rol de anticuerpos toxoplasma v36n2a5

7/24/2019 rol de anticuerpos toxoplasma v36n2a5

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Artculo Original Original Article

julio-diciembre 2013Gac Med Bol 2013; 36 (2): 76-80

Amilcar Flores Len1,a, N. Marisol Crdova Rojas2,b, Karina Mamani Herrera3,c, Emilse Egez Suarez3,d

La toxoplasmosis es una zoonosis causada por Toxoplasmagondii, parsito intracelular obligado. Es capaz de produ-cir morbimortalidad grave cuando aecta al embrin, al etoo a un individuo inmunodeficiente. En el ser humano inmu-no competente, tan slo el 10% de las inecciones cursa conmaniestaciones clnicas, generalmente leves: linadenopatas,hepatomegalia y fiebre1. Se estima que cerca de un tercio de lapoblacin mundial est inectada por T. gondii2,3, con mayorprevalencia en regiones hmedas y calurosas4,5.

La mayora de las inecciones por T. gondiien humanos sonasintomticas, sin embargo, una ineccin primaria en muje-res embarazadas puede resultar en un dao severo al eto ocausar aborto. La recuencia de transmisin vertical se incre-menta con la edad gestacional. Se estima que la tasa de trans-misin al eto es del 15% si la ineccin materna es adquiridadurante el primer trimestre, 30% durante el segundo y 60% enel tercero6,7.

La ineccin por T. gondii, genera en el individuo una res-puesta inmune de tipo humoral y celular. Los anticuerpospresentes se ponen en evidencia con tcnicas de laboratorio

especficas. Las pruebas utilizadas detectan anticuerpos es-pecficos anti-T. gondii, tipo IgG e IgM8, siendo las IgM in-dicadores de ineccin aguda. Las IgG presentan el pico deconcentracin entre 6 y 8 semanas luego de la ineccin y semantienen en orma indefinida, por ende no sirven para diag-

nosticar ineccin aguda9.La proteccin del husped rente a T. gondiiresulta de una

respuesta inmune mediada por clulas con produccin decitoquinas proinflamatorias que incluyen interern gamma(IFN-), interleuquina 12 (IL-12) y actor de necrosis tumo-ral ala (NF-), esta respuesta se caracteriza por ser una res-puesta T1. Durante la ase inicial de la ineccin, los neutrfi-los, macragos y clulas asesinas naturales (NK) constituyenla principal respuesta del hospedero, mediante la agocitosis,toxicidad celular y la produccin de IFN-7,9,10. Los macra-gos activados por IFN- inhiben la replicacin del parsito atravs de un nmero de mecanismos microbicidas potentes

tales como el oxidativo y no oxidativo, as como tambin lainduccin por IFN- de indoleamina 2,3-dioxigenasa que de-grada el triptano, el cual se requiere para la replicacin delT. gondii7.

La accin combinada de citoquinas como IL-12, IFN-,NF- protege al husped contra la rpida replicacin de lostaquizotos y posteriores cambios patolgicos. Luego de la in-

vasin del enterocito, el T. gondiiinecta las clulas presenta-doras de antgeno en la lmina propia del intestino e induceuna respuesta transitoria y local de T19,11.

Dentro del anterior contexto, el presente estudio evalu in

1Laboratorios de Investigacin Mdica (LABIMED), Facultad de Medicina, UniversidadMayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia.2Instituto de Investigacines Biomdicas (IIBISMED), Facultad de Medicina, Universi-dad Mayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia.3Hospital Materno Inantil Germn Urquidi. Cochabamba, Bolivia.aBilogo; bBioqumica-armacutica;cEstudiante de medicina; dGinecloga-Obstetra*Correspodencia a: Amilcar Flores Len.Correo electrnico: [email protected] el 11 de noviembre 2013. Aceptado el 29 de noviembre de 2013

Resumen

Abstract

Objectives: the study aimed to evaluate in vitro the role of anti T. gondiiin activating immune responses in pregnant women.Methods:

the study was performed with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of pregnant women with chronic toxoplasmosis (n = 15) were

stimulated in the presence and absence of autologous plasma (PA) (anti T. gondii antibody). Results: the data show that in PBMC stimu-lated in the absence of autologous plasma there is increased cell proliferation (P < 0.05) than cells in the presence of autologous plasma.

Levels of IFN- produced in both conditions (PA and SBF) were similar. Comparing the production of IFN- vs IL - 10 shows increased

production of Th1 cytokines. Conclusions: in general, our results suggest that the antibodies present in autologous plasma modulate

the immune response in pregnant women with chronic toxoplasmosis, such that the immune system does not exacerbate or inhibit this

specific response. The presence of antibodies to T. gondii not affecting IFN- production in pregnant women with chronic toxoplasmosis,

but if cell proliferation.

Keywords:Chronic Toxoplasmosis in pregnant women, anti-Toxoplasma gondii antibodies, cytokines, cell proliferation.

Objetivos:el estudio tuvo como objetivo evaluar in vitro el rol de anticuerpos anti T. gondii en la activacin de la respuesta inmune en

mujeres embarazadas. Mtodos:el estudio se realiz con clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC) de mujeres embarazadas

con toxoplasmosis crnica (n=15) que fueron estimuladas en presencia y ausencia de plasma autlogo (PA) (anticuerpos anti T. gondii).

Resultados:los datos muestran que en PBMC estimuladas en ausencia de plasma autlogo existe mayor proliferacin celular (P


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vitro el rol de anticuerpos anti-T. gondiiy el papel del IFN-(H1) e IL-10 (H2), en la activacin de la respuesta inmunepara el control de la ineccin, en mujeres embarazadas contoxoplasmosis crnica.

Materiales y mtodos

rea de EstudioEl trabajo de investigacin se realiz en los Laboratorios deInvestigacin Mdica (LABIMED) - IIBISMED de la Facultadde Medicina, Universidad Mayor de San Simn.

Grupo de EstudioSe reclutaron para este estudio a 15 mujeres entre 15 a 20 aos,embarazadas (tercer trimestre de gestacin) con toxoplasmo-sis crnica, previo consentimiento inormado, que asistieronal control prenatal del Hospital Materno Inantil Germn Ur-quidi (Cochabamba, Bolivia), entre los meses de junio a sep-tiembre del 2012. Los criterios de inclusin ueron: mujeresembarazadas con serologa IgG positiva para T. Gondii. Fue-

ron excluidas del estudio: mujeres embarazadas con serologaIgG negativa o IgM positiva para T. gondii.

Recoleccin de MuestrasSe recolect 9 ml de sangre peririca en tubos heparinizadosestriles, libres de endotoxina para el aislamiento de clulasmononucleares de sangre peririca (PBMC), y 1 ml de san-gre total ue recolectado en tubo seco para la determinacinde anticuerpos anti-T. gondii.Las muestras de sangre uerontomadas en ayunas de por lo menos de 8 horas.

Determinacin de anticuerpos IgG e IgM anti-T. gondiiLa determinacin de anticuerpos IgG e IgM anti-T. gondii, ensuero obtenido de mujeres embarazadas, se realiz utilizandola tcnica de ensayo inmunoenzimtico (ELISA) siguiendo lasespecificaciones del kit (Globe Diagnostics SRL. Italy).

Aislamiento de clulas mononucleares de sangre perifrica(PBMC)El aislamiento de clulas mononucleares de sangre peririca(PBMC) se realiz por centriugacin sobre gradiente de den-sidad Nycopret (Nycomed Pharma AS. Oslo. Norway) pre-

via dilucin del paquete globular (1:5) con RPMI-1640 con-teniendo 100 U penicilina/ml, 100 g de estreptomicina/ml(RPMI P/S) (todo Cambrex Bio Science). Una vez recuperado

el anillo de PBMC se ajustaron las clulas a una concentracinfinal de 2 millones de clulas/ml. Estimulacin de clulas mo-nonucleares de sangre peririca (PBMC).

Para determinar el eecto de los anticuerpos anti-T. gondii,PBMC (2 x 106 cels/mL) de mujeres embarazadas con toxo-plasmosis crnica, ueron cultivados por duplicado en placasde 96 pocillos ondo plano, en RPMI P/S por 6 das a 37 Ccon 5% de CO2 y humedad relativa, en presencia de plasmaautlogo y/o suero bovino etal (SBF). En estas condicionesPBMC ueron estimuladas en tres condiciones dierentes: sn-tesis espontnea (control negativo de prolieracin), estimula-

cin con antgeno lisado de T. gondii (Ag toxo) (50 g/ml) yEnterotoxina Estafiloccica B (SEB) 100ng/mL como controlpositivo de prolieracin. Posterior al cultivo, las clulas ue-ron centriugadas y los sobrenadantes ueron conservados a-80 C para el anlisis de citoquinas T1 y T2.

Medicin de la respuesta celularLa prolieracin celular se midi por el mtodo de Ioduro dePropidium (PI), intercalante de bases de DNA, esta no atra-

viesa la membrana celular de manera directa, por lo que uenecesario permeabilizar la membrana celular para marcar lasclulas a nivel de DNA. La medicin de prolieracin celularse realiz en el equipo Fluoroskan Ascent (parmetros de me-dicin 538 nm de excitacin y 612 nm de emisin).

Cuantificacin de citoquinasLa cuantificacin de IL-10 e IFN- ue empleada como marca-dor de la respuesta T1/T2 respectivamente. Niveles de estascitoquinas ueron medidos en los sobrenadantes del cultivocelular mediante la tcnica de ELISA, para lo cual se emple el

Kit de INF- (R&D Systems. INC, Minneapolis, EEUU); Kitde IL-10 (R&D Systems. INC, Minneapolis EEUU). El ensayoue calibrado para detectar INF- e IL-10 dentro de un rangode 1000 a>8 pg/mL y 4000 a>32pg/mL respectivamente.

Anlisis EstadsticoLos resultados en la prolieracin celular ueron expresadoscomo media aritmtica desviacin estndar (DE). En lacuantificacin de citoquinas se expresaron como media arit-mtica error estndar (SEM). La comparacin estadstica dela prolieracin celular y cuantificacin de citoquinas entre lascondiciones estudiadas ueron desarrollados con la prueba Ude Mann Whitney. Para el anlisis estadstico de los resulta-dos se utiliz el paquete estadstico Graphpad Prism Sofware

versin 4,03 (San Diego, CA.), las dierencias se consideraronestadsticamente significativas a un nivel de significacin dep


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A B

Figura 1. AyBProliferacin celular de PBMC en mujeres embarazadas con

toxoplasmosis crnica (M+T+) en presencia de plasma antlogo y SBF, cul-

tivadas durante 6 das en estufa a 37C con 5% de CO2 estimuladas con a)

Ag toxo b) SEB. Diferencias estadsticamente significativas p0,05.

figura 1B, muestra la prolieracin celular de PBMC estimu-ladas con SEB (Control Positivo), en la cual se observa mayorprolieracin celular en presencia de SBF comparando con elPA (PA= 0,520,49; SBF = 1,531,31) dierencia estadstica-mente significativas (P < 0,05 U de Mann Whitney).

Estos resultados muestran el rol inmunomodulador de losanticuerpos presentes en mujeres embarazadas.

Mujeres embarazadas con toxoplasmosis crnica mues-

tran una disminucin de la actividad inflamatoria de la in-

munidad celular.

La figura 2 muestra la produccin de IFN- e IL-10 porPBMC estimuladas en tres condiciones: Ag toxo, SEB y pro-duccin espontnea comocontrol negativo (SE), en presenciade plasma autlogo y/o SBF.

La figura 2 (A y B) muestra que los niveles de IFN- pro-ducidos por las PBMC en las tres condiciones, estimulados enpresencia de PA y SBF, no muestran dierencias estadsticassignificativas entre ambas condiciones (SE = 0; Ag = 845,4

144; SEB= 844,8 189,3pg/ml respectivamente).Mujeres embarazadas con toxoplasmosis crnica muestranuna disminucin de los niveles de IL-10.

La figura 3 (A y B) muestra la produccin de IL-10 porPBMC en presencia de PA y SBF. Los resultados muestran queno existe dierencias estadsticas significativas entre la sntesisespontnea y Ag toxo, sin embargo si se observa produccinde IL-10 por las PBMC cuando son estimuladas con SEB.

Una importante respuesta inmune tipo H1 se observa enrespuesta a Ag de Toxoplasma gondii.

La figura 4 (A y B) muestra una comparacin entre los ni-veles de produccin de INF- e IL-10 en presencia de PA, los

resultados muestran dierencias estadsticamente significati-vas entre ambos INF- e IL-10 (IFN-: 845,4 144,0; IL-10= 1,874 1,040pg/ml), del mismo modo en la figura 4b seobserva un comportamiento similar de produccin de ambascitoquinas, en presencia de SBF cuyas dierencias son estads-ticamente significativas (INF- = 777,2 143,1; IL-10 = 1,01 0,73 pg/ml).

DiscusinPara determinar el eecto de los anticuerpos anti-Toxoplas-

ma gondiien la respuesta inmune celular realizamos estimu-laciones de PBMC con Ag soluble de toxoplasma en presencia

de plasma autlogo, que presenta anticuerpos anti-T. gondii yen ausencia del mismo para determinar el eecto de estos en laprolieracin celular.

Nuestros resultados muestran que PBMC de mujeres em-barazadas estimuladas con Ag de T. gondiiy SEB en ausenciade anticuerpos, muestran mayor prolieracin celular compa-rando con PBMC en presencia de plasma autlogo (fig. 1 Ay B), esto sugiere que el sistema inmune en presencia de PA

A B

Figura 3. AyBRespuesta inmune de PBMC en mujeres embarazadas con

toxoplasmosis crnica (M+ T+) en tres condiciones: sntesis espontanea

(S.E), Ag toxo (50g/ml) y SEB (100 ng/ml), despus de un cultivo de 6

das a 37C con 5% de CO2 en presencia de: a) plasma autlogo. b) Suero

Bovino Fetal. **Diferencias estadsticamente significativas p


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y SBF est activado, sin embargo, la prolieracin celular enpresencia de anticuerpos esta disminuida, esto podra debersea la presencia de los anticuerpos IgG especficos y linocitos dememoria como lo reportan tambin, Romero A.. 2001 y Mo-llinedo P. 2005, en mujeres embarazadas, los cuales indicanque al presentar anticuerpos IgG anti-T. gondii antes del em-barazo queda inmunizada contra la enermedad ya que poseedeensas inmunolgicas que protegern a la gestante y al etocontra uturas reinecciones11,12.

Pezerico y col. 2009, realizaron estudios en modelo de ra-tones BALB/c que ueron reinectados con T. gondiiduranteel embarazo, estos ratones inectados crnicamente no mos-traron reineccin durante el embarazo13, nuestros resultadosin vitro indican que las PBMC de mujeres embarazadas contoxoplasmosis crnica al entrar en contacto con el antgeno detoxoplasmosis (asumiendo una re-ineccin in vitro) tienenmenor prolieracin rente a PBMC en ausencia de PA, estoes debido a que la respuesta inmune ser mucho mas rpidapor la exposicin al mismo antgeno por segunda vez y por lapresencia de memoria inmunolgica rente al parsito1,14.

Es conocido que los anticuerpos (IgG), orman parte de lainmunidad adquirida humoral que se desarrolla cuando el or-ganismo est expuesto a antgenos, estos anticuerpos atacan aun antgeno especfico y acilitan la destruccin del antgenopor parte de los agocitos15. Estudios realizados en ratones quecarecen de clulas han demostrado que el suero inmune, pors mismo, no es protector16.

Asimismo, otros estudios han demostrado que ratones de-ficientes en linocitos B mueren durante la ineccin secunda-ria por Toxoplasma, con una gran cantidad de taquizotosenel cerebro y pulmones, indicando que las clulas B juegan unpapel importante en la resistencia a la ineccin activa persis-tente, probablemente a travs de la produccin de anticuerpos

especficos17. Respecto a este hecho, nuestros resultados indi-can que las PBMC de mujeres embarazadas, estimuladas conSBF en ausencia de anticuerpos mostraron niveles ms ele-

vados de prolieracin sugiriendo que el sistema inmune nosolo depende de esta va (inmunidad humoral) para el controlde la ineccin puesto que tambin podra haber otras vas deaccin rente al agente patgeno como el sistema de comple-mento y otros18.

Se sabe que el IFN- es una citoquina T1 producida porlinocitos activados. Macragos y clulas NK, participantambin en la respuesta inmunitaria mediada por las clulas einhibe la prolieracin T2, disminuyendo la inmunidad hu-moral19. Se ha demostrado tambin que el IFN- tiene la capa-cidad de inhibir la prolieracin de T. gondiipor activacin declulas endoteliales de venas umbilicales humanas12.

En nuestro estudio los niveles de IFN- en sobrenadan-tes de PBMC, estimulados con Ag de T. gondii en presencia

y ausencia de anticuerpos ueron similares, ya que no hubodierencias estadsticamente significativas entre ambas (fig. 2A y B), estos resultados indican que los anticuerpos anti-T.

gondii no influyen en la produccin de IFN-, pero si en su ac-tivacin y regulacin, ya que se observ mayor prolieracincelular en PBMC estimuladas en ausencia de anticuerpos. Encambio los niveles de IFN- producidos en la condicin deSEB (control positivo) ueron menores en presencia de plasmaautlogo, con respecto a la produccin de IFN- con SBF. Estal la importancia del IFN- en la respuesta inmunitaria con-tra el parsito, que estudios realizados en murinos, demues-tran que la neutralizacin de la citoquina lleva a la muertede los animales inectados por una cepa habitualmente no

virulenta, reactivando la ineccin crnica por ruptura de losquistes12. Es innegable la uncin esencial de las citoquinasproinflamatorias para la resolucin de la toxoplasmosis; sinembargo, su produccin excesiva es perjudicial para el hospe-dero y tambin durante el embarazo debido a que en modelosanimales produce abortos espontneos y recurrentes20,21.

Con respecto a los niveles de IL-10 (fig. 3 A y B) en PBMC

estimulados con Ag de T. gondiiueron similares en presenciay ausencia de anticuerpos, sin embargo, con SEB en ausenciade plasma autlogo los niveles de IL-10 ueron mayores queen presencia de plasma autlogo, esto se debe a que el SEB esun sperantgeno que va estimular la produccin de respuestatanto T1 como T2 y de esta manera tener una respuesta in-mune incrementada.

Los resultados de la (fig. 4 A y B) concuerdan con lo seala-do por Ki-Man Kang 2006, que en ratones BALB/c inectadoscon T. gondii evidenci una respuesta T115. ambin nuestrosresultados son corroborados con la investigacin de Fatoohi ycol. 2002, quien encontr alta produccin de IFN- y menor

produccin de IL-4 como respuesta al Ag soluble de Toxoplas-maen mujeres embarazadas inectadas crnicamente22,23.En conclusin, podemos indicar que la presencia de an-

ticuerpos anti-T. gondii presentes en el plasma modulan larespuesta inmune en mujeres embarazadas con toxoplasmo-sis crnica, de tal modo que el sistema inmune no se exacer-

ve provocando el aborto en la madre o inhiba esta respuestaespecifica. Estos anticuerpos anti-T. gondiino influyen en laproduccin de IFN-, pero si en la prolieracin celular y larespuesta inmune especfica de estas mujeres embarazadas seencuentra polarizada hacia una respuesta T1, debido a que seencontr mayor produccin de IFN- y bajos niveles de IL-10.

Agradecimientos: Un sincero agradecimiento a la Agencia de CooperacinSueca (ASDI), IIBISMED, LABIMED y al personal del HMIGU.

Conflictos de inters:Los autores declaramos no tener conflicto de intereses,en relacin a este artculo.

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