumpleaños, rechazando el aperitivo que le ofrecí… quién nos iba a decir que más

adelante íbamos a compartir adicción por rosquilletas, croissants y empanadillas. Chicas:

sabéis que aunque a veces puedo resultar distante y distraída, y tuve días un tanto

huraños con vosotras, os guardo un gran cariño. De hecho, os echaba de menos incluso

estando a dos puertas de vosotras. Han sido muchas horas y días de trabajo en vuestra

compañía, donde la organización fue fundamental y la responsabilidad un requisito de

confianza. Me alegro mucho de haberos conocido. Y ahora, ¿quién va a hacer

desaparecer las cajas de puntas vacías?

Otras personas que también he conocido durante este tiempo han sido los doctorandos

del resto de grupos de investigación de la Universidad. Cuando empecé la mayoría de

doctorandos estaban acabando su tesis (Ana, Marioa, Sole, Sarita, María, Ester, Tania) y

compartíamos el laboratorio con el grupo de investigación de Nacho Pérez (el llamado

grupo de bioquímica). Al mismo tiempo que yo se incorporó al CEU otra doctoranda,

Pilar Madrigal, y las dos fuimos las primeras doctorandas de la CEINDO en Valencia.

Además, Pili fue quien depositó antes. Creo que nosotras, incluyendo a Sara, aportamos

nuevos aires al laboratorio, una tarea que resultó sencilla gracias a la personalidad y

disponibilidad de Pili, que estoy segura le van a ser útiles para hacer grandes proyectos.

En los años siguientes se fueron incorporando nuevos doctorandos y doctorandas:

Beatriz, Roberto, Ángel, Cristina, Adrián, Josep, Teresa. Crecía de nuevo la familia de

“becarios”, y a medida que pasaba el tiempo y se acercaba el momento de que yo

entregara la tesis, podía ver en sus rostros la incertidumbre de pensar “cuando yo esté

ahí donde está ella”, que seguro contrastaría con mi cara de cansancio (así me

describían en esos días). Por eso, como he dicho al principio, todo llega y, además, llega

más rápido de lo que imaginamos. Y en esto seguro que me entiende Bea, con quien

intercambié tanto información sobre trámites y documentos, como estados de emoción.

Así que, ánimo!!

En la Universidad, obviamente, también he coincidido con profesores, sobre todo

anatomopatólogos: Joaquín, Agustín y Laura. También les agradezco la atención que me

han prestado cuando he tenido dudas y los consejos que me han dado. Además, sin salir

del ámbito de la anatomía patológica, una merecida mención a los técnicos de

laboratorio por su labor: Rocío, Brenda y Laura. Con Brenda intercambié alguna hipótesis

científica, en momentos de pseudo-lucidez en los que nos dejábamos llevar por el

entusiasmo de querer dar respuesta alguna pregunta que no se había respondido

todavía. Prescisamente por ese interés, estoy segura de que vas a elaborar un TFG de

mucha calidad. Disfruta de tu estancia Brenda. Y cómo no hablar de Fany, dedicada a la

anatomía patológica casi durante toda la carrera, y con quien he compartido congresos y

momentos de trabajo en el laboratorio y en el microscopio. Ahora te toca a ti, Fany.

Felicidades!! Y también mencionar a Jorge, Jaume y Carlota, a quienes les esperan

nuevos retos, a cada cual desde una situación diferente; Jorge va a dar un paso más en

su formación de anatomopatólogo, y Jaume y Carlota, que sin dejar de ser alumnos ya

son veterinarios. Suerte a todos!!

Y sin abandonar todavía el CEU, recordar también a los alumnos que vinieron a nuestro

laboratorio a hacer su TFG (Celia, Servando), TFM (Álex) o prácticas Erasmus (Natasha).

Asimismo, comentar el cambio de vecindario que experimentamos al mudarnos al nuevo

edificio. Al principio estuvieron con nosotras Marta, Sandra, Carmen López y Edgar, pero

tras designarse definitivamente los puestos de trabajo, acabamos compartiendo estufas

de cultivo con el grupo de Provagin (Juanjo, Ángel, Estrella, Empar, Lorena, Lola). Fuera

con unos o con otros, la convivencia fue agradable. Y como no podía ser de otra manera,

citar a las personas que también participan (o participaron) en el funcionamiento de la

Universidad a través de su trabajo: Ámparo (laboratorio análisis clínicos); José Manuel y

Maricarmen (recepción hospital); los Pacos (y su furgoneta); Eliseo (mantenimiento

edificio Salud); José Antonio, Vanesa, Cris, Rocío y Ana (laboratorios); Paula, Juan, Javi,

Marcos (granja); Ricardo, Iván, Matías, David, Marlene, Paqui (conserjes); Lorena,

Vanesa, Ámparo (limpieza). Todas estas personas han aportado también su granito o

montoncito de arena a mi trabajo, aunque se tratara de hacer su trabajo, valga la

redundancia.

Por otra parte, mencionar también con cariño las ocasiones que he estado en la granja

de conejos de la UPV, por el buen trato que he recibido por parte de quienes trabajan

allí y lo que he aprendido de ellos, bien fuera en la granja bien fuera en los congresos de

ASESCU. Gracias a Juanjo, Concha, Enrique, Eugenio, Luís, Pablo. Guardo anécdotas

graciosos con todos ellos. Y por supuesto con Alberto, quien me ha ayudado muchísimo

con el análisis estadístico de este trabajo y ha tenido paciencia para explicarme, incluso

varias veces, las cuestiones que le reformulaba. Ahora veo de otra forma la estadística.

Gracias Alberto!! Y cómo no acordarse del incomparable Joan Rosell, a quien tenemos

en gran estima por su dedicación y profesionalidad, y su carisma.

Además, recordar de especial manera a mis amistades más preciadas (Mariangeles,

Marta y Joana) por su interés y apoyo, y al resto de personas conocidas del pueblo que

también se interesaron por mi trabajo. Quienes me conocen bien saben que cuando

digo pueblo, según el contexto y sin que diga el nombre, se trata de mi localidad natal

(Bonrepós y Mirambell) o de mi localidad “de adopción” (Bronchales). No he podido

evitar nombrar estos pueblos distantes porque siento alegría de haberme criado en un

pueblo de la huerta valenciana, así como de disfrutar de la naturaleza y encontrar la paz

al mismo tiempo en “el balcón de España”.

Finalmente, y no por ello menos importantes, mi familia, sobre todo mis padres. La

razón principal ya no es sólo porque les debo la vida, sino porque también les debo su

ejemplo. Las actitudes buenas que en mí puedan ver las demás personas en gran medida

son las que me inculcaron en casa. Ellos tuvieron aptitud para criarme y educarme, y

tanto en mis estudios universitarios como durante el doctorado, han tenido actitud para

apoyarme y sostenerme con el cariño propio de los padres y la comprensión inherente al

ser humano. Por eso les dedico el trabajo que se expone en las siguientes páginas.

RESUMEN

Staphylococcus aureus es una bacteria capaz de producir diferentes tipos de lesiones en

multitud de hospedadores. Las infecciones producidas por S. aureus son causa habitual

de infecciones en la piel, donde suelen generar abscesos. Para entender la patogénesis

de estas lesiones se requieren modelos de infección animal que se aproximen a las

situaciones clínicas naturales. La susceptibilidad del hospedador, la dosis del inóculo y la

elección de la cepa bacteriana son consideraciones importantes para establecer el

modelo animal apropiado. Por esta razón, el presente manuscrito se centra en la

caracterización y descripción inmunopatológica pormenorizada de un modelo de

infección experimental en conejo empleando dosis bajas de S. aureus.

En primer lugar, se caracterizaron las lesiones cutáneas y las respuestas inmunitarias

local y periférica tras la inoculación de una cepa ST121 de S. aureus aislada de conejo.

Los resultados mostraron un aumento del número de linfocitos B y T CD25+ sanguíneos a

los 0,5 días post-inoculación (dpi). Todos los animales presentaron lesiones evidentes al

1º dpi, coincidiendo con el incremento del número de células inflamatorias (heterófilos)

a nivel microscópico y el aumento de granulocitos sanguíneos. Esta afluencia de

heterófilos y su agrupación en el lugar de inoculación dio lugar a la formación de

nódulos. A los 3 dpi los abscesos alcanzaron las mayores dimensiones y se observaron

los primeros casos de dermonecrosis y ulceración. Además, a nivel microscópico los

abscesos estaban rodeados por una banda eosinófila y presentaban fenómenos de

Splendore-Hoeppli en su interior, y comenzaron a aumentar el número de macrófagos

locales y de monocitos sanguíneos. El 7º dpi se caracterizó por la apertura de los

abscesos y la consecuente disminución del número de bacterias. A nivel local, se

elevaron el número de células plasmáticas, linfocitos T y macrófagos; y de granulocitos y

monocitos en sangre. Tras el drenaje del contenido purulento comenzó la reparación

progresiva de las lesiones hasta los 28 dpi. A nivel histológico los fenómenos de

reparación se correspondieron con la presencia de tejido de granulación, disminución

gradual del número de células inflamatorias y reepitelización de la zona de lesión.

Asimismo, durante la fase de recuperación tuvo lugar un incremento de las poblaciones

sanguíneas de granulocitos y monocitos a los 14 dpi.

En segundo lugar, se evaluaron las lesiones provocadas por diversas cepas de S. aureus

mutantes en genes involucrados en la formación de abscesos (agr, coa-vwb, hla y el

locus psm), para estudiar posibles modificaciones en su morfología y respuesta

inflamatoria. A los 7 dpi, no hubo diferencias significativas en el número de animales

infectados, el tamaño y la gravedad de las lesiones producidas por las cepas mutantes

respecto a la cepa salvaje. En cuanto a las lesiones a nivel histológico, los abscesos

producidos por los mutantes también se caracterizaban por rodearse de bandas

eosinófilas, mayoritariamente incompletas en las cepas J Δagr y JΔ hla, y fenómenos de

Splendore.Hoeppli. Además, se observó mayor presencia de heterófilos difusos

alrededor de los abscesos desarrollados por J Δpsm., J Δagr y JΔ hla. Por último, el

infiltrado inflamatorio en el músculo cutáneo fue de carácter más leve-moderado, salvo

con la cepa J Δpsm.

Finalmente, se planteó comparar las lesiones y la respuesta inmunitaria desarrolladas

por la cepa ST121 salvaje con las provocadas por distintas cepas ST121 mutantes a los 1,

3 y 7 dpi. La cepa cunícola salvaje y la cepa humana rabbitizada (F dltBr) fueron capaces

de producir lesiones en todos los animales inoculados. Además, las lesiones cutáneas

desarrolladas por la cepa mutante humana fueron similares a las producidas por la cepa

salvaje aislada de conejo. Sin embargo, las cepas de origen cunícola produjeron lesiones

más leves tras restablecer el gen rot (J rot+) y mutar el gen dltB (J dltBh). Asimismo, en los

abscesos desarrollados por la cepa J dltBh no se observó una banda eosinófila, y sólo se

encontraron fenómenos de Splendore-Hoeppli con la J rot+. Por otra parte, la respuesta

inmunitaria periférica en los animales inoculados con las cepas mutantes se caracterizó

por menor número de granulocitos y monocitos, y recuentos superiores de linfocitos (B,

T, T CD4+, T CD8+ y T CD25+). En cuanto a la respuesta inmunitaria local, al 1º dpi se

encontró un mayor número de células plasmáticas en las lesiones producidas por la cepa

J rot+, y sólo se detectaron linfocitos T en los animales infectados con F dltBr y J dltBh.

Por todo ello, el modelo experimental caracterizado en este trabajo puede constituir un

sistema adecuado para reproducir, de forma fiable, las infecciones provocadas por

S. aureus en condiciones naturales.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is a bacterium capable of producing different types of lesions in

many hosts. The infections produced by S. aureus are the usual cause of skin infections,

where abscesses tend to form. Animal infection models that approach natural clinical

situations are needed to understand the pathogenesis of these lesions. Host

susceptibility, inoculum dose and choice of bacterial strain are relevant considerations

to determine a suitable animal model. This is why the present manuscript centres on a

characterisation and immunopathological description by detailing an experimental

infection model in rabbits using low S. aureus doses.

Firstly, skin lesions and local and peripheral immune responses were characterised after

the inoculation of an isolated rabbit strain ST121 of S. aureus. The results showed an

increase in the number of B and T CD25+ blood lymphocytes at 0.5 days post-inoculation

(dpi). All the animals presented evident lesions on 1 dpi, which coincided with an

increasing number of inflammatory cells (heterophils) under a microscope, and more

granuolocytes in blood. This abundance of heterophils and them grouping at the

inoculation site gave way to nodes forming. On 3 dpi, abscesses had reached their

biggest size, and the first cases of dermonecrosis and ulceration were observed. The

microscope revealed that abscesses were surrounded by an eosinophil band, presented

Splendore-Hoeppli phenomena in their interior, and the number of local macrophages

and monocytes in blood began to grow. Dpi 7 was characterised by abscesses opening

and the number of bacteria subsequently lowered. Locally, the number of plasma cells, T

lymphocytes and macrophages rose, as did the number of granulocytes and monocytes

in blood. After draining purulent content, lesion repair progressively started until 28 dpi.

In histological terms, repair phenomena corresponded with the presence of granulation

tissue, a gradual reduction in the number of inflammatory cells and epithelialisation in

the lesion area. During the recovery phase, the granulocyte and monocyte populations

in blood had grown by 14 dpi.

Secondly, the lesions caused by the different mutant S. aureus strains in the genes

involved in abscess formation (agr, coa-vwb, hla and locus psm) were evaluated to

study any possible modifications in their morphology and inflammatory response. On 7

dpi, no significant differences were found in the number of infected animals, nor in the

size or severity of the lesions caused by the mutant strains in relation to the wild strain.

With the histological-type lesions, the abscesses caused by mutants were also

characterised by being surrounded by eosinophil bands, most of which were incomplete

in strains J Δagr and J Δhla, and by Splendore-Hoeppli phenomena. More diffuse

heterophils were present around the abscesses developed by J Δpsm., J Δagr and

J Δhla. The inflammatory infiltrate in skin muscle was more mild-moderate, except with

strain J Δpsm.

Finally, a comparison of the lesions and immune response developed by wild strain

ST121 with those caused by different mutant ST121 strains by 1, 3 and 7 dpi was made.

The wild rabbit strain and the human rabbitised (F dltBr) strain were capable of

producing lesions in all the inoculated animals. Moreover, the skin lesions developed by

the human mutant strain were similar to those produced by the wild isolated rabbit

strain. However, the strains of rabbit origin caused less severe lesions after gene rot

(J rot+) was re-established and gene dltB (J dltBh) mutated. In the abscesses developed

by strain J dltBh, no eosinophil band was observed, and Splendore-Hoeppli phenomena

were found only with J rot+. The peripheral immune response in the animals inoculated

with mutant strains was characterised by fewer granulocytes and monocytes, and by

higher lymphocyte counts (B, T, T CD4+, T CD8+ and T CD25+). More plasma cells were

found for the local immune response on 1 dpi in the lesions caused by strain J rot+, and T

lymphocytes were detected only in the animals infected by F dltBr and J dltBh.

Thus the experimental model characterised herein may prove to be a suitable system to

reliably reproduce infections caused by S. aureus under natural conditions.

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL

Página

LISTA DE ABREVIATURAS ----------------------------------------------------------------------

ÍNDICE DE FIGURAS -----------------------------------------------------------------------------

ÍNDICE DE IMÁGENES ---------------------------------------------------------------------------

ÍNDICE DE TABLAS -------------------------------------------------------------------------------

1. INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------

1.1. Género Staphylococcus ------------------------------------------------------------------

1.1.1. Staphylococcus aureus ------------------------------------------------------------------ 1.1.2. Importancia clínica de S. aureus ------------------------------------------------------

1.1.2.1. Humanos --------------------------------------------------------------------------- 1.1.2.2. Ganadería --------------------------------------------------------------------------

1.1.2.2.1. Cunicultura ------------------------------------------------------------------- 1.1.3. Factores de virulencia de S. aureus -------------------------------------------------- 1.1.4. Modelos de infección experimental con S. aureus ------------------------------

1.1.4.1. Estudios experimentales en piel ---------------------------------------------- 1.1.4.2. El conejo como modelo de infección experimental ----------------------

1.2. Sistema inmunitario ----------------------------------------------------------------------

1.2.1. Respuesta inmunitaria innata --------------------------------------------------------- 1.2.1.1. Polimorfonucleares neutrófilos ----------------------------------------------- 1.2.1.2. Células mononucleares: monocitos-macrófagos -------------------------

1.2.2. Respuesta inmunitaria adaptativa --------------------------------------------------- 1.2.2.1. Linfocitos ---------------------------------------------------------------------------

1.2.2.1.1. Linfocitos B ------------------------------------------------------------------- 1.2.2.1.2. Linfocitos T -------------------------------------------------------------------

1.2.3. Citoquinas ---------------------------------------------------------------------------------

1.3. Piel --------------------------------------------------------------------------------------------

1.3.1. Estructura histológica de la piel ------------------------------------------------------ 1.3.2. Mecanismos de defensa cutáneos ---------------------------------------------------

2. OBJETIVOS -----------------------------------------------------------------------------------

3

13

19

23

27

27

27 29 32 34 35 36 41 43 59

60

61 63 66 66 67 67 67 68

69

70 71

79

ÍNDICE GENERAL

Página

3. MATERIAL Y MÉTODOS -----------------------------------------------------------------

3.1. Cepas bacterianas y medios de cultivo ----------------------------------------------

3.2. Plásmidos y cebadores -------------------------------------------------------------------

3.3. Biología molecular ------------------------------------------------------------------------ 3.3.1. Extracción del DNA genómico -------------------------------------------------------- 3.3.2. Amplificación del DNA mediante PCR ----------------------------------------------- 3.3.3. Transformación de Escherichia coli --------------------------------------------------

3.3.3.1. Obtención de células competentes: método del CaCl2 ------------------ 3.3.3.2. Método del choque térmico ---------------------------------------------------

3.3.4. Transformación de S. aureus ---------------------------------------------------------- 3.3.4.1. Obtención de células competentes: método de la sacarosa ---------- 3.3.4.2. Electroporación -------------------------------------------------------------------

3.3.5. Transferencia de plásmidos entre cepas de S. aureus -------------------------- 3.3.5.1. Inducción de cepas con mitomicina ----------------------------------------- 3.3.5.2. Infección con bacteriófago en medio líquido ----------------------------- 3.3.5.3. Transducción de plásmido entre cepas -------------------------------------

3.3.6. Mutagénesis por recombinación ----------------------------------------------------- 3.3.6.1. Amplificación de las flanqueantes mediante PCR ------------------------ 3.3.6.2. Clonación de las flanqueantes y del pMAD -------------------------------- 3.3.6.3. Recombinación bacteriana en S. aureus ------------------------------------

3.3.7. Extracción de DNA plasmídico -------------------------------------------------------- 3.3.8. Secuenciación de los productos de PCR y digestión -----------------------------

3.4. Comportamiento in vitro de cepas de S. aureus ---------------------------------- 3.4.1. Evaluación del crecimiento bacteriano en medio líquido ---------------------- 3.4.2. Coagulación de plasma de conejo --------------------------------------------------- 3.4.3. Supervivencia en sangre de conejo --------------------------------------------------

3.5. Modelo de infección experimental en piel de conejo --------------------------- 3.5.1. Preparación del inóculo bacteriano ------------------------------------------------- 3.5.2. Protocolo de inoculación intradérmica --------------------------------------------- 3.5.3. Cepas bacterianas, animales empleados y tiempos de muestreo ----------- 3.5.4. Toma de muestras ----------------------------------------------------------------------- 3.5.5. Análisis mediante citometría de flujo y contador hematológico ------------- 3.5.6. Análisis histopatológicos ---------------------------------------------------------------

3.5.6.1. Estudios histológicos ------------------------------------------------------------ 3.5.6.2. Estudios inmunohistoquímicos -----------------------------------------------

3.5.7. Análisis bacteriológico: pureza de los cultivos y recuentos bacterianos --- 3.5.8. Cuantificación de citoquinas plasmáticas y locales ------------------------------

3.6. Análisis estadístico ------------------------------------------------------------------------

83

83

85

88 88 88 89 89 89 90 90 90 91 91 91 91 92 92 93 94 96 96

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100 100 102 102 102 106 106

107

ÍNDICE GENERAL

Página

4. RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------

4.1. Modelo de infección experimental intradérmica en conejo con una cepa

de S. aureus de origen cunícola -------------------------------------------------------

4.1.1. Observaciones macroscópicas -------------------------------------------------------- 4.1.1.1. Desarrollo y evolución clínica de las lesiones cutáneas ----------------- 4.1.1.2. Recuentos bacterianos ---------------------------------------------------------- 4.1.1.3. Estado de salud de los animales ----------------------------------------------

4.1.2. Observaciones microscópicas --------------------------------------------------------- 4.1.2.1. Descripción histológica --------------------------------------------------------- 4.1.2.2. Evaluación de la respuesta inmunitaria local ------------------------------

4.1.3. Estudio de la respuesta inmuitaria periférica ------------------------------------- 4.1.4. Estudio de las citoquinas locales y plasmáticas -----------------------------------

4.2. Evaluación de cepas mutantes de S. aureus ---------------------------------------

4.2.1. Caracterización in vitro de cepas mutantes de S. aureus ----------------------- 4.2.1.1. Crecimiento en medio líquido en condiciones controladas ------------ 4.2.1.2. Capacidad de coagulación en plasma de conejo ------------------------- 4.2.1.3. Supervivencia bacteriana en sangre de conejo ---------------------------

4.2.2. Caracterización in vivo de cepas mutantes de S. aureus ------------------------ 4.2.2.1. Estudio de la capacidad de formación de abscesos intradérmicos --

4.2.2.1.1. Observaciones macroscópicas ------------------------------------------ 4.2.2.1.2. Observaciones microscópicas -------------------------------------------

4.3. Estudio de la interacción de cepas de S. aureus modificadas

genéticamente y el conejo --------------------------------------------------------------

4.3.1. Observaciones macroscópicas -------------------------------------------------------- 4.3.1.1. Capacidad de producir lesiones cutáneas ---------------------------------- 4.3.1.2. Recuentos bacterianos ---------------------------------------------------------- 4.3.1.3. Estado de salud de los animales ----------------------------------------------

4.3.2. Observaciones microscópicas --------------------------------------------------------- 4.3.2.1. Descripción histológica ---------------------------------------------------------- 4.3.2.2. Evaluación de la respuesta inmunitaria local ------------------------------

4.3.3. Estudio de la respuesta inmunitaria periférica -----------------------------------

115

115

115 115 117 118 120 120 139 147 153

157

157 157 159 160 162 162 162 166

174

174 174 176 178 178 178 186 188

ÍNDICE GENERAL

Página

5. DISCUSIÓN -----------------------------------------------------------------------------------

5.1. El modelo de infección experimental intradérmica a baja dosis infectiva -

5.2. Genes implicados en la patogenia de S. aureus en conejos --------------------

5.3. Importancia de la cepa ST121 cunícola para el estudio de S. aureus --------

6. CONCLUSIONES -----------------------------------------------------------------------------

7. BIBLIOGRAFÍA -------------------------------------------------------------------------------

197

197

212

215

221

225

LISTA DE ABREVIATURAS

3


agr Gen regulador accesorio. Del inglés: Accessory gene regulator

AIPs Péptidos autoinductores Del inglés: Auto-inducing peptides

ALT Ácido lipoteicoico

amp Ampicilina

AMPs Péptidos antimicrobianos. Del inglés: Antimicrobial peptides

APCs Células presentadoras de antígenos. Del inglés: Antigen-presenting cells

Aur Aureolisina

BPI Factor bactericida/estimulador de la permeabilidad. Del inglés:

Bactericidal/permeability-increasing protein

CaCl2 Cloruro de calcio

CA-MRSA S. aureus resistente a la meticilina asociado a la comunidad. Del inglés:

Community-acquired methicillin-resistant S. aureus

CAMPs Péptidos catiónicos antimicrobianos. Del inglés: Cationic antimicrobial

peptides

CLP Progenitor linfoide común. Del inglés: Common lymphoid progenitors

cm / cm2/ cm3 Centímetro/ centímetro cuadrado/ centímetro cúbico

CSFs Factores estimulantes de colonias. Del inglés: Colony-stimulating

factors

DNA Ácido desoxirribonucleico. Del inglés: Deoxyribonucleic acid

dNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato

DO (nm) Densidad óptica a una determinada longitud de onda (nm)

DPBS Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Del inglés:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline solution

dpi Día/s post-inoculación

ECDC Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades. Del

inglés: European Centre for Disease Prevention and Control

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. Del inglés: Ethylenediaminetetraacetic

acid

e.g. Por ejemplo. Del latín: exempli gratia

4


EGFP-PMNs Polimorfonucleares neutrófilos con proteína verde fluorescente

mejorada. Del inglés: Enhanced green fluorescence protein-

Polymorphonuclear neutrophils

ELISA Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas. Del inglés: Enzyme-linked

immunosorbent assay

ELP Progenitor linfoide primario o temprano. Del inglés: Early lymphoid

progenitor

Eri Eritromicina

ETs Toxinas exfoliativas. Del inglés: Exfoliative toxins

F Flanqueante

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura

FDA Agencia del gobierno de los Estados Unidos responsable de la

administración de medicamentos; en España es la AEMPS. Del inglés:

Food and Drug Administration

FITC Isotiocianato de fluoresceína. Del inglés: Fluorescein isothiocyanate

g Gramo

g (RCF) Fuerza g (unidad de la fuerza centrífuga relativa. Del inglés: Relative

centrifugal force

g/l Gramos/litro

G/L Granulocitos/Linfocitos

GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos. Del

inglés: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

h Horas

HA-MRSA S. aureus resistente a la meticilina asociado a los hospitales. Del inglés:

Hospital-acquired methicillin-resistant S. aureus

Hb Hemoglobina

hBDs Defensinas beta humanas. Del inglés: Human β-defensins

Hla Hemolisina alfa. Del inglés: Alpha-hemolysin

Hlb Hemolisina beta. Del inglés: Beta-hemolysin

Hlg Hemolisina gamma. Del inglés: Gamma-hemolysin

5


HNPs Péptidos neutrofílicos humanos. Del inglés: Human neutrophil peptides

hpi Hora/s post-inoculación

HRP Peroxidasa de rábano. Del inglés: Horseradish peroxidase

Hto Hematocrito

H&E Hematoxilina-eosina

H2O Agua

H2O2 Peróxido de hidrógeno (también conocido como agua oxigenada)

i.b. Intrabronquial

IBMCP-UPV Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas de la Universidad

Politécnica de Valencia

i.d. Intradérmico

i.e. Es decir. Del latín: id est

IFN Interferón

Ig Inmunoglobulina

IL Interleucina

i.m. Intramamaria

i.n. Intranasal

i.p. Intraperitoneal

IsdA Determinante A de superficie regulado por hierro. Del inglés: Iron-

regulated surface determinant protein

i.t. Intratraqueal

i.v. Intravenoso

Kb Kilobase

Kg Kilogramo

Kv Kilovoltios

l Litro

L Longitud

LA-MRSA S. aureus resistente a la meticilina asociado al ganado. Del inglés:

Livestock-associated methicillin-resistant S. aureus

6


LB Medio de cultivo Luria-Bertani

M (mM) Molar (milimolar)

MDSCs Células supresoras mieloides derivadas. Del inglés: Myeloiod-derived

supresor cells

MGEs Elementos genéticos móviles. Del inglés: Mobile genetic elements

MgSO4 Sulfato de magnesio

MHC Complejo mayor de histocompatibilidad. Del inglés: Major

histocompatibility complex

ml Mililitro

MLST Tipificación de secuencias multiloculares. Del inglés: Multilocus

sequence typing

MRSA S. aureus resistente a la meticilina. Del inglés: Methicillin-resistant S.

aureus

MSCRAMMs Componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas

adhesivas de la matriz. Del inglés: Microbial surface components

recognizing adhesive matrix molecules

MSSA S. aureus sensible a la meticilina. Del inglés: Methicillin-sensitive S.

aureus

NaCl Cloruro sódico

Na3C6H5O7 Citrato de sodio

NaHCO3 Bicarbonato de sodio

NETs Trampas extracelulares de los neutrófilos. Del inglés: Neutrophil

extracellular traps

NF-B Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B

activadas. Del inglés: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells

NH4Cl Cloruro de amonio

NK Células asesinas naturales. Del inglés: Natural killer

NODs Dominio de oligomerización por unión de nucleótidos. Del inglés:

Nucleotide-binding oligomerization domain

NSG Cepa de ratón inmunodeficiente. Del inglés: NOD scid gamma

7


OIE Organización Mundial de Sanidad Animal

OMS Organización Mundial de la Salud

o.n. Durante toda la noche. Del inglés: Overnight

PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos. Del inglés: Pathogen-

associated molecular patterns

PTAH Hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory. Del inglés: Mallory’s phosphotungstic acid haematoxilin

pb Pares de bases

PBMCs Células mononucleares de sangre periférica. Del inglés: Peripheral

blood mononuclear cells

PBS Tampón fosfato salino. Del inglés: Phosphate Buffered Saline

PCR Reacción en cadena de la polimerasa. Del inglés: Polimerase chain

reaction

PepG Peptidoglicano

PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado. Del inglés: Pulsed-field gel

electrophoresis

PFTs Toxinas formadoras de poros. Del inglés: Pore-forming toxins

pi Post-inoculación

pg Picogramo

PMNs Polimorfonucleares neutrófilos. Del inglés: Polymorphonuclear

neutrophils

Pmt Sistema transportador de modulinas solubles en fenol. Del inglés:

Phenol-soluble modulins transporter

PRRs Receptores de reconocimiento de patrones. Del inglés: Pattern

recognition receptors

PSMs Modulinas solubles en fenol. Del inglés: Phenol-soluble modulins

PTSAgs Superantígenos de toxinas pirogénicas. Del inglés: Pyrogenic toxin

superantigens

PVL Leucocidina Panton-Valentine. Del inglés: Panton-Valentine leukocidin

RNS Especies reactivas de nitrógeno. Del inglés: Reactive nitrogen species

ROS Especies reactivas de oxígeno. Del inglés: Reactive oxygen species

8


rpm Revoluciones por minuto

SACs Agrupaciones de estafilococos en los abscesos. Del inglés:

Staphylococcal abscess comunities

SAK Estafiloquinasa. Del inglés: Staphylokinase

sar Regulador estafilocócico accesorio. Del inglés: Staphylococcal accesory

regulator

s.c. Subcutáneo

SCCmec Cassete cromosomico estafilocócico mec. Del inglés: Staphylococcal

chromosome cassete mec

SCN Staphylococcus coagulasa negativo

SD Sin diluir

SFP Intoxicación alimentaria por estafilococos. Del inglés: Staphylococcal

food poisoning

SNP Polimorfismo de un solo nucleótido. Del inglés: Single nucleotide

polymorphism

spp. Especies

SSSS Síndrome estafilocócico de la piel escaldada. Del inglés: Staphylococcal

scalded-skin syndrome

ST Secuencia tipo. Del inglés: Sequence type

SSTIs Infecciones de piel y tejidos blandos. Del inglés: Skin and soft tissue

infections

TBST Solución salina con tampon Tris con Tween. Del ingles: Tris buffered

saline with Tween

TCS Sistema regulador de dos componentes. Del inglés: Two component

system

TLRs Receptores tipo Toll. Del inglés: Toll-like receptors

TNF Factor de necrosis tumoral. Del inglés: Tumor necrosis factor

Treg Células T reguladoras. Del inglés: Regulatory T cells

Tris Tris(hidroximetil)aminometano (Fórmula: C4H11NO3)

TSA Medio de cultivo agar de soja tríptico. Del inglés: Tryptic soy agar

9


TSB Medio de cultivo líquido de soja tríptico. Del inglés: Tryptic soy broth

TSS Síndrome del shock tóxico. Del inglés: Toxic shock syndrome

TSST-1 Toxina 1 del Síndrome del shock tóxico. Del ingles: Toxic shock

syndrome toxin 1

U Unidad de actividad enzimática

UE Unión Europea

UFC Unidad formadora de colonias

VRSA S. aureus resistente a la vancomicina. Del inglés: Vancomycin-resistant

S. aureus

vWbp Proteína de unión al factor de von Willebrand. Del inglés: von

Willebrand factor-binding protein

W Anchura. Del inglés: Width

wt Cepa salvaje. Del inglés: Wild type

X-gal 5-Bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranósido (también BCIG)

g Microgramo

F Microfaradio

l Microlitro

M Micromolar

ÍNDICE DE FIGURAS

13

ÍNDICE DE FIGURAS

Número Contenido Página

1.1 Interpretación de la prueba del manitol en medio agar. (Dibujo

generado a partir de Washington y Yu, 1970)

28

1.2 Porcentaje de aislados MRSA en países de la UE en el año 2015.

(Fuente: European Centre for Disease Prevention and Control)

33

1.3 Interacción entre los factores de virulencia de S. aureus y la

respuesta inmunitaria. (Figura adaptada a partir de Pozzi et al.,

1995)

62

1.4 Fagocitosis de S. aureus por los neutrófilos. (Figura adaptada a

partir de McGuinness et al., 2016)

64

1.5 Función microbicida de los neutrófilos. (Figura adaptada a partir de

McGuinness et al., 2016)

65

1.6 Componentes de la piel implicados en la defensa frente a la

colonización, invasión e infección por S. aureus. (Figura adaptada a

partir de Krishna y Miller, 2012a)

74

3.1 Representación esquemática de la PCR para obtener los fragmentos

flanqueantes (F) al gen de estudio

93

3.2 Representación esquemática de la PCR para unir F1 y F2 en un solo

fragmento amplificado (F12)

93

3.3 Primera recombinación del proceso de mutagénesis. (Dibujo

generado a partir de Arnaud et al., 2004)

94

3.4 Segunda recombinación del proceso de mutagénesis. (Dibujo

generado a partir de Arnaud et al., 2004)

95

4.1 Evolución del volumen (cm3) de los nódulos a lo largo del período

experimental con la cepa Jwt

116

4.2 Evolución del peso de los animales a lo largo del período

experimental tras la inoculación de la cepa Jwt

119

4.3 Evolución de la temperatura corporal de los animales a lo largo del

período experimental tras la inoculación de la cepa Jwt

120

4.4 Representación de los hallazgos microscópicos a las 12 horas tras la

inoculación intradérmica de la cepa Jwt

122

14

ÍNDICE DE FIGURAS




124



125



128

4.8 Representación de los hallazgos microscópicos a los 7 días tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt

130


133


134


135

4.12 Evolución del número de células linfocitos T (a), células plasmáticas

(b) y macrófagos (c) a nivel local durante el estudio con la cepa Jwt

143

4.13 Evolución del número de leucocitos totales (a), granulocitos (b),

monocitos (c), linfocitos totales (d), linfocitos B (e) y linfocitos T

CD25+ (f) en sangre periférica tras la inoculación intradérmica de la

cepa Jwt

151

4.14 Evolución de la ratio Granulocitos/Linfocitos en sangre periférica

tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt

152

4.15 Evolución del hematocrito (a) y de la hemoglobina (b) tras la


152

4.16 Evolución de la concentración (pg/ml) de las interleuquinas 4 (a) y

18 (b) en plasma, y de la interleuquina 4 (c) e interferón gamma (b)

en tejido, tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt

156

4.17 Curva de crecimiento de 9 cepas mutantes de S. aureus de origen cunícola

158

4.18 Curva de crecimiento de 6 cepas mutantes de S. aureus de origen

humano y la USA300 (CA-MRSA)

158

15

ÍNDICE DE FIGURAS


4.19 Número total de bacterias (103 UFC/100 l) de diferentes cepas de

S. aureus tras su incubación en sangre de conejo

160

4.20 Número de bacterias (103 UFC/100 l) de cepas mutantes de S. aureus de origen cunícola incubadas en sangre de conejo a diferentes tiempos (hasta 3 horas)

161

4.21 Porcentaje de animales infectados con cada cepa mutante y la cepa salvaje (Jwt; control positivo) a los 7 días post-inoculación

163

4.22 Representación del volumen (cm3) de los nódulos producidos por las cepas mutantes J Δcoa-vwb (Estudio 1), J Δhla (Estudio 2),

J Δpsm (Estudio 3) y J Δagr (Estudio 4).en comparación a la Jwt (control positivo) a los 7 días post-inoculación

164

4.23 Gravedad de las lesiones cutáneas con cada cepa mutante y sus controles a los 7 días post-inoculación

165

4.24 Caracterización de los hallazgos histológicos a los 7 días post-inoculación con las cepas Jwt y J Δcoa-vwb

167

4.25 Caracterización de los hallazgos histológicos a los 7 días post-inoculación con las cepas Jwt y J Δhla

169

4.26 Caracterización de los hallazgos histológicos a los 7 días post-

inoculación con las cepas Jwt y J Δpsm

171

4.27 Caracterización de los hallazgos histológicos a los 7 días post-inoculación con las cepas Jwt y J Δagr

173

4.28 Porcentaje de animales con lesiones tras la inoculación

intradérmica de 300 UFC de las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh

175

4.29 Gravedad de las lesiones cutáneas observadas con las cepas Jwt,

F dltBr, J rot+ y J dltBh 175

4.30 Evolución del número medio de bacterias (106 UFC/g) aisladas a

partir de las lesiones cutáneas con las cepas Jwt, F dltBr y J rot+

durante el estudio

177

4.31 Evolución del engrosamiento de la epidermis tras la inoculación

intradérmica de las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh

179

4.32 Evolución de los hallazgos histológicos en la dermis superficial tras

la inoculación intradérmica de las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh:

dilatación vascular (A), edema (B) y hemorragias (C)

183

16

ÍNDICE DE FIGURAS


4.33 Evolución de los hallazgos histológicos en la dermis profunda tras la

inoculación intradérmica de las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh:

dilatación vascular (A), inflamación perivascular (B) y abscesos (C)

184

4.34 Evolución de los hallazgos histológicos en el músculo cutáneo tras

la inoculación intradérmica de las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh:

inflamación intersticial (A) y atrofia muscular (B)

185

4.35 Número (cél/mm2) de células plasmáticas (a), linfocitos B (b),

linfocitos T (c) y macrófagos (d) a nivel local según el tipo de cepa

de S. aureus (Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh) en cada tiempo de

muestreo (1, 3 y 7 días post-inoculación)

187

4.36 Efecto del tipo de cepa de S. aureus (Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh) y

del tiempo post-inoculación sobre el número de leucocitos totales

(a), granulocitos (b) y monocitos (c), y sobre el valor de la ratio

Granulocitos/Linfocitos (d), el hematocrito (e) y la hemoglobina (f)

en sangre periférica

192

4.37 Recuento de leucocitos totales, granulocitos, linfocitos totales, linfocitos T, T CD4+, T CD8+ y monocitos (106/l) en los animales con lesiones producidas por las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh de S. aureus

193

4.38 Recuento de linfocitos B y linfocitos T CD25+ (106/l), y las ratios CD4+/CD8+ y Granulocitos/Linfocitos en los animales con lesiones cutáneas producidas por las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh de S. aureus

194

ÍNDICE DE IMÁGENES

19



4.1 Hallazgos macroscópicos representativos de cada tiempo de

muestreo del estudio con la cepa Jwt

116

4.2 Presencia de descarga purulenta en la extremidad posterior

derecha (a) e izquierda (b) de dos conejos a los 9 días post-

inoculación con la cepa Jwt

117

4.3 Infiltrado inflamatorio en la dermis profunda a las 12 horas tras la

inoculación intradérmica de la cepa Jwt. 10x. H&E

121

4.4 Dilatación vascular e hiperemia. 40x. H&E 121

4.5 Agrupación de heterófilos formando un absceso en la dermis

profunda a las 24 horas post-inoculación. 2x. H&E

123

4.6 Absceso intradérmico a los 2 días post-inoculación. Imagen

principal a 2x. Imagen en detalle a 10x. H&E

125

4.7 Agrupación de bacterias Gram-positivas en el interior de un

absceso. 20x. Gram

126

4.8 Dermonecrosis y presencia de hemorragias subepidérmicas. 10x.

H&E

127

4.9 Absceso intradérmico rodeado por una banda eosinófila completa.

2x. H&E

127

4.10 Fenómenos de Splendore Hoeppli. A. 60x. B. 40x. H&E 128

4.11 Necrosis de la epidermis y pérdida de la integridad del epitelio. 10x.

H&E

129

4.12 Infiltración, atrofia e interrupción del músculo cutáneo. 20x. H&E 130

4.13 (A) Reepitelización epidérmica y ausencia de anejos cutáneos. 10x.

H&E. (B) Tejido de granulación inmaduro. 20x. H&E

131

4.14 Infiltración, atrofia e interrupción del músculo cutáneo. 20x. H&E 132

4.15 Atrofia de las fibras del músculo cutáneo de una zona de lesión (A)

en comparación a una zona sana (B). 20x. Tricrómico de Masson

132

4.16 Hiperplasia del epitelio de los bordes de la úlcera. 40x. H&E 134

4.17 Hiperplasia epitelial, invasión de folículos pilosos y hemorragias en

zonas recuperadas de lesión a los 28 días post-inoculación. 10x.

H&E

136

20



4.18 Linfocitos próximos a la zona de lesión en la dermis profunda. (A)

Linfocitos T adyacentes a vasos sanguíneos. 20x. Mouse

Monoclonal Anti-Dog CD3-12. Complejo avidina-biotina peroxidasa

(ABC). (B) Linfocitos B agrupados. 10x. Monoclonal Mouse Anti-

Human CD79. Complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC)

140

4.19 Agrupación de células plasmáticas en dermis profunda. 20x. Mouse

Monoclonal Anti-Rabbit Light Chain, HRP Conjugated

140

4.20 Macrófagos distribuidos de manera difusa a las 24 horas post-

inoculación, 20x (A), y a los 7 días post-inoculación, 40x (B), y

delimitando un absceso, 2x (C). Mouse Monoclonal Anti-Rabbit

Macrophage Clone RAM11. Complejo avidina-biotina peroxidasa

(ABC)

141

4.21 Inmunoglobulinas alrededor de las bacterias contenidas en un

Splendore-Hoeppli. 20x. Biotinylated Anti-Rat IgG (H+L)

144

4.22 Presencia de células en proliferación en la dermis profunda tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt. (A) Diferentes tipos de células de morfología redondeada a los 3 días post-inoculación: células plasmáticas, linfocitosy macrófagos. 40x. (B) Células proliferativas distribuidas de manera difusa en la dermis profunda y entre las fibras del músculo cutáneo a los 7 días post-inoculación. 4x. Mouse Monoclonal Anti-PCNA. Complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC).

146

4.23 Incubación de S. aureus en plasma de conejo 159

ÍNDICE DE TABLAS

23

ÍNDICE DE TABLAS


1.1 Modelos de infección experimental in vivo con S. aureus 44

1.2 Aislados clínicos de S. aureus de origen humano más comúnmente

utilizados en los estudios experimentales in vivo

56

1.3 Péptidos antimicrobianos catiónicos que participan en la inmunidad

cutánea frente a S. aureus

72

3.1 Cepas bacterianas utilizadas en este estudio 82

3.2 Plásmidos utilizados en este estudio 83

3.3 Cebadores utilizados en este estudio 84

3.4 Cepas de S. aureus incubadas en sangre de conejo 95

3.5 Número de conejos inoculados con cada cepa de S. aureus y

tiempos de muestreo empleados

97

3.6 Anticuerpos utilizados en la técnica de citometría de flujo para el

estudio de las poblaciones celulares a nivel periférico

99

3.7 Anticuerpos utilizados en el estudio inmunohistoquímico 103

3.8 Citoquinas analizadas en este estudio 104

3.9 Modelos estadísticos utilizados en este trabajo en función de la

variable y del estudio

108

4.1 Número de bacterias de la cepa Jwt en los puntos de inoculación

durante el estudio

118

4.2 Evolución del peso y la temperatura corporal de los animales tras la


119

4.3 Caracterización de los hallazgos histológicos tras la inoculación

experimental intradérmica de la cepa Jwt

137

138

4.4 Caracterización de la respuesta inmunitaria local tras la inoculación

experimental intradérmica de la cepa Jwt

142

4.5 Evolución de las poblaciones leucocitarias (106/l) en sangre

periférica tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt

149

4.6 Evolución de los parámetros hematológicos (% hematocrito y

g hemoglobina/l) tras la inoculación intradérmica de la cepa Jwt

150

24

ÍNDICE DE TABLAS


4.7 Concentración de citoquinas (pg/ml) en plasma y piel durante el

estudio tras la inoculación experimental intradérmica de la cepa

Jwt

154

4.8 Número medio de bacterias (106 UFC/g) en las zonas de lesión

producidas por diferentes cepas de S. aureus (Jwt, F dltBr y J rot+)

176

4.9 Número medio de bacterias (106 UFC/g) aisladas a partir de las

lesiones en función de la cepa de S. aureus (Jwt, F dltBr y J rot+) y

del tiempo post-inoculación

177

4.10 Temperatura corporal de los animales inoculados con diferentes

cepas de S. aureus (Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh)

178

4.11 Caracterización de los hallazgos histológicos y evolución de su

gravedad tras la inoculación intradérmica de diferentes cepas de

S. aureus (Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh)

182

4.12 Número de fenómenos de Splendore-Hoeppli encontrados en los

abcesos producidos por las cepas Jwt y J rot+ en los días 3 y 7 post-

inoculación

185

4.13 Recuento de las poblaciones leucocitarias sanguíneas y los

parámetros hematológicos (hematocrito y hemoglobina) en los

animales inoculados con las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh de

S. aureus

189

4.14 Recuento de las poblaciones leucocitarias sanguíneas y los

parámetros hematológicos (hematocrito y hemoglobina) de los

animales inoculados con las cepas Jwt, F dltBr, J rot+ y J dltBh de

S. aureus en función del tiempo post-inoculación

191

1. INTRODUCCIÓN

27

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Género Staphylococcus

Los estafilococos son bacterias Gram-positivas que pertenecen a la familia

Micrococcaceae. Este género bacteriano se caracteriza por crecer tanto en condiciones

con oxígeno como carente de éste (anaerobio facultativo), y en medios que contienen

un 10% de NaCl. Además, son cocos catalasa positivos y utilizan los glúcidos para su

metabolismo (Branson, 1968; Lowy, 1998).

El genoma de los estafilococos consiste en un cromosoma circular, así como elementos

extracromosomales (fagos, plásmidos y transposones) a través de los cuales transmiten

entre sí los genes que codifican los caracteres de virulencia, como puede ser la

capacidad de resistencia antibiótica, entre otros (Lowy, 1998; Baba et al., 2008; Chen et

al., 2018).

Una de las especies más conocidas perteneciente a este género es Staphylococcus

aureus, adaptada al ser humano y aislada también de un gran número de especies

animales. Además, existen otras especies de estafilococos no adaptadas al hospedador

humano, tales como S. delphini, S. intermedius y S. pseudintermedius (Thomer et al.,

2016).

1.1.1. Staphylococcus aureus

S. aureus es el primer agente que se aisló a partir del exudado purulento de una herida

(1881). Fue Alexander Ogston quien identificó a esta bacteria como un estafilococo

atendiendo a su aspecto en forma de esferas agrupadas, que recuerda a racimos de uva,

y desde entonces empezó a distinguirse de los estreptococos, bacterias que también

pueden producir lesiones purulentas y que se establecen como formaciones en cadena

(Thomer et al., 2016).

La terminología de S. aureus fue propuesta poco después por Friedrich Julius Rosenbach

basándose en la pigmentación amarilla de sus colonias. Esta coloración amarillenta,

presente en algunas cepas, se debe a la presencia de la estafiloxantina, un pigmento

1. Introducción

28

carotenoide que participa en la evasión de la fagocitosis. Por otra parte, Rosenbach

también añadió la nomenclatura de S. albus para los aislados de color blanco (Thomer et

al., 2016).

Este microorganismo es capaz de sobrevivir en numerosos y diversos ambientes, y

prueba de ello es el hecho de que ha sido aislado de gran cantidad de animales

vertebrados. Esta habilidad de adaptación deriva de su potencial para adquirir

características fenotípicas específicas para su hospedador, como pueden ser la actividad

hemolítica y la capacidad de coagular el plasma y la sangre (Fitzgerald, 2012). Este

último rasgo es de interés diagnóstico porque permite diferenciarlo de algunas bacterias

comensales pertenecientes al mismo género; como por ejemplo, S. epidermidis, que es

un estafilococo coagulasa negativo (SCN) (Cheng et al., 2010). Además del test de la

coagulasa, gracias a la prueba del manitol también se puede distinguir de otras especies

de Staphylococcus (Branson, 1968; Lowy, 1998; Baba et al., 2008) (Figura 1.1). Otra

particularidad de este agente también es la producción de DNAsa y proteína A (Baba et

al., 2008).

Agar Sal Manitol

Figura 1.1. Interpretación de la prueba del manitol en medio agar. Resultado positivo (+): la

bacteria aislada es S. aureus cuando el medio cambia a color amarillo por la fermentación del

manitol. Resultado negativo (-): el medio aparece de color rosa porque la bacteria aislada no

fermenta el manitol. (Dibujo generado a partir de Washington y Yu, 1970).

1. Introducción

29

En un principio se pensó que S. aureus no era móvil porque carece de flagelos. Sin

embargo, en superficies de agar blandas forma colonias gigantes a 37ºC tras 10 horas de

incubación, un fenómeno que se conoce como colony spreading (Kaito y Sekimizu, 2007;

Pollit et al., 2015) y que puede ocurrir por medio de la absorción de agua de las placas

de agar y flotando en la superficie de soluciones acuosas (Lin et al., 2016). Al respecto,

hay cepas que manifiestan una mayor habilidad de dispersión, participando así en su

virulencia ya que contribuye a evitar a otras colonias bacterianas a través del halo que

las rodea (Tsompanidou et al., 2013; Kizaki et al., 2016). Además, esta capacidad se

puede estimular en medio agar mediante la suplementación con suero de mamífero

(Omae et al., 2014).

1.1.2. Importancia clínica de S. aureus

S. aureus es uno de los agentes integrantes del grupo de patógenos llamado ESKAPE

(Enterococcus faecium, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanni,

Pseudomonas aeruginosa, y Enterobacter spp.), reconocidos como la causa principal de

las infecciones nosocomiales y por ser resistente a la mayoría de los antibióticos

convencionales. Este grupo es también responsable de gran parte de las infecciones en

piel y tejidos blandos (SSTIs), que por otra parte se encuentran entre las infecciones

bacterianas más frecuentes en los seres humanos, y para las que se ha descrito a S.

aureus como su principal agente causal en todo el mundo (Pfalzgraff et al., 2018).

La presentación clínica de las SSTIs puede ser de carácter leve y superficial, o bien grave

y complicada, con propagación sistémica e incluso desenlace letal. Las formas más

habituales de las SSTIs son la celulitis y los abscesos, y es a partir de éstos últimos, sobre

todo aquellos que se encuentran próximos al músculo subyacente, desde donde las

bacterias pueden difundir y producir infección en prácticamente cualquier sistema

orgánico interno. Por otra parte, la clasificación empleada con mayor frecuencia en los

ensayos clínicos es la establecida por la FDA, que distingue entre SSTIs complicadas y

SSTIs no complicadas, pudiendo ser necesaria la intervención quirúrgica para el caso de

las primeras. La antibioterapia tópica se puede usar en casos de infecciones superficiales

no complicadas, permitiendo así alcanzar una mayor concentración del fármaco en el

sitio de infección y una reducción de los posibles efectos adversos a nivel sistémico. No

1. Introducción

obstante, la aplicación de fármacos tópicos requiere de la suficiente penetración tisular

(Cho et al., 2011; Pfalzgraff et al., 2018). Por otra parte, la afectación sistémica en

muchas ocasiones está mediada tanto por las toxinas bacterianas como por la respuesta

inflamatoria del propio organismo. La secreción de toxinas repercute en un mayor

tiempo del periodo de inflamación y el retraso de la cicatrización, cronificando así la

infección. Esta demora y/o defectos en la recuperación de las lesiones es una

característica de las infecciones por S. aureus (Pfalzgraff et al., 2018).

Además de ocasionar infecciones en la piel, S. aureus puede afectar a otras

localizaciones y sistemas del organismo, ayudado por un amplio repertorio de

mecanismos de virulencia y una tolerancia metabólica que conjuntamente le permiten

producir diferentes enfermedades: endocarditis, osteomielitis, neumonía, septicemia y

síndrome del shock tóxico (TSS). La capacidad de colonizar varios tejidos puede ocurrir

por contacto directo tras un traumatismo, por diseminación hematógena o mediante

propagación a partir de una infección contigua. En general, las infecciones producidas

por S. aureus se caracterizan por la persistencia local, necrosis tisular, metástasis a

distancia y resistencia a la terapia antimicrobiana, siendo la formación de abscesos la

manifestación patológica habitual (Lowy, 1998; DeLeo y Chambers, 2009; Brandt et al.,

2018).

S. aureus es una bacteria comensal y oportunista muy extendida, cuyo éxito como

patógeno humano guarda relación con su coexistencia mutua durante muchos años,

circunstancia que le ha permitido desarrollar medios para contrarrestar al sistema

inmunitario de la especie humana (Kobayashi et al., 2015b). El hospedador humano

puede ser infectado por las bacterias que colonizan su piel y superficies mucosas. De

hecho, la colonización proporciona a las bacterias una oportunidad para introducirse en

el organismo cuando las defensas decaen, y está determinada por múltiples factores

que, en conjunto, contribuyen a la interacción entre el hospedador y el microorganismo.

Por una parte, están los determinantes bacterianos que definen la habilidad del

patógeno para adherirse al tejido y evadir la respuesta inmunitaria; por otra interviene

también la genética del hospedador, que define la susceptibilidad hacia un determinado

microorganismo; y por último, los factores ambientales participan igualmente en esta

interacción afectando tanto al hospedador como a la bacteria (Sollid et al., 2014).

30

1. Introducción

31

Las superficies mucosas principalmente colonizadas por S. aureus son nariz, garganta,

pared vaginal, y tracto gastrointestinal. Un estudio llevado a cabo en Alemania concluyó

que el 80% de las infecciones invasivas producidas por esta bacteria tiene su origen en la

cepa que coloniza al paciente (von Eiff et al., 2001). La capacidad de colonización, entre

otros factores, permite clasificar a los clones de S. aureus en cepas de alta y baja

virulencia. En conejos se ha visto que tras la inoculación en cavidad nasal (Hermans et

al., 2000) y heridas cutáneas (Meulemans et al., 2007) con ambos tipos de cepas,

algunos de los animales infectados con cepas de alta virulencia desarrollan lesiones en

otras locaciones anatómicas de la piel. No obstante, aunque la colonización puede

predisponer a la infección, se ha visto que los individuos colonizados presentan

infecciones menos severas en comparación con los individuos no colonizados, y que

entre los pacientes que desarrollan bacteriemia, los que no son portadores registran

mayores índices de mortalidad que los portadores (Liu, 2009). De este modo,

atendiendo a que muchas infecciones en individuos portadores son producidas por sus

cepas colonizantes, la colonización puede conferir ciertos niveles de protección

inmunitaria (Gordon y Lowy, 2008; Liu, 2009), y en este sentido se ha encontrado que

los portadores persistentes presentan niveles de inmunoglobulinas (IgGs) frente a las

exotoxinas de S. aureus significativamente superiores a los no portadores (Clarke et al.,

2006; Verkaik et al., 2009).

El riesgo de infección por S. aureus es mayor en individuos hospitalizados, durante el

postoperatorio y en pacientes con dispositivos médicos (tubo traqueal, marcapasos y

válvulas cardíacas, catéteres intravenosos e implantes articulares). Otras poblaciones

consideradas de elevado riesgo de contraer una infección invasiva por este agente son

los neonatos de muy bajo peso, y pacientes que han recibido una terapia

inmunosupresora o anticancerígena (Lowy, 1998; Thomer et al., 2016).

En general, las cepas de S. aureus presentan una especialización con respecto al grado

de infectividad de su huésped, lo que limita la infección cruzada entre especies (Kapur et

al., 1995; Jorgensen et al., 2005; Herron-Olson et al., 2007).

1. Introducción

1.1.2.1. Humanos

Además de por su alta prevalencia, S. aureus es conocido por su capacidad para adquirir

resistencia a los antibióticos, una habilidad de manifiesto carácter epidémico. Las cepas

resistentes a la penicilina aparecieron a finales de 1940, y el incremento de éstas a

mediados de los años 50 derivó en la ineficacia terapéutica de estos productos

antimicrobianos en general (Kobayashi et al., 2015b).

Las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) fueron descritas a principios de

1960, y durante las siguientes décadas se extendieron por todo el mundo. Además,

pueden dividirse en dos grupos genéticamente distintos que afectan a diferentes, pero a

veces solapadas, poblaciones: las cepas asociadas a hospitales (HA-MRSA) y las

vinculadas a comunidades (CA-MRSA) (Liu, 2009; Kobayashi et al., 2015b).

Hasta finales de los 90 las infecciones por cepas MRSA estuvieron limitadas en gran

medida a los individuos inmunodeprimidos o al personal sanitario (Liu, 2009). En esa

misma década tuvo lugar un notable incremento en la incidencia de infecciones

bacterianas, en particular de las infecciones en piel y tejidos blandos, a causa de cepas

CA-MRSA. Este aumento pudo atribuirse a varios motivos, como: 1) la mejora de la

capacidad de supervivencia de la bacteria en al ambiente, a través de fómites y

animales; 2) el incremento de la transmisión entre individuos; 3) la mayor habilidad para

colonizar el hospedador; 4) la disminución del umbral del propio mecanismo bacteriano

para activar sus genes de virulencia; y 5) el incremento de la patogenicidad durante la

infección (Liu, 2009; Kobayashi et al., 2015b). El conocido como USA300 es el clon CA-

MRSA más extendido a nivel internacional y es la causa principal de infecciones en piel y

tejidos blandos en humanos. Su éxito se debe a que se transmite más fácilmente,

coloniza mejor y es más patogénica (Miller y Diep, 2008; Liu, 2009; Cho et al., 2011;

Kobayashi et al., 2015b).

Por otra parte, en 2002 se identificó otro grupo de S. aureus resistentes: las cepas VRSA,

resistentes al antibiótico de elección frente a los MRSA, la vancomicina. No obstante,

este no fue el primer caso conocido de resistencia a la vancomicina, pues fue

descubierta con anterioridad (1980) en enterococos (McGuinness et al., 2017).

32

1. Introducción

33

En la actualidad las cepas MRSA prevalecen como un grave problema sanitario. En un

informe emitido por la ECDC sobre resistencia a antibióticos en 2015 se puso de

manifiesto una reducción del 2% de aislados MRSA en la población europea entre los

años 2012 y 2015. Sin embargo, la presencia de MRSA no fue la misma en todos los

países, y en algunos seguía siendo elevada (Figura 1.2). Además, el 85,2% de las cepas

MRSA que se aislaron fueron también resistentes a fluoroquinolonas

(https://ecdc.europa.eu). Ante este escenario, que se extiende a nivel mundial, la FAO,

la OIE y la OMS conjuntamente elaboraron y publicaron en 2016 un manual para

orientar a los diferentes países en la elaboración de planes estratégicos frente a las

resistencias antimicrobianas (http://www.who.int/iris/handle/10665/204470).

<1% 1% a <5% 5% a <10% 10% a <25% 25% a <50% ≥50% Sin datos o con <10 aislados No incluidos

Países no visibles Liechtestein Luxemburgo Malta

Figura 1.2. Porcentaje de aislados MRSA en países de la UE en el año 2015. (Fuente:

European Centre for Disease Prevention and Control -ECDC-).

https://ecdc.europa.eu/

http://www.who.int/iris/handle/10665/204470

1. Introducción

34

Así pues, casi un siglo después de que Fleming descubriera la penicilina (1928), los datos

relativos a la resistencia a los antibióticos de uso común, debido a su uso inadecuado y

excesivo en el ámbito de la medicina, el sector agropecuario y la industria alimentaria,

plantean una situación dirigida hacia la búsqueda de terapias antimicrobianas

alternativas (Pfalzgraff et al., 2018).

1.1.2.2. Ganadería

A parte de ser un conocido patógeno humano, S. aureus produce gran variedad de

infecciones con importancia económica para la ganadería (principalmente vacuno

lechero, ovejas, cabras, aves de corral y conejos), puesto que repercuten en la

productividad y el bienestar de los animales, y también pueden ser trascendentes para

la seguridad alimentaria global. Los estudios muestran que la gran mayoría de las cepas

de S. aureus aisladas de ganado pertenecen a un reducido número de clones asociados a

animales, algunos de los cuales pertenecen a secuencias tipo (STs) encontrados en

aislados de origen humano, lo que sugiere un ancestro común bastante reciente entre

ellos (Fitzgerald, 2012; Viana et al., 2015).

Históricamente la resistencia a la meticilina rara vez ha sido observada entre las cepas

de S. aureus aisladas de animales. El primer LA-MRSA (cepa MRSA asociada a ganadería)

identificado proviene de vacuno lechero, hace aproximadamente 40 años. Desde

entonces se describieron más casos de MRSA en vacas y se especuló que pudieran

actuar como reservorio de infecciones por MRSA en humanos tras descubrir un nuevo

alelo del gen mecA (mecALGA251) en aislados bovinos. El gen mecA está incluido en el

cassette cromosómico estafilocócico mec (SCCmec), un elemento genético móvil (MGE)

que confiere resistencia a la meticilina y está asociado al SCCmecXI descrito en humanos

(Fitzgerald, 2012).

Sin embargo, la detección en cerdos del clon MRSA ST398 pasó a ser la principal causa

de preocupación debido a su carácter zoonótico y a que se aislaron cepas pertenecientes

al genotipo ST398 en otras especies animales (Fitzgerald, 2012). Asimismo, el interés por

los MRSA aumentó todavía más tras encontrar nuevas especies de hospedador para

estas cepas en algunos países del norte de Europa occidental (rata, oveja, pinzón, foca

común y conejo) (Paterson et al., 2012), y más recientemente se ha descrito la presencia

1. Introducción

de LA-MRSA en explotaciones cunícolas de la Península Ibérica (Moreno-Grúa et al.,

2018).

Entre los posibles desencadenantes de adquisición de SCCmec, además de la presión

antibiótica selectiva en la industria ganadera, destacaría el papel de los seres humanos

como fuente de nuevas cepas patógenas para ganado, plausible principalmente por la

presencia de MGEs bacterianos. Por ello, la industrialización y la globalización también

han participado en la emergencia y propagación de patógenos (Fitzgerald, 2012).

1.1.2.2.1. Cunicultura

En el continente europeo se han descrito brotes desencadenados por S. aureus en el

sector de la cunicultura industrial (Vancraeynest et al., 2006; Fitzgerald, 2012). En estos

brotes los animales muestran diferentes lesiones de tipo purulento tanto a nivel local

como sistémico y pueden verse afectados individuos de diversas edades y estados

productivos. Los principales procesos piógenos que se encuentran en maternidad y

cebadero son las dermatitis supurativas, mastitis, abscesos multisistémicos y

pododermatitis. En la estafilococia de los gazapos lactantes se suelen observar pequeños

abscesos en la piel, a veces subcutáneos, e incluso en órganos internos, dando lugar a

cuadros subagudos y muerte del animal (Corpa et al., 2009). Las mastitis por S. aureus

son una de las principales causas de muerte y eliminación de conejas reproductoras en

las granjas (Segura et al., 2007; Rosell y De la Fuente, 2009 y 2018).

En la especie cunícola han sido identificados varios genotipos de S. aureus, siendo la

cepa ST121 la más extendida en las granjas de conejos de la costa mediterránea

española (Viana et al., 2007 y 2011) y a nivel internacional (Vancraeynest et al., 2006).

Además, se ha descrito que este clon 121 es capaz de producir abscesos en piel de

conejo a partir de una reducida carga bacteriana, y que se adaptó a esta especie tras la

mutación de un único nucleótido del gen dltB en una cepa humana (Viana et al., 2015).

Mientras que el gen dltB se encuentra altamente conservado en los aislados humanos,

se observan mutaciones para este gen entre cepas de conejo de diferente origen clonal,

lo que sugiere una evolución convergente entre los clones de S. aureus que infectan al

hospedador cunícola (Viana et al., 2015; Holmes et al., 2016). Además, se ha descrito

que las cepas de S. aureus de origen humano pueden sobrevivir en las explotaciones

35

1. Introducción

36

cunícolas y transmitirse a los conejos por contacto directo (Devriese et al., 1981;

Hermans et al., 1999). Por otra parte, cabe resaltar que entre las infecciones humanas

producidas por S. aureus a nivel global destaca la presencia de cepas pertenecientes al

genotipo ST121 (Rao et al., 2015).

1.1.3. Factores de virulencia de S. aureus

S. aureus produce una gran variedad de factores de virulencia que participan en todos

los niveles de las interacciones que se producen entre el hospedador y el patógeno, de

manera que le permiten unirse a los tejidos, facilitando la subsiguiente invasión tisular y

diseminación por el organismo, así como la supervivencia en el nuevo ambiente. De este

modo, entre estas moléculas se incluyen proteínas que contribuyen a su habilidad para

colonizar y producir la lisis de las células de los mamíferos, permitiendo así a la bacteria

eludir la respuesta inmunitaria, pero a su vez actúan también como potentes estímulos

para activar la inmunidad innata. Además, un mismo factor de virulencia puede tener

varias funciones en la patogénesis de una enfermedad, del mismo modo que varios

factores de virulencia pueden desarrollar una misma función (Dinges et al., 2000;

Gordon y Lowy, 2008; Liu, 2009; Rigby y DeLeo, 2012; Brandt et al., 2018), como la de

protegerse de la actividad bactericida de los leucocitos polimorfonucleares o alterar su

función (Rigby y DeLeo, 2012). Por otra parte, la supervivencia bacteriana no sólo

depende de la evasión de las defensas del sistema inmunitario, sino también del éxito en

la adquisición de nutrientes, particularmente de hierro y carbohidratos, siendo también

importantes para el metabolismo bacteriano otros elementos como el manganeso y el

zinc (Balasubramanian et al., 2017).

Un aspecto representativo de la patogénesis de las infecciones bacterianas es la

regulación de la expresión genética de los factores de virulencia microbianos. Esto

ocurre de manera coordinada en virtud de las necesidades de la bacteria para reducir

excesivas demandas metabólicas. Se consigue mediante la liberación de moléculas de

señalización (AIPs), que son producidas de forma basal. De este modo, al inicio de la

infección (fase de crecimiento exponencial) la bacteria expresa en su superficie

moléculas de adhesión para facilitar la colonización de los tejidos, mientras que en la

posterior fase de diseminación, coincidiendo con la fase estacionaria, predominan la

1. Introducción

síntesis y secreción de toxinas citolíticas. El primer gen regulador descrito (1968) y más

conocido es agr, el gen regulador accesorio, cuya activación se asocia con la invasión del

hospedador, mientras que cuando se encuentra inhibido se relaciona con el periodo de

colonización (Lowy, 1998; Novick, 2003; Gordon y Lowy, 2008; Balasubramanian et al.,

2017). Además, se ha descrito menor virulencia en cepas mutantes en el gen regulador

sar (Cheung et al., 1994; Gresham et al., 2000; Rasigade et al., 2013; Tuchscherr et al.,

2015), y se ha señalado al gen rot como represor de toxinas, siendo su influencia sobre

la expresión de ciertos genes opuesta a la de agr, de manera que al comienzo de una

infección, contando con la presencia de un bajo número de bacterias y niveles basales

de AIPs, agr se encuentra inactivo y la expresión de la proteína Rot está aumentada

(Saïd-Salim et al., 2003; Balasubramanian et al., 2017). También se ha referido al factor

sigma alternativo (sigB) como un regulador global de genes de virulencia a partir de la

fase final de multiplicación logarítmica y ante condiciones de estrés (Kullik et al., 1998;

Kato et al., 2011).

Además, se han definido sistemas reguladores de dos componentes (TCS) implicados en

la patogénesis de S. aureus, tales como arIRS, que participa en la aglutinación (Walker et

al., 2013), graRS, que regula la sensibilidad frente a los elementos antimicrobianos de la

inmunidad innata (Kraus et al., 2008; Cheung et al., 2014a), y vraRS, responsable de la

resistencia a los antibióticos (Galbusera et al., 2011).

Un mecanismo importante para promover la colonización del hospedador es la

capacidad de adherencia a sus tejidos, a través de proteínas de superficie llamadas

MSCRAMMs que se unen a componentes tales como el fibrinógeno, la fibronectina y la

citoqueratina presentes en el epitelio nasal o en los queratinocitos de la epidermis

(Gordon y Lowy, 2008; Krishna y Miller, 2012b). Algunos elementos que permiten la

colonización nasal de S. aureus son el ClfB y la proteína A (spa), que se unen a la proteína

loricrina del epitelio escamoso (Mulcahy et al., 2012; Pietrocola et al., 2017), y el IsdA,

que se expresa de manera mayoritaria durante las infecciones humanas producidas por

S. aureus, y es un ejemplo de factor de virulencia multifuncional. IsdA por una parte

actúa como inhibidor de proteasas al unirse a la lactoferrina, el polipéptido más

abundante en las secreciones nasales, y por otra parte participa en la resistencia a las

defensas innatas de la piel, como los ácidos grasos y los péptidos antimicrobianos.

37

1. Introducción

38

Además, el déficit de hierro es un estímulo ambiental que favorece la expresión de esta

proteína para potenciar la adhesión celular (Clarke et al., 2007; Zinkernagel y Nizet,

2007; Clarke et al., 2008 y 2009).

Asimismo, componentes de la pared celular de S. aureus, comunes para las bacterias

Gram-positivas, como son el ácido lipoteicoico (ALT) y el peptidoglicano (PepG), tienen

potentes propiedades proinflamatorias y actúan de manera sinérgica durante la

inducción de la fisiopatología del shock séptico (De Kimpe et al., 1995). La capacidad de

formar biofilm proporciona resistencia a la antibioterapia convencional y protección

frente a los mecanismos de defensa del huésped, como la fagocitosis mediada por los

macrófagos (Scherr et al., 2015). En este sentido las cepas que presentan biofilm son de

10 a 1000 veces más resistentes a los antibióticos de uso común. Se estima que están

presentes en, al menos, el 65% de todas las infecciones humanas (Pfalzgraff et al., 2018).

Por otra parte, S. aureus secreta moléculas citotóxicas que rompen la integridad de la

superficie de las células para favorecer su invasión, y en el caso de las células del sistema

inmunitario, para modificar las funciones inmunitarias. Además, algunas de estas toxinas

citolíticas presentan especificidad tanto a nivel de célula como de especie animal

(Brandt et al., 2018). Estas exoproteínas pueden dividirse en varias clases atendiendo a

su mecanismo de acción y efectos, y tropismo celular; estos grupos son los

superantígenos de toxinas pirogénicas (PTSAgs), las toxinas exfoliativas, hemolisinas,

leucocidinas y modulinas solubles en fenol (PSMs) (Lowy, 1998; Dinges et al., 2000).

Los PTSAgs son toxinas secretadas por S. aureus y Streptococcus pyogenes y poseen

características biológicas importantes. Incluyen la TSST-1, la mayoría de las

enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC, SED, SEE y SEH) y las toxinas pirogénicas

estreptocócicas. Los PTSAgs estafilocócicos causan o pueden estar implicados en la

patogénesis de varios estados agudos o crónicos de enfermedades humanas, como la

intoxicación alimentaria por estafilococos (SFP) y el TSS (Dinges et al., 2000).

Las toxinas exfoliativas (ETs) no sólo son producidas por S. aureus, sino también por

otras especies de su mismo género (S. chromogenes, S. hyicus, S. pseudintermedius), y

también se ha visto que son específicas para varios organismos hospedadores. Las cepas

de S. aureus que infectan a humanos principalmente producen ETA y ETB, y son

1. Introducción

responsables del síndrome estafilocócico de la piel escaldada (SSSS). La toxina ETD es

menos común y se aísla de abscesos cutáneos y forúnculos, y la toxina ETC puede afectar

a caballos, polluelos y ratones lactantes (Bukowski et al., 2010).

Las hemolisinas y las leucocidinas son toxinas formadoras de poros (PFTs) que producen

daño en la bicapa lipídica de la membrana plasmática de las células eucariotas,

permitiendo así el intercambio de iones y la lisis celular por hinchazón osmótica. En el

grupo de las hemolisinas (α, β, δ y ϒ), la hemolisina α (Hla, también conocida como

toxina α) es la más prominente, de hecho un elevado porcentaje de cepas de S. aureus

producen esta citotoxina, y es activa frente a un gran rango de células de mamíferos,

siendo especialmente sensibles los eritrocitos de conejo. Por su parte, la hemolisina β

(Hlb, también conocida como esfingomielinasa C) es altamente hemolítica para ovejas,

pero no para los eritrocitos de conejo, lo cual puede deberse al diferente contenido en

esfingomielina de los eritrocitos de ambas especies. La hemolisina ϒ (Hlg) es una toxina

de dos componentes (Hlg1 y Hlg2) que además de lisar los glóbulos rojos de varias

especies animales, también puede afectar a macrófagos y neutrófilos. Por su parte, las

leucocidinas son citolisinas bicomponente que presentan una especificidad celular por

los leucocitos polimorfonucleares y monocitos/macrófagos, e incluyen seis

exoproteínas: LukSF-PV, LukED, LukMF, LukAB/HG, HlgAB y HlgCB (Tomita y Kamio,

1997; Dinges et al., 2000; Alonzo y Torres, 2014).

Por otra parte, los PSMs son toxinas que tienen como células diana de su actividad

citolítica los glóbulos blancos y rojos de la sangre. Difiriendo en la secuencia de

aminoácidos se han descrito cuatro péptidos PSMα (PSMα1-4), dos PSMβ (PSMβ1 y 2) y

un PSMδ, siendo los primeros los más predominantes, y el PSMα3 el que presenta

mayor actividad proinflamatoria. Todas las cepas patógenas secretan toxinas de la

familia de los PSMs mediante el sistema Pmt, que a su vez protege a la bacteria de estos

mismos péptidos. Además, también intervienen en la formación del biofilm (Wang et al.,

2007; Chatterjee et al., 2013).

Hay una acción coordinada entre la Hla y los PSMs durante las fases tempranas de la

infección, de tal manera que el locus psmα regula la producción de Hla durante la fase

de crecimiento para potenciar el mecanismo que le permite a S. aureus modular la

39

1. Introducción

40

respuesta inmunitaria innata a través de los PSMs, y simultáneamente producir daño

tisular mediante la Hla (Berube et al., 2014). La Hla y el PSMα participan en la

patogénesis de las infecciones en piel porque interfieren de manera directa en la

actividad de los PMNs (Kennedy et al., 2010; Li et al., 2010; Kobayashi et al., 2011;

Adhikari et al., 2016; Le et al., 2016).

Igualmente cabe mencionar una serie de enzimas que contribuyen a la supervivencia de

S. aureus mediante la evasión de la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, al desarrollo de

la enfermedad. Una de estas enzimas es la coagulasa (Coa), que fue además uno de los

primeros factores de virulencia descritos para este patógeno (Loeb, 1903), y más

recientemente se descubrió una segunda coagulasa, la proteína de unión al factor Von

Willebrand (vVwbp) (Bjerketorp et al., 2002). Ambas son polipéptidos que se unen y

activan la protrombina y convierten el fibrinógeno en fibrina, siendo así responsables de

la coagulación del plasma y de la sangre. Además, intervienen en la formación de

abscesos (McAdow et al., 2012a) y se han asociado también al desarrollo de infecciones

cutáneas (Vanassche et al., 2011; Malachowa et al., 2016). La expresión de los genes coa

y vwb es un rasgo universal de las cepas de S. aureus (Cheng et al., 2010) y, mientras que

la secuencia del gen coa es variable entre los aislados, la del gen vwb se encuentra más

conservada (McCarthy y Lindsay, 2010). Ambos genes presentan una estructura y

secuencia homólogas (McAdow et al., 2012a).

Por otra parte, S. aureus también utiliza enzimas como la alquil hidroperóxido reductasa,

catalasa y superóxido dismutasa para protegerse de las especies de oxígeno reactivo

(ROS) liberadas por las células fagocíticas, contribuyendo el pigmento estafiloxantina en

la protección adicional frente a estas moléculas (Kobayashi et al., 2015b). Asimismo, la

estafiloquinasa (SAK) y la aureolisina (Aur) inhiben la función de algunos péptidos

antimicrobianos (Ryu et al., 2014; Pietrocola et al., 2017). Aur también induce la

coagulación y puede interferir en la activación de linfocitos B y T (Pietrocola et al., 2017).

La distribución de algunos factores de virulencia está ligada con el tipo clonal, lo que

implica que no todas las cepas de S. aureus contienen los mismos tipos de toxinas

(Peacock et al., 2002; Baba et al., 2008). Así pues, mientras la Hla es expresada por la

mayoría de los aislados clínicos (Berube y Bubeck Wanderburg, 2013), los PSMs son

1. Introducción

expresados en menor medida por las cepas HA-MRSA en comparación a las CA-MRSA

(Wang et al., 2007), y entre éstas últimas, la cepa USA300 es más virulenta que la

USA400 (Liu, 2009). Por otra parte, teniendo en cuenta que la contribución de las toxinas

de S. aureus a la patogénesis y severidad de las infecciones depende del sitio de

infección (tropismo celular), de la especie animal objeto de estudio y del repertorio de

factores de virulencia de la cepa, se puede entender que exista controversia en torno al

papel los mecanismos de patogenicidad de S. aureus a tenor de los resultados de los

diferentes modelos animales empleados (Brandt et al., 2018).

1.1.4. Modelos de infección experimental con S. aureus

Durante los últimos años ha quedado claro que la interacción de S. aureus con las células

del hospedador es más compleja de lo que se expuso años atrás, y los resultados

publicados son tan variables como contradictorios. Aparentemente, los estudios

desarrollados varían dependiendo de la cepa bacteriana y de la dosis que se inocula, así

como del tipo de célula hospedadora (Sinha y Fraunholz, 2010; Strobel et al., 2016;

Brandt et al., 2018).

De entre los numerosos esfuerzos que han sido desarrollados para conocer la

interacción entre S. aureus y el hospedador, el ratón ha sido el animal que se ha

utilizado con mayor frecuencia en los diferentes modelos de infección experimental,

seguido por la especie cunícola. Otros roedores (e.g., rata, ratón algodonero) también se

han empleado para el estudio de la patogenia de S. aureus, aunque en menor medida,

así como otras especies animales (cabras, cerdos, ovejas y vacas) (Tabla 1.1).

La susceptibilidad del hospedador es una consideración importante a la hora de

seleccionar el modelo de especie animal apropiado. Dado que se requieren modelos

animales que mimeticen las infecciones humanas, advirtiendo que S. aureus no es un

colonizador natural del ratón y que existe una afinidad selectiva de los factores de

virulencia de S. aureus hacia las células humanas, muchos de estos mecanismos que

evaden la respuesta inmunitaria en humanos difícilmente pueden ser estudiados en la

especie murina, como es el caso de PVL (Liu, 2009; Tseng et al., 2015). Por esta razón, en

las infecciones experimentales en ratón se emplean elevadas dosis de inóculo

bacteriano para establecer lesión (salvo excepciones, de 1x104 a 1x1010 UFC), y esto

41

1. Introducción

42

puede tener consecuencias involuntarias en la interpretación de la patogenia de S.

aureus (Tseng et al., 2015). Además, los nulos resultados obtenidos en ensayos clínicos

en los que se aplicaba en humanos los mecanismos de inmunización (activa o pasiva)

frente a S. aureus desarrollados en ratones, han hecho que se cuestione a esta especie

como herramienta para el estudio de la patogénesis y terapéutica de este patógeno en

humanos.

Para resolver esta falta de afinidad entre las toxinas de S. aureus y las células murinas se

han desarrollado los conocidos como “ratones humanizados” (NSG) (Tabla 1.1), que al

presentar un sistema inmunitario defectuoso no rechazan las células hematopoyéticas

humanas trasplantadas, a diferencia de los ratones normales, y producen células de la

inmunidad innata y adaptativa propias de los humanos. Además, la carga bacteriana que

se inocula a este tipo de ratones puede ser inferior en comparación a los ratones wt

(Knop et al., 2015; Soong et al., 2015; Tseng et al., 2015; Prince et al., 2017), pues la

presencia de células inmunitarias humanas confiere un incremento en la susceptibilidad

a las infecciones por S. aureus. Sin embargo, a pesar de que consiste en un modelo

murino más selecto, se trata de un sistema económicamente costoso y los resultados

pueden verse afectados por el uso de células de diferentes donantes. Además, como el

ratón está inmunocomprometido puede no ser útil para determinados estudios, y se

desconocen las posibles incompatibilidades entre ratones y humanos que puedan

interferir en el desarrollo y funciones de las células inmunitarias humanas (Tseng et al.,

2015).

Por otra parte, cabe considerar igualmente no sólo las características generales de la

especie hospedadora, sino también de la cepa de hospedador, sobre todo en el caso de

los ratones, ya que se ha visto que algunas cepas murinas presentan mayor resistencia a

ser infectadas por S. aureus, y estas diferencias pueden condicionar el desarrollo de la

inmunidad protectora (von Kröckritz-Blickwede et al., 2008; Montgomery et al., 2014).

Sin embargo, la necesidad de inocular elevadas cargas bacterianas no sólo ocurre en los

modelos en ratón, sino también en otras especies animales, y esto puede estar

relacionado con la inoculación de cepas de origen humano (Tabla 1.2). Son pocos los

modelos experimentales donde utilizan cepas aisladas de animales: colonización nasal

1. Introducción

en cerdos (Crombé et al., 2012; Jouy et al., 2012; Szabó et al., 2012); infección en piel de

conejo (Hermans et al., 2000; Meulemans et al., 2007; Viana et al., 2015); y mastitis en

cabras (Cremonesi et al., 2012; Rainard et al., 2018), ovejas (Cucarella et al., 2004;

Tormo et al., 2007), ratones (Breyne et al., 2017; Li et al., 2017) y vacas (Bannerman et

al., 2004; Sladek et al., 2005; Sladek y Rysanek, 2006; Slama et al., 2009; Jensen et al.,

2013; Ster et al., 2013). Cuando se inoculan cepas de origen animal “en animales” la

dosis bacteriana se reduce entre 10 y 1000 veces, a excepción de los estudios de

colonización (Tabla 1.1). De este modo, la elección de la cepa bacteriana supone una

consideración fundamental para establecer el modelo animal apropiado, y teniendo en

cuenta que S. aureus es una bacteria específica de hospedador, utilizar cepas no

adaptadas a la especie objeto de estudio también puede conducir a la obtención de

resultados no representativos para la especie en cuestión ni extrapolables a la especie

humana (Holtfreter et al., 2013).

1.1.4.1. Estudios experimentales en piel

Las infecciones cutáneas por S. aureus generan lesiones piógenas caracterizadas por

eritema, calor y endurecimiento, y frecuente ulceración y drenaje de material purulento.

Microscópicamente estas lesiones están compuestas ante todo por colecciones de

neutrófilos, una marca distintiva de las infecciones por este agente (Cheng et al., 2011;

Krishna y Miller, 2012b). Sin embargo, atendiendo a las posibles vías de inoculación

presentadas en los modelos experimentales en piel (como se pueden ver en la Tabla 1.1:

epicutánea, i.d., s.c. o a través de heridas) y las distintas localizaciones anatómicas

(oreja, espalda, flanco), sumadas a la elevada dosis de bacterias que se inocula, a las

diferencias genéticas entre las cepas infectantes, al volumen del inóculo, así como a las

características intrínsecas de la especie animal objeto de estudio, no se ha afianzado un

modelo animal que mimetice el desarrollo y la evolución de las infecciones en piel

producidas por S. aureus en humanos.

43

1. Introducción

44

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1. Introducción

45

1. Introducción

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1. Introducción

47

1. Introducción

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1. Introducción

49

1. Introducción

50

Tab

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1. Introducción

51

1. Introducción

52

Tab

la 1

.1. M

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1. Introducción

53

1. Introducción

54

Tab

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fecc

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exp

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enta

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Cep

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.

1. Introducción

55

1. Introducción

56

Tabla 1.2. Aislados clínicos de S. aureus de origen humano más comúnmente utilizados en los

estudios experimentales in vivo.

Nombre

de la cepa MRSA/MSSA1 PFGE2 ST3 Referencia bibliográfica

BD02-25 HA-MRSA USA500 8 Li et al., 2010

BK648 MRSA USA1000 59 Voyich et al., 2006






c99-529

CA-MRSA

USA400

1

Strandberg et al., 2010

Spaulding et al., 2012a

CDC587 MSSA USA200 Spaulding et al., 2012a

CN1 CA-MRSA 72 Li et al., 2010

COL

HA-MRSA

Voyich et al., 2005

McLoughlinet al., 2006

Lijek et al., 2012


Xu et al., 2015

FRI1169 MSSA Spaulding et al., 2012a

FPR3757

USA300

Parker y Prince et al., 2012

Prabhakara et al., 2013

Soong et al., 2015

LAC*

CA-MRSA

USA300

8

Voyich et al., 2005 y 2006

Wang et al., 2007

Bubeck Wardenburg et al., 2008

Montgomery et al., 2008

Crémieux et al., 2009

Cheng et al., 2010

Kennedy et al., 2010

DuMont et al., 2011

Lipinska et al., 2011

Kobayashi et al., 2011

McAdow et al., 2011

1 MRSA: S. aureus resistente a la meticilina; asociado a la comunidad (CA-MRSA) o a los

hospitales (HA-MRSA)/ MSSA: S. aureus sensible a la meticilina. 2 Electroforesis en gel de campo pulsado; 3 Secuencia tipo.

* Continúa en la página siguiente.

1. Introducción

57



Nombre


LAC** CA-MRSA USA300 8 Wilson et al., 2011

Adhikari et al., 2012

Lijek et al., 2012

Malachowa et al., 2012

Parker y Prince et al., 2012

Rauch et al., 2012


Cassat et al., 2013

Chatterjee et al., 2013

Becker et al., 2014

Berube et al., 2014

Crémieux et al., 2014

Sampedro et al., 2014

Chan et al., 2015


Maurer et al., 2015

Scherr et al., 2015

Syed et al., 2015


Davido et al., 2016

Loughran et al., 2016

Chan et al., 2017

Prince et al., 2017

Dillen et al., 2018

Levy MSSA USA300 Spaulding et al., 2012a

MN8 MSSA USA200 Spaulding et al., 2012a

MN128 CA-MRSA USA200 Strandberg et al., 2010

MN1021 CA-MRSA USA200 Strandberg et al., 2010

MnCop MSSA USA400 1 Voyich et al., 2005 y 2006

MNPA CA-MRSA USA200 Strandberg et al., 2010

MNPE MSSA USA200 Spaulding et al., 2012a y b

MNWH MSSA USA200 Spaulding et al., 2012a



** También en la página anterior.

1. Introducción

56



Nombre


MW2

CA-MRSA

USA400

1 Voyich et al., 2005 y 2006

Wang et al., 2007


Li et al., 2010

Strandberg et al., 2010

McAdow et al., 2011

Lijek et al., 2012


Rauch et al., 2012

Chatterjee et al., 2013

Walker et al., 2013

Cheung et al., 2014a

Newman

MSSA

Collins et al., 2002

Bubeck Wardenburg et al., 2008

Cheng et al., 2009

Tseng et al., 2009

Cheng et al., 2010

Kennedy et al., 2010

McAdow et al., 2011

Schmaler et al., 2011

Vanassche et al., 2011


Jongerius et al., 2012

Lijek et al., 2012

Mulcahy et al., 2012

Rauch et al., 2012


Feuerstein et al., 2015

Xu et al., 2015


SF1208 HA-MRSA USA200 36 Li et al., 2010

SF1497 CA-MRSA USA1100 30 Li et al., 2010

SF1681 CA-MRSA USA1100 59 Li et al., 2010



58

1. Introducción

57



Nombre


SF2561 HA-MRSA USA100 5 Li et al., 2010

SF8300 CA-MRSA USA300 8 Diep et al., 2010

Li et al., 2010

Tkaczyck et al., 2013


Le et al., 2016



1.1.4.2. El conejo como modelo de infección experimental

Los modelos experimentales en conejos se iniciaron en los años 50 del siglo pasado

(Rogers et al., 1956 y 1957). En la década de los años 70, varios estudios ex vivo

determinaron la existencia de similitudes entre la sensibilidad de células humanas y de

conejo frente a determinadas toxinas estafilocócicas (Cassidy y Harshman, 1973;

Wiseman, 1975). Más tarde, en 1991 Hildebrand et al. describieron que los eritrocitos de

conejo son más sensibles incluso que los humanos al efecto de la toxina Hla, y más

recientemente se ha demostrado que la sangre de humanos y conejos incubada con S.

aureus presenta un perfil semejante de transcripción genética de citoquinas

proinflamatorias (Malachowa et al., 2015). Por otra parte, aunque los conejos son

resistentes a altas concentraciones de PTSAgs por vía i.v., desarrollan efectos letales

similares a las TSS humanas mediante infusión continua de bajas dosis (Dinges et al.,

2000). Además, pueden reproducir infecciones en piel similares a las que S. aureus

desarrolla en la población humana, hecho que también puede estar relacionado con el

grosor de la piel del conejo (1,7 mm), que es similar al de los humanos (1,5 mm) (Le et

al., 2016).

Sin embargo, teniendo en cuenta que el conejo manifiesta susceptibilidades frente a las

toxinas y superantígenos estafilocócicos similares a los humanos, en comparación a

59

1. Introducción

otras especies animales (ratones, ratas y primates no humanos) como hemos visto en los

apartados anteriores, los ratones han sido el modelo de elección para el estudio de su

patogenia.

1.2. Sistema inmunitario

El sistema inmunitario debe garantizar la defensa efectiva contra los patógenos y

minimizar los perjuicios mediados por la respuesta inflamatoria (Josefowicz et al., 2012).

Todas las células del sistema inmunitario derivan de células madre pluripotentes de la

médula ósea, en concreto, las líneas mieloide y linfoide dan lugar a los leucocitos y

linfocitos sanguíneos, respectivamente (Drouet-Viard y Fortun-Lamonthe, 2002). Dado el

potencial de crecimiento logarítmico de los microorganismos durante las fases

tempranas de la infección, la destrucción efectiva de estos agentes depende de la

adecuada coordinación de una compleja serie de procesos celulares y moleculares en el

hospedador, dando comienzo con la sensibilización de las células de la inmunidad innata

(Rigby y DeLeo, 2012).

La respuesta inmunitaria incluye los sistemas innato y adaptativo, y aunque los

mecanismos innatos se consideraron parte de una respuesta inflamatoria no específica

(incluyendo la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos, y la activación del complemento)

presenta una especificidad considerable. Esto es debido a que está directamente dirigida

hacia componentes moleculares presentes en la superficie de los microorganismos

(PAMPs) (Krishna y Miller, 2012b). Además, la ausencia de vacunas que potencien la

respuesta humoral frente a esta bacteria sugiere que los anticuerpos no son suficientes

para su profilaxis, por lo que la inmunidad adaptativa por sí sola no basta para una

óptima defensa frente a las infecciones por S. aureus (Chan et al., 2017), lo que resalta,

por lo tanto, la importancia de la respuesta innata. Por otra parte, también se ha visto

que la respuesta inflamatoria observada en las infecciones localizadas, sobre todo en las

de piel, a menudo contribuye más a la gravedad clínica que la propia carga bacteriana

(Montgomery et al., 2014). No obstante, no hay que perder de vista que las elevadas

dosis infectivas que se establecen en algunos modelos dan lugar a una activación

instantánea del sistema inmunitario innato al entrar en contacto con los agentes

60

1. Introducción

patógenos, que antecede incluso a la síntesis de proteínas de evasión inmunitaria

(Jongerius et al., 2012).

1.2.1. Respuesta inmunitaria innata

El sistema inmunitario innato incluye diferentes tipos de células, como monocitos

sanguíneos y macrófagos tisulares, células polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y

basófilos), células dendríticas y células NK, y aunque todas ellas se consideran la primera

línea de defensa del hospedador, los neutrófilos juegan el papel central de la interacción

bacteria-hospedador (Kin y Sanders, 2006). Igualmente, las proteínas que forman parte

de la cascada del complemento son una parte fundamental de esta respuesta innata ya

que promueven la actividad fagocítica de neutrófilos y macrófagos por medio de su

fijación a las bacterias (Pietrocola et al., 2017). Además, en las infecciones cutáneas los

queratinocitos también participan como primera defensa frente a los patógenos

(Krishna y Miller, 2012a y b; Brandt et al., 2018).

La respuesta inmunitaria innata se caracteriza por una reacción inflamatoria de carácter

agudo en la que las células efectoras (fagocitos) se distribuyen por el organismo hasta

alcanzar y acumularse en el sitio de agresión (Drouet-Viard y Fortun-Lamonthe, 2002). La

fagocitosis es un paso crítico en la eliminación de bacterias, y las células fagocíticas

(neutrófilos, monocitos/macrófagos y células dendríticas) reconocen moléculas ligadas a

la superficie de las bacterias (PAMPs) por medio de la interacción con sus receptores

PRRs, entre los que se incluyen los TLRs. Estos TLRs activan vías de transducción de

señales (como el NF-кB) que inducen la expresión de mediadores proinflamatorios

(citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión y péptidos antimicrobianos),

induciendo así la fagocitosis y prolongando la supervivencia celular. Aunque los PRRs son

importantes para la detección de los patógenos, la eficiencia de la fagocitosis también

depende de la opsonización de la bacteria con proteínas séricas del hospedador (DeLeo

et al., 2009; Krishna y Miller, 2012a y b; Ryu et al., 2014), siendo la molécula del

complemento C3 la más representativa en la inmunidad innata frente a S. aureus

(Pietrocola et al., 2017). Por su parte, las células dendríticas no actúan como células

fagocíticas por definición, sino que su función es ingerir bacterias y luego migrar hacia

61

1. Introducción

los nódulos cercanos donde presentan el material antigénico procesado a células

especializadas del sistema inmunitario adaptativo (Brandt et al., 2018).

Como se ha visto con anterioridad, S. aureus puede infectar a un amplio espectro de

diferentes tipos celulares en el hospedador y es el agente etiológico de un gran rango de

patologías, donde los mecanismos de defensa innatos son la primera interfase entre el

hospedador y la bacteria, pero también es fundamental la inmunidad adaptativa (Figura

1.3).

Figura 1.3. Interacción entre los factores de virulencia de S. aureus y la respuesta inmunitaria.

Las citotoxinas de S. aureus pueden lisar las células fagocíticas (PMNs y monocitos-macrófagos)

que intervienen en la respuesta inmunitaria innata, interferir en la inducción y síntesis de

anticuerpos específicos (cruces rojas sobre flechas negras), y también pueden afectar a la

interacción entre los sistemas innato y adaptativo (cruces rojas sobre flechas azules). (Figura

adaptada a partir de Pozzi et al., 2015).

A continuación, de entre los citados componentes celulares que comprenden la

respuesta innata, se van a comentar los que se han descrito como más representativos

frente a las infecciones por S. aureus: los neutrófilos y los monocitos/macrófagos.

62

1. Introducción

1.2.1.1. Polimorfonucleares neutrófilos

El primer paso para la erradicación de microorganismos invasores del organismo es el

reclutamiento activo de neutrófilos (PMNs) al sitio de infección. En un proceso con

múltiples pasos, los PMNs son movilizados desde la sangre periférica o médula ósea en

respuesta a factores quimiotácticos producidos tanto por el hospedador como por el

patógeno (DeLeo et al., 2009; Pietrocola et al., 2017). Estas células representan la

población de leucocitos polimorfonucleares más abundante en sangre (los PMNs

intravasculares representan la mitad de los granulocitos) y son cruciales para la defensa

frente a S. aureus. Eliminan a las bacterias vía fagocitosis, generando ROS y NOS

(mediante el sistema NADPH oxidasa), y liberando enzimas (azurocidina, BPI, catepsina,

lactoferrina, lisozima, proteinasa 3 y elastasa) y péptidos antibacterianos (AMPs)

contenidos en gránulos citoplasmáticos (Krishna y Miller, 2012b; Rigby y DeLeo, 2012;

McGuinness et al., 2016; Thomer et al., 2016; Brandt et al., 2018).

La liberación de moléculas reactivas desencadena una actividad tanto microbicida como

inmunomoduladora, y a elevadas concentraciones pueden desencadenar efectos

antiinflamatorios y predisponer a la infección mediante la inhibición de la proliferación e

inducción de la muerte de células del hospedador (Brandt et al., 2018). Individuos con

defectos genéticos o adquiridos que dan lugar a una reducción del número de

neutrófilos (e.g., neutropenia congénita severa, neutropenia inducida por

quimioterapia) o que alteran su función, como la capacidad de producir superóxido (e.g.,

enfermedad granulomatosa crónica) tienen mayor riesgo de contraer graves infecciones

por S. aureus (Krishna y Miller, 2012b; Kobayashi et al., 2015b).

Por otra parte, los PMNs también pueden liberar NETs (trampas extracelulares de los

neutrófilos), que están compuestos por DNA, histonas, péptidos antimicrobianos y

proteasas que envuelven a las bacterias para su destrucción minimizando el daño tisular

(Brinkmann et al., 2004; Fuchs et al., 2007). No obstante, S. aureus es capaz de destruir

los NETs, y el producto de degradación de éstos (2’-deoxiadenosina) induce la apoptosis

de macrófagos, lo cual puede contribuir a su supervivencia dentro de los abscesos

(Brandt et al., 2018).

63

Figura 1.4. Fagocitosis de S. aureus por los neutrófilos. El proceso de fagocitosis es mediado por

la unión específica de la bacteria opsonizada con su correspondiente receptor en la membrana

plasmática del fagocito (Complemento-CR e Ig-FcR) (Figura adaptada a partir de McGuinness et

al., 2016).

1. Introducción

La fagocitosis se ve facilitada cuando las bacterias son opsonizadas por componentes del

sistema de complemento y/o inmunoglobulinas (Berends et al., 2014). Los PMNs

presentan dos tipos de receptores para mediar la fagocitosis: los receptores para el

fragmento Fc de las inmunoglobulinas (FcRs) y los receptores del complemento (CRs)

(Figura 1.4). La producción de especies reactivas por los PMNs activados por la

combinación de ambos tipos de receptores es más duradera y de mayor magnitud,

sugiriendo así cooperativismo de receptores (Wright y Silverstein, 1983). Esto, además,

apunta a que la activación por FcRs o CRs procede de dos vías diferentes de transducción

de señal intracelular distinta. Además, la fagocitosis mediada por ambos tipos de

receptores desencadena la apoptosis de manera más rápida (Kobayashi et al., 2002).

La inducción de la apoptosis en PMNs activados y la posterior eliminación de los mismos

del lugar de infección/inflamación por parte de los macrófagos son importantes porque

previenen el daño de tejidos sanos y contribuyen a la resolución de la infección. La

64

Figura 1.5. Función microbicida de los neutrófilos. S. aureus es expuesto a mecanismos

oxidativos (especies reactivas vía NADPH oxidasa) y factores oxígeno-independientes (gránulos

citoplasmáticos) en el interior de fagosomas competentes (fagolisosomas). (Figura adaptada a

partir de McGuinness et al., 2016).

1. Introducción

eliminación de células apoptóticas por los macrófagos se denomina eferocitosis

(Kobayashi et al., 2002 y 2015b). Sin embargo, algunas cepas patógenas (como las CA-

MRSA) alteran la progresión normal de la apoptosis, produciendo la lisis de los PMNs por

necrosis programada, sobreviviendo y diseminándose a otras partes del organismo.

Además, parece ser que la carga bacteriana juega un papel esencial en la dirección de

los PMNs hacia la necrosis programada (DeLeo et al., 2009; Kobayashi et al, 2015b).

Por otra parte, Gresham et al. (2000) demostraron que los PMNs no sólo son

importantes para la eliminación de bacterias, sino que también pueden facilitar la

patogénesis de las infecciones por S. aureus, puesto que la bacteria es capaz de

sobrevivir en el interior de estas células fagocíticas. Los PMNs presentan dos

localizaciones intracelulares para el agente patógeno, una que contribuye a su

destrucción (fagolisosoma) y otra que permite su supervivencia (macropinosoma). Los

macropinosomas son fagosomas de gran tamaño cuya membrana no es competente

para fusionarse con los gránulos citoplasmáticos (Bayles et al., 1998) (Figura 1.5). Del

mismo modo, se ha descrito que S. aureus también puede sobrevivir en monocitos y

macrófagos (Kubica et al., 2008), así como en fagocitos no profesionales, como células

epiteliales y endoteliales, y osteoblastos (Bayles et al., 1998; Gresham et al., 2000).

65

1. Introducción

1.2.1.2. Células mononucleares: monocitos-macrófagos

En respuesta a la inflamación e infección, los monocitos sanguíneos derivados de la

médula ósea acuden a los tejidos atraídos por señales quimiotácticas, e in situ se

diferencian en macrófagos (Gordon et al., 2014).

Los macrófagos son notablemente versátiles en su capacidad de reconocer y responder

a una amplia gama de estímulos, a través de una gran variedad de receptores de

superficie (TLRs) e intracelulares (NODs) (Gordon et al., 2014). Junto con los macrófagos

perivasculares, los macrófagos tisulares regulan el reclutamiento de PMNs y monocitos

al sitio de infección, y participan en la eliminación de células muertas. También

producen ROS y RNS, péptidos antimicrobianos, y proteínas quelantes que privan a las

bacterias de los nutrientes esenciales para su metabolismo (Brandt et al., 2018).

Mayoritariamente, los macrófagos perivasculares son críticos para la migración de los

PMNs a la piel infectada por S. aureus; los PMNs se extravasan desde las vénulas de la

dermis inflamada en proximidad a macrófagos perivasculares, que son la mayor fuente

de elementos quimiotácticos para estas células. Sin ir más lejos, S. aureus utiliza la

muerte de los macrófagos perivasculares mediada por la Hla para disminuir la afluencia

de neutrófilos al lugar de la infección (Abtin et al., 2014).

1.2.2. Respuesta inmunitaria adaptativa

El sistema inmunitario adaptativo está constituido por diferentes poblaciones de

linfocitos que actúan de manera antígeno-específica, permitiendo así el desarrollo de

una respuesta más rápida y contundente en posteriores exposiciones al mismo

antígeno: memoria inmunológica (Kin y Sanders, 2006).

Una infección bacteriana severa normalmente induce en el hospedador una respuesta

inmunitaria adaptativa en 7-10 días para limitar el desarrollo de la infección y prevenir

futuras reinfecciones. Sin embargo, una de las características de S. aureus es su

habilidad para infectar al hospedador humano repetidamente a lo largo de su vida, y

aunque no está claro el mecanismo por el cual elude el desarrollo de memoria a largo

plazo, una de las hipótesis es que altera la función de una subpoblación linfocitaria

(linfocitos T) (Liu, 2009).

66

1. Introducción

1.2.2.1. Linfocitos

A continuación se va a definir de manera breve y resumida las poblaciones de linfocitos

cuya función se ha descrito tanto frente a las infecciones bacterianas en general, como

ante la patogenia de S. aureus en particular.

1.2.2.1.1. Linfocitos B

Los linfocitos B se someten a varias etapas de desarrollo desde su origen en las células

madre hematopoyéticas, incluyendo los estadios celulares de progenitor linfoide

primario o temprano (ELP), progenitor linfoide común (CLP), células pro-B y células pre-

B, que acontecen en la médula ósea, y finalmente las células B transitorias. Éstas últimas

cuando son activadas pueden dar lugar a linfocitos B maduros, células plasmáticas o

células B de memoria en los órganos linfoides periféricos. Asimismo, los linfocitos B

maduros también pueden diferenciarse en ambos tipos celulares (células plasmáticas y

linfocitos B de memoria). Por otra parte, los linfocitos B activados pueden comportarse

como células productoras de anticuerpos cuando se unen a un antígeno, pero también

pueden participar como células presentadoras de antígenos (APCs). Además, también

intervienen en la defensa inmunológica mediante la secreción de citoquinas (Drouet-

Viard y Fortun-Lamonthe, 2002; Hua y Hou, 2013).

1.2.2.1.2. Linfocitos T

La población de linfocitos T se divide en dos linajes celulares caracterizados por distintas

funciones y especificidades antigénicas. Por una parte, los linfocitos T CD4+, que se

activan al reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas del complejo mayor de

histocompatiblidad (MHC) clase II, y manifiestan funciones predominantemente

cooperadoras (de ahí que se les llame linfocitos T colaboradores). Por ejemplo, las

células T CD4+ desempeñan un papel central en la defensa frente a una amplia variedad

de microorganismos patógenos, ayudando a las células B a producir anticuerpos y

regulando a los linfocitos T CD8+ y macrófagos (Cosmi et al., 2014). En lo que respecta a

las células T CD8+, éstas están restringidas al reconocimiento mediante moléculas MHC

clase I, y desempeñan funciones citotóxicas (Xiong y Bosselut, 2012).

67

1. Introducción

Por otra parte, retomando el papel de las células T CD4+, éstas también se pueden

subdividir en varias poblaciones atendiendo a sus funciones inmunológicas. Estos linajes

incluyen células efectoras, como se ha comentado, y células reguladoras, las cuales

protegen frente a las respuestas efectoras de defensa del hospedador (Cosmi et al.,

2014). Durante la respuesta inmunitaria debe alcanzarse un equilibrio que maximice el

reconocimiento y la eliminación de los agentes patógenos, y que asimismo minimice la

patología y autoinmunidad inmunomediadas. Una de las células que regulan este

equilibrio son las células T reguladoras (Treg), entre ellas las células T CD4+CD25+ (las

llamadas células Treg naturales), pero también las células CD8+ y las NK, entre otras

(Keynan et al., 2007). La actuación de las células Treg puede generar cierta

inmunosupresión que cronifique la infección, y en estos casos se ha visto que no

intervienen tanto las células Treg, sino más bien las células supresoras derivadas de

mieloide (MDSCs) (Tebartz et al., 2015).

1.2.3. Citoquinas

Las citoquinas son proteínas de pequeño tamaño sintetizadas por varios tipos celulares

en respuesta a estímulos de activación, y que inducen diferentes efectos por medio de

su unión a receptores específicos (Pietrocola et al., 2017). Se han definido

principalmente cuatro familias de citoquinas, a saber, las interleucinas (ILs), los factores

de necrosis tumoral (TNFs), los interferones (IFNs) y los factores estimulantes de

colonias (CSFs), cuya principal fuente celular son los linfocitos T (Drouet-Viard y Fortun-

Lamonthe, 2002). Mucho se ha descrito acerca del papel de las citoquinas en la

respuesta inmunitaria del hospedador, pues según autores estas moléculas reguladoras

pueden desempeñar un efecto beneficioso o perjudicial en las infecciones por S. aureus

dependiendo del estado de la enfermedad, de las condiciones inmunológicas y

características de la respuesta del hospedador, y de la genética del huésped y el

patógeno (Sasaki et al., 2006).

Un ejemplo de esta controversia lo refleja el interferón ϒ (IFN-ϒ), el cual se ha descrito

que sí participa en la regulación de la inmunidad celular y sobre la producción de

inmunoglobulinas (IgG2a e IgM) frente a S. aureus, pero no interviene en la producción

de Igs en las reinfecciones (Sasaki et al., 2006). Nakane et al. (1995) también apuntaron

68

1. Introducción

que el IFN-ϒ sólo ejerce un efecto protector durante el estadio temprano de la infección

y también añadieron que el factor de necrosis tumoral (TNF) participa en la resistencia

frente a la septicemia por S. aureus.

Por otra parte, otras citoquinas que mejoran la defensa inmunitaria frente a las

infecciones por S. aureus son la interleucina 1β (IL-1β) y la IL-6, porque favorecen la

supervivencia de los PMNs y facilitan su acumulación durante las fases iniciales de la

inflamación (DeLeo, 2004), y junto a la IL-1β, la IL-8 (Greenlee-Wacker et al., 2014) y la

IL-17 (Thammavongsa et al., 2015), intervienen también en la quimiotaxis de PMNs.

Asimismo, las citoquinas que secretan las células inmunitarias activadas no sólo influyen

de manera directa sobre otras células inmunitarias, sino que también actúan sobre la

actividad del sistema nervioso central, y éste a su vez regula la magnitud de la respuesta

inmunitaria a través del sistema nervioso periférico mediante la liberación de epinefrina,

que actúa sobre los linfocitos T CD4+ y las células B (Kin y Sanders, 2006).

1.3. La piel

La piel es una importante barrera que no sólo protege al cuerpo de la flora microbiana

del medio ambiente, sino también frente a otros agentes externos como alérgenos,

radiación ultravioleta y otros agentes físicos y químicos (Pietrocola et al., 2017). Por otra

parte, presenta características únicas que no manifiestan otros sistemas de barreras

también expuestos al entorno exterior (mucosa intestinal o respiratoria). Además de

otorgar protección físico-química, interviene de manera directa en funciones vitales

como la respuesta inmunitaria y la producción de hormonas y vitaminas. En la piel hay

numerosas células inflamatorias que pueden participar de la respuesta inmunitaria

cutánea: células dendríticas (células de Langerhans), macrófagos, mastocitos, linfocitos

B y T, células plasmáticas y células NK. Todas estas células, incluyendo los

queratinocitos, están implicadas en el control de las infecciones en piel por S. aureus,

cuya incidencia es un reflejo de la competición que se establece entre la inmunidad

cutánea del hospedador y los factores de virulencia de este patógeno (Krishna y Miller,

2012a y b; Ryu et al., 2014; Brandt et al., 2018).

69

1. Introducción

1.3.1. Estructura histológica de la piel

En la piel se distinguen tres partes: epidermis, dermis e hipodermis. La epidermis es la

parte externa y está formada por queratinocitos en diferentes estados de maduración,

células de Langerhans y células T. La capa más externa de la epidermis, la capa córnea,

se considera la principal barrera física de la piel, pero puede ser interrumpida por

heridas, permitiendo así la invasión del tejido subyacente por parte de microorganismos

comensales y patógenos. El estrato córneo de la piel, que es una capa exclusiva de este

órgano, se compone de queratinocitos diferenciados (desprovistos de orgánulos) y

contiene fibrillas de queratina. Debajo de la capa córnea se encuentran las capas lúcida,

granular, espinosa y basal, siguiendo este mismo orden. Además, la epidermis

continuamente se está reformando con queratinocitos que migran desde la capa basal a

la capa córnea (Figura 1.6) (Krishna y Miller, 2012a y b; Yousef y Sharma, 2017). El

estrato lúcido sólo está presente en zonas de piel gruesa (Yousef y Sharma, 2017).

En cuanto a la dermis, contiene elementos que proporcionan soporte estructural a las

células inmunitarias residentes, así como a los anejos cutáneos (glándulas sebáceas y

sudoríparas, y folículos pilosos) y vasos sanguíneos. Este armazón de sostén está

constituido por fibras de colágeno y elastina (Krishna y Miller, 2012a y b; Brandt et al.,

2018; Pfalzgraff et al., 2018).

La hipodermis o fascia subcutánea es la capa más profunda de la piel. Principalmente

contiene adipocitos, fibroblastos y macrófagos, junto con algunos folículos pilosos,

neuronas sensoriales y vasos sanguíneos (Wong et al., 2016; Yousef y Sharma, 2017).

Las propiedades de la piel como barrera física y bioquímica se deben a la asociación de

los queratinocitos con los productos del sudor, componentes lipídicos y péptidos

antimicrobianos. Asimismo, la piel también representa una barrera efectiva para la

terapia tópica, debido especialmente a la gran organización de los lípidos del estrato

córneo (Pfalzgraff et al., 2018).

70

1. Introducción

1.3.2. Mecanismos de defensa cutáneos

Los mecanismos de defensa cutáneas del huésped que previenen la colonización

microbiana incluyen la barrera epidérmica, como se ha comentado anteriormente, así

como los microorganismos comensales y los péptidos antimicrobianos presentes de

manera natural, y las células inmunitarias residentes. En primer lugar, la superficie de la

piel tiene propiedades constitutivas tales como condiciones de baja temperatura y pH

ácido que interfieren en el crecimiento bacteriano. El pH bajo de la piel se debe a la

presencia de los subproductos de degradación de la filagrina (ácido urocánico y ácido

pirrolidona carboxílico) que se forman durante la diferenciación epidérmica, y estos

metabolitos condicionan también la expresión de factores de virulencia implicados en la

colonización de S. aureus, como el ClfB y el FnBPA (Krishna y Miller, 2012a y b; Ryu et al.,

2014).

En segundo lugar, la presencia de organismos comensales en la superficie de la piel

también puede prevenir de manera directa la colonización e invasión por otros

microorganismos. Por ejemplo, S. epidermidis segrega una proteína (llamada Esp) que

inhibe la colonización por S. aureus mediante la destrucción del biofillm, y también

produce otras proteínas con actividad antimicrobiana directa contra esta misma bacteria

(PSMγ y PSMδ). Además, S. epidermidis activa TLR2 en los queratinocitos e induce la

producción de AMPs (Krishna y Miller, 2012a; Ryu et al., 2014).

Por último, los péptidos antimicrobianos son polipéptidos constituidos por menos de 50

aminoácidos que pueden actuar como bactericidas o bacteriostáticos, neutralizantes de

toxinas y moduladores de la respuesta inmunitaria. La mayoría son de naturaleza

catiónica (CAMPs) e interaccionan con la membrana aniónica de los microorganismos.

Estos péptidos pueden ser producidos por los queratinocitos de la epidermis y otras

células epiteliales (células de Langerhans y macrófagos activados), así como PMNs y

glándulas sudoríparas. En humanos se han descrito varios grupos de CAMPs (Tabla 1.3),

y mientras que algunos son sintetizados por los queratinocitos de manera fisiológica,

otros son producidos durante procesos infecciosos e inflamatorios. De este modo, la

regulación del sistema inmunitario por los péptidos antimicrobianos está principalmente

determinada por el tipo de célula, la presencia de otro estímulo proinflamatorio y la

71

1. Introducción

cinética de la propia respuesta inmunitaria (Komatsuzawa et al., 2006; Krishna y Miller,

2012a y b; Ryu et al., 2014; Pfalzgraff et al., 2018).

Una evidencia de la importancia que tienen los péptidos antimicrobianos en la defensa

frente a S. aureus son los mecanismos de inhibición que se han detectado hacia estas

moléculas. Por otra, parte se ha visto que pueden reducir también la susceptibilidad

frente a los antibióticos. De hecho, la proporción de cepas que manifiestan baja

sensibilidad frente a los péptidos antimicrobianos es mayor entre cepas MRSA que en

MSSA (Komatsuzawa et al., 2006; Krishna y Miller, 2012a y b; Ryu et al., 2014; Pfalzgraff

et al., 2018).

Tabla 1.3. Péptidos antimicrobianos catiónicos que participan en la inmunidad cutánea frente a S. aureus.

Familia Péptidos Origen celular1 Función

Catelicidinas LL-37

KS-30

RK-31

Queratinocitos, macrófagos y PMNs

Quimiotaxis de PMNs, monocitos y linfocitos T

Defensinas

α-defensinas/HNPs HNP1

HNP2*

HNP3

HNP4

PMNs, macrófagos y células de Langerhans

Quimiotaxis de monocitos, linfocitos T y mastocitos

[El 50% de los gránulos de los PMNs contienen α-defensinas (Ryu et al., 2014)]

β-defensinas/hBDs hBD1

hBD2

hBD3* hBD4

Queratinocitos, macrófagos y células de Langerhans

Quimiotaxis de células de Langerhans inmaduras, linfocitos T CD4+ y monocitos/macrófagos

Dermocidina

Glándulas sudoríparas Antimicrobiana

RNasa7

Queratinocitos

Bactericida. Altos niveles en el estrato córneo pueden prevenir la colonización

1 Por orden de importancia; * Péptidos que presentan mayor actividad bactericida.

72

1. Introducción

Por otra parte, la vitamina D también participa en la respuesta inmunitaria de la piel

frente a S. aureus porque promueve la expresión de LL-37 por los queratinocitos, PMNs

y monocitos/macrófagos (Ryu et al., 2014).

En la piel existen un abundante número de células inmunitarias implicadas en el control

de las infecciones por S. aureus, influenciando de diferentes maneras la respuesta

inmunitaria. Durante una infección bacteriana las células presentes en la epidermis y la

dermis reconocen al patógeno y desencadenan la respuesta inmunitaria innata. Los

queratinocitos son las primeras células en encontrarse con los patógenos, pero no son

las únicas capaces de reconocerlos; como se ha comentado, monocitos, macrófagos y

PMNs también presentan TLRs. TLR1, TLR2 y TLR6 reconocen componentes de la pared

celular de S. aureus (ácido lipoteicoico y peptidoglicano) y desencadenan la producción

de citoquinas proinflamatorias y péptidos antimicrobianos, el reclutamiento de PMNs de

la circulación sanguínea e inducen la fagocitosis (Figura 1.6) (Krishna y Miller, 2012a y b;

Brandt et al., 2018).

Por último, cabe mencionar que las interacciones que se producen entre S. aureus y el

hospedador durante la colonización de la piel son clave para el tipo de infección que se

va a producir, de acuerdo además con el sitio anatómico de la piel implicado (Krishna y

Miller, 2012a y b).

73

1. Introducción

Figura 1.6. Componentes de la piel implicados en la defensa frente a la colonización, invasión e

infección por S. aureus. (Figura adaptada a partir de Krishna y Miller, 2012a).

74

Capas

Córnea

Granula

Espinos

Basal

Bacterias comensales

AMPs

Queratinocitos

Der

mis

Ep

ider

mis

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