Formas LFormas L naturales:Carentes totalmente (o casi) de PC
que algunas bacterias generan espontneamente en medios a base de
suero (que son hipertnicos)Ejemplo: Streptobacillus
moniliformisColonias en forma de huevo fritoFormas L inducidas:
tratamiento con penicilina en medio hipertnicoL inestables:
tratamiento breve; revierten PCL estables: tratamiento prolongado;
no revierten PC
*En este tema vamos a abordar la biosntesis y crecimiento del
PG, as como las formas carentes de pared celular.*Desde el punto de
vista topolgico, todas las capas de las envueltas bacterianas
(membranas, pared celular) son superficies cerradas sobre s mismas,
fsicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la
clula. Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse
durante el crecimiento por incorporacin de nuevos materiales.
Adems, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e
incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de
las bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a
parar a diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana
externa, e incluso medio exterior.Durante cada ciclo celular, hay
una fase en la que los materiales de las envueltas (y
concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora) deben de
facilitar la divisin de la clula en una descendencia de dos clulas
hijas.Finalmente, queda el problema de la energa. Los procesos
biosintticos requieren aporte de energa qumica, pero el ATP y
compuestos similares no pueden salir del protoplasto.Precisamente
en este captulo vamos a ver algunas de las estrategias bioqumicas y
moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos
puntos para el caso del peptidoglucano. Veremos que la estrategia
implica varias fases.
* Sntesis de precursores solubles en el citoplasma. Estos
precursores son transferidos a un transportador lipdico situado en
la membrana citoplsmica (un poliisoprenol fosfatado llamado
undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacardicas
con el pentapptido.Las unidades disacardicas se polimerizan en
cadenas lineales fuera de la membrana, pero an unidas al
undecaprenil-fosfato de la membrana. Unin del polmero lineal as
formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por
entrecruzamiento de (al menos) parte de sus pptidos respectivos. A
estas etapas hay que aadir una fase adicional de regeneracin del
transportador lipdico, una vez que ha cumplido su misin, para que
pueda ser operativo en un nuevo ciclo de sntesis.*Fase 1:. Los
monosacridos que luego van a constituir la unidad disacardica
repetitiva del esqueleto del peptidoglucano (NAM y NAG) se activan
al unirse a uridn difosfato (UDP). (En general, los monosacridos
que han de incorporarse a polmeros de pared celular bacteriana se
activan mediante su unin con nuclesidos-fosfato.) Por lo tanto, en
esta fase se sintetizan por separado: NAG-UDP y NAM-UDPLuego se va
produciendo la adicin secuencial y ordenada de los distintos
aminocidos al NAM (en reacciones que requieren energa e iones
Mn++): 1.L-ala2. D-glu3.m-DAP (u otro diaminocido; p. ej. L-lys en
Staphylococcus aureus)4.D-ala-D-alaObservar que no se produce un
tetrapptido, sino un pentaptido. El ltimo paso de adicin de
aminocidos es la unin del dipptido D-alanil-D-alanina, que se ha
sintetizado en dos fases:una racemasa convierte la L-ala a
D-ala;creacin de enlace peptdico entre dos D-ala.*Esquema de la
biosntesis del pepetidoglucano*Fase 2: El UDP-NAM-pentapptido se
transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado
undecaprenil-fosfato (que abreviaremos como Lip-P).El
undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 tomos de C (C55,
derivado de la repeticin 11 veces de la unidad isoprenoide, con un
fosfato terminal). Antiguamente se le conoca con el nombre de
bactoprenol, pero esta denominacin ha cado en desuso desde que se
sabe que no es exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el
transporte y ensamblaje de sustancias que, como los azcares, son
hidroflicas, y no podran pasar por s mismas la barrera hidrofbica
de la membrana.Una vez que el NAM-pentaptido est unido al
undecaprenil (por medio de pirofosfato) se produce la unin con la
NAG, en una reaccin de transglucosidacin que genera el enlace (14)
entre NAG-NAM. Por lo tanto, se obtiene:
Lip-P-P-NAM(pentapptido)-NAG.En esta situacin es cuando se producen
la modificaciones que ya estudiamos en la estructura bsica del PG.
Por ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutmico
en posicin (2) es amidado (pasa a --CO-NH2. Por otro lado, se
introducen los puentes peptdicos, que en el caso de esta bacteria
consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal
de la L-Lys en posicin (3).
*Esquema de la biosntesis del pepetidoglucano*Fase 3:
Polimerizacin de varias unidades disacardicas: ello se logra en una
reaccin de transglucosidacin. Consiste en la unin de cada unidad
disacardica (con su pentapptido) unida a su respectivo Lip-P-P, con
el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez
est unida a otra molcula de Lip-P-P. En el proceso se libera uno de
los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma
pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P acta una fosfatasa especfica,
que elimina el fosfato terminal, regenerndose el
undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el
descrito.
*Esquema de la biosntesis del PG*Fase 4: El polmero surgido de
la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y
unido an al transportador lipdico de membrana. Ahora este polmero
naciente (con sus pentapptidos) reacciona, por transpeptidacin, con
un PG aceptor preexistente. En esta reaccin se ven implicados el
grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH2 libre del
diaminocido (3) del PG aceptor (o del ltimo aminocido del puente
peptdico). Esto es lo mismo que decir que el enlace peptdico entre
D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro
enlace peptdico, entre dicha D-ala (4) y el diaminocido del PG
naciente.La energa para esta reaccin la suministra la hidrlisis
concomitante del enlace peptdico entre las dos D-ala terminales. Es
decir, en cada reaccin de transpeptidacin se libera una D-ala,
correspondiente a la que ocupaba la posicin (5).Ya dijimos en el
captulo anterior que no todos los tetrapptidos participan en
entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5) de los pptidos no
implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima
llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no slo que en el
PG maduro existan tetrapptidos (y no los pentapptidos originales),
sino tambin la existencia de tripptidos.
*Obsrvese que la reaccin de transpeptidacin supone la sustitucin
del enlace peptdico entre la D-Ala(4) y D-Ala(5) por otro enlace
peptdico entre la D-Ala(4) y el diaminocido en (3) del pentapptido
de otra cadena de PG. De esta forma, se evita el problema del
suministro de ATP (imposible fuera del protoplasto). Esta es la
reaccin inhibida por la penicilina y otros antibiticos
beta-lactmicos.*Esquema de la transpeptidacin en una bacteria
Gram-negativa y en otra Gram-positiva*Tienen un efecto bactericida
sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir
determinados pasos del ciclo de sntesis y ensamblaje del PG,
provocan la acumulacin de precursores de dicho PG, lo que a su vez
desencadena la activacin de las autolisinas de la bacteria, que
degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios
hipotnicos), por entrada masiva de agua a la clula.1.Fosfomicina:
acta inhibiendo la formacin del 3-O-D-lactil-ter de la NAG (o sea,
del NAM). 2.Cicloserina: Se comporta como anlogo estructural de la
D-alanina, por lo que inhibe la actuacin de la racemasa que
convierte la L-ala a D-ala, as como de la reaccin de unin de dos
D-ala.3.Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido
hasta entonces al UDP y lo pasa al bactoprenol (fase
2).4.Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda
transglucosidacin (fase 3), es decir, la unin de diversas unidades
disacardicas.5. Bacitracina: se une al undecaprenol-P-P, bloqueando
su desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin del
transportador de membrana. 6. Antibiticos -lactmicos (p. ej.:
penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reaccin de
entrecruzamiento por transpeptidacin.
*Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la pared
celular es una estructura cerrada y sin solucin de continuidad,
debe permitir su expansin (crecimiento), y esto supone que se han
de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se
ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones, es decir,
debe existir una accin concertada de muren-hidrolasas y de
muren-sintasas. Por otro lado, hay que tener en cuenta que en el
crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos:
la expansin (aumento de tamao) de esa pared, y la formacin del
tabique transversal en el centro de la clula.El crecimiento y
septacin del peptidoglucano estn basados en la actividad controlada
y localizada en puntos determinados, de una gama de autolisinas,
especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y/o
transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son los sitios de accin
de las penicilinas (y otros antibiticos -lactmicos), se les conoce
tambin con el nombre de PBP (de penicillin-binding proteins).
*El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar
dividido en dos fases:1. Crecimiento en longitud (elongacin),
mientras la clula crece en tamao.2.Produccin del tabique
transversal (septacin), que conduce a la formacin de dos clulas
hijas.*ElongacinLas PBPs 1 son las encargadas de la elongacin de
las cadenas de PG naciente (por transglucosidacin de las unidades
disacardicas) y simultneamente, por transpeptidacin, logran el
entrecruzamiento.Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la
parte cilndrica del sculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5
cortan enlaces del PG preexistente. La PBP2 interviene aqu tambin
para transpeptidacin. La cadena de PG se va elongando
unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la clula. Se
calcula que existen unos 200 sitios de insercin de nuevo material
en cada clula, dispersos de forma ms o menos uniforme por toda la
superficie de la clula. La maquinaria biosinttica tarda 8 minutos
en completar cada circunferencia de elongacin.*La divisin de la
bacteria por fisin binaria simtrica se logra por medio de una
invaginacin circular de las envueltas (membrana citoplsmica y
peptidoglucano) en mitad de la clula madre. En el inicio de este
proceso tiene un papel esencial la protena FtsZ, y ms tarde
intervienen otras protenas Fts.FtsZ es una protena imprescindible,
presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido
con las tubulinas eucariticas. Al parecer, al igual que las
tubulinas, la FtsZ se une a GTP, con lo que se promueve su
polimerizacin. Bajo control del ciclo celular, la FtsZ se ensambla
poco antes de la divisin en el centro de la clula, formando un
anillo citocintico en el lado citoplsmico de la membrana celular.
Existen indicios fuertes de que la formacin de este anillo de FtsZ
sealiza el sitio por donde se producir la divisin y se activar el
crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Una vez que
FtsZ ocupa el lugar del futuro septo, entran en accin otras
protenas Fts, formando un complejo llamado divisoma.La hiptesis
seala que los polmeros de FtsZ se van contrayendo, de modo que
tiran de las envueltas hacia el interior, provocando la tpica
invaginacin alrededor del centro del bacilo, y que simultneamente,
la FtsZ provoca la activacin de la PBP3 (=FtsI), que es una
transglucosidasa/transpeptidasa especfica del tabique
transversal.*A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo
(Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino
zonal, comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia
afuera.El proceso se puede describir as:1. En la clula adulta antes
de la divisin aparece una banda ecuatorial donde la pared celular
se hace ms gruesa.2.Debajo de esta zona engrosada (hacia el
interior del citoplasma) se va depositando nuevo material, lo que
marca el inicio de la formacin del tabique transversal. Enseguida
aparece una muesca en la banda ecuatorial.3.El tabique, con un
grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue
avanzando, hasta que...4.... se completa. Simultneamente a los
pasos 3 y 4 la zona de nueva sntesis de P.C. superficial alcanza el
ecuador de las cellas hijas nacientes.5.El tabique completo de
doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el exterior
hacia el centro, por accin de autolisinas. De esta forma se le
adjudica a cada clula hija la nueva pared correspondiente a uno de
sus polos (el otro procede, intacto, de la clula madre).*Esquema
que ilustra lo explicado en la diapositiva anterior: obsrvese las
bandas ecuatoriales engrosadas de PC, que se van separando hacia
fuera, mientras que se va sintetizando material nuevo en el
interior. En el centro se formar un tabique transversal, cuya fisin
sealar el nacimiento de las dos clulas hijas.*Mediante
procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o
parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos
las clulas bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de
pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas clulas
bacterianas que poseen restos de pared.*Obtencin. Existen dos
posibles mtodos alternativos:1.Por destruccin del entramado del PG
mediante enzimas lticas (lisozima, peptidasas). En el caso de
bacterias Gram-negativas, previamente hay que desorganizar la
membrana externa para hacerla permeable a estas enzimas. Ello se
logra usando el quelante EDTA y/o sometiendo las clulas a bajas
temperaturas.2.Por inhibicin de la formacin de nuevo PG en las
clulas en crecimiento, tratndolas p. ej., con penicilina. Si se
parte de un mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer
crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente.Estos
mtodos permiten: en el caso de Gram-positivas, la desorganizacin
total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos;en el caso
de las Gram-negativas, quedan restos de membrana externa y de
peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen
esferoplastos.*Protoplastos y esferoplastos son formas osmticamente
sensibles debido precisamente a que al no existir o estar
desorganizado parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las
fuerzas de presin osmtica existentes en los medios hipotnicos en
que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. *Por lo
tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas,
hay que obtenerlas en medios o soluciones isotnicos o ligeramente
hipertnicos, para evitar su lisis: soluciones de NaCl 0,25-0,5 M;
sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M;polietilnglicol (PEG) al 7,5%.En
estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas
esfricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria
con pared de que proceden.*Los protoplastos (a) en medios
hipotnicos el agua entra y termina lisando la clula; (b) en una
solucin isotnica, el agua no entra al protoplasto, y este permanece
estable. Recuerdas dnde acta la lisozima para desorganizar el
peptidoglucano?
*Se emplean en varios aspectos de investigacin bsica y
aplicada:mtodo suave para luego obtener extractos libres de clulas
y fracciones subcelulares.en algunas bacterias, mtodo para hacerlas
permeables al ADN, en experimentos de transformacin gentica (para
hacer ingeniera gentica, por ejemplo).para realizar fusin entre
protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso
entre especies distintas. Se trata de un mtodo de obtencin de
recombinantes somticos usado para determinados estudios genticos en
bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia
gentica.
*Son clulas bacterianas carentes total o casi totalmente de
P.C., con formas pleomrficas, irregulares y globulares, que se
producen de forma espontnea en algunas especies bacterianas (p.
ej., Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a
base de suero (que son hipertnicos).Las colonias de las formas L
naturales son muy caractersticas: en huevo frito, bifsicas.Se
pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas, tratndolas con penicilina en
medios hipertnicos.Las formas L inestables se generan por
tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma
normal con pared. Poseen algo de PG, aunque ste se encuentra
alterado respecto al PG de la clula normal.Las formas L estables se
producen por tratamientos ms prolongados, y no suelen revertir al
tipo normal. La mayora carecen totalmente de peptidoglucano.As
pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o
parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de aceptor de
nuevo PG.
