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Resistiendo el estrés oxidativo:
La travesía de Trypanosoma cruzi
a la infección
Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi
Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al; Science Vol 309; 2005
Respuesta inmune innata
2- Sistema del complemento
Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno
1- Respuesta celular
Activación de macrófagos residentes,
células de Langerhans y NK
Producción de interleuquinas proinflamatorias
Rol central de los macrófagos en el control de la infección
Fagocitosis como primera línea de defensacontra la infección por T. cruzi
Villalta et al, 1984
8 min
Interacciones Macrófagos - T cruzi
Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis
2 O2 + NADPH 2 O2
• – + NADP+ + H+
Alvarez, MN et al, 2007
Actvadores: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6,
productos derivados de patógenos
(virales, bacterianos y de protozoarios)
Inhibidores: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β
Interacción con células apoptóticas
Óxido Nítrico Sintasa
● NO Óxido Nítrico
NO2¯ Nitrito
Dióxido de Nitrógeno
● NO2
NO3¯
Nitrato
RNH2 L-Arginina
- 1e-
- 1e-
- 1e-
i NOS
Especies Reactivas del Nitrógeno
Peroxidasa/H2O2 (MPO)
- 5e-
Superóxido(anion radical)
+
Peróxido de
Hidrógeno
OH● Radical Hidroxilo
H2O2
2 H2O
O2
Especies Reactivasdel Oxígeno
NADPHoxidasa
OH¯
SOD
+ 1e-
+ 1e-
+ 1e-
+ 1e-
O2●
_
peroxinitrito
●NO2 + CO3●¯
ONOO
ONOOH
●NO2 + OH●
H+ CO2
ONOOCO2¯
-
●NO2 + CO3●¯
Oxidantes intrafagosomales
Macrófago no estimulado
2 hrs de infección
Oxidantes intrafagosomales
Macrófago estimulado con IFN-ϒ
2 hrs de infección
0
20
40
60
80
100
Infe
cció
n (
%)
Apocinina
O2
●-
*
+●NO
Amastigotas intracelulares
O2
●-
Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas rol del ONOO- en el control parasitario
Defensas Antioxidantes en T. cruzi
NADPH
NADP +
TRox
TRred
T(SH)2
TS2
TXNox
TXNred
TcCPXRed
TcCPXOx
ONOOH
NO2-
Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro
TR = tripanotiona reductasa
T(SH)2= tripanotiona
TXN = triparedoxina
TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica
10 6 M-1s-1
(10 3 M-1s-1) (10 3 M-1s-1)
Trujillo et al, 2004
Células Control Células Control + ONOO- TcCPX + ONOO-
Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad
mediada por ONOO-
Resistencia de cepa TcCPX
0
20
40
60
80
100
120
Infe
cció
n
(%)
Tc CPXsalvaje
O2●- ONOO-
O2●-
*
ONOO-
Infección en macrófagos
In vitro
Infección en ratones
In vivo
Días post-infección
Trip
om
ast
igo
tas
en
50
ca
mp
os
Evaluación in vivo
TCC CL-WT
Caracterización de las cepas
Contenido de Enzimas Antioxidantes
Anticuerpos específicos
TcCPX TcMPX TcTS TcCPX TcMPX TcTS
Con
teni
do r
ela
tivo
de e
nzim
a
Epimastigotas de 3 días
Tripomastigotas Metacíclicos
Tripomastigotas en 100 campos Tripomastigotas en 100 campos
Co
nte
nid
o r
ela
tivo
de
en
zim
a
(trip
om
ast
igo
ta m
eta
cícl
ico
)
Enzimas antioxidantes: factores de virulencia
Respuesta inmune innata
2- Sistema del complemento
Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno
1- Respuesta celular
Activación de macrófagos residentes,
células de Langerhans y NK
Producción de interleuquinas proinflamatorias
Muerte Celular Programada en T. cruzi
Activación del complemento
sobre la superficie del parásito,
Influjo de Ca2+ y disfunción
mitocondrial
Irigoín, F et al., 2009
Tinción de núcleos apoptóticos
Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF)
CTL SHI SHF Control SHF
Exposición de fosfatidil-serina
Fragmentación ADN
Ctl
SHF
O2- como mediador de la MCP
Smith and Murphy, 2003
HEMito-Hidroetidio
(Mitosox)Detección de O2
- mitocondrial en T. cruzi
Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)
O2- mitocondrial como mediador de la MCP
Exposición a suero humano fresco
MitoSOX oxidado Tinción nuclear
Protección de la MCP por Fe-SOD
Control TcSODA
SHI SHF SHF SHIbp
Sobreexpresión de la Fe-SODA
2 O2• – + 2H+ O2 + H2O2
k = 109 M-1 s-1
Macrófagos peritoneales
Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.
Infección in vivoCorazón(14 dpi)
Infección in vitroCardiomiocitos
Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado
Activación Clásica
Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363
Activación Alterna
Activación Clásica
Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363
Determinantes de la eficiencia de la infecciónpor Trypanosoma cruzi
Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con
inducción de la iNOS en macrófagos
Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos
Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo
PERSPECTIVAS
Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran
con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas
a un tratamiento coadyuvante
Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas
dilucidando las señales que llevan a la inducción
del proceso de muerte
Howard Hughes Medical Institute PEDECIBA (Uruguay)CONICYT (Uruguay)
PDT (Uruguay)
Departamento de Bioquímica
María Noel Alvarez Gonzalo Peluffo Florencia IrigoínMadia TrujilloCarlos RobelloRafael Radi
Colaboración Internacional
Shane WilkinsonMartin Taylor
John Kelly
Paola ZagoMiguel Basombrio