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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN
MATERIALES AVANZADOS, S.C.
DEPARTAMENTO DE ESTUDIOS DE POSGRADO
AUTOMATIZACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO
ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN
DE BISMUTO EN MUESTRAS AMBIENTALES Y
FARMACÉUTICAS
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA AMBIENTAL
Presenta:
Carlos Mauricio Calderilla Jaime
ASESORES:
Dra. Luz Olivia Leal Quezada
Dra. Jessica Avivar Cerezo
Dr. Víctor Cerdà Martín
Chihuahua, Chihuahua Febrero 2014
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................... IV
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... VI
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................... 1
RESUMEN ....................................................................................................................... 3
ABSTRACT ...................................................................................................................... 4
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
1.1 Generalidades del bismuto ................................................................................. 6
1.2 Distribución en el medio ambiente .................................................................... 7
1.3 Fuentes naturales y antropogénicas .................................................................... 9
1.4 Usos y aplicaciones ............................................................................................ 9
1.5 Toxicidad y efectos sobre la salud ................................................................... 11
1.6 Normativa ......................................................................................................... 12
CAPÍTULO 2
METODOLOGÍA ANALÍTICA
2.1 Técnicas de detección de bismuto ......................................................................... 14
2.2 Espectrofotometría UV-VIS .................................................................................. 15
2.2.1 Celda de flujo de largo paso óptico ................................................................ 17
2.2.2 Método químico y reactivos cromogénicos .................................................... 18
2.3 Técnicas de análisis en flujo.................................................................................. 21
2.3.1 Análisis por inyección en flujo multijeringa (MSFIA) ................................ 223
CAPÍTULO 3
OBJETIVOS
3.1 Objetivo general .................................................................................................... 28
3.2 Objetivos específicos............................................................................................. 28
II
CAPÍTULO 4
DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Metodología .......................................................................................................... 30
4.2 Reactivos ............................................................................................................... 32
4.3 Muestras ................................................................................................................ 32
4.3.1 Muestras farmacéuticas .................................................................................. 33
4.3.2 Muestras ambientales ..................................................................................... 35
4.3.3 Preparación de muestras ................................................................................. 36
4.4 Diseño del sistema ................................................................................................. 37
4.5 Software y configuración del sistema ................................................................... 39
4.5.1 Configuración del sistema .............................................................................. 40
4.5.2 Desarrollo del método analítico ...................................................................... 41
4.5.3 Ejecución del método ..................................................................................... 42
4.5.4 Tratamiento de datos ...................................................................................... 43
4. 6 Sistema de detección del método propuesto ........................................................ 44
4.7 Detección ICP-OES............................................................................................... 45
4.8 Procedimiento analítico ......................................................................................... 46
4.9 Diseño de experimentos ........................................................................................ 47
CAPÍTULO 5
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Pruebas preliminares ............................................................................................. 52
5.2 Montaje del sistema ............................................................................................... 53
5.3 Optimización de variables ..................................................................................... 54
5.3.1 Screening ........................................................................................................ 54
5.3.1.1 Análisis de datos del ratio ........................................................................ 57
5.3.2 Diseño central compuesto ............................................................................... 61
5.3.2.1 Análisis de datos del ratio ........................................................................ 63
5.4 Parámetros analíticos............................................................................................. 67
5.4.1 Rango lineal de trabajo y sensibilidad ............................................................ 67
5.4.2 Límite de detección ........................................................................................ 69
5.4.3 Límite de cuantificación ................................................................................. 70
5.4.4 Repetibilidad ................................................................................................... 71
III
5.4.5 Reproducibilidad ............................................................................................ 72
5.4.6 Frecuencia de análisis y de inyección ............................................................. 72
5.5 Estudio de interferencias ....................................................................................... 73
5.6 Validación de la metodología analítica y análisis de muestras farmacéuticas ...... 75
5.7 Aplicación a muestras ambientales ....................................................................... 76
5.8 Comparación con trabajos previos basados en la automatización mediante técnicas
de análisis en flujo ....................................................................................................... 77
CAPÍTULO 6
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
6.1 Conclusiones ............................................................................................................. 80
6.2 Recomendaciones ..................................................................................................... 81
CAPÍTULO 7
BIBLIOGRAFÍA
7.1 Bibliografía ............................................................................................................... 84
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies del bismuto .......................................................................................... 6
Figura 2 Estimación global de bismuto en base a reservas del año 2009 ......................... 8
Figura 3 Funcionamiento de la celda de núcleo líquido (LWCC) .................................. 18
Figura 4 Molécula de azul de metiltimol en 2D y 3D ..................................................... 19
Figura 5 Mecanismo de reacción .................................................................................... 20
Figura 6 Complejo Bi-MTB............................................................................................ 20
Figura 7 Módulo MSFIA ................................................................................................ 24
Figura 8 Movimientos de las jeringas en MSFIA ........................................................... 25
Figura 9 Salidas traseras del módulo MSFIA ................................................................. 26
Figura 10 Válvula solenoide externa. ............................................................................. 26
Figura 11 Plataforma protectora de las válvulas ............................................................. 26
Figura 12 Secuencia de pasos de la metodología............................................................ 30
Figura 13 Muestra farmacéutica: Synalar Rectal (Pomada 30 g) ................................... 33
Figura 14 Muestra farmacéutica: Labcatal (20 ampolletas de 1ml) ............................... 34
Figura 15 Muestra farmacéutica: Gastrodenol (50 comprimidos) .................................. 35
Figura 16 Localización de los pozos ............................................................................... 35
Figura 17 Dibujo esquemático del método propuesto.. .................................................. 39
Figura 18 AutoAnalysis: Configuración del sistema ...................................................... 41
Figura 19 AutoAnalysis: Método analítico ..................................................................... 42
Figura 20 AutoAnalysis: Ejecución del método ............................................................. 43
Figura 21 AutoAnalysis: Fiagrama de señales analíticas ............................................... 44
Figura 22 Sistema de detección utilizado para el método propuesto .............................. 45
Figura 23 Materiales utilizados en la optimización de variables .................................... 48
V
Figura 24 Elección de la longitud de onda de absorción del complejo MTB-Bi ............ 52
Figura 25 Montaje del método propuesto ....................................................................... 54
Figura 26 Diagrama de pareto de los efectos de las variables y sus interacciones ......... 59
Figura 27 a) Gráfica de los valores observados contra los valores teóricos estimados; b)
Histograma de residuales ................................................................................. 60
Figura 28 Función desirability para las respuestas del screening ................................... 61
Figura 29 a) Gráfica de los valores observados contra los valores teóricos estimados; b)
Histograma de residuales ................................................................................. 65
Figura 30 Función desirability para las respuestas del diseño central compuesto .......... 66
Figura 31 Curva de calibración de rango lineal de trabajo ............................................. 69
VI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Propiedades físicas y químicas del bismuto ........................................................ 7
Tabla 2 Límites de detección de bismuto en técnicas analíticas ..................................... 15
Tabla 3 Método de digestión para muestras farmacéuticas ............................................ 36
Tabla 4 Condiciones del ICP-OES ................................................................................. 46
Tabla 5 Procedimiento analítico del método desarrollado .............................................. 47
Tabla 6 Absorción del complejo con MTB en medio acuoso y con PVP a dos diferentes
longitudes de onda ........................................................................................................ 53
Tabla 7 Valores de los rangos establecidos para el screening ........................................ 55
Tabla 8 Experimentos de screening expresados en valores codificados......................... 56
Tabla 9 Valores de la respuesta de los experimentos del screening ............................... 57
Tabla 10 Comparación entre modelos de screening ....................................................... 58
Tabla 11 Tabla de ANOVA del modelo de ajuste 3-way ............................................... 58
Tabla 12 Rangos de las variables para el diseño central compuesto .............................. 62
Tabla 13 Experimentos del diseño central compuesto para 4 variables ......................... 62
Tabla 14 Valores de la respuesta de los experimentos del diseño central compuesto .... 63
Tabla 15 Comparación entre modelos del diseño central compuesto ............................. 64
Tabla 16 Tabla de ANOVA del modelo Lineal /Cuadrático con efectos principales + 2
way aplicado a las respuestas del método propuesto ....................................... 64
Tabla 17 Valores óptimos de las variables estudiadas. ................................................... 67
Tabla 18 Datos de curva de calibrado del rango lineal ................................................... 68
Tabla 19 Señales analíticas de blancos para el cálculo de LOD .................................... 70
Tabla 20 Datos para el cálculo de la repetibilidad .......................................................... 71
Tabla 21 Datos para el cálculo de la reproducibilidad .................................................... 72
VII
Tabla 22 Parámetros analíticos del método propuesto ................................................... 73
Tabla 23 Resultados del análisis de muestras farmacéuticas .......................................... 76
Tabla 24 Resultados de concentración de bismuto en muestras de agua de pozo .......... 77
Tabla 25 Métodos automatizados para la determinación de bismuto con detección
espectrofotométrica .......................................................................................... 78
VIII
1
AGRADECIMIENTOS
Durante el desarrollo de este trabajo se recibieron diversos apoyos tanto morales como
económicos, por ello en este apartado se agradece principalmente:
A mi familia por el apoyo incondicional que me ha otorgado hacia mi persona, para
culminar mis estudios de manera satisfactoria.
A mis asesores por sus conocimientos transmitidos y su apoyo vocacional durante el
desarrollo de mis estudios de maestría.
A CIMAV por el apoyo económico y administrativo que se requirió durante mis estudios
y mi estancia en el extranjero.
A CONACYT por el apoyo económico a través de mi beca nacional para la realización
de mi maestría y del otorgamiento de una beca mixta para la realización de mi estancia en
el extranjero
Al grupo de investigación por su apoyo en el desarrollo de este trabajo.
2
3
RESUMEN
En este proyecto de investigación se presenta un método automático espectrofotométrico
para la determinación de bismuto en muestras ambientales (agua de pozo) y
farmacéuticas. El fundamento químico está basado en la reacción colorimétrica entre el
azul de metiltimol (MTB) y el bismuto en presencia de polivinilpirrolidona (PVP) en
medio ácido. Este método se ha automatizado utilizando el análisis por inyección en flujo
multijeringa (MSFIA), que se utiliza como sistema de impulsión de líquidos. El sistema
MSFIA se ha acoplado a una celda de flujo de largo paso óptico, con la finalidad de bajar
los límites de detección. Los parámetros que influyen en la señal analítica se han
optimizado mediante un diseño multi-variable.
Las cifras más relevantes atribuibles al método propuesto son un rango lineal amplio de
1.5-600 μg L-1
, un bajo límite de detección de 1.5 μg L-1
, una buena precisión de 1.4%,
expresada como RSD (desviación estándar relativa), y una alta frecuencia de análisis de
30 inyecciones/hora. La metodología propuesta se ha validado con éxito analizando
muestras de referencia, es decir, muestras farmacéuticas de concentración conocida, tanto
con el método propuesto como con la espectrometría de emisión óptica con plasma de
acoplamiento inductivo (ICP-OES). El método desarrollado también se ha aplicado a
muestras ambientales, específicamente a muestras de agua de pozo, utilizando la técnica
de la adición de estándar, para validar los resultados en esta matriz. Las recuperaciones
logradas están en el rango de 90-98%.
Una de las ventajas del método automatizado desarrollado en este proyecto es la
miniaturización, lo que permite su utilización “in situ” en el control de procesos o en
mediciones de campo. Por otra parte, es una metodología más económica y amigable con
el medio ambiente en comparación con métodos existentes para la determinación de
bismuto.
4
ABSTRACT
In this research project an automated method for bismuth determination in
pharmaceuticals and environmental samples (well water) is presented. This method is
based on the colorimetric reaction of bismuth and methylthymol blue (MTB) in the
presence of polyvinylpyrrolodone (PVP) in acid medium. This method has been
automated exploiting the multisyringe flow injection analysis technique (MSFIA), which
is used as liquid driver. The MSFIA system has been coupled to a long path length
capillary flow cell in order to improve the sensitivity of the developed system. Parameters
affecting the analytical response where optimized by multivariate experimental design.
Most relevant figures of merit of the developed method are a wide linear working range
of 1.5-600 μg L-1
, a low detection limit of 1.5 μg L-1
, a good precision of 1.4 % expressed
as RSD (relative standard deviation) and a high injection throughput of 30
injections/hour. The methodology was successfully validated by analyzing reference
samples, i.e. pharmaceutical samples with a known concentration of bismuth with the
proposed system and also by means of inductively coupled plasma-optical emission
spectrometry (ICP-OES). The developed method was also applied to environmental
samples, specifically to well water samples, spiking them with known amounts of Bi to
validate the applicability in this matrix. Recoveries of 90-98% were achieved.
One of the main advantages of the developed automated method is the miniaturization
achieved, which allows its in-situ utilization in control processes and in field
measurements. Moreover, a more economically and environmentally friendly
methodology in comparison with previous methods for Bi determination was
accomplished.
5
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
En este capítulo se presentan las características generales del bismuto, nuestro analito de
interés, se introducen los aspectos generales de este elemento químico, tales como sus
aplicaciones, usos, normatividad, toxicidad, entre otros, que nos brindarán una visión
amplia de la justificación de la elección de dicho elemento para este trabajo.
6
1.1 Generalidades del bismuto
El significado de la palabra bismuto se relaciona con la palabra alemana Weissmuth o
sustancia blanca. El bismuto es un elemento químico con número atómico 83 y masa
atómica de 208.98, perteneciente al grupo 15 de la tabla periódica, junto con el arsénico,
antimonio, fósforo y nitrógeno. Este grupo comparte la característica de tener números de
oxidación de +3 y +5, que son los principales para bismuto, aunque el estado de
oxidación más estable es +3. Este elemento tiene la más baja electronegatividad de su
grupo periódico. Según la escala Allred-Rochow debe ser considerado, junto con el
antimonio, como metálico, pero de acuerdo con la escala de Pauling ambos se colocarían
en la banda de los metaloides.
El bismuto se encuentra en la naturaleza como 209
Bi con un porcentaje del 100%
de abundancia. El comportamiento de las especies de bismuto respecto al potencial de
hidrógeno se muestra en la Figura 1, donde se puede observar que en medios ácidos se
favorece al Bi+3
y se comprueba que las especies más abundantes en diferentes medios
son derivados del bismuto con carga +3. Se considera al bismuto como el elemento
pesado más estable de la tabla periódica.
Figura 1. Especies del bismuto
Las propiedades físicas y químicas del analito de interés se resumen en la Tabla 1.
7
Tabla 1. Propiedades físicas y químicas del bismuto
Propiedades físicas
Estado Sólido
Densidad 9747 Kg/m3 (293K)
Punto de fusión 544.5 K
Punto de ebullición 1833 K
Entalpía de fusión 10.48 kJ mol-1
Entalpía de vaporización 179.1 kJ mol-1
(298.15 K)
Propiedades químicas
Afinidad electrónica 91.3 kJ mol-1
Radio medio 160 pm
Electronegatividad 2.02 Escala Pauling
Radio covalente 146 pm
(Carmalt & Norman, 1998)
El bismuto tiene una configuración electrónica de [Xe] 4 f 14
5 d 10
6 s 2 6 p
3. La
mayoría de los compuestos de bismuto son relativamente no tóxicos, fáciles de manejar y
pueden tolerar pequeñas cantidades de humedad (Leonard, et al., 2002).
1.2 Distribución en el medio ambiente
La abundancia natural estimada del bismuto es de 0.2 partes por millón (ppm, mg L-1
). En
la corteza terrestre, el bismuto ocupa el lugar 69 de abundancia. La estimación de las
reservas de bismuto en el mundo se basa en los recursos disponibles de plomo, ya que el
bismuto es un subproducto de la producción de este elemento. La estimación de reservas
de bismuto en el mundo en 2009 se muestra en la Figura 2 (Yang & Sun, 2011).
8
Figura 2. Estimación global de bismuto en base a reservas del año 2009
La concentración de trazas de bismuto en muestras ambientales se ha incrementado,
por lo que se requiere acertar en los niveles de migración e impactos en el ambiente.
Usualmente los niveles de bismuto en las matrices ambientales se encuentran en niveles
de partes por millón (ppm) o partes por billón (ppb). En el suelo las concentraciones
usualmente se mantienen alrededor de 1 µg g-1
, pero en algunos casos, cuando se tiene
contaminación estos valores aumentan. En el caso de los sedimentos el rango de
concentraciones de bismuto es de 0.07 - 49.6 µg g-1 (Das, et al., 2006). En muestras
geológicas, como rocas de silicato, el contenido de bismuto en la mayoría de los casos es
inferior a 1 mg g-1
.
En carbón se han encontrado muestras que contienen más de 1 mg g -1
de bismuto, lo
que indica que, en la quema de carbón, el bismuto puede ser distribuido en las cenizas
volantes y las cenizas del fondo (Moscoso, et al., 2003).
En minerales, los de plomo y bismuto van relacionados en la corteza terrestre.
Muestras de mineral de plomo tienen una alta concentración de bismuto
(aproximadamente 16 g g-1
). En las hojas de té la concentración de bismuto es
aproximadamente 0.26 mg g-1
. En los alimentos, el contenido típico de bismuto anda en
niveles de ng g-1
, pero, en algunos alimentos procedentes de China y Turquía, el nivel
puede ser mayor (Das, et al., 2006).
China
69%
Perú
6%
Canadá
4%
Bolivia
3%
México
3%
Estados
Unidos
2%
Kasajistán
3% Otros
países
11%
9
1.3 Fuentes naturales y antropogénicas
El bismuto en la corteza terrestre se encuentra en forma de mineral, como es el caso de la
bismutita [(BiO)2CO3], el sulfuro de bismuto (Bi2S3) y el ocre de bismuto [α-Bi2O3]. Su
mineral más común es el sulfuro de bismuto y se encuentra con o sin sus productos de
oxidación, ocre de bismuto o bismutita, respectivamente. El bismuto se puede encontrar
dentro de los minerales de otros metales como, oro, plata, plomo, zinc y tungsteno.
Existen otros minerales de bismuto que se encuentran en asociación con depósitos de oro
y bismuto en China, entre ellos se incluyen al bismuto elemental, montanita (Bi2TeO6 ·
2H2O), pavonita (AgBi3S5) y Bi7Te3 (Kyle, et al., 2011 ).
Las erupciones volcánicas son fuentes naturales de bismuto, y de hecho este elemento
puede ser tomado como trazador de erupciones volcánicas, ya que en éstas se emiten
grandes cantidades de bismuto en la forma química de Bi2O3 (Ferrari, et al., 2000).
Existen estudios que demuestran que probablemente las actividades humanas han
modificado de forma sustancial a gran escala el ciclo atmosférico del bismuto. Las
fuentes antropogénicas que pueden ser consideradas para la modificación de dicho ciclo,
son la incineración de basura, la fabricación de aleaciones de hierro-manganeso, la
metalurgia de aluminio y de plata, así como la minería y fundición de plomo (Ferrari, et
al., 2000). El bismuto, en conjunto con el plomo, también es un subproducto de la
producción de estaño, cobre y zinc. (Yang & Sun, 2011).
1.4 Usos y aplicaciones
Los compuestos de bismuto y sus aleaciones se pueden encontrar en varias aplicaciones
comerciales, entre ellas en la producción de grasa lubricante, productos químicos,
catalizadores, cosméticos, balas, sistemas de rociado contra incendio, soldaduras,
materiales termoeléctricos, pigmentos, medicinas, aceros maleables, carriers para
U235
/U233
, accesorios para pesca, etc.
10
Dentro de las aplicaciones del bismuto destacan la sustitución del plomo en la
industria manufacturera, debido a la similitud de características entre ambos elementos.
Además el bismuto es un metal mucho menos tóxico para los organismos vivos. Por ello
se ha acrecentado la sustitución del plomo, ya que se están resolviendo problemas
ambientales por contaminación de elementos pesados tóxicos. Otra aplicación en el área
química del bismuto es en la síntesis de compuestos orgánicos (Leonard, et al., 2002).
Otro de los usos principales del bismuto es en la medicina, datando el primer
reporte del uso del bismuto como medicamento en 1786, por Louis Odier para el
tratamiento de dispepsia. En la actualidad, basados en características ya conocidas de este
elemento, se han sintetizado y desarrollado compuestos de dicho elemento como
medicamentos para tratamientos de diversas enfermedades. Se han usado como agentes
antimicrobianos y agentes antitumorales. Los compuestos de bismuto se han usado
ampliamente en los tratamientos de infecciones microbianas, tales como la sífilis. En este
último caso se ha recomendado el tartrato de bismuto sodio/potasio, yoduro quinina
bismuto, iodobismutol y cloruro de bismuto. Para la colitis se sugiere utilizar el subnitrato
de bismuto o citrato de bismuto, en cambio para las infecciones en heridas se utiliza oxido
de bismuto. Para malaria se usa tioglicolato de sodio-bismuto. Los compuestos de
subsalicilato de bismuto y subnitrato de bismuto se han utilizado para diarrea, dispepsia y
úlceras pépticas. El tiolato de bismuto y complejos de oxina han demostrado actividades
anti-tumorales en concentraciones micromolares. Recientemente, se ha descubierto que el
bismuto tiene un efecto severo en la inhibición del síndrome respiratorio agudo del
coronavirus.
Otra aportación reciente es que los isótopos radiactivos 212
Bi y 213
Bi pueden tener un
potencial como agentes terapéuticos de pequeños tumores, con el único inconveniente de
que ambos isótopos tienen una serie de decaimiento ramificada, que resulta en emisiones
de partículas α/β (Yang & Sun, 2011).
11
1.5 Toxicidad y efectos sobre la salud
El aumento del uso del bismuto ha contribuido a la distribución de este elemento en el
medio ambiente, por lo tanto se ha provocado un incremento en la exposición de los
organismos vivos a dicho elemento en diferentes matrices. Algunos autores consideran
que las trazas de bismuto tienen una función fisiológica conocida, pero la Organización
de Agricultura y Alimentación (FAO) y Organización Mundial de la Salud (OMS) no
consideran al bismuto un elemento esencial (Das, et al., 2006).
El bismuto es un elemento considerado no tóxico, lo que representa un contraste
significativo con los elementos ubicados cercanos al bismuto en la tabla periódica, tales
como el arsénico, antimonio, plomo y estaño, que son altamente tóxicos (Leonard, et al.,
2002). Sin embargo, el bismuto tiene asociada una dosis letal para un adulto de 70 kg de
15 g. Esto remarca que a largo plazo el uso del bismuto tendrá varios efectos secundarios
e incluso tóxicos para los seres humanos. Son pocos los casos de exposición ocupacional
de bismuto, y la mayoría de los casos de intoxicación son debidos a casos accidentales o
acciones deliberadas, como sobredosificaciones de medicamentos que contienen este
elemento (Yang & Sun, 2011).
Los compuestos del bismuto son poco absorbidos, además de ser considerados de
baja toxicidad. En exposición crónica, el bismuto puede ser almacenado en las células
epiteliales, provocando alteraciones en el citoplasma. Después de ser absorbido, el
bismuto es transportado a través del suero humano por la enzima transferrina, entregado a
las células y excretado por la vía urinaria. Sin embargo, varios efectos tóxicos en los seres
humanos y algunos animales son atribuidos a los compuestos del bismuto, tales como
afecciones en las articulaciones, sistema óseo, hepatitis, afecciones en el sistema
nervioso, encéfalo y toxicidad para los riñones (Cadore, et al., 1998).
12
1.6 Normativa
De acuerdo a las aplicaciones del bismuto, se le brinda una característica de elemento
verde, por lo cual las entidades de regulación ambiental no contemplan normativas para el
contenido de bismuto en cualquiera de las matrices ambientales. Sin embargo, retomando
lo anterior, se requiere una normatividad a corto o mediano plazo para la regulación del
bismuto, debido al aumento considerable de su uso y a la exposición del ser humano a
este elemento.
13
CAPÍTULO 2
METODOLOGÍA ANALÍTICA
Existen diversas metodologías analíticas para la determinación de elementos traza. En
este apartado se revisan las diferentes alternativas para la determinación de bismuto, a la
vez que se describe la metodología analítica seleccionada.
14
2.1 Técnicas de detección de bismuto
Existen actualmente numerosas técnicas para determinación de elementos traza. En el
caso específico del bismuto se han utilizado, entre otras, las técnicas de espectrometría
atómica, siendo la espectrometría de absorción atómica electrotérmica la más utilizada, en
comparación con técnicas como la absorción atómica de llama (FAAS), la absorción
atómica con generación de hidruros (HG-AAS), y la espectrometría de fluorescencia
atómica, que se utilizan muy poco en la determinación de bismuto, específicamente en
muestras ambientales.
La espectrometría de absorción atómica electrotérmica (ET-AAS), a pesar de ser
muy utilizada, depende de la composición del material a ser analizado, requiriendo la
separación de la matriz para la determinación de bismuto debido a los efectos de
interferencias y para mejorar la vida útil del tubo de grafito (Schwingel, et al., 2002).
En cuanto a la espectrofotometría UV-Vis, se ha empezado a utilizar en la
determinación de elementos traza incluyendo el bismuto, debido a los actuales accesorios
ópticos que actualmente se acoplan al instrumento para poder bajar los límites de
detección.
Se ha incrementado el uso de la espectrometría utilizando el plasma de
acoplamiento inductivo (ICP-OES e ICP-MS). La técnica ICP-OES (Moyano, et al.,
2001; Suna & Wub, 2011), es de las técnicas más utilizadas para determinar bismuto
debido a sus bajos límites de detección. La determinación de bismuto con estas técnicas
se ha realizado para diferentes tipos de matrices, tales como agua, suelos, rocas, plantas,
muestras biológicas (orina), productos farmacéuticos, metales, etc. (Das, et al., 2006).
En la Tabla 2 se muestran los límites de detección de algunas técnicas
espectrométricas utilizadas en el Centro de Investigación de Materiales Avanzados S.C.
(CIMAV). Esta información no es general, sino específica de cada instrumento
disponible. La finalidad de esta tabla es visualizar el reto de este trabajo, que consiste en
bajar los límites de detección de la espectrofotometría ultravioleta visible acoplando una
celda de flujo de largo paso óptico.
15
Tabla 2. Límites de detección de bismuto en técnicas analíticas
Método Límite de detección
μg L-1
FAAS 500
GF-AAS 1
HG-AFS 2
ICP-OES 10
ICP-MS 0.005
Espectrofotometría UV-VIS 250
2.2 Espectrofotometría UV-VIS
La espectrofotometría UV-VIS ha sido empleada ampliamente en diferentes ámbitos
científicos, especialmente en química analítica y bioquímica, debido a su simplicidad,
flexibilidad y bajo costo. Se han utilizado métodos espectrofotométricos en métodos
oficiales y métodos estándar de análisis. Sin embargo, en la actualidad se tiene la
necesidad de reducir las cantidades de muestra y/o reactivos necesarios para llevar a cabo
una medición analítica, especialmente cuando las muestras son escasas o existe el empleo
de disolventes orgánicos tóxicos. Todo esto ha promovido el desarrollo de
instrumentación de espectrofotometría de microvolumen.
Dentro de las aplicaciones de la espectrofotometría se encuentra la de cuantificar
un analito de interés basándose en la ley de Lambert-Beer, que relaciona la absorbancia
(A), la absortividad molar (ε), la concentración (c) y la longitud del camino óptico(b), éste
último basado en la longitud de la celda donde se coloca la muestra. Para que la ley de
Lambert-Beer se cumpla, el valor de la absorbancia medida no debe exceder de 1.5, ya
que a partir de ahí el error cometido en las determinaciones no es asumible (Harris, 2007).
La ley de Lambert-Beer se expresa en la ecuación 2.1
A =εbc Ec. 2.1
16
Por otro lado, la miniaturización de los sistemas desarrollados para la preparación,
separación y detección de la muestra constituye una clara tendencia en la química
analítica. La integración de las diferentes etapas analíticas, la fiabilidad, la portabilidad y
la facilidad de operación pueden ser considerados los principales factores para el
desarrollo de dispositivos miniaturizados de análisis. Los avances en espectrofotometría
de microvolumen UV-VIS se derivan principalmente de los esfuerzos para miniaturizar el
compartimento de la muestra. Sin embargo, no hay que olvidar que estos avances también
se han acompañado de mejoras en las fuentes de radiación, detectores y el uso extendido
de la fibra óptica (Pena-Pereira, et al., 2011).
La espectrofotometría es también la técnica de detección más común en los
sistemas de análisis de flujo, sin embargo, los límites de detección obtenidos mediante
métodos espectrofotométricos no pueden llegar a los niveles necesarios para algunas
aplicaciones analíticas. Retomando lo anterior, se han buscado diferentes estrategias que
se puedan aplicar al análisis espectrofotométrico de flujo con el propósito de mejorar la
sensibilidad y el límite de detección.
Si se toma en cuenta la ley de Lambert-Beer, el valor de absorbancia detectada
para una concentración dada de analito depende del valor de la absortividad molecular del
compuesto y de la longitud de trayectoria de la muestra en la celda. Por lo tanto, una
manera de aumentar la sensibilidad es formar productos de reacción con mayor
absortividad molecular.
Otra alternativa para mejorar la sensibilidad de la espectrofotometría UV-Vis es la
preconcentración del analito previo a su detección, por ejemplo con extracción en fase
sólida (SPE). Además, la separación del analito de la matriz también mejora la
selectividad del método, aunque se necesitan principalmente disolventes orgánicos para la
elución y los efluentes producidos pueden ser tóxicos y/o peligrosos. El rendimiento de la
muestra se reduce notablemente si el soporte físico (la fase sólida) se reutiliza, así como
la elución total del analito por lo que se necesita un reacondicionamiento de la columna
(Páscoa, et al., 2012).
El aumento en la longitud del camino óptico es un enfoque alternativo atractivo
para mejorar la sensibilidad de los métodos espectrofotométricos. Esta opción fue la que
17
se eligió para este trabajo, y se describe en el siguiente apartado. El aumento de la
longitud del camino óptico se logra con la utilización de una celda de flujo de largo paso
óptico.
2.2.1 Celda de flujo de largo paso óptico
En los últimos años, la celda de flujo de largo paso óptico (LWCC- Liquid Waveguide
Capillary Cell) ha desempeñado un papel importante en la medición de especies químicas
a concentraciones nanomolares. Estos dispositivos LWCC aumentan la sensibilidad de los
instrumentos ópticos, detectando al máximo la señal óptica y minimizando al mismo
tiempo el ruido de fondo. Se basan en que la luz introducida en el capilar es totalmente
reflejada a través del mismo hacia el detector, esto es debido a que el índice de refracción
del tubo capilar es menor que el índice de refracción del núcleo líquido (el líquido
contenido en ellas, en este caso de disoluciones acuosas) (Gimbert & Worsfold, 2007).
El capilar puede medir hasta 5m de longitud, pero al ser de teflón puede
enrollarse, minimizando así el espacio requerido. Se ha utilizado con una amplia gama de
técnicas de detección diferentes, incluyendo la espectrofotometría, fluorescencia,
quimioluminiscencia y espectrometría Raman, y su aplicación se ha centrado en matrices
ambientales (Dallas & Dasgupta, 2004).
La celda de flujo de largo paso óptico puede ser utilizada en sistemas autónomos
de inyección, incorporada a un sistema en flujo como sensor de gas, debido a su alta
permeabilidad a gases y puede ser acoplada a las técnicas antes mencionadas (Gimbert &
Worsfold, 2007).
Las celdas de flujo de largo paso óptico se pueden clasificar en dos tipos tomando
en cuenta su construcción, tipo I y tipo II. El tipo I se compone de sólidos tubos de teflón
AF con bajo índice de refracción. La luz viaja por el capilar y se refleja totalmente en el
interior de la interfaz de teflón AF, con la condición de que el ángulo de incidencia supere
el ángulo crítico, la luz pasa desde un medio más denso ópticamente (agua) a la interfaz
con el medio menos denso (teflón AF). La célula de tipo II consiste en un tubo capilar de
18
sílice fundida (n1 = 1,46) con un recubrimiento exterior de teflón AF con bajo índice de
refracción. La luz viaja por el capilar y se refleja totalmente de manera interna en la
interfaz entre el capilar de sílice fundida de su superficie exterior y el revestimiento de
teflón AF con la misma condición mencionada anteriormente (Páscoa, et al., 2012) .
D'Sá y Steward (2001) demostraron que en ausencia de imperfecciones en el
capilar de cuarzo o de dispersión de partículas en las soluciones, la luz no puede ser
atrapada en la guía de ondas de cuarzo de la pared, ya que siempre habrá una reflexión
interna total en el cuarzo / interfaz de teflón. La luz reflejada de vuelta a la interfaz agua /
cuarzo volverá a entrar en el medio principal de nuevo. En la Figura 3 se puede observar
cómo viaja la luz a través de la celda de flujo de largo paso óptico (D'sá & Steward,
2001).
Figura 3. Funcionamiento de la celda de núcleo líquido (LWCC)
2.2.2 Método químico y reactivos cromogénicos
El uso de la espectrofotometría ultravioleta-visible generalmente requiere una reacción
colorimétrica para la determinación de elementos traza. Existen diferentes reactivos
cromogénicos que pueden complejar al analito de interés, en la reacción de dicho
complejo se puede formar un color que beneficia su detección.
En el caso del bismuto existen diferentes reactivos cromogénicos, tales como el
azul de metiltimol (Tzanavaras, et al., 2004), naranja de xilenol (Jerónimo, et al., 2004),
Fuente de luz
n
n
n Núcleo líquido
Capilarrar
Capilar
Espectrofotómetro
19
ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (González-Portal, et al., 1985),
tetrametilenditiocarbamato de plomo (Szpunar, 1991), entre otros.
Para el método propuesto se eligió el azul de metiltimol, ya que es de los que
actualmente se están utilizando en la determinación de bismuto, junto con el naranja de
xilenol, debido a su afinidad estructural y química.
El azul de metiltimol es de color amarillo en medio ácido y azul o morado en el
rango de pH entre 5.4-11. Pertenece al grupo de los reactivos con grupos ácidos
iminodiacéticos, como es el caso del complejante EDTA. Este reactivo se ha utilizado
para diversos iones, que se pueden observar en el apartado 5.5 (estudio de interferencias)
del capítulo de resultados. Este reactivo tiene afinidad por iones de alta carga. Su fórmula
estructural en 2D y 3D se muestra en la Figura 4.
Figura 4. Molécula de azul de metiltimol en 2D y 3D
Como se puede observar en la Figura 4, el azul de metiltimol tienes dos grupos
ácidos en los extremos, lo que permite que en ciertas condiciones forme complejos de
relación 1:1 o 2:1 respecto al átomo que reacciona con la molécula.
El bismuto reacciona con el azul de metiltimol en condiciones ácidas, pudiendo
formar complejos de estequiometría 1:1 o 2:1 en función de la cantidad de analito,
20
dependiendo de la concentración de éste y del reactivo (Tzanavaras, et al., 2004). El
complejo bismuto-MTB es de color rojo –violeta.
El mecanismo de reacción del método propuesto se basa en una reacción de
sustitución, ya que el reactivo utilizado está estabilizado con sal sódica, por lo cual el
bismuto ataca los grupos ácidos de la molécula uniéndose a los átomos de oxígeno. En la
Figura 5 se identifica la posición donde se lleva a cabo la reacción y en la Figura 6 se
muestra el complejo formado entre el azul de metiltimol y el bismuto en relación 1:1.
Bi3+
Figura 5. Mecanismo de reacción
Figura 6. Complejo Bi-MTB
En la determinación de bismuto con azul de metiltimol se puede adicionar
polivinilpirrolidona (PVP) para aumentar la solubilidad del reactivo en medio acuoso y
producir un efecto batocrómico, es decir, desplazar el máximo de absorción hacia
21
longitudes de onda mayores, debido al aumento de polaridad del medio (Hernandéz, et
al., 1987).
2.3 Técnicas de análisis en flujo
En las últimas décadas se han desarrollado nuevas metodologías analíticas con el objeto
de realizar una vigilancia y control continuo de un gran número de parámetros
ambientales que permitan obtener resultados fiables, seguros y económicos, de un gran
número de muestras en un lapso de tiempo pequeño. Los analistas en ciertas ocasiones se
enfrentan a un elevado número de muestras que requieren ser analizadas con cierta
brevedad, lo cual requiere métodos que representen un mínimo consumo de tiempo por
parte del usuario, tales como los métodos automáticos de análisis en flujo.
Las técnicas en flujo tienen dos finalidades principales, automatizar las
metodologías analíticas y, en mayor medida, automatizar los tratamientos previos de las
muestras, ya que son los pasos que consumen mayor tiempo y reactivos. El uso de las
técnicas de análisis en flujo permite el desarrollo de métodos total o parcialmente
automatizados, en función de los pasos del protocolo analítico desarrollado. En cualquier
caso, se alcanzan una serie de ventajas como la reducción al mínimo de la manipulación
de la muestra por parte del analista, evitando la contaminación de ésta y salvaguardando
la seguridad del analista, así como la reducción del consumo de muestras y reactivos y
por tanto la generación de residuos. También se mejora la reproducibilidad y se consigue
una disminución significativa del tiempo y coste por análisis.
Las técnicas de flujo surgieron en la década de los 50, con el análisis en Flujo
Segmentado (Segmented Flow Analysis - SFA). Desde entonces han ido evolucionando,
desarrollándose entre otras: el Análisis por Inyección en Flujo (Flow Injection Analysis -
FIA), Análisis por Inyección Secuencial (Sequential Injection Analysis - SIA), Análisis
por Inyección en Flujo Multiconmutado (Multicommuted Flow Injection Analysis -
MCFIA), Análisis por Inyección en Flujo Multijeringa (Multisyringe Flow Injection
Analysis - MSFIA), Lab-on-valve (LOV), y el Sistema en Flujo Multibomba
(Multipumping Flow Systems - MPFS). Los componentes básicos de los sistemas de
análisis en flujo son un módulo de impulsión del líquido (bombas peristálticas, bombas de
22
pistón bidireccional o micro-bombas) y un conjunto de tubos de plástico o manifold que
conduce los líquidos hacia el detector con una célula de flujo. Estos métodos se basan en
la introducción de la muestra en una tubería de pequeño diámetro a la que se le agregan
los reactivos y luego se conducen al detector para realizar la medición que permita
determinar la concentración de la especie de interés. El orden de adición de la muestra y
los reactivos, así como el tiempo de reacción y el caudal, se controlan automáticamente
permitiendo una repetitividad de la señal analítica y una frecuencia de muestreo elevadas.
La propiedad de interés (absorbancia, fluorescencia, potencial, etc.) se registra
continuamente mediante un sistema de detección adecuado, que produce una señal
transitoria en forma rectangular o de pico, cuyas características (altura o área del pico) se
relacionan con la concentración del analito en la muestra (Cerdà, 2006).
A continuación se describen brevemente cada una de las técnicas en flujo.
En 1957, Skeggs propuso el análisis de flujo segmentado (SFA). Si bien se habían
propuesto algunas técnicas precedentes, se considera que el SFA es la primera técnica en
flujo digna de mencionarse como tal. El SFA consiste en un método de flujo automático
continuo donde las muestras aspiradas son segmentadas inyectando burbujas de aire, que
deben ser eliminadas previamente a la entrada al detector. Con la aparición de nuevas
técnicas en flujo, el SFA quedó relegado por sus bajas ventajas analíticas en comparación
a las nuevas técnicas (Cerdá, et al., 1999).
En 1975 aparece la técnica conocida como FIA (análisis por inyección en flujo),
propuesta por J. Ruzicka y E. H. Hansen, que está constituida por una bomba peristáltica
capaz de impulsar la muestra y los reactivos, y un conjunto de tubos que conducen los
líquidos (manifold). Además, cuenta con una válvula de inyección que permite intercalar
un volumen de muestra en la corriente del líquido portador. Proporciona ventajas frente a
SFA tales como la reducción en la cantidad de reactivos, una mayor versatilidad,
construcción fácil y más económica (Ruzicka & Hansen, 1988).
En 1990, J. Ruzicka y G. Marshall desarrollaron la técnica SIA (análisis por
inyección secuencial). El SIA está constituido por una válvula de selección cuyo puerto
central está conectado a una bomba de pistón bidireccional y a varios puertos laterales.
Los puertos laterales pueden ser conectados a los reservorios de los reactivos, a la
23
muestra, al detector y a otras válvulas de selección. Esta técnica es la primera que
requiere ser manejada por medio del ordenador. Dentro de las ventajas que brinda el SIA
destaca su gran capacidad para el análisis multiparamétrico, la reducción del uso de
reactivos y muestra, ya que éstos son inyectados sólo cuando son requeridos, así como su
gran robustez y flexibilidad debido al uso del ordenador (Ruzicka & Marshall, 1990).
Reis, et al.[1994] propusieron la técnica MCFIA (análisis por inyección en flujo
multiconmutado), basada en la utilización de válvulas solenoides de tres vías de
conmutación rápida. Como sistema de propulsión de líquidos se utilizan generalmente
bombas peristálticas. Esta técnica brinda ventajas como alta frecuencia de análisis y bajo
consumo de reactivos.
En 1999 se desarrolló la técnica MSFIA (análisis por inyección en flujo
multijeringa) (Cerdà & Pons, 2006). Esta técnica se describe ampliamente en el siguiente
apartado, ya que fue la técnica en flujo utilizada para automatizar la determinación de
bismuto en el presente trabajo.
En 2002 aparece la técnica MPFS (sistema en flujo multibomba), propuesto por
Lapa et al. [2002], que se basa en la utilización de bombas solenoides de pistón, en donde
el movimiento del pistón significa la impulsión de un volumen predeterminado de
líquido. Las bombas solenoides actúan simultáneamente como impulsoras de líquidos y
como válvulas para direccionar los líquidos.
Con el paso del tiempo han aparecido variaciones a estas técnicas tales como el
LOV [Lab-on valve ; (Ruzicka, 2000)] y el Chip on valve (Cerdà, 2006).
2.3.1 Análisis por inyección en flujo multijeringa (MSFIA)
Esta técnica fue desarrollada y propuesta en 1999 por Cerdà et al., del grupo de Química
Analítica, Automatización y Medio Ambiente del departamento de Química de la
Universidad de las Islas Baleares (UIB). De esta técnica se destaca que es una de las más
versátiles, ya que reúne características beneficiosas de sus antecesoras, tales como la alta
24
frecuencia de inyección del FIA, la robustez, el bajo consumo de reactivos y la
versatilidad de la técnica SIA, así como la simplicidad y el uso de válvulas solenoides de
conmutación introducidas con la técnica MCFIA. Todas estas ventajas justifican el uso de
ella para la automatización del método propuesto.
Cada módulo multijeringa (Figura 7) puede equiparse con 4 jeringas, cuyos
pistones están fijados a una barra, y a la cabeza de cada una de las jeringas hay una
válvula solenoide de conmutación de tres vías. El movimiento del motor propulsa
simultáneamente los pistones de las cuatro jeringas, trabajando en modo multicanal como
en FIA, pero evitando el uso de los tubos frágiles de Tygon de las bombas peristálticas.
La válvula solenoide de tres vías permite su conexión al sistema (ON) o al depósito de
reactivo (OFF), independiente del desplazamiento del pistón. Por lo tanto, hay dos
direcciones de flujo opcionales, una para movimiento de dispensar y otra dirección para el
movimiento de aspirar (Cerdà, 2006). Los cambios de posición de las válvulas son muy
rápidos y las conmutaciones por lo tanto pueden llevarse a cabo sin detener el
movimiento del pistón (Miró, et al., 2002). En la Figura 8 se pueden visualizar los
posibles movimientos de las jeringas y sus válvulas.
Figura 7. Módulo MSFIA
25
Figura 8. Movimientos de las jeringas en MSFIA
Además, con el uso de dichas válvulas los reactivos son devueltos a sus depósitos
cuando no son necesarios, sin perturbar el desarrollo de la reacción. Por lo tanto, se logra
una reducción de más de 10 veces en la generación de residuos respecto a los
procedimientos usuales de técnicas de inyección en flujo. La variedad de jeringas permite
obtener diferentes caudales y volúmenes de inyección a través de un mismo conjunto de
tuberías.
El módulo multijeringa posee en su parte posterior una regleta con cuatro salidas
(Figura 9), a cada una de cuales se le puede conectar hasta tres válvulas solenoides
externas (Figura 10). A cada una de las válvulas adicionadas al sistema se le incorpora un
circuito electrónico de protección para evitar su sobrecalentamiento (Figura 11). Las
válvulas solenoides, introducidas con la técnica MCFIA, pueden conmutar sin necesidad
de parar el movimiento del pistón del módulo multijeringa. Su conmutación es tan rápida
que no se produce ninguna sobrepresión al cambiar la posición de las mismas. Los
sistemas MSFIA se controlan por ordenador, así como también otros módulos que
compongan el sistema, las válvulas solenoides adicionales o el muestreador automático.
Válvula solenoide
26
Figura 9. Salidas traseras del módulo MSFIA Figura 10. Válvula solenoide externa
Figura 3. Plataforma protectora de las válvulas
27
CAPÍTULO 3
OBJETIVOS
28
3.1 Objetivo general
Desarrollar y validar un método automatizado para la determinación de bismuto en
muestras de agua y farmacéuticas mediante la técnica de análisis por inyección en flujo
multijeringa con detección espectrofotométrica.
3.2 Objetivos específicos
1) Construir el manifold e implementar el sistema de análisis MSFIA, y su acoplamiento
al sistema de detección espectrofotométrico acoplando una celda de flujo de largo paso
óptico.
2) Optimizar el método implementado a través de ensayos analíticos para encontrar los
valores óptimos de cada una de las variables que influyen en el sistema.
3) Determinar los parámetros analíticos del método, utilizando las condiciones óptimas
obtenidas en la etapa anterior.
4) Estudiar las posibles interferencias que normalmente se encuentran presentes en las
muestras de agua y farmacéuticas.
5) Validar el método desarrollado a través de materiales de referencia certificados
(CRM), por comparación con otros métodos de análisis o con estudios de recuperación.
6) Aplicar la metodología desarrollada al análisis de muestras de agua y muestras
farmacéuticas.
29
CAPÍTULO 4
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El procedimiento, los materiales y las especificaciones de un método son de vital
relevancia para poder entender los resultados de una investigación, por lo cual en este
capítulo se describe cada una de las especificaciones y pasos seguidos durante el
desarrollo del método y por consecuencia las herramientas necesarias para su
automatización.
30
4.1 Metodología
La metodología desarrollada para este trabajo se llevó a cabo en 7 pasos principales, y
dentro de cada uno de ellos se desarrollaron varias actividades que se pueden agrupar para
el mayor entendimiento de este apartado. En la Figura 12 se puede apreciar la secuencia
que se siguió.
Figura 4. Secuencia de pasos de la metodología
A continuación se realiza una descripción más detallada de cada uno de las fases o pasos
del trabajo:
1. Pruebas preliminares. En este paso se realizaron pruebas manuales para elegir la
longitud de onda y el medio, es decir, si se requería la utilización de
polivinilpirrolidona (PVP). Para la elección de la longitud de onda adecuada
correspondiente a la máxima absorción del complejo, una vez realizado el
espectro, se compararon dos longitudes de onda de 548 nm y 600 nm. Para la
elección del medio se probó uno acuoso al 100% y una disolución de 6 g L-1
de
PVP en medio acuoso siguiendo bases bibliográficas.
2. Construcción del sistema. Se llevó a cabo el montaje de la tubería y conectores
para unir el sistema de detección con el sistema MSFIA y se elaboró el
procedimiento analítico a través del software AutoAnalysis.
1. Pruebas preliminares
2. Construcción del sistema
3. Optimización
4. Parámetros Analíticos
5. Estudio de interferencias
6. Validación del método
7. Aplicación a muestras ambientales y farmacéuticas
31
3. Optimización del sistema. Para encontrar los valores óptimos se desarrolló un
diseño de experimentos multivariante. Primero se realizó un screening aplicando
un modelo full factorial 2K, para observar la influencia de las variables.
Posteriormente se hizo un diseño central compuesto (central composite) para la
optimización de las variables que resultaron significativas.
4. Determinación de parámetros analíticos. Para el método propuesto se
determinaron el rango lineal de trabajo, la sensibilidad, los límites de detección y
cuantificación, la repetitividad, la reproducibilidad y la frecuencia de inyección y
de análisis.
5. Estudio de interferencias. Se realizó una investigación bibliográfica descartando
los interferentes que forman complejo con el reactivo cromogénico, pero que
absorben a diferentes longitudes de onda o reaccionan en diferentes condiciones a
las establecidas para la reacción del bismuto con MTB. Para los iones
interferentes que si podrían reaccionar en las mismas condiciones y absorben a la
misma longitud de onda, se estudió su grado de interferencia fijando una
concentración de bismuto y variando la concentración de interferente. Finalmente,
para aquellos interferentes que afectaban a la señal analítica se buscaron agentes
enmascarantes para neutralizar su efecto.
6. Validación del método. Para este paso se realizó por un lado una comparación
entre métodos analizando muestras de referencia (muestras farmacéuticas con una
concentración conocida de bismuto). Los métodos utilizados fueron el propuesto
en este trabajo y la detección por ICP-OES. El tratamiento que se les aplicó a las
muestras farmacéuticas se describe en este capítulo en el apartado 4.3.3. Por otro
lado, para validar la aplicación a muestras ambientales se realizó un estudio de
recuperación para ver el efecto matriz de las muestras objeto de análisis.
7. Aplicación a muestras ambientales y farmacéuticas. Las muestras de agua de
pozo se analizaron de forma directa, sin pre-tratamiento o digestión. Además, se
aplicó el método de la adición de estándar para obtener los porcentajes de
recuperación y para corroborar los resultados se aplicaron agentes enmascarantes.
32
Las muestras farmacéuticas se analizaron con el sistema propuesto tras el
tratamiento descrito en el apartado 4.3.3.
4.2 Reactivos
En las pruebas preliminares, así como en las pruebas de funcionamiento se utilizaron los
siguientes reactivos, todos de calidad analítica:
Agua desionizada MilliQ: Se utilizó para todas las disoluciones acuosas, así como
para el lavado de los instrumentos y materiales utilizados.
Ácido nítrico (HNO3): Scharlau España, con pureza del 65%, densidad 1.41 g ml-
1.
Azul de metiltimol (sal sódica): Panreac España para complexiometría.
Disolución estándar de bismuto: Scharlau España, 1000 mg L-1
(ppm) en
disolución de ácido nítrico 0.5 mol L-1
, densidad aproximada 1.02 g ml-1
.
Polivinilpirrolidona K90: Fluka Chemika, Suiza.
EDTA: Scharlau España.
Ácido ascórbico: L (+), Scharlau España.
Fluoruro de sodio: PROLABO, 96%.
Ácido fluorhídrico: Scharlau España, con pureza del 48 %, densidad 1.16 g ml-1
.
Cloruro de sodio: Scharlau España
Nitrato de aluminio nonahidratado: Merck
Nitrato de hierro III nonahidratado: Scharlau España
4.3 Muestras
Las muestras seleccionadas para la aplicación del método propuesto fueron muestras
farmacéuticas y muestras de agua. En el siguiente apartado se describen las muestras
farmacéuticas, el uso y su formulación.
33
4.3.1 Muestras farmacéuticas
Las muestras farmacéuticas elegidas fueron Synalar rectal, Labcatal y Gastrodenol, ya
que contienen compuestos de bismuto. En este apartado se describirá el compuesto
presente en las muestras y su fórmula.
Synalar rectal (Pomada 30g, Marca Astellas, Madrid, España) se recomienda de
manera médica para el tratamiento en el alivio de síntomas de hemorroides
internas y externas, fisuras anales, irritación anal o perianal e inflamación en el
recto. En la Figura 13 se puede observar la presentación del medicamento
utilizada para la determinación de bismuto. Este medicamento contiene :
Acetónido de fluocinolona (0.0001g g-1
), mentol (0.0025g g-1
), subgalato de
bismuto (0.05 g g-1
), clorhidrato de lidocaína (0.02 g) y excipientes
(propilenglicol, estearato de sorbitano, polisorbato 60, parahidroxibenzoato de
metilo, parahidroxibenzoato de propilo, alcohol estearílico, alcohol cetílico,
vaselina filante, parafina líquida, ácido cítrico, agua).
Figura 5. Muestra farmacéutica: Synalar Rectal (Pomada 30 g)
El compuesto de bismuto presente en la muestra es el subgalato de bismuto
(C7H5BiO6), el cual tiene un peso molecular de 394 g mol-1
.
Labcatal (20 ampollas de 1ml, Marca Labcatal Ibérica, Madrid, España) es un
producto que contiene oligoelementos. Estos son sustancias químicas que se
encuentran en nuestro organismo para intervenir en su metabolismo y en cierta
concentración menor o mayor pueden ser perjudiciales para el organismo. Los
elementos que entran dentro de las características anteriores, en su mayoría
metales, son esenciales para el buen funcionamiento de las células. Este producto
34
farmacéutico se recomienda para el sistema respiratorio, para prevenir inflamación
de garganta, de amígdalas y laringe. En la Figura 14 se puede apreciar el producto
Labcatal analizado. La composición por ampolla es la siguiente: 0.133 mg de
gluconato de bismuto, 8.35 g de glucosa y el resto agua purificada.
Figura 6. Muestra farmacéutica: Labcatal (20 ampolletas de 1ml)
El compuesto de bismuto presente en la muestra es el gluconato de bismuto
(C18H33BiO21), el cual tiene un peso molecular de 794 g mol-1
.
La tercera muestra es el producto farmacéutico denominado Gastrodenol (50
comprimidos); se recomienda para efecto citoprotector, al tapizar la mucosa
gástrica y adsorber a la pepsina, disminuyendo el daño sobre las ulceraciones
mucosas. Según algunos autores podría estimular también la producción de
prostaglandinas, moco y bicarbonato y además, se ha sugerido un cierto efecto
inhibitorio sobre H. pylori, impidiendo probablemente la adherencia de la
bacteria, y una acción antiácida (Andersen, et al., 2000). La Figura 15 muestra el
producto Gastrodenol analizado. Este medicamento contiene 120 mg/tableta de
subcitrato de bismuto coloidal y excipientes (citrato potásico, citrato amónico,
almidón de maíz, povidona K-30, poliacrilina potásica, macrogol 6000, estereato
de magnesio e hipromelosa).
35
Figura 7. Muestra farmacéutica: Gastrodenol (50 comprimidos)
El compuesto de bismuto presente en la muestra es el subcitrato de bismuto
coloidal (C12H10BiO14K3), el cual tiene un peso molecular de 704 g mol-1
.
4.3.2 Muestras ambientales
Las muestras ambientales que se analizaron con el método propuesto fueron muestras de
agua, específicamente agua de pozo, las cuales fueron tomadas de tres diferentes lugares
en Mallorca, España (ilustrados en la Figura 16). Las muestras se tomaron directamente
de la tubería del pozo, dejando fluir el agua durante 10 min, para no tomar la que está
almacenada en la tubería, y posteriormente se tomaron las muestras.
Pozo Son Amar
Pozo Pou Nou
Pozo Aspace
36
Figura 8. Localización de los pozos
4.3.3 Preparación de muestras
El procedimiento que se siguió para la preparación de la muestra antes de la
determinación del analito fue variable en función de la muestra elegida. En los siguientes
párrafos se describe cada uno de los tratamientos para las diferentes muestras.
El tratamiento de muestra es importante para la medición adecuada del analito.
Para este método propuesto se requiere una matriz 0.1 mol L-1
de HN03, para favorecer la
formación del complejo MTB-Bi. Esto es resultado de pruebas preliminares y de acuerdo
a trabajos previos (Tzanavaras, et al., 2004).
Así las muestras de agua fueron llevadas a 0.1 mol L-1
de HN03 para su análisis.
Esto se realizó tomando 0.6783 ml de ácido nítrico concentrado al 65% y aforando dicho
volumen a 100 ml con la muestra de agua de pozo.
El procedimiento de tratamiento para las muestras farmacéuticas fue mediante
una digestión por microondas, la cual consistía en pesar 0.2 g de muestra, agregar 9 ml de
HNO3 concentrado (65%) y finalmente adicionar 2 ml de HF concentrado (48%). El
método de digestión por microondas consistía en varios pasos a diferentes potencias. En
la Tabla 3 se puede observar el método utilizado, resultando una duración total del
proceso de 34 min por digestión.
Tabla 3. Método de digestión para muestras farmacéuticas
Paso Tiempo (min) Potencia (W)
1 6 250 2 6 400 3 6 650 4 6 250 5 10 Ventilación
37
La muestra farmacéutica en forma de crema se pesó de manera directa, se hizo el
proceso de digestión descrito en el párrafo anterior y posteriormente se llevó a sequedad
total mediante parrilla, para evaporar los ácidos de la digestión, y se levantó el volumen
con 0.1 mol L-1
de HNO3, dos veces. Se llevó la muestra a 100 ml en un matraz aforado.
De la solución anterior se tomó una alícuota de 0.5 ml y se aforó a 100 ml con 0.1 mol L-1
de HNO3, para finalmente hacer la determinación del analito con el método propuesto.
En el caso de la muestra farmacéutica en forma de tableta, primero se pesó la
tableta, después se trituró mediante mortero, y se pesaron 0.2 g de la muestra triturada y
homogenizada. Se realizó el proceso de digestión y el tratamiento post-digestión descrito
anteriormente. El primer aforo fue a 250 ml. De la solución anterior se tomó una alícuota
de 0.5 ml y se aforó a 100 ml con 0.1 mol L-1
de HNO3, para finalmente hacer la
determinación del analito con el método propuesto.
Para la muestra liquida (ampolla) simplemente se tomó 1ml de la muestra y se
llevó a 100 ml con 0.1 mol L-1
HNO3, para su posterior detección. Para corroborar el
contenido del analito se realizó una digestión por microondas, tomando 1 ml de la
muestra, después agregando 9 ml de HNO3 concentrado y se aplicó el método de
digestión descrito en el inicio de este apartado. No se observaron diferencias, por lo que
para posteriores análisis simplemente se realizó la acidificación y dilución de la muestra.
4.4 Diseño del sistema
En el método propuesto se utilizó un módulo MSFIA (BUS4, CRISON Instruments S.A.,
Barcelona, España) y una celda de flujo de largo paso óptico de 1 m (LWCC-3100, World
Precision Instruments, USA). Estos instrumentos se utilizaron con el fin de mejorar la
sensibilidad del método, así como reducir el consumo de reactivos y residuos para obtener
un método simple y con alta frecuencia de inyección.
38
A su vez a la celda de flujo de largo óptico se conectaron dos fibras ópticas, una
de ellas enlazada al detector espectrofotométrico (USB 2000, terminación 6048, Ocean
Optics Inc.) y la otra fibra a la fuente de luz (DH-2000, Ocean Optics Inc., Alemania).
Esto se hizo con el propósito de lograr que la reflexión de la radiación sea total, y por
consecuencia la reducción de la pérdida de radiación por las paredes. En el caso de la
fuente de luz, se utilizó la lámpara de halógeno de tungsteno, ya que se utiliza para rango
visible.
El manifold está conformado por un bucle de carga (longitud 2 m; diámetro
interno (i.d.) de 0.08 mm), un bucle de reacción (100 cm), 2 válvulas solenoides, una de
las cuales se utilizó para la inserción de la muestra al sistema y otra para evitar que los
residuos de limpieza pasen por la celda de flujo de largo paso óptico, y finalmente la
tubería que conecta a los reservorios con el modulo MSFIA y éste a su vez con el sistema.
Se utilizó tubería de PTFE (Politetrafluoroetileno) de 0.08 mm de i.d. para conexiones al
sistema y 1.5 mm (i.d.) para conectar el sistema con los reservorios de los diversos
reactivos.
En el módulo MSFIA, sólo se utilizaron 3éjeringas, de las cuales 2 eran de 10 ml
y 1 jeringa era de 5 ml. Esta configuración fue de acuerdo a la proporción de volumen de
muestra y volumen de reactivo que se utilizó.
En la Figura 17 se encuentra el esquema del método propuesto.
39
Figura 9. Dibujo esquemático del método propuesto. BC: bucle de carga; BR: bucle de reacción anudado;
LWCC: celda de largo paso óptico; PC: personal computer; R: residuos; S: jeringa; V: válvula solenoide
externa.
4.5 Software y configuración del sistema
El control instrumental del sistema analítico propuesto se realizó mediante el software
AutoAnalysis, desarrollado por el grupo de Química Analítica, Automatización y Medio
Ambiente de la Universidad de las Islas Baleares de Palma de Mallorca, España. Dicho
software se divide en una aplicación principal y un conjunto de bibliotecas de enlace
dinámico (DLL) que permite la conexión de los instrumentos al ordenador y su control.
Además está diseñado para ofrecer al usuario una gran versatilidad en la automatización
de métodos analíticos. Así, mediante una selección apropiada de módulos instrumentales
y las DLLs necesarias, el paquete de programas AutoAnalysis permite la aplicación
automática o semiautomática de un gran número de técnicas en flujo (por ejemplo FIA,
SIA, MCFIA, MSFIA, LOV, etc.).
LWCC
BC
BR
H2O
H2O
S1
S2
S3
S4
R
V1
V2
MTB
Muestra
Fuente de luz Detector
PC
on off
40
Dentro de las ventajas que ofrece el software AutoAnalysis se encuentran: 1)
permitir la resolución de varios problemas analíticos con el mismo programa, lo que evita
la utilización de varios programas simplificando así el procedimiento; 2) permite que todo
el personal del laboratorio utilice el mismo programa en distintas aplicaciones, por lo
tanto es más fluido el intercambio de experiencia y opiniones; 3) AutoAnalysis se ha
diseñado para la plataforma Win32, lo que permite que mientras se está utilizado este
programa, se pueda estar trabajando simultáneamente con otros programas (por ejemplo
procesadores de texto, navegadores, hojas de cálculo, presentaciones, etc.); 4) permite el
uso de variables e instrucciones condicionales, además cuenta con su lenguaje propio, por
consecuencia permite el desarrollo de métodos inteligentes (Cerdà, 2006). Los métodos
son desarrollados siguiendo unos pasos muy sencillos descritos en los siguientes
apartados.
4.5.1 Configuración del sistema
En el programa se cuenta con la ventana HARDWARE, en la cual se puede cargar, salvar,
borrar o modificar la configuración de la instrumentación utilizada para los diferentes
métodos a desarrollar. En dicha ventana se seleccionan los canales de comunicación
necesarios y se continúa conectando los instrumentos necesarios para el método analítico.
Para este caso se seleccionaron los canales de Serie CRISON y Ocean Optics, y
posteriormente se arrastraron los instrumentos de multijeringa y el detector
espectrofotométrico Ocean Optics. La configuración del sistema propuesto se puede
observar en la Figura 18.
41
Figura 10. AutoAnalysis: Configuración del sistema
Una vez definido el hardware se procedió a desarrollar el método analítico.
4.5.2 Desarrollo del método analítico
El método analítico es una secuencia de instrucciones, donde cada instrucción es
ejecutada por uno de los instrumentos conectados, o también puede ser un comando
definido por el sistema para controlar el tiempo, agregar marcas, condicionales o repetir
procedimientos. Estos son un conjunto de instrucciones agrupadas bajo el mismo nombre,
que bien pueden repetirse dentro del mismo método o pueden ser utilizados por métodos
diferentes, con la ventaja de definirlos sólo una vez.
La ejecución de las instrucciones de los instrumentos puede llevarse a cabo de dos
maneras, una en forma exclusiva, durante la cual no se realizará ninguna otra instrucción
hasta finalizar la que está en curso, y la otra en forma no exclusiva, según la cual el
método continúa con la ejecución de los pasos sucesivos sin finalizar la que está en curso.
42
En el método analítico desarrollado se utilizó un procedimiento para el cambio de
muestra, un comando de repetición del método (loop) para realizar tres réplicas de la
medición de una muestra y la serie de pasos para realizar la determinación del analito.
Este método se puede observar en la Figura 19.
Figura 11. AutoAnalysis: Método analítico
4.5.3 Ejecución del método
Una vez definido un método, se verifican los comandos utilizados para poder proceder a
la ejecución del mismo. Mediante una barra de herramientas se puede controlar dicha
ejecución y los parámetros del área de dibujo. En la Figura 20 se muestra la imagen de la
ejecución de un método analítico, es decir cuando se va realizando la formación del
fiagrama.
43
Figura 20. AutoAnalysis: Ejecución del método
4.5.4 Tratamiento de datos
Los resultados de la determinación del analito de interés son representados mediante el
software a través de un fiagrama, donde se observan los picos y la tabla de valores, dicha
tabla contiene la altura de pico, así como su área.
AutoAnalysis permite el procesamiento de los datos obtenidos en el momento de la
determinación y de aquellos registrados en experimentos anteriores. Además se tiene la
opción de almacenar los espectros obtenidos durante la adquisición y recuperarlos más
tarde. Dentro del procesamiento de datos, AutoAnalysis permite el suavizado de los
picos, la obtención de su primera y segunda derivada, visualizar la línea de base utilizada
en el cálculo de áreas y alturas de pico, y corregir su integración si se aprecia que no son
correctas, eliminar picos no deseados, realizar y trabajar con curvas de calibración
integradas, hasta realizar el procesamiento en línea de los datos mediante el uso de
condicionales.
El análisis de datos del método propuesto fue llevado a cabo mediante los valores
de la altura de pico, en la Figura 21 se muestra uno de los fiagramas obtenidos en la
determinación de bismuto.
44
Figura 21. AutoAnalysis: Fiagrama de señales analíticas
4. 6 Sistema de detección del método propuesto
El sistema de detección empleado fue un espectrofotómetro miniaturizado (Ocean Optics
USB 2000, USA), acoplado a una celda de flujo de núcleo líquido de largo paso óptico
(LWCC) (World Precision Instruments, USA), mediante una fibra óptica (Ocean Optics,
USA) de 400 µm. Se utilizó otra fibra óptica (Ocean Optics, USA) de 600 µm para
conectar la celda con la fuente de luz deuterio-halógena (Ocean Optics, DH-2000, US). El
espectrofotómetro se conectó al ordenador vía una interfaz USB.
La celda de flujo de largo paso óptico (World Precision Instruments, USA) está
compuesta de material de Teflón AF tipo II, con un diámetro interno de 550 µm, una
longitud efectiva de paso de 100.0 ± 0.5 cm, y un volumen interno de 240 µL. El sistema
de detección se puede observar en la Figura 22. Para minimizar el efecto Schlieren
(desviación de la luz por un gradiente en el índice de refracción, gradiente directamente
relacionado con el gradiente de densidad del objeto observado), se seleccionó una
longitud de onda de corrección de 760 nm, donde el complejo no absorbe y la intensidad
de la fuente de luz no se encontraba saturada. Para la determinación del analito de interés
se utilizó la longitud de onda de 600 nm para la lectura de absorbancia.
45
Figura 22. Sistema de detección utilizado para el método propuesto
4.7 Detección ICP-OES
Para la validación del método propuesto se recurrió a la detección ICP-OES como método
de contraste, para lo que se utilizó el equipo Optical Emission Spectrometer (Optima
5300DV, Marca Perkin Elmer). Las muestras analizadas por este detector fueron las
farmacéuticas. Cada una de ellas se llevó a una dilución diferente, ya que el método
propuesto se optimizó para concentraciones de µg L-1
, en cambio para este detector se
requerían niveles de bismuto de mg L-1
. Las muestras farmacéuticas en forma de crema y
tableta, tras ser digeridas, se llevaron a 100 ml y luego se tomó un 1 ml de esta disolución
y se aforó a 25 ml. La muestra en forma líquida (ampolla) se tomó de manera directa, y el
contenido de la ampolla simplemente se aforó a 25 ml.
Se procedió a la lectura de la señal analítica para cada una de las muestras con las
diferentes líneas espectrales atómicas del bismuto, en posición radial y axial, para
encontrar la línea más adecuada para la determinación de bismuto. Para el tratamiento de
datos se utilizó la longitud de onda 190.171 nm en posición axial.
46
Las condiciones del equipo utilizado se encuentran en la Tabla 4.
Tabla 4. Condiciones del ICP-OES
Parámetro Valor
Generador de energía RF (W) 1300
Frecuencia de generador RF (MHz) 40
Flujo de gas auxiliar ( L min-1) 0.2
Caudal de flujo de muestra (ml min-1) 1.4
Caudal de flujo al nebulizador (L min-1) 0.5
4.8 Procedimiento analítico
Para llevar a cabo la determinación del analito de interés se utilizó el procedimiento
analítico que se describe a continuación. La Tabla 5 resume los pasos del método
analítico.
El procedimiento denominado cambio de muestra se utilizó para evitar la
contaminación entre muestras. En primer lugar se realiza la etapa de limpieza de tubería
en la cual se desecha el liquido que se encuentra entre el reservorio de la muestra y la
válvula externa que inserta la muestra (V1), como puede verse en la etapa de limpieza de
tubería a) y b) de la Tabla 5, después se llevan a cabo los pasos c) y d) para el llenado de
la citada tubería con la nueva muestra. A continuación se procede a realizar la limpieza
del bucle para evitar contaminación.
El siguiente paso es la carga de la muestra, esto se llevo a cabo para cargar la
muestra en la tubería, antes de la mezcla con el reactivo.
Finalmente se realizó la mezcla de la muestra con el reactivo cromogénico. Para
esto, la tubería de la muestra y la tubería que transporta al reactivo cromogénico están en
posición de 180º en el conector, y se utiliza un bucle de reacción para garantizar una
óptima mezcla. La última parte de esta etapa es impulsar la mezcla con agua para que el
producto de reacción pase por el detector y realizar la determinación analítica.
47
Tabla 5. Procedimiento analítico del método desarrollado
Pasos Etapa Caudal (ml/min)
Jeringa 1 (S1)
Jeringa 2 (S2)
Jeringa 3 (S3)
Válvula externa 1
(V1)
Válvula externa 2
(V2)
Cambio de muestra
Limpieza de tubería
a) Cargar 0.7 mL 1.5 ON OFF OFF ON OFF
b)Dispensar 1.0 mL 1.5 ON OFF OFF OFF OFF
c) Cargar 0.2 mL 1.5 ON OFF OFF ON OFF
d)Dispensar 0.2 mL 1.5 ON OFF OFF OFF OFF
Limpieza de bucle
a) Dispensar 1.5 mL 1.5 OFF OFF ON OFF OFF
Carga de muestra
a) Cargar 0.5 mL 1.5 ON OFF OFF ON OFF
Mezcla/Inyección al detector
a)Dispensar 0.5 mL 1.5 ON ON OFF OFF OFF
b)Dispensar 2.0 mL 5 OFF OFF ON OFF ON
4.9 Diseño de experimentos
La optimización del método desarrollado se llevó a cabo mediante un diseño
experimental, con el objeto de conocer los factores que tienen una influencia en los
valores de la variable respuesta, estableciendo los niveles de los factores que dan lugar a
condiciones óptimas y así redecir los valores de la respuesta en un intervalo definido de
los factores. Los métodos de diseño experimental permiten sistematizar la forma de
realizar los experimentos, y brindan la obtención máxima de información posible con la
mínima cantidad de experimentos (Alpízar, et al., 1997). El diseño estadístico de
experimentos tiene como objetivo seleccionar la estrategia experimental óptima que
permita obtener la información buscada con el mínimo de coste y además evaluar los
resultados experimentales obtenidos, garantizando la máxima fiabilidad en las
conclusiones que se obtengan. El diseño experimental es un conjunto específico de
experimentos definidos por una matriz compuesta por las combinaciones de diferentes
niveles de las variables estudiadas (Almeida, et al., 2008).
48
Dentro de los diseños experimentales se encuentran los diseños factoriales. Uno de
los casos dentro del diseño factorial de k factores, es el diseño 2k que proporciona el
número más pequeño de corridas para las que pueden estudiarse k factores en un diseño
factorial completo, donde cada uno tiene sólo dos niveles, estos niveles en este trabajo
son cuantitativos. Como sólo existirán dos niveles, se predice que la respuesta es
aproximadamente lineal sobre el rango de los niveles establecidos.
La optimización de este trabajo se realizó primero con un screening para observar
las variables que afectaban de manera significativa a la respuesta, con un diseño 2k
y 5
variables (k = 5) que pudiesen afectar a la señal analítica. Se agregaron puntos centrales
para que proporcionara una protección a la curvatura y permitiera la estimación
independiente del error.
Las variables que se plantearon fueron: la concentración y volumen del reactivo
cromogénico, debido a que éste puede aumentar la lectura del blanco; el volumen de
muestra ya que de ésta depende la señal del analito; el caudal y la longitud del bucle de
reacción, para brindarle el tiempo necesario para que se lleve a cabo la reacción
cromogénica, ya que se requieren 5 segundos para que se lleve a cabo la reacción del
bismuto con el MTB (Tzanavaras, et al., 2004).
Con los resultados del screening se seleccionaron las variables que tienen un
efecto significativo sobre la señal analítica, y así proceder a su optimización mediante un
diseño central compuesto. Este diseño se utiliza para ajustar a un modelo de superficie de
respuesta de segundo orden con términos cuadráticos. Se eligió porque se emplea mucho
en la práctica debido a que son relativamente eficientes con respecto al número de
corridas que requieren (Montgomery & Runger, 1996).
Así, el diseño central compuesto se aplicó para 4 variables, utilizando nuevos
rangos basados en los resultados obtenidos en el screening y agregando 3 puntos
centrales. Los rangos para el screening y para el diseño central compuesto se presentan en
el capítulo de resultados.
En la Figura 23 se muestran algunos de los materiales utilizados para la
optimización.
49
Figura 23. Materiales utilizados en la optimización de variables
50
51
CAPÍTULO 5
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Este capítulo muestra los resultados de cada una de las etapas del desarrollo del método,
así como su discusión y análisis.
52
5.1 Pruebas preliminares
Las pruebas preliminares se iniciaron con la elección de la longitud de onda de máxima
absorción. Las longitudes de onda probadas fueron 548 nm y 600 nm, ya que fue donde se
observaron máximos. Se evaluaron las dos longitudes para observar cuál de ellas brindaba
una mayor diferencia entre la lectura de la señal analítica del blanco y la muestra. En la
Figura 24 se puede observar que la longitud de onda que brinda mayor diferencia es la
longitud de 600 nm a diferentes concentraciones de MTB, por lo cual esta fue la longitud
de onda elegida para realizar la determinación de bismuto en este método.
Figura 24. Elección de la longitud de onda de absorción del complejo MTB-Bi
También se evaluó la importancia del medio, es decir, si era beneficioso utilizar
polivinilpirrolidona (PVP). Para ello se hizo la lectura de la señal analítica en medio
acuoso al 100% y en medio con PVP a las dos longitudes de onda. En la Tabla 6 se
presentan los resultados de estas pruebas.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0.E+00 2.E-06 4.E-06 6.E-06 8.E-06
Dif
ere
ncia
Mu
estr
a -
Bln
aco
(U
A)
Concentración de MTB (mol L-1)
548 nm
600 nm
53
Tabla 6. Absorción del complejo MTB en medio acuoso y con
PVP a dos diferentes longitudes de onda
Longitud de onda 548nm
Medio Blanco Muestra Diferencia
Acuoso
100%
0.06752 0.7409 0.6734
6 g L-1
PVP
0.2343 0.8573 0.6229
Longitud de onda 600nm
Medio Blanco Muestra Diferencia
Acuoso
100%
0.02127 1.1435 1.1223
6 g L-1
PVP
0.09545 1.2825 1.1871
Como podemos observar en la tabla anterior se corrobora que la mayor diferencia
de lectura entre muestra y blanco se obtiene a 600 nm. A su vez se deduce que la PVP
mejora ligeramente la señal analítica, sin aumentar significativamente la señal del blanco
a 600 nm. El uso de PVP proporciona el efecto batocrómico, que nos permite eliminar
posibles interferentes. Por todo lo citado anteriormente se decidió añadir PVP al reactivo
colorimétrico.
5.2 Montaje del sistema
El montaje del sistema en flujo y su acoplamiento al detector, a través de los diferentes
accesorios del manifold, se realizó de manera exitosa. Se logró conectar adecuadamente
el módulo multijeringa a la celda de flujo de largo paso óptico, y ésta a su vez con el
espectrofotómetro y la fuente de luz a través de dos fibras ópticas.
El acoplamiento del detector al sistema permitió el desarrollo de un sistema
compacto y miniaturizado. El detector utilizado ocupa un espacio pequeño, ya que en
comparación con otros detectores éste es de menor tamaño, permitiendo la
miniaturización del sistema y logrando que sea portátil.
En la Figura 25 se puede observar una foto del método desarrollado.
54
Figura 25. Montaje del método propuesto
5.3 Optimización de variables
Con la finalidad de obtener una mayor respuesta, y aumentar la diferencia de absorbancia
entre el blanco y la muestra, se llevó a cabo la optimización de forma multivariante de las
variables físicas y químicas que pudiesen afectar a dicha respuesta. En primer lugar se
realizó un screening y finalmente con las variables representativas se obtuvieron las
condiciones críticas para el sistema mediante una superficie respuesta.
5.3.1 Screening
Se realizó un screening con la finalidad de obtener las variables que pudiesen afectar la
señal analítica. En este caso se eligió la concentración del reactivo cromogénico (azul de
metiltimol-MTB), volumen de MTB, volumen de muestra, caudal y longitud del bucle de
reacción (BR). Estas variables fueron elegidas de acuerdo a pruebas preliminares,
55
teniendo como condición que la respuesta (en unidades de absorbancia) no tuviese un
valor mayor de 1.
Para llevar a cabo el screening se eligió un modelo full factorial 2k, por lo tanto el
factorial fue 25. En Tabla 7 se pueden observar los rangos y las variables elegidas. Los
rangos fueron propuestos de acuerdo a las pruebas preliminares.
Tabla 7. Valores de los rangos establecidos para el screening
Factor Mínimo
(-1)
Punto central
(0)
Máximo
(+1)
Unidades
Concentración de
MTB
0.000001 0.0000004 0.000007 mol L-1
Volumen de MTB 0.1 0.3 0.5 mL
Volumen de muestra 0.2 0.6 1.0 mL
Caudal 1 1.5 2 mL min-1
Longitud de bucle
de reacción
25 62.5 100 cm
Una vez seleccionadas las variables y sus rangos, se procedió a introducirlos al
software STATISTICA (STATISTICA 8, Stat soft) que se utilizó para el análisis de los datos.
La matriz de los experimentos para el screening constó de 32 experimentos con diferentes
condiciones más 3 puntos centrales, en total 35 experimentos. La matriz codificada se
generó con valores (-1, 0,+1) que representan el nivel inferior del rango, el nivel
intermedio y el valor superior del rango de cada variable. Las combinaciones de los
códigos se encuentran descritas en la Tabla 8.
56
Tabla 8. Experimentos de screening expresados en valores codificados
Experimento Concentración de MTB
Volumen de MTB
Volumen de muestra
Caudal Longitud de BR
1 -1.0 -1.0 -1.0 -1.0 -1.0 2 1.0 -1.0 -1.0 -1.0 -1.0 3 -1.0 1.0 -1.0 -1.0 -1.0 4 1.0 1.0 -1.0 -1.0 -1.0 5 -1.0 -1.0 1.0 -1.0 -1.0 6 1.0 -1.0 1.0 -1.0 -1.0 7 -1.0 1.0 1.0 -1.0 -1.0 8 1.0 1.0 1.0 -1.0 -1.0 9 -1.0 -1.0 -1.0 1.0 -1.0
10 1.0 -1.0 -1.0 1.0 -1.0 11 -1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 12 1.0 1.0 -1.0 1.0 -1.0 13 -1.0 -1.0 1.0 1.0 -1.0 14 1.0 -1.0 1.0 1.0 -1.0 15 -1.0 1.0 1.0 1.0 -1.0 16 1.0 1.0 1.0 1.0 -1.0 17 -1.0 -1.0 -1.0 -1.0 1.0 18 1.0 -1.0 -1.0 -1.0 1.0 19 -1.0 1.0 -1.0 -1.0 1.0 20 1.0 1.0 -1.0 -1.0 1.0 21 -1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 22 1.0 -1.0 1.0 -1.0 1.0 23 -1.0 1.0 1.0 -1.0 1.0 24 1.0 1.0 1.0 -1.0 1.0 25 -1.0 -1.0 -1.0 1.0 1.0 26 1.0 -1.0 -1.0 1.0 1.0 27 -1.0 1.0 -1.0 1.0 1.0 28 1.0 1.0 -1.0 1.0 1.0 29 -1.0 -1.0 1.0 1.0 1.0 30 1.0 -1.0 1.0 1.0 1.0 31 -1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 32 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 33 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 34 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 35 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
En la Tabla 9 se representan las respuestas de los experimentos antes mencionados
para la muestra, el blanco y el ratio, que fue calculado como cociente de la lectura de la
muestra y la lectura del blanco. Estos datos fueron analizados por medio del programa
computacional estadístico (STATISTICA 8, Stat soft).
57
Tabla 9. Valores de la respuesta de los experimentos del screening
5.3.1.1 Análisis de datos del ratio
Se analizaron los datos de la muestra, el blanco y el ratio, pero se utilizaron los resultados
del ratio para los análisis de datos posteriores, ya que en éste se engloba el objetivo de la
optimización, es decir, obtener la máxima señal posible con la muestra y el blanco más
pequeño posible.
Resultados de los experimentos
Experimento Blanco Muestra Ratio Experimento Blanco Muestra Ratio
1 0.1210 0.2948 2.4372 19 0.2927 0.8396 2.8686
2 0.2365 1.0618 4.4892 20 0.5151 1.1925 2.3150
3 0.3106 0.7467 2.4043 21 0.0680 0.1335 1.9635
4 0.5632 1.1171 1.9835 22 0.0625 0.4578 7.3300
5 0.0535 0.1135 2.1214 23 0.1805 0.4760 2.6376
6 0.0881 0.4505 5.1123 24 0.3079 1.6407 5.3293
7 0.1551 0.3834 2.4718 25 0.1235 0.3168 2.5648
8 0.2865 1.2991 4.5340 26 0.2047 1.1656 5.6944
9 0.1183 0.2537 2.1438 27 0.2972 0.8159 2.7450
10 0.2261 0.8673 3.8351 28 0.5369 1.2076 2.2491
11 0.3052 0.7035 2.3049 29 0.0651 0.1213 1.8645
12 0.5382 1.1785 2.1899 30 0.0592 0.4273 7.2127
13 0.0404 0.0925 2.2902 31 0.1723 0.4447 2.5814
14 0.0842 0.3428 4.0717 32 0.2972 1.5344 5.1633
15 0.1486 0.3272 2.2015 33 0.1664 0.9074 5.4531
16 0.2693 1.1353 4.2156 34 0.1672 0.9091 5.4380
17 0.1127 0.2980 2.6453 35 0.1681 0.9122 5.4274
18 0.1879 1.1841 6.3016
58
En la Tabla 10 se describen los diferentes modelos que se utilizaron para el ajuste
de los datos, con sus respectivos parámetros, con la finalidad de obtener el mejor ajuste
de los datos al modelo seleccionado para el análisis.
Tabla 10. Comparación entre modelos del screening
Modelo Coeficiente de determinación
Error Pérdida de ajuste (P value)
Sin interacción 0.68232 0.000176 0.000150
2-way 0.89889 0.000001 0.000146
3-way 0.99759 0.000167 0.004540
De la Tabla 10 se puede deducir que los resultados obtenidos tienen un mejor
ajuste al tercer modelo (3-way), tomando como referencia el coeficiente de
determinación, debido a que se cumple la recomendación que sea cercano a 1, además el
error de este modelo es pequeño. La falta de ajuste en este análisis de datos es
significativa ya que el valor de P es menor que 0.05, teniendo en cuenta que se utiliza un
intervalo de confianza del 95%.
Los resultados de la tabla de ANOVA del modelo 3-way se muestran en la Tabla
11. Dichos resultados demuestran que las 5 variables estudiadas son significativas.
Tabla 11. Tabla de ANOVA del modelo de ajuste 3-way
Modelo 3-way
Variables principales Interacción entre 2 variables Interacción entre 3 variables
Variable P Variable Variable P Variable Variable Variable P
Concentración
MTB(1)
5E-06 1 2 2.E-05 1 2 3 2.E-04
1 3 2.E-05 1 2 4 1.E-03
Volumen
MTB(2)
3E-05 1 4 1.E-03 1 2 5 8.E-05
1 5 6.E-05 1 3 4 7.E-03
Volumen
muestra (3)
4E-05 2 3 8.E-05 1 3 5 3.E-04
2 4 2.E-03 1 4 5 1.E-02
Caudal (4) 4E-04 2 5 2.E-04 2 3 4 3.E-03
3 4 1.E-01 2 3 5 2.E-02
Longitud de
bucle (5)
3E-05 3 5 2.E-03 2 4 5 7.E-03
4 5 5.E-03 3 4 5 5.E-03
Curvatura 2E-05
59
Otro aspecto importante que se extrae de los resultados es que la curvatura es
significativa, por consecuencia nuestros datos no se ajustan bien a un modelo lineal, por
lo tanto se requiere realizar un diseño de superficie de respuesta que incluya términos
cuadráticos para obtener los valores críticos de las variables, tal como un diseño central
compuesto.
El gráfico de Pareto que ofrece de manera gráfica la influencia relativa en la señal
analítica, de cada una de las variables y sus múltiples interacciones, se muestra en la
Figura 26.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Patrón/blanco
2**(5-0) design; MS Pure Error=.0001675
DV: Patrón/blanco
-2.478377.0973339.76822-11.5396-11.768113.4562214.46667-17.4220.0510224.99566-26.083731.6987
-49.403462.98207
-75.015781.64705
112.2694-113.396
132.0657162.9482
172.9244-189.636
217.0908-249.309255.106
461.4316
p=.05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
3by42*3*51*4*52*4*51*3*44by5
3*4*52*3*43by52by41by4
1*2*4(4)Caudal
1*3*52by5
1*2*32by3
1*2*51by5
(3)V(muestra)(5)RC
(2)V(MTB)1by31by2
Curvatr.(1)[MTB]
-2.478377.0973339.76822-11.5396-11.768113.4562214.46667
-17.4220.0510224.99566-26.0837
Figura 26. Diagrama de Pareto de los efectos de las variables y sus interacciones
En el diagrama de Pareto se muestran las variables en orden decreciente,
basándose en el nivel de importancia en la influencia de la señal analítica. Tomando lo
anterior, la variable que afecta en mayor proporción es la concentración del reactivo
cromogénico, seguida de la curvatura. La línea punteada de color rojo en el diagrama
60
indica el límite de aceptación para que la variable sea considerada significativa, y se
cumple siempre y cuando la barra sobrepase la línea punteada. Dicho limite está asociado
con el intervalo de confianza del 95% (α= 0.05). Por lo tanto, se corrobora que la
curvatura es significativa, y por consecuencia el requerimiento de realizar un diseño
central compuesto es necesario para obtener el valor crítico de las variables estudiadas.
De la Figura 27 se puede deducir que los datos obtenidos son satisfactorios, ya
que se ajustan al modelo elegido, en el histograma de residuales se observa que los
residuos se comportan de manera gaussiana.
Observed vs. Predicted Values
2**(5-0) design; MS Pure Error=.0001675
DV: Patrón/blanco
1 2 3 4 5 6 7 8
Observed Values
1
2
3
4
5
6
7
8
Pre
dic
ted
Va
lue
s
Histogram of Raw Residuals
2**(5-0) design; MS Pure Error=.0001675
DV: Patrón/blanco
-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
X <= Category Boundary
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18F
req
ue
ncy
Figura 27. a) Gráfica de los valores observados contra los valores teóricos estimados; b) Histograma de
residuales
Finalmente, se utilizó la función "desirability" para ver la tendencia de la señal
analítica respecto a los factores. Se puede observar en la Figura 28 que el caudal causa un
mínimo efecto, por lo tanto se decide fijarlo, y se elimina esta variable para la
optimización mediante superficie de respuesta. Para fijar el caudal, se tiene en cuenta: a)
Que beneficie a la frecuencia de análisis, y b) El gráfico de "desirability". Se decidió
fijarlo al valor del punto central.
Retomando la Figura 28 también se deduce que al aumentar la concentración de
MTB, aumenta la respuesta del blanco en mayor proporción que la de la muestra, por lo
tanto se reduce el rango para esta variable. Para el volumen de MTB cumple la misma
condición, si se aumenta dicho parámetro también aumenta la respuesta del blanco, y
como consecuencia se realiza una disminución del rango para el volumen del reactivo
S1
61
cromogénico. En cambio para el volumen de muestra, si éste disminuye aumenta la señal
analítica, por lo cual se decide reducir el rango inicial.
Para la longitud del bucle de reacción, si aumenta su valor la respuesta es mayor,
por lo cual se aumenta el rango para la optimización.
Profiles for Predicted Values and Desirability[MTB]
-.1000
.09718
.70000
V(MTB) V(muestra) Caudal RC Desirability
1.
.5
0.
.04
03
8.3
01
77
.56
31
6
Bla
nco
1.
.5
0.
-.4000
.95175
2.0000
0.
.5
1.
.09
24
8.8
66
58
1.6
40
7
Pa
trón
0.
.5
1.
0.0000
6.4753
9.0000
0.
.5
1.
1.8
64
54
.59
72
7.3
30
0
Pa
trón
/bla
nco
0.
.5
1.
-1. 0. 1.
.74731
-1. 1. -1. 1. -1. 1. -1. 1.D
esir
abili
ty
1.
.5
0.
0.
.5
1.
0.
.5
1.
Figura 28. Función "desirability" para las respuestas del screening
5.3.2 Diseño central compuesto
Para obtener los valores óptimos de las variables que influyen en el sistema, se aplicó el
diseño central compuesto para las cuatro variables que seleccionamos con el screening.
La disminución o ampliación de rangos se sustenta también de acuerdo a los resultados
estadísticos previos del screening. En la Tabla 12 se pueden observar los rangos
establecidos para la aplicación de este diseño.
62
Tabla 12. Rangos de las variables para el diseño central compuesto
Para la elección del rango de los volúmenes se tomaron en cuenta las proporciones
que nos brindan las jeringas del sistema MSFIA para poder inyectar los volúmenes
exactos. Sin embargo, no fue posible cuadrar todas las combinaciones, y para las
relaciones que no cumplieron dicho criterio se utilizó el “método sándwich” para la
inyección de muestra y reactivo cromogénico (orden de inyección: muestra-reactivo en
cuatro segmentos iguales).
Con los rangos propuestos, se continuó con la obtención de los experimentos
estadísticos aplicando el diseño central compuesto para cuatro variables centrado en las
caras. Se obtuvieron 24 experimentos más 3 experimentos correspondientes a los puntos
centrales, para dar un total de 27 experimentos. El código de dichos experimentos se basa
en la numeración +1, 0,-1, al igual que en la etapa del screening. En la Tabla 13 se pueden
observar las combinaciones estadísticas obtenidas con el programa estadístico utilizado
(STATISTICA 8, Stat soft).
Tabla 13. Experimentos del diseño central compuesto para 4 variables
Factor Mínimo (-1) Punto central (0) Máximo (+1) Unidades
Concentración de MTB
0.000001 0.0000035 0.000006 mol L-1
Volumen de MTB 0.1 0.25 0.4 ml Volumen de muestra 0.1 0.45 0.8 ml Caudal 1.5 1.5 1.5 ml min -1 Longitud de bucle de reacción
100 150 200 cm
Experimento Concentración
de MTB
Volumen
de MTB
Volumen
de muestra
BR Experimento Concentración
de MTB
Volumen
de MTB
Volumen de
muestra
BR
1 -1 -1 -1 -1 15 1 1 1 -1 2 -1 -1 -1 1 16 1 1 1 1
3 -1 -1 1 -1 17 -1 0 0 0 4 -1 -1 1 1 18 1 0 0 0 5 -1 1 -1 -1 19 0 -1 0 0 6 -1 1 -1 1 20 0 1 0 0 7 -1 1 1 -1 21 0 0 -1 0 8 -1 1 1 1 22 0 0 1 0 9 1 -1 -1 -1 23 0 0 0 -1
10 1 -1 -1 1 24 0 0 0 1 11 1 -1 1 -1 25 0 0 0 0 12 1 -1 1 1 26 0 0 0 0 13 1 1 -1 -1 27 0 0 0 0 14 1 1 -1 1
63
Las respuestas de los diferentes experimentos se pueden apreciar en la Tabla 14.
Tabla 14. Valores de la respuesta de los experimentos del diseño central compuesto
Resultados de los experimentos
Experimento Blanco Muestra Ratio Experimento Blanco Muestra Ratio
1 0.0883 0.2865 3.2439 15 0.1281 0.9495 7.4123
2 0.0684 0.2194 3.2059 16 0.1230 1.0311 8.3828
3 0.0831 0.1342 1.6159 17 0.1131 0.3261 2.8833
4 0.0705 0.1242 1.7622 18 0.1188 0.9321 7.8460
5 0.2177 0.5398 2.4794 19 0.0723 0.3053 4.2198
6 0.1871 0.4923 2.6305 20 0.1894 1.0583 5.5874
7 0.1235 0.3504 2.8379 21 0.1697 0.2816 1.6598
8 0.1151 0.3550 3.0834 22 0.1088 0.4693 4.3136
9 0.0968 0.5406 5.5878 23 0.1212 0.7311 6.0323
10 0.0785 0.4410 5.6209 24 0.1095 0.6945 6.3423
11 0.0776 0.4842 6.2365 25 0.1196 0.7494 6.2680
12 0.0827 0.4298 5.1961 26 0.1286 0.7513 5.8406
13 0.2323 0.4307 1.8538 27 0.1289 0.7574 5.8778
14 0.2010 0.3435 1.7087
Los datos de la Tabla 14 se introdujeron en el programa estadístico STATISTICA
para su tratamiento. El primer paso fue elegir los datos de las variables dependientes que
se analizarían, por lo cual se eligió, al igual que en la etapa del screening, los datos del
ratio, ya que nos expresa la relación de las respuestas de las muestras y de sus blancos
correspondientes.
5.3.2.1 Análisis de datos del ratio
En la Tabla 15 se describen los diferentes modelos a los que se pueden ajustar los datos
de los resultados de los experimentos, con sus respectivos parámetros, con la finalidad de
seleccionar el mejor ajuste de las respuestas con el modelo.
64
Tabla 15. Comparación entre modelos del diseño central compuesto
Modelo Coeficiente de determinación
Error Pérdida de ajuste (P value)
Lineal/ efecto principal 0.42288 0.056 0.0173
Lineal/Cuadrático/Efectos principales 0.62680 0.056 0.0213
Lineal/efectos principales/2 way 0.70041 0.056 0.0232
Lineal/Cuadrático/Efectos principales/2 way 0.90436 0.056 0.05153
De la Tabla 15 se puede deducir que los resultados obtenidos se ajustan mejor al
cuarto modelo (que tiene en cuenta los términos lineales y cuadráticos con efectos
principales + interacciones de segundo orden (2way)), tomando como referencia el
coeficiente de determinación, debido a que se requiere que sea más cercano a 1 y el error
de este modelo es pequeño. Además, la falta de ajuste en este análisis de datos no es
significativa ya que el valor de P es mayor que 0.05, caso contrario a los tres modelos
restantes. En el estudio de los diferentes ajustes se utilizó un intervalo de confianza del
95%.
Los datos presentados en la Tabla 16, brindan como información que el volumen
de reactivo cromogénico y la longitud del bucle de reacción no son significativos para
este modelo.
Tabla 16. Tabla de ANOVA del modelo Lineal /Cuadrático con efectos principales + 2 way aplicado a las
respuestas del método propuesto
Modelo Lineal/Cuadrático con efectos principales + 2 way
Parte lineal Parte cuadrática Interacción entre 2 variables
Variable P Variable P Variable Variable P
Concentración MTB(1) 0.0014 Concentración MTB(1) 0.5515 1 2 0.0410
1 3 0.5436
Volumen MTB(2) 0.5514 Volumen MTB(2) 0.1354 1 4 0.0000
2 3 0.0035
Volumen muestra (3) 0.0060 Volumen muestra (3) 0.0041 2 4 0.1544
3 4 0.7670 RC(4) 0.2929 RC (4) 0.0240
65
De la Figura 29 se obtiene la siguiente información: 1) el ajuste de las respuestas
es satisfactorio al modelo elegido, ya que los residuos tienen un comportamiento normal;
y 2) los valores observados se comportan de manera lineal respecto a los valores teóricos.
Observed vs. Predicted Values
4 factors, 1 Blocks, 27 Runs; MS Pure Error=.0560386
DV: ratio
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Observed Values
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Pre
dic
ted
Va
lues
Histogram of Raw Residuals
4 factors, 1 Blocks, 27 Runs; MS Pure Error=.0560386
DV: ratio
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
X <= Category Boundary
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fre
quency
Figura 29. a) Gráfica de los valores observados contra los valores teóricos estimados; b) Histograma de
residuales
El siguiente paso fue realizar la aplicación de la función desirability, que se
presenta en la Figura 30. Se puede observar un máximo en la variable de volumen de
muestra, para el ratio y la muestra, en cambio se obtiene un mínimo para el blanco, lo
cual predice un valor óptimo para esta variable. Se procedió a calcular el valor real,
dentro del rango propuesto, del valor 0.13 obtenido de la función desirability. El valor
calculado es igual a 0.5 ml de volumen de muestra, valor óptimo de dicha variable para el
método propuesto.
La concentración de reactivo cromogénico tiene un comportamiento ascendente
para la muestra y el ratio mientras que el blanco no varía de forma apreciable, por
consecuencia la concentración óptima para el sistema es la correspondiente al límite
máximo del rango propuesto.
Para la variable de volumen de MTB se observa que aumenta la respuesta
conforme se aumenta la cantidad de dicha variable, pero en consecuencia aumenta el
blanco, por lo tanto se utilizaron los datos del ratio para tomar el valor óptimo, que puede
66
ser entre el valor menor y el punto central. Tomando como referencia que la respuesta del
blanco no es alta, pero además considerando la condición de obtener una mayor
sensibilidad se decide trabajar con el valor intermedio, ya que el ratio permanece casi
invariable hasta ese punto.
Profiles for Predicted Values and Desirability[MTB]
0.0000
.07183
.30000
V MTB V muestra RC Desirability
1.
.5
0.
.06
84
2.1
50
37
.23
23
2
Bla
nc
o
1.
.5
0.
-.2000
.77989
1.4000
0.
.5
1.
.12
42
0.5
91
23
1.0
58
3
Mu
es
tra
0.
.5
1.
0.0000
8.1269
10.000
0.
.5
1.
1.6
15
94
.99
94
8.3
82
8
rati
o
0.
.5
1.
-1. 1.
.87127
-1. 1. -1. .13333 1. -1. 1.D
es
ira
bil
ity
1.
.5
0.
0.
.5
1.
0.
.5
1.
Figura 30. Función desirability para las respuestas del diseño central compuesto
La longitud de bucle de reacción óptima, de acuerdo a la Figura 30, es la longitud
menor en el rango propuesto, ya que al aumentar la longitud hay un mínimo de la
respuesta, debido a la dispersión. Después de haber discutido los valores óptimos de las 4
variables que influyen en la señal, éstos se presentan en la Tabla 17.
67
Tabla 17. Valores óptimos de las variables estudiadas
Variable Valores óptimos
Concentración de MTB 0.000006 mol L-1
Volumen de MTB 0.5 mL
Volumen de muestra 0.25 mL
Caudal 1.5 mL min-1
Longitud de bucle 100 cm
5.4 Parámetros analíticos
Después de haber realizado la optimización de las variables del método, se procedió a
realizar los diferentes experimentos para obtener los parámetros analíticos del método
propuesto.
El límite detección, límite de cuantificación, rango lineal, sensibilidad,
repetibilidad, precisión intermedia, frecuencia de análisis y frecuencia de inyección, son
los criterios que se eligieron para visualizar cuantitativamente la calidad del método
propuesto para determinar bismuto. Los principales indicadores de calidad de los métodos
son la exactitud, precisión, sensibilidad y análisis de muestreo, con los cuales se ha
cumplido en este estudio. A continuación se expondrá cada uno los criterios.
5.4.1 Rango lineal de trabajo y sensibilidad
El rango lineal de trabajo es el intervalo de concentraciones a las cuales la pendiente de la
curva se mantiene constante. Como se mencionó anteriormente, al tratarse de una
detección espectrofotométrica, se debe de cumplir que el valor máximo de la señal
analítica (unidades de absorbancia, UA) tenga como límite el valor de 1.
68
Para obtener el rango de este método espectrofotométrico para bismuto, se
probaron concentraciones de 10 ppb (µg L-1
) a 600 ppb. La inyección al sistema se realizó
de forma ascendente en relación a la concentración. Se utilizaron 8 patrones (n=8) para
obtener el rango.
Los patrones utilizados se prepararon en 0.1 mol L-1
de HNO3. Las
concentraciones de los patrones de 10, 25 y 50 µg L-1
, se realizaron a partir de una
solución de 1 mg L-1
de bismuto, en cambio los patrones de 100, 250, 400, 500, 600 y
1000 µg L-1
se prepararon a partir de una solución intermedia de 10 mg L-1
(solución
acuosa). Dicha solución fue preparada a partir de un patrón certificado de bismuto de
1000 mg L-1
en 0.5 mol L-1
HNO3 (Scharlau).
Para determinar la calidad de ajuste de la recta se utilizó el coeficiente de
determinación. En la Tabla 18 se muestran los valores de concentración utilizada y su
valor de absorbancia resultado del análisis.
Tabla 18. Datos de la curva de calibrado
Concentración
(µg L-1
)
Absorbancia (UA)
10 0.0033
25 0.0204
50 0.0489
100 0.1356
250 0.4217
400 0.6939
500 0.9112
600 1.0521
La curva de calibración se representa en la Figura 31. Como puede apreciarse, se
obtiene un coeficiente de determinación (R2) de 0.9982. La pendiente de la recta es
0.0018 y la intersección es de -0.00249. El coeficiente de determinación se considera
adecuado para obtener los datos correspondientes. En la curva de calibración están
representados los valores netos de absorbancia, obtenida de la resta de la lectura de la
muestra menos la lectura del blanco frente a la concentración en µg L-1
.
69
Figura 31. Curva de calibración del rango lineal de trabajo
Con los resultados de la curva de calibración, y cumpliendo la condición de
absorbancia menor o igual a 1, se obtiene el rango lineal de trabajo de 1.5 a 600 µg L-1
.
Otro parámetro que se deriva de la curva de calibración es la sensibilidad. De
acuerdo a la IUPAC, la sensibilidad se define como la pendiente de la curva de
calibración en la concentración de interés, y se refiere a la medida de la capacidad de
diferenciar concentraciones de valores muy semejantes (Skoog, et al., 2008). Para el
método propuesto y de acuerdo a la definición, dicho parámetro toma un valor de 0.0018
UA (Unidad de absorbancia) / µg L-1
.
5.4.2 Límite de detección
El límite de detección (LOD) es la concentración más baja detectable de analito en
una muestra, en las condiciones que se lleva a cabo el experimento, sin necesidad de ser
cuantificada, pero que además tiene diferencia significativa de la señal del blanco
(Alpízar, et al., 1997).
y = 0.0018x - 0.0249 R² = 0.9982
n = 8
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 100 200 300 400 500 600 700
Ab
sorb
anci
a n
eta
Concentración (µg l-1)
Curva de calibración
70
El cálculo de este límite está descrito por la ecuación 5.1, donde Sb, es la
desviación estándar del blanco, y m corresponde a la pendiente de la curva de calibración.
Esta ecuación está establecida por la IUPAC (Currie, 1999).
Ec. 5.1
Para el método propuesto se obtuvo la señal analítica correspondiente de 10
blancos (n= 10). Las respuestas analíticas obtenidas se presentan en la Tabla 19.
Posteriormente, se procedió al cálculo de la desviación estándar de los valores obtenidos,
cuyo valor estimado fue de 0.00088.
Tabla 19. Señales analíticas de blancos para el cálculo de LOD
Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia
1 0.0660 6 0.0658
2 0.0663 7 0.0650
3 0.0659 8 0.0652
4 0.0678 9 0.0665
5 0.0655 10 0.0673
Con el valor de la pendiente previamente calculado (0.0018) se realizó la
sustitución de datos en la ecuación, obteniendo un límite de detección de 1.5 µg L-1
.
5.4.3 Límite de cuantificación
El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito presente en una muestra
que puede ser determinada con una precisión y exactitud aceptable en las condiciones
experimentales de trabajo (Morante, et al., 2007).
La ecuación para obtener el límite de cuantificación se presenta a continuación
(ecuación 5.2), donde Sb es la desviación estándar del blanco, y m corresponde a la
pendiente en la curva de calibración. Esta ecuación está establecida por la IUPAC
(Currie, 1999).
Ec. 5.2
71
Para el cálculo del límite de cuantificación se tomaron los datos de la Tabla 19, la
desviación estándar de dichos datos (0.00088), y la pendiente de la curva de calibrado del
apartado de rango lineal de trabajo (0.0018), para sustituirlos en la ecuación. El límite de
cuantificación para el método propuesto fue de 4.9 µg L-1
.
5.4.4 Repetibilidad
El siguiente parámetro analítico estudiado fue la repetibilidad (Tabla 20), que se refiere a
la medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones, la misma
muestra, realizado por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos
aparatos y reactivos, efectuado en un intervalo de tiempo corto. Esta precisión es también
catalogada como intra-ensayos. La repetibilidad está expresada como desviación estándar
relativa (RSD).
Tabla 20. Datos para el cálculo de la repetibilidad
Repetibilidad (n=12) Realizado : 27/12/12
Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia
1 0.4892 7 0.4972
2 0.4957 8 0.4958
3 0.4978 9 0.4955
4 0.4992 10 0.4892
5 0.4981 11 0.4961
6 0.4963 12 0.4994
Resultados
X= 0.4961 s= 0.0036
RSD= 0.70%
La metodología aplicada fue medir 12 veces la misma muestra (250 µg L-1
de Bi)
y por el mismo analista, cuyos resultados se presentan en la Tabla 20. Se obtuvo la media
aritmética (X) de estos datos, la desviación estándar (s) y la desviación estándar relativa
(RSD). En el método propuesto la repetibilidad tiene un valor de 0.7 %, que es altamente
satisfactorio, ya que el criterio de aceptación es de un valor menor al 5 %.
72
5.4.5 Reproducibilidad
La reproducibilidad es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos cuando el
método es aplicado a la misma muestra repetidas veces cambiando uno de los elementos
en distintos días. La reproducibilidad también se expresa como desviación estándar
relativa (RSD).
Para obtener este parámetro se realizó la determinación de bismuto en 5 días
diferentes, preparando las disoluciones cada día. La concentración utilizada para las
réplicas fue de 250 µg L-1
. Se calculó la media aritmética (X), la desviación estándar (s) y
la desviación estándar relativa (RSD), cuyos resultados se encuentran en la Tabla 21. La
reproducibilidad para el método propuesto fue de 1.4 %, lo que reitera la calidad del
método desarrollado. El criterio de aceptación recomendado de este parámetro para los
métodos analíticos es también que sea menor al 5%.
Tabla 21. Datos para el cálculo de la reproducibilidad
5.4.6 Frecuencia de análisis y de inyección
La frecuencia viene determinada por la cantidad de análisis o de inyecciones que se
pueden llevar a cabo con un método determinado en relación al tiempo. En este método se
midió el tiempo que se requería para analizar una muestra, incluyendo el cambio de
muestra y la determinación del analito con tres réplicas. La frecuencia de análisis para el
método propuesto fue de 8 muestras por hora.
Réplica Día Lectura
1 26/12/12 0.4892
2 27/12/12 0.4998
3 28/12/12 0.5014
4 31/12/12 0.5057
5 2/1/2013 0.5070
Resultados
X= 0.5006
s = 0.0070
RSD = 1.4%
73
Para la frecuencia de inyección se midió el tiempo requerido para obtener sólo una
respuesta, y con el método propuesto se pueden realizar 30 inyecciones por hora, lo que
nos permite calificar a nuestro método como un método rápido, automático y directo para
la determinación de bismuto.
En la Tabla 22 se presenta un resumen de los parámetros analíticos del método
propuesto para la determinación de bismuto.
Tabla 22. Parámetros analíticos del método propuesto
Parámetros analíticos
Límite de detección 1.5 µg L-1
Límite de cuantificación 4.9 µg L-1
Rango lineal 1.5-600 µg L-1
Sensibilidad 0.0018 UA/ µg L-1
Repetibilidad 0.70 %
Reproducibilidad 1.40 %
Frecuencia de análisis 8 muestra hora-1
Frecuencia de inyección 30 inyección hora-1
5.5 Estudio de interferencias
Debido a que las interferencias pueden distorsionar la señal del analito de interés,
evitando su correcta cuantificación o provocando un error sistemático, ya sea constante o
dependiente de la concentración de analito en la muestra, se realizó un estudio de
interferentes para el método propuesto.
La definición de interferente se precisa como aquella sustancia que causa un error
sistemático en la determinación del analito de una magnitud relativa, igual o superior a un
valor establecido. Lo primero fue establecer los interferentes que pudiesen afectar la señal
analítica de bismuto en la detección espectrofotométrica.
74
Se estudiaron las interferencias que pudiesen afectar de manera positiva, es decir,
que provocan que la lectura de la señal analítica sea mayor a la esperada, provocando una
sobreestimación del analito en cuestión. Esto en el sistema propuesto, puede ser debido a
que diferentes metales pueden formar complejos con el reactivo cromogénico y absorber
en la misma longitud de onda y en las mismas condiciones. Por lo tanto, se realizó una
revisión bibliográfica para encontrar los posibles iones interferentes. Se ha reportado que
el torio (IV), zirconio (IV), lantano (III), ytrio (III), cerio, cromo(III), mercurio, galio
(III), magnesio (II), aluminio (III), hafnio, hierro (III), paladio (II), uranio (VI) , titanio
(IV) , calcio (II), cadmio (II), cobre (II), vanadio (V), molibdeno (VI), niobio y estaño
(IV) pueden reaccionar y formar complejo con el azul de metiltimol (Karadakov, et al.,
1968; Srivastava & Banerji, 1968; Cheng, 1963).
Para el estudio de interferentes del método propuesto, se procedió a descartar los
iones que forman complejos con el azul de metiltimol en condiciones diferentes. Por
ejemplo, el calcio se eliminó como posible interferente ya que se requiere un medio
básico de pH 12 para formar el complejo (Themelis, et al., 1999), así como el cadmio,
que también requiere un medio básico de pH 9 para reaccionar con el reactivo
cromogénico (Ensafi & Ghaderi, 2007), al igual que el torio (IV) (Adam & PrÌibil, 1969).
Para que el reactivo cromogénico forme complejo con el estaño (IV), niobio y molibdeno
(VI) se requiere una temperatura más elevada, por lo que también fueron descartados. El
titanio (VI) también se excluyó, ya que forma un complejo de color cercano al azul,
mientras que el bismuto forma complejo de color rojo-violeta en medio ácido. El uranio
(VI) se determina en medio neutro y para tener estabilidad se requiere calentar, por lo
tanto no se considera interferente en las condiciones establecidas para la medición de
bismuto (Srivastava & Banerji, 1968). El zirconio y el hafnio se determinan en
condiciones ácidas, pero estos elementos no se encuentran presentes en las muestras a
analizar, y si se encuentran en el agua, la concentración es muy baja, por lo que no
representan interferentes potenciales (Cheng, 1963). El MTB tiene afinidad por los
cationes de más alta carga en medio ácido por lo tanto se descartan los iones de carga +2
(Sandell, 1959). Con lo anterior y tomando como referencia que el paladio (II) absorbe en
530 y 500 nm, se descarta para el estudio de interferencias (Srivastava & Banerji, 1973).
Por otro lado, el MTB es poco sensible para la determinación de cromo debido a que
requiere condiciones especiales para la formación del complejo (Cheng, 1967). Con todo
lo antes mencionado, se sustenta que en el estudio experimental de interferencias sólo se
75
eligieron los iones Fe3+
y Al+3
, ya que pueden formar complejo con el reactivo
cromogénico, además de que se encuentran presentes en aguas de pozo.
El hierro (III) en agua de pozo se encuentra en concentraciones entre 1-2 mg L-1
(Pozdniakovaa, et al., 1997). Este rango de concentraciones se tomó como referencia para
llevar a cabo el estudio. Se analizó una muestra con 200 µg L-1
de bismuto como
concentración base, y se adicionaron concentraciones de hierro crecientes hasta 200 µg L-
1 de Fe
+3 (preparado a partir de nitrato de hierro (III) nonahidratado). A partir de esta
concentración se produjo una interferencia, por lo que se procedió a adicionar ácido
ascórbico (1 x 10-5
mol L-1
) para enmascarar la interferencia del hierro. Los resultados
fueron satisfactorios, pudiéndose analizar el bismuto en presencia de Fe3+
hasta en una
concentración de 2 mg L-1
.
Para el ión aluminio se llevó a cabo el mismo procedimiento antes descrito, y
hasta la concentración de 1 mg L1 de aluminio, no se observó interferencia en el método
propuesto. El límite máximo de estudio se fijó basándose en la concentración de aluminio
encontrada en aguas de pozo, siendo ésta alrededor de 100 µg L-1
(Frankowski, 2012). La
concentración de bismuto se mantuvo constante e igual que en el estudio anterior (200 µg
L-1
).
También se realizó un estudio para interferentes que reaccionan con el bismuto,
causando una interferencia negativa en la señal. Se tomó como principal interferente al
ión cloruro, debido a que enmascara al bismuto y se encuentra presente en algunos
fármacos (Tzanavaras, et al., 2004), como ya se vio en estudios previos. Se adicionó ión
cloruro hasta una concentración de 60 mg L-1
, y no se observaron interferencias en la
señal analítica del bismuto.
5.6 Validación de la metodología analítica y análisis de muestras farmacéuticas
La validación del método propuesto fue realizada por medio del análisis de muestras de
referencia y por comparación de resultados mediante dos técnicas analíticas, el método
desarrollado y la técnica de ICP-OES. Las muestras utilizadas para la validación fueron 3
76
muestras diferentes de fármacos, digeridas y preparadas en matriz de 0.1 mol L-1
de
HNO3 (procedimiento descrito en el apartado de muestras). Las muestras analizadas y los
resultados correspondientes se encuentran en la Tabla 23.
Tabla 23. Resultados de muestras farmacéuticas
Muestras farmacéuticas
Muestra Contenido teórico Método propuesto ICP-OES
Synalar rectal
(Crema)
25 mg g-1
25 ± 1.1 mg g-1
24 ± 1 mg g-1
Gastrodenol
(Tableta)
70 mg g-1
66 ± 2 mg g-1
69 ± 5 mg g-1
Labcatal
(Ampolleta)
35 mg L-1
34.7 ± 0.2 mg L-1
34.4 ± 0.4 mg L-1
* No existen diferencias significativas entre el valor obtenido con el método propuesto y por
ICP- OES con un intervalo de confianza 95% (α =0.05)
Los resultados de la validación son satisfactorios, ya que no existen diferencias
significativas entre los resultados obtenidos por las dos técnicas utilizadas en relación a
los contenidos teóricos de bismuto en los fármacos. La comparación de resultados se
realizó a través de la prueba de Fisher de homocedasticidad y la prueba de t de
comparación de medias para saber si la diferencia era significativa.
5.7 Aplicación a muestras ambientales
El método automatizado fue aplicado a muestras de agua de pozo, las cuales fueron
descritas en el apartado 4.3.2, y preparadas en 0.1 mol L-1
de HNO3. Se realizaron 3
réplicas de cada una de las muestras y se calculó su desviación estándar.
Para verificar si existía efecto matriz en las muestras, se llevó a cabo la adición de
un estándar, añadiendo a cada una de las muestras 50 µg L-1
de bismuto. Los porcentajes
de recuperación obtenidos se muestran en la Tabla 24. Los resultados fueron
77
satisfactorios ya que se encuentran dentro del rango de aceptación de 100 ± 10 % en
todos los casos. Para verificar que no había interferentes, se añadieron agentes
enmascarantes. Los agentes utilizados fueron el ión fluoruro (fluoruro de sodio), ácido
ascórbico y EDTA. Se observó que la señal analítica no se modificaba, comprobándose
así la veracidad de los resultados obtenidos para las muestras de pozo.
Tabla 24. Resultados de concentración de bismuto en muestras de agua de pozo
Agua de pozo
Pozo Concentración de Bi (µg L-1)
Bismuto añadido (µg L-1)
Recuperación (%)
Pozo Son Amar 53 ± 5 0 --
102 ± 8 50 98.4
Pozo Pou Nou 59 ± 3 0 --
105 ± 5 50 90.1
Pozo Aspace 51 ± 4 0 --
99 ± 2 50 94.9
5.8 Comparación con trabajos previos basados en la automatización
mediante técnicas de análisis en flujo
La determinación espectrofotométrica de bismuto fue automatizada previamente por otros
autores utilizando las técnicas de flujo SIA (análisis por inyección secuencial) y MCFIA
(análisis por inyección en flujo multiconmutado). El MTB fue empleado como reactivo
cromogénico para determinar bismuto en un sistema SIA que fue aplicado a muestras
farmacéuticas (Tzanavaras, et al., 2004). Por otro lado, encontramos en la bibliografía un
sistema MCFIA para determinar bismuto utilizando naranja de xylenol como reactivo
cromogénico con acoplamiento de un sensor sol-gel para la determinación del analito en
muestras farmacéuticas (Jerónimo, et al., 2004). En la Tabla 25 se muestra una
comparación de las principales características de cada uno de los métodos mencionados
anteriormente para bismuto y el método propuesto en este proyecto.
78
Tabla 25. Métodos automatizados para la determinación de bismuto con detección espectrofotométrica
Analito Reactivo
cromogénico
Detección Técnica
en flujo
Concentración
de reactivo
(mol L-1)
Limite de
detección
(µg/L-1)
RSD
(%)
Frecuencia
de inyección
( h-1)
Referencia
Bismuto Azul de
Metiltimol
Espectrofotométrica SIA 5.00E-04 250 1.1 72 (Tzanavaras, et
al., 2004)
Bismuto Azul de
Metiltimol
Espectrofotométrica-
LWCC
MSFIA 6.00E-06 1.5 0.7 30 Método
Propuesto
Bismuto Naranja de
Xilenol
Espectrofotométrica-
Sensor sol-gel
MCFIA 2.00E-03 7 0.8 42
(Jerónimo, et
al., 2004)
Como conclusiones de este estudio comparativo, puede verse en la Tabla 25 que el
método propuesto ofrece un límite de detección más bajo, siendo aproximadamente 4.5
veces menor que el del método basado en MCFIA y 167 veces menor que el del sistema
SIA. Con lo anterior, se puede afirmar que el método desarrollado es mucho más sensible
que los que existían previamente, lo que lo convierte en una excelente alternativa para
muestras ambientales con bajo contenido de bismuto.
También se obtiene un ahorro considerable de reactivo cromogénico en
comparación con los otros métodos, una mayor reproducibilidad de los análisis y se logra
un sistema mucho más miniaturizado, ya que las otras técnicas utilizaron
espectrofotómetros de gran tamaño.
Sin embargo, la frecuencia de análisis de nuestro método es menor debido a la
inclusión de pasos adicionales para evitar la contaminación de muestras en el momento de
la inserción.
79
CAPÍTULO 6
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
80
6.1 Conclusiones
El método propuesto es miniaturizado, debido a que los equipos utilizados son de tamaño
reducido, lo que favorece la reducción del consumo de reactivos, por tanto la generación
de residuos, cumpliendo de esta manera con los principios de la química verde. Otro
aspecto importante de la miniaturización, es la facilidad con la que el método desarrollado
puede aplicarse a mediciones “in situ” y en campo, debido a su portabilidad.
El método desarrollado en este trabajo reduce la cantidad de reactivo, por consecuencia la
determinación de bismuto es más económica. Además, cabe resaltar la simplicidad del
sistema desarrollado en comparación con otras técnicas analíticas.
Dentro de los sistemas miniaturizados, el sistema propuesto basado en la determinación
espectrofotométrica proporciona una mayor sensibilidad, ya que se obtienen límites de
detección menores. Se logró mejorar los límites de detección que se tenían en
espectrofotometría ultravioleta-visible acoplando una celda de flujo de largo paso óptico.
Se puede realizar la determinación de bismuto en muestras ambientales y muestras
farmacéuticas de manera adecuada con el método propuesto. La determinación de
bismuto en muestras de agua se puede realizar de manera directa y rápida, sin digestión
previa.
81
6.2 Recomendaciones
El método propuesto puede ser modificado fácilmente, por ejemplo acoplando una
columna para extracción sólido-líquido, que preconcentre al analito, mejorando la
sensibilidad para su aplicación en muestras ambientales, en particular las muestras de
aire, donde el bismuto se puede utilizar como trazador.
Por otra parte, se puede extender el uso del método propuesto a otros tipos de muestras,
por ejemplo, en productos de la industria de manufactura, donde se sustituye al plomo por
bismuto.
82
83
CAPÍTULO 7
BIBLIOGRAFÍA
84
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