Tesis de Maestría...Los hidrolizados totales de proteínas de frijol presentaron actividad antibacteriana sobre cepas indicadoras mostrando su capacidad de inhibición en amplio espectro

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

OBTENCIÓN DE FRACCIONES PEPTÍDICAS DE

Phaseolus vulgaris L. Y EVALUACIÓN DE SU

ACTIVIDAD BIOLÓGICA

TESIS

Que para obtener el Grado de:

Doctora en Ciencias en Bioprocesos

Presenta:

M. en C. Teresita de Jesús Ariza Ortega

Directores:

Dr. Jorge Yáñez Fernández

Dra. María del Carmen Oliver Salvador

México D. F., julio 2014

Declaración de originalidad

2

Obtención de fracciones peptídicas de Phaseolus vulgaris L. y evaluación de su actividad biológica

Autorización de uso de obra

3


Acta de revisión de tesis

4


Resumen

5


Resumen

En México, el cultivo de frijol es el segundo en importancia después del maíz, ya que

además de proveer al ser humano de proteína de alta calidad, se le han atribuido diversas

actividades biológicas que pueden favorecer la salud humana. Por lo que, en este trabajo se

evaluó la actividad biológica in vitro (antioxidante, antimicrobiana e inhibidora de la enzima

convertidora de la angiotensina I) e in vivo (antihipertensiva) de péptidos obtenidos por hidrólisis

enzimática de tres variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.): frijol negro plus, frijol azufrado

higuera y frijol pinto Saltillo.

Los hidrolizados totales de proteínas de frijol presentaron actividad antibacteriana sobre

cepas indicadoras mostrando su capacidad de inhibición en amplio espectro. Los péptidos de la f<1

kDa inhibieron la cepa Shigella dysenteriae con concentración mínima inhibitoria de 10 a 40 µg de

ésta fracción. Y la mayor inhibición del crecimiento bacteriano fue observada con la variedad FAH.

Los hidrolizados totales de frijol mostraron actividad antioxidante, así como sus fracciones

peptídicas; y se observó la tendencia a incrementar ésta actividad biológica al disminuir la masa

molecular de los péptidos. La actividad antioxidante se determinó por cuatro métodos y los

valores máximos obtenidos por métodos espectrofotométricos fueron de: DPPH+ = 40.19 ± 3.83 %

(FNP, f1-3), ABTS+ = 99.17 ± 0.91 % (FNP, f<1) y DMPD+ = 89.08 ± 2.46 % (FPS, f<1); y por el método

de quimioluminiscencia de 94.02 ± 1.09 % (FAH, f1-3).

Todos los hidrolizados totales y las fracciones peptídicas de frijol presentaron actividad

inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina. El mayor porcentaje de actividad fue del

95 % con la fracción f1-3 kDa de las variedades FAH y FPS. Y se comprobó la actividad

antihipertensiva de los péptidos de FAH (f3-10) in vivo y se observó una reducción de la presión

arterial sistólica (27.13 mmHg) de ratas hipertensas similar a la del Captopril (29.67 mmHg) a las 2

h de haberse administrado.

Adicionalmente, se purificaron dos péptidos con actividad antioxidante de FAH (f1-3 kDa),

por espectrometría de masas se determinó su peso molecular (656.219 y 879.242 Da) y por

análisis bioinformático se determinaron las secuencias de aminoácidos posibles.

Las actividades biológicas estudiadas, antimicrobianas, antioxidantes e hipertensivas de las

fracciones peptídicas de hidrolizados de proteína de frijol tienen un considerable potencial en el

desarrollo de alimentos nutracéuticos para el mejoramiento de la salud humana.

Abstract

6


Abstract

In Mexico, the bean crop is the second in importance after corn because of its quality

protein contain, furthermore, it has recently been studied their human health enhance. Therefore,

in this study the in vitro (antioxidant, antimicrobial and inhibitory of angiotensin converting

enzyme) and in vivo (antihypertensive) biological activities of peptides obtained by enzymatic

hydrolysis of proteins from three common bean (Phaseolus vulgaris L.) varieties (negro plus,

azufrado higuera and pinto Saltillo) were evaluated.

Antimicrobial activity was observed with the total hydrolysate of bean proteins in a wide

broad. The peptidic fraction f<1 kDa inhibited the growth of Shigella dysenteriae with a minimal

inhibitory concentration of 10 to 40 µg of peptide.

Antioxidant activity was observed in the total hydrolysates and peptidic fractions tested. It

was observed that the trend in the antioxidant activity was increased while the group of peptides

decreased in molecular mass. The maximum antioxidant activity observed in spectrophotometric

methods was: DPPH+ = 40.19 ± 3.83 % (FNP, f1-3), ABTS+ = 99.17 ± 0.91 % (FNP, f<1), and DMPD+ =

89.08 ± 2.46 % (FPS, f<1); and by chemiluminescence of 94.02 ± 1.09 % (FAH, f1-3),

Inhibitory angiotensin converting enzyme activity was observed in the total hydrolysates

and peptidic fractions tested. The maximum activity was 95 % with f1-3 kDa from FAH and FPS

beans. Also, the antihypertensive activity was probed with the f3-10 from FAH in vivo over Wistar

spontaneously hypertense rats resulting in a similar systolic pressure values (27.13 mmHg) to

positive control (Captopril, 29.67 mmHg) at 2 h of administration.

The molecular mass of two isolated peptides with antioxidant activity from FAH (f1-3 kDa)

was determined (656.219 y 879.242 Da) by mass spectrometry, and the possible amino acid

sequences were determined by a bioinformatics analysis.

The biological activities studied, antimicrobial, antioxidant, and antihypertensive of the

peptidic fractions from common bean hydrolysates (from the three bean varieties of this work)

support their potential use in the pharmaceutics and food fields to develop a nutraceutic product.

Apoyos para la realización de éste trabajo

7


Apoyos para la realización de éste trabajo

Este trabajo fue realizado en los laboratorios de Biotecnología Alimentaria y Biología

Molecular de la sección de estudios de posgrado e investigación de la Unidad Profesional

Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional.

El programa de posgrado de Doctorado en Ciencias en

Bioprocesos de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional está

incluido en el Padrón Nacional de Posgrado con el número

de referencia 000653.

La presente Tesis fue realizada con el apoyo de la Beca

350021 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología en el

periodo 2012-2013.

El Instituto Politécnico Nacional a través de la Secretaría de

Investigación y Posgrado y por conducto de la Dirección de

Posgrado, otorgo apoyo por parte del Programa de Beca

Institucional de Posgrado en el periodo 2010-2012 y 2013-

2014.

Índice

8


Índice general

Resumen…………………………………………………………………………… ..............................................................5

Abstract……………………………………………………………………………………………………………………………………...….6

Índice...................................................................................................................................................8

1. Introducción ............................................................................................................................16

1.1 Particularidades e importancia del frijol ...........................................................................16

1.1.1 El frijol común (Phaseolus vulgaris L.).......................................................................16

1.1.2 El cultivo de frijol en México .....................................................................................17

1.1.3 Importancia de las semillas de frijol en la alimentación ...........................................18

1.2 Las proteínas y su función en el organismo ......................................................................19

1.2.1 Concepto general de proteínas ................................................................................19

1.2.2 Importancia de las proteínas ....................................................................................19

1.2.3 Proteínas de origen animal .......................................................................................20

1.2.4 Proteínas de origen vegetal ......................................................................................20

1.3 Proceso de hidrólisis enzimática .......................................................................................21

1.3.1 Hidrólisis de proteínas ..............................................................................................21

1.3.2 Importancia de los hidrolizados de proteína ............................................................22

1.3.3 Enzimas proteolíticas ................................................................................................22

1.4 Actividad biológica y funcionalidad de péptidos ..............................................................24

1.4.1 Alimentos funcionales ..............................................................................................24

1.4.2 Péptidos con actividad biológica ..............................................................................25

1.5 Aplicación y función de péptidos en la salud ....................................................................26

1.5.1 Problemática actual y riesgos en la salud .................................................................26

1.5.2 Actividad antibacteriana como control de patógenos ..............................................26

1.5.3 Actividad antioxidante como control de la oxidación celular ...................................28

1.5.4 Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina como control de

la hipertensión ..........................................................................................................................30

1.6 Péptidos identificados como biológicamente activos .......................................................32

2. Justificación .............................................................................................................................35

3. Objetivos .................................................................................................................................36

Índice

9


3.1 Objetivo general ...............................................................................................................36

3.2 Objetivos particulares.......................................................................................................36

4. Materiales y Métodos ..............................................................................................................37

4.1 Materiales biológicos y reactivos .....................................................................................37

4.2 Caracterización física de las semillas de frijol ...................................................................37

4.3 Preparación de las harinas de semillas de frijol ................................................................38

4.4 Caracterización químico proximal de las harinas de semillas de frijol ..............................38

4.4.1 Determinación de humedad .....................................................................................39

4.4.2 Determinación de proteína total ..............................................................................39

4.4.3 Determinación del extracto etéreo ..........................................................................40

4.4.4 Determinación de fibra cruda ...................................................................................40

4.4.5 Determinación de cenizas totales .............................................................................41

4.4.6 Carbohidratos totales ...............................................................................................41

4.5 Proceso de desengrasado de las harinas de frijol .............................................................41

4.6 Obtención de los concentrados proteicos de frijol ...........................................................42

4.7 Caracterización de los concentrados proteicos de frijol ...................................................42

4.7.1 Contenido total de proteína en los concentrados de frijol .......................................42

4.7.2 Determinación de proteína soluble en los concentrados proteicos de frijol ............42

4.7.3 Perfil proteico de los concentrados de proteína de frijol .........................................43

4.7.4 Electroforesis bidimensional de los concentrados de proteína de frijol ...................44

4.8 Hidrólisis enzimática de las proteínas de frijol .................................................................44

4.9 Fraccionamiento de los hidrolizados proteicos por ultrafiltración ...................................45

4.10 Caracterización del fraccionamiento por ultrafiltración ...................................................46

4.11 Determinación de la actividad antibacteriana de los hidrolizados totales y fracciones

peptídicas de frijol .......................................................................................................................46

4.11.1 Prueba de susceptibilidad microbiana ......................................................................46

4.11.2 Determinación de la concentración mínima inhibitoria ...........................................47

4.12 Determinación de la actividad antioxidante de los hidrolizados totales y fracciones

peptídicas de frijol .......................................................................................................................48

4.12.1 Actividad antioxidante como captura del radical libre DPPH+ ..................................48

4.12.2 Actividad antioxidante en función de la decoloración del radical libre ABTS+ ..........49

Índice

10


4.12.3 Actividad antioxidante en función de la decoloración del radical libre DMPD+ ........50

4.12.4 Actividad antioxidante determinada por el método de quimioluminiscencia ..........51

4.13 Determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina 52

4.14 Purificación de las fracciones peptídicas con actividad antioxidante ...............................54

4.15 Determinación de la masa molecular del péptido con actividad antioxidante .................54

4.16 Determinación de la secuencia de aminoácidos por bioinformática del péptido con

actividad antioxidante .................................................................................................................54

4.17 Análisis estadístico de datos .............................................................................................55

5. Resultados y Discusión ............................................................................................................56

5.1 Evaluación y caracterización física de las semillas de frijol ...............................................56

5.2 Obtención de las harinas de frijol .....................................................................................57

5.3 Caracterización químico proximal de las harinas de frijol ................................................58

5.4 Obtención del concentrado de proteínas de frijol ............................................................60

5.5 Comparación de los perfiles electroforéticos de las harinas de frijol ...............................61

5.5.1 Electroforesis de los concentrados de proteína de frijol ..........................................61

5.5.2 Electroforesis bidimensional de los concentrados de proteína de frijol ...................62

5.6 Hidrólisis enzimática de las proteínas de frijol .................................................................65

5.6.1 Hidrólisis enzimática de las proteínas contenidas en las harinas de frijol ................65

5.6.2 Hidrólisis enzimática de los concentrados proteicos de frijol ...................................66

5.7 Fraccionamiento de péptidos por ultrafiltración ..............................................................67

5.8 Determinación de la actividad antibacteriana ..................................................................69

5.8.1 Controles positivos - Resistencia de las cepas indicadoras a los antibióticos ...........69

5.8.2 Actividad antibacteriana en harinas de frijol hidrolizadas ........................................70

5.8.3 Actividad antibacteriana en harinas desengrasadas e hidrolizadas de frijol .............70

5.8.4 Actividad antibacteriana de los hidrolizados totales obtenidos a partir de la proteína

concentrada de frijol ................................................................................................................71

5.8.5 Actividad antibacteriana de las fracciones peptídicas de los hidrolizados de los

concentrados proteicos de frijol ...............................................................................................72

5.8.6 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de las fracciones peptídicas e

hidrolizados de frijol .................................................................................................................73

5.9 Determinación de la actividad antioxidante .....................................................................75

Índice

11


5.9.1 Método de captación del radical libre DPPH+ ...........................................................75

5.9.2 Método de captación del radical libre ABTS+ ............................................................78

5.9.3 Método de captación del radical libre DMPD+ ..........................................................80

5.9.4 Método de quimioluminiscencia ..............................................................................82

5.9.5 Comparación de métodos de determinación de la actividad antioxidante ..............84

5.10 Determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina 85

5.11 Purificación de las fracciones con actividad .....................................................................88

5.11.1 Separación de péptidos por grupos y determinación de su actividad antioxidante .88

5.11.2 Separación de péptidos individualmente y determinación de su actividad

antioxidante .............................................................................................................................90

5.11.3 Comparativo de la actividad antioxidante de péptidos purificados ..........................92

5.12 Identificación del péptido con actividad antioxidante ......................................................93

5.12.1 Determinación del peso molecular del péptido ........................................................93

5.12.2 Identificación molecular del péptido ........................................................................95

6. Conclusiones ............................................................................................................................99

7. Perspectivas ...........................................................................................................................100

8. Referencias ............................................................................................................................101

9. Anexos ...................................................................................................................................111

9.1 Productos derivados de ésta Tesis..................................................................................111

9.2 Antioxidantes de referencia utilizados como control .....................................................113

9.3 Lista de aminoácidos ......................................................................................................114

Índice

12


Índice de Cuadros

Cuadro 1-1. Proteasas comerciales grado alimenticio. ....................................................................23

Cuadro 1-2. Péptidos bioactivos obtenidos de proteínas animales. .................................................33

Cuadro 1-3. Péptidos bioactivos sintetizados químicamente. ..........................................................33

Cuadro 1-4. Péptidos bioactivos obtenidos de proteínas vegetales. ................................................34

Cuadro 5-1. Características físicas de las semillas de las tres variedades de frijol............................56

Cuadro 5-2. Masas y rendimientos de las harinas de frijol después de la molienda y tamizado. .....57

Cuadro 5-3. Análisis químico proximal de las harinas de frijol (%) ...................................................58

Cuadro 5-4. Composición químico proximal en harinas de frijol reportadas previamente (%) ........59

Cuadro 5-5. Contenido de proteína en los concentrados de frijol (%)..............................................60

Cuadro 5-6. Grado de hidrólisis alcanzado por las harinas de frijol durante el tratamiento (%) ......65

Cuadro 5-7. Grado de hidrólisis obtenido en 2 h de reacción con los concentrados de proteína de

frijol (%) ...................................................................................................................................66

Cuadro 5-8. Determinación de la resistencia de las cepas a los antibióticos de referencia (control

positivo). ..................................................................................................................................69

Cuadro 5-9. Actividad antibacteriana del hidrolizado total de los concentrados proteicos de frijol 71

Cuadro 5-10. Actividad antibacteriana de las fracciones del hidrolizado del concentrado de FAH ..73

Cuadro 5-11. CMI determinada para las fracciones de hidrolizados de frijol. ..................................74

Cuadro 5-12. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por captación de DPPH+ (%)

.................................................................................................................................................76

Cuadro 5-13. Equivalentes del antioxidante de referencia con respecto de las fracciones de

péptidos de frijol determinada por captación del radical libre DPPH+ .....................................77

Cuadro 5-14. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por decoloración del ABTS+

(%) ...........................................................................................................................................78


péptidos de frijol determinada por captación del radical libre ABTS+......................................79

Cuadro 5-16. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por decoloración del

DMPD+ (%) ...............................................................................................................................80


péptidos de frijol determinada por captación del radical libre DMPD+ ...................................81

Índice

13


Cuadro 5-18. Actividad quimioluminiscente de los controles positivos y blancos de control. .........82

Cuadro 5-19. Actividad antioxidante determinada por quimioluminiscencia de péptidos de frijol

(%) ...........................................................................................................................................83

Cuadro 5-20. Inhibición de la ECA-I por los péptidos de frijol de 1-3 kDa (%) ..................................85

Cuadro 5-21. Efecto en la presión sanguínea (PS) de la administración de la F3-10 del FAH sobre

RWH.........................................................................................................................................87

Cuadro 5-22. Actividad antioxidante (%) de los péptidos individuales colectados en la separación

individual por HPLC de los péptidos de los grupos 40A y 45A del FAH. ...................................91

Cuadro 5-23. Análisis de aminoácidos realizado en el sistema de predicción virtual ExPASY

(UniProt: P02853). ...................................................................................................................95

Cuadro 5-24. Análisis de aminoácidos realizado en el sistema de predicción virtual ExPASY

(UniProt: Q8RVH1). ..................................................................................................................96

Índice

14


Índice de Figuras

Figura 1-1. Cultivo y vaina del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). .................................................16

Figura 1-2. Variedades de frijol utilizadas en este trabajo. ..............................................................18

Figura 1-3. Representación del mecanismo de acción de los péptidos antibacterianos del tipo alfa

hélice. ......................................................................................................................................28

Figura 1-4. Mecanismo de acción de la inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina I

(modificado de Keidar y col., 2007). ........................................................................................31

Figura 4-1. Harinas obtenidas de las tres variedades de frijol. .........................................................38

Figura 4-2. Caracterización químico proximal de las harinas de frijol según métodos de la AOAC. .39

Figura 4-3. Equipo de (a) isoelectroenfoque y (b) electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil

sulfato de sodio de las proteínas de frijol. ...............................................................................43

Figura 4-4. Montaje experimental utilizado durante el proceso de hidrólisis enzimática. ...............44

Figura 4-5. Determinación de la actividad antibacteriana de los hidrolizados totales y fracciones

peptídicas. ...............................................................................................................................47

Figura 4-6. Estructura química (a) del radical libre difenilpicrilhidrazilo y (b) del compuesto estable

difenilpicrilhidrazina (Molyneux, 2004). ..................................................................................48

Figura 4-7. Reacción de formación del radical libre ABTS+. ..............................................................49

Figura 4-8. Reacción de decoloración del radical libre DMPD+ (Chagas y col., 2009). ......................50

Figura 4-9. Reacción quimioluminiscente llevada a cabo por el radical libre 3-aminoptalatohidrazilo

(Douglas y Garley, 2010). .........................................................................................................51

Figura 4-10. Montaje experimental del equipo de quimioluminiscencia. ........................................52

Figura 5-1. Semilla de frijol de las tres variedades estudiadas en este trabajo. ...............................56

Figura 5-2. SDS-PAGE del concentrado de proteínas de frijol de las variedades FNP, FAH y FPS en

condiciones no reductoras y reductoras. Gel al 15 % de acrilamida con 5 µg de proteína por

pozo. ........................................................................................................................................61

Figura 5-3. Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida y dodecil-sulfato de sodio del

concentrado de proteínas de frijol. .........................................................................................63

Figura 5-4. SDS-PAGE al 15 % de los concentrados proteicos y los hidrolizados totales de proteínas

de frijol. ...................................................................................................................................67

Índice

15


Figura 5-5. SDS-PAGE al 18%, de los péptidos obtenidos de la ultrafiltración de los hidrolizados de

frijol a) negro plus, b) azufrado higuera y c) pinto Saltillo. ......................................................68

Figura 5-6. Comparación de la actividad antioxidante de los hidrolizados totales y las fracciones

peptídicas de hidrolizados de proteína de frijol determinada por los cuatro métodos. ..........84

Figura 5-7. Inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina con el hidrolizado total y las

fracciones peptídicas de proteínas de frijol. ............................................................................86

Figura 5-8. Cromatografía de liquídos de alta eficiencia (HPLC) del perfil de separación de péptidos

la fracción f1-3 de: a) FNP, b) FAH y c) FPS. .............................................................................88

Figura 5-9. Actividad antioxidante de los trece grupos de péptidos colectados por HPLC del perfil

de separación de péptidos la fracción f1-3 de: a) FNP, b) FAH y c) FPS; determinada por el

método de quimioluminiscencia. ............................................................................................89

Figura 5-10. Cromatografía de la separación individual de péptidos de los grupos a) 40A y b) 45A

del FAH. ...................................................................................................................................91

Figura 5-11. Comparativo de la actividad antioxidante de la fracciones (FAH f<3), grupos de

péptidos (40A y 45A), picos (4A y 10A) y picos puros colectados por HPLC.............................92

Figura 5-12. Resultados del análisis de espectrometría de masas de la muestra 4A. .......................93

Figura 5-13. Resultados del análisis de espectrometría de masas de la muestra 10A. .....................94

Figura 5-14. Posición de péptidos con actividad antioxidante en la faseolina. ................................96

Figura 5-15. Posición de péptidos con actividad antioxidante en la lectina. ....................................97

Introducción

16


1. Introducción

1.1 Particularidades e importancia del frijol

1.1.1 El frijol común (Phaseolus vulgaris L.)

El frijol es una especie perteneciente a las leguminosas que es cultivada y consumida como

parte de la dieta del ser humano por su alto contenido de proteínas (Boye y col., 2010)

principalmente en países en desarrollo como América latina (Camacho-Espinoza y col., 2010), y

algunas regiones de Europa, Asia y África (Makri y Doxastakis, 2006).

En México los estados más ricos en especies de esta familia son Oaxaca y Chiapas (Lutz y Edel-

León, 2009). Además, en nuestro país se han encontrado vestigios de domesticación de cinco

especies de leguminosas comestibles: Phaseolus vulgaris (frijol común), P. coccineus (ayocote), P.

acutifolius (alubia), Phaseolus lunatus (lima o furuna) y P. polyanthus (botil) (Fraile y col., 2007). En su

composición se encuentran grupos importantes de aminoácidos, aunque su valor nutricional es

limitado por su deficiencia en aminoácidos sulfurados (metionina y cisteína) y triptófano (Carrasco-

Castilla y col., 2012), en la dieta de los mexicanos dicha carencia es compensada con el consumo de

maíz (Barrón-Contreras, 2006).

La familia Leguminosae comprende alrededor de 650 géneros y 18,000 especies en el mundo,

ésta es una de las seis familias de angiospermas más diversas que existen (Fraile y col., 2007). El frijol

es una especie perteneciente a las leguminosas y su información taxonómica se presenta a

continuación (SIOVM, 2011). Reino: Plantae, División: Magnoliophyta, Clase: Magnoliopsida, Orden:

Fabales, Familia: Fabaceae, Género: Phaseolus L. y Especie: P. vulgaris L.

Figura 1-1. Cultivo y vaina del frijol común (Phaseolus vulgaris L.).

http://3.bp.blogspot.com/_SFypYTh6fdY/SNhnkrJCcEI/AAAAAAAAACo/JiWSQ9LKO3Y/s1600-h/rg16.jpg

Introducción

17


El fruto de las leguminosas es la legumbre, nombre con que se designan las semillas

encerradas en una vaina (Figura 1-1), también nos encontramos con lomentos, es una falsa legumbre,

los frutos de las leguminosas pratenses tienen muy diferentes formas, siendo los más característicos

las legumbres esféricas, aovadas, alargadas o espiraladas, recubiertas de costillas, espinas, verrugas,

articulados (White y González, 1990).

1.1.2 El cultivo de frijol en México

En México los cuatro cultivos principales por superficie sembrada son: maíz, frijol, sorgo y trigo.

Después del maíz (52 %), el 14 % de la superficie de total de cultivo es utilizada para la siembra de las

cinco especies ancestralmente domesticadas de frijol, el 95 % es para el cultivo de frijol, debido a que

en éste existe una amplia variación de color, tamaño, forma de grano, así como hábito de crecimiento

y precocida, en intervalo de adaptación y potencial de producción, en calidad comercial y nutritiva

(SIAP, 2013).

Ya que el frijol ha sido cultivado a nivel mundial desde épocas ancestrales, éste ha tomado gran

importancia en varios países; en 2001 Nigeria fue el principal productor de fríjol en el mundo, desde

2002 hasta 2009 Brasil ha ocupado ese lugar, y de manera invariable México ha ocupado el quinto

lugar en este grupo de productores (FAO, 2013). En nuestro país los estados productores de frijol son:

Zacatecas, Sinaloa, Durango, Chihuahua y Nayarit (COVECA, 2012). India es el principal país

importador de frijol seguido de Brasil y Estados Unidos, México ocupa el octavo lugar (FAO, 2013).

En México después del maíz, el frijol es la semilla a la que más familias recurren para

complementar su alimentación. El consumo per cápita de frijol en México de 1994 a 2005 oscila entre

10 y 15 kg anuales, curiosamente el incremento en la producción anual coincide con el incremento en

el consumo (SIAP, 2013). Por lo que, se ha reportado que la producción nacional no es suficiente para

cubrir la demanda por lo que se ha recurrido a importar de países como Estados Unidos y Canadá (96

% y 4 % de las importaciones, respectivamente). Durante este periodo las variedades importadas

fueron en su mayoría de frijol negra, seguidas de las variedades de frijol pinto y otras variedades con

testa de colores claros (Figura 1-2).

Este asunto representa un problema, ya que depender de las importaciones significa perder

autosuficiencia alimentaria, situación que no es recomendable ya que más de 100 millones de

mexicanos consumen frijol (Borja-Bravo y García-Salazar, 2008).

Introducción

18


Figura 1-2. Variedades de frijol utilizadas en este trabajo.

a) negro plus, b) azufrado higuera y c) pinto Saltillo.

1.1.3 Importancia de las semillas de frijol en la alimentación

La mayoría de las leguminosas han sido explotadas a gran escala lo son por sus semillas, varias

de las cuales han sido alimentos básicos de la dieta desde tiempos ancestrales en ciertas regiones del

mundo, como es el caso del frijol común, en el sur de México y Centroamérica (Drago-Serrano y col.,

2006). Varios frijoles (género Phaseolus) se domesticaron desde épocas muy antiguas y dieron pie al

desarrollo de civilizaciones en nuestro país y otros lugares de América. Son desde entonces las

leguminosas base en la dieta mexicana, especialmente el frijol común, que fue importante

componente de la dieta en Mesoamérica y hoy es, sólo después del maíz, la planta más cultivada en

México e importante fuente de proteínas, sobre todo para las poblaciones de bajos recursos (Borja-

Bravo y García-Salazar, 2008).

El frijol es probablemente la leguminosa más importante en Latinoamérica y África, ya que en

estas zonas geográficas las proteínas de origen animal no son ampliamente consumidas y por lo

regular son sustituidas con frijoles para satisfacer los requerimientos proteínicos (Delgado-Sánchez y

col., 2006), se considera además que el frijol común es una fuente importante de aminoácidos ya que

contiene 19 de ellos en variadas proporciones.

La composición de frijol varía de acuerdo con las condiciones de cultivo y la localidad de

siembra, pero el perfil de antocianinas quienes determinan el color del frijol se conserva. México,

como parte de Mesoamérica, es considerado uno de los centros de origen más importantes de varios

tipos de frijol, entre los que destaca por su valor comercial Phaseolus vulgaris L., especie donde se

encuentra el frijol negro que es el de mayor consumo nacional (Sánchez y col., 2001).

a) b) c)

Introducción

19


1.2 Las proteínas y su función en el organismo

1.2.1 Concepto general de proteínas

Las proteínas son moléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. El término

proteína significa “de primera calidad”, debido a su importancia estructural y nutricional en los seres

vivos. Las proteínas pueden ser clasificadas de diferentes formas; por sus propiedades físico-químicas

las proteínas se clasifican en: proteínas simples, que por hidrólisis dan solo aminoácidos o sus

derivados; proteínas conjugadas, que por hidrólisis dan aminoácidos acompañados de sustancias

diversas, y proteínas derivadas, sustancias formadas por desnaturalización y desdoblamiento de las

anteriores.

1.2.2 Importancia de las proteínas

Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más

versátiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme

cantidad de funciones diferentes.

Las proteínas son necesarias para la vida, sobre todo por su función plástica, pero también por

sus funciones biorreguladoras y de defensa. Las proteínas son el principal componente estructural y

funcional de las células y tienen numerosas e importantes funciones dentro del organismo que van

desde su papel catalítico (enzimas) hasta su función en la motilidad corporal (actina, miosina),

pasando por su papel mecánico (elastina, colágeno), de transporte y almacén (hemoglobina,

mioglobina, citocromos), protección (anticuerpos) y reguladora (hormonas), (Sánchez-Contreras,

2007). Su característica más importante es que contienen nitrógeno, siendo el contenido medio de

este elemento de un 16 %. Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas de unidades

estructurales, los aminoácidos. Estos aminoácidos se unen por medio de enlaces peptídicos entre los

grupos carboxilo y el grupo α-amino (imino), con pérdida de agua. La secuencia de aminoácidos que

componen una proteína constituye su estructura primaria, de vital importancia desde el punto de

vista nutricional. También tienen importancia nutricional, aunque en menor medida, la estructura

secundaria y terciaria (Sánchez-Contreras, 2007).

Las proteínas se clasifican atendiendo a distintos puntos de vista como son: solubilidad,

composición, forma, propiedades físicas, función y estructura tridimensional. La proteína supone

aproximadamente el 17 % de la masa corporal de un individuo. A pesar de su diversidad funcional

Introducción

20


(enzimática, de transporte y almacén, mecánica, motilidad, protección y reguladora) un 25 % es

proteína estructural y hemoglobina (Martínez-Agustín y Martínez de Victoria-Muñoz, 2006).

Las proteínas están conformadas por cadenas mayores a 70 aminoácidos, éstos son

fundamentales para el buen funcionamiento del organismo. Para una persona adulta son ocho los

aminoácidos esenciales (fenilalanina, leucina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, triptófano y

valina), mientras que durante el crecimiento se precisan dos más (arginina e histidina, durante la

infancia y adolescencia); y los aminoácidos no esenciales (alanina, cisteína, cistina, glicina,

hidroxiprolina, prolina, serina, tirosina, ácido aspártico, y glutámico), (Sánchez-Contreras, 2007).

1.2.3 Proteínas de origen animal

Las proteínas de origen animal poseen un alto valor biológico desde el punto de vista

nutricional, ya que de ellas se obtiene la gran mayoría de nitrógeno y aminoácidos necesarios para el

buen funcionamiento del organismo humano. Se han realizado estudios en los cuales se ha

determinado que los alimentos de origen animal no presentaron aminoácidos limitantes y las cifras

de digestibilidad y disponibilidad se encontraron en un intervalo que varió de 94 % en las carnes a 97

% en el huevo, situación que no es posible observar en las proteínas de fuentes vegetales. La soya, el

garbanzo, el pistacho y la remolacha son los únicos alimentos vegetales que no contienen

aminoácidos limitantes, sin embargo, presentaron un intervalo del 48 % al 78 % de digestibilidad y

disponibilidad (Suárez-López y col., 2006). Algunas fuentes de proteínas animales son: huevo, leche y

sus derivados, hemoglobina, todo tipo de carne, y músculo de productos marinos (Vrese y

Schrezenmeir, 2008).

1.2.4 Proteínas de origen vegetal

La búsqueda de fuentes alternativas de proteínas se ha convertido, a lo largo de las últimas

décadas, en una importante tendencia de investigación, no solo para encarar la creciente demanda

de proteínas sino también para conseguir cultivos alternativos que sustituyan a las proteínas de

origen animal, capaces de suplementar proteína de alta calidad y prevenir la malnutrición. Las

proteínas vegetales en general, gozan de aceptación mundial y son valoradas por sus atributos

sensoriales y nutricionales (Montaño-Pérez y Vargas-Albores, 2002). Algunas fuentes de proteínas

vegetales son: la semillas de girasol, lupinos, frijol, haba, alverjón, garbanzo, chícharos y otras semillas

(Vrese y Schrezenmeir, 2008).

Introducción

21


En su forma natural las proteínas vegetales no tienen las mismas propiedades que después de

un proceso de fraccionamiento, es por ello que la hidrólisis de proteínas de fuentes alimenticias tiene

gran importancia porque permite explicar la contribución de cada fracción a la calidad nutricional y

sus propiedades funcionales. La calidad de una proteína es importante, seguida de la digestibilidad,

pues no todas las proteínas son digeridas, absorbidas y utilizadas en la misma medida por el

organismo humano (Padilla y col., 2010; Möller y col., 2008).

Una ventaja adicional al consumo de proteínas de origen vegetal es que se ha reportado que la

inclusión de leguminosas en la dieta permite la prevención de varias enfermedades metabólicas como

diabetes mellitus, enfermedades coronarias cardiacas y cáncer de colón, debido a su importante

contenido de fibra, fenoles y otros compuestos como son los péptidos derivados del proceso de

hidrólisis (Siddiq y col., 2010).

1.3 Proceso de hidrólisis enzimática

1.3.1 Hidrólisis de proteínas

La hidrólisis proteica se realiza para cortar la proteína original en fragmentos y modificar sus

funciones. Normalmente su proceso se lleva a cabo en un reactor, con control de agitación, pH,

temperatura y tiempo del proceso. El sustrato se disuelve en agua hasta que el pH y la temperatura

se estabilizan; a continuación se agrega la proteasa dando inicio a la hidrólisis. A medida que ésta

progresa se produce una disminución del pH debido a la rotura de los enlaces peptídicos. En los casos

de hidrólisis enzimática el pH debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante la adición de

base diluida. Para finalizar la hidrólisis proteica la enzima puede ser inactivada con calor, mediante

una disminución del pH o con una combinación de ambos. O también puede ser retirada del medio

mediante filtración y la proteína finalmente precipitada (Alvarado-Carrasco y Guerra, 2010).

En un proceso de hidrólisis se deben tomar en consideración varios factores como: las

características del reactor, volumen de operación, control de agitación, pH, temperatura, tiempo de

reacción, tipo y concentración de sustrato, especificidad y concentración de la enzima, que son

importantes para la obtención de hidrolizados con características específicas de grado de hidrólisis,

tamaño de fracciones de proteína, aminoácido donde se ubica el sitio de acción y otros factores

(Benítez y col., 2008).

Introducción

22


1.3.2 Importancia de los hidrolizados de proteína

El término propiedades funcionales se aplica a los ingredientes alimenticios y se define como

toda propiedad no nutricional que influencia la utilidad de un ingrediente en un alimento. La mayor

parte de las propiedades funcionales influyen sobre el carácter sensorial del alimento, pero también

pueden tener un papel decisivo en el comportamiento físico de los alimentos o de los ingredientes

alimenticios durante su preparación, transformación o almacenamiento (Belén-Camacho y col.,

2007); desde el punto de vista técnico-funcional de las proteínas, estas propiedades tienden a

mejorar al ser sometidas a un proceso de hidrólisis (Acuña-Goycolea, 2001). La hidrólisis proteica se

realiza para modificar las funciones propias de la proteína. En los hidrolizados de proteína se

potencian diversas características funcionales, tales como viscosidad baja, mayor capacidad de

agitación, dispersión y alta solubilidad, que les conceden ventajas para el uso en muchos productos

alimenticios, respecto a las proteínas originales (Chung y col., 2008; Guadix y col., 2000).

Recientemente se ha incrementado el interés del estudio de péptidos debido a la potencial

actividad biológica (como: antihipertensivos, antibacterianos, anticariogénicos, antiulceratívos,

anticarcinogénicos, anticoagulantes, antitrombóticos y antioxidantes) que han mostrado diversos

fragmentos proteicos obtenidos vía hidrólisis enzimática con variación de tipo de enzima y fuente de

obtención. Dichos péptidos se han obtenido de proteínas animales como: leche, huevo, plasma

sanguíneo, músculo de pescado; o fuentes vegetales como la soya, garbanzo, girasol, colza, lupino,

amaranto y otras semillas (Torruco-Uco y col., 2009). En el caso del presente trabajo se utilizó una

fuente de proteína vegetal, el frijol común, quien contiene entre 13 - 27 % de proteína (Zubirán,

1996) y que puede llegar a concentrarse hasta el 80 % según los reportes previos (Hernández-Álvarez

y col., 2010).

1.3.3 Enzimas proteolíticas

Actualmente se encuentran disponibles comercialmente muchas proteasas grado alimenticio.

Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen, (animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su

modo de acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base en su sitio catalítico. Las endo-proteasas

hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario,

eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos (Villanueva y col., 1999). La naturaleza

del centro catalítico de las proteasas difiere de acuerdo con los aminoácidos y otros ligandos que

intervienen en la formación del complejo enzima-sustrato. El centro activo contiene aminoácidos o

Introducción

23


bien cationes metálicos que promueven la catálisis, denominándose proteasas serinicas, proteasas

cisteínicas, proteasas aspárticas, según intervengan los aminoácidos serina, cisteína o ácido aspártico

(Benítez y col., 2008).

Las primeras enzimas proteolíticas utilizadas en la industria alimentaria fueron proteasas

pancreáticas de origen animal, si bien cada vez están adquiriendo mayor importancia las de origen

bacteriano o fúngico. En el Cuadro 1-1 se presentan algunas de las proteasas comerciales de grado

alimentario disponibles en el mercado y se indica la especificidad de las mismas. Los preparados

enzimáticos suelen ser mezclas de estas enzimas y normalmente se venden en estado líquido o como

polvos (Benítez y col., 2008). En este trabajo se utilizó una serinproteasa de origen bacteriano, la

Alcalasa® que no presenta especificidad, por lo que genera una amplia gama de péptidos.

Cuadro 1-1. Proteasas comerciales grado alimenticio.

Tipo de proteasa Nombre Fuente Temp.

(°C)

Intervalo

de pH

Sitio de acción

catalítica

Serínica

Animal

Bacteriana

Tripsina

Quimiotripsina

Elastasa

Substilisin, Carlsberg,

Alcalasa

Subst. BPN.

Substilisin Novo

Porcino, bovino

Bacillus licheniformis

Bacillus

amyloliquefaciens

30 – 60

45 – 55

50 – 60

40 – 55

7 – 9

8 – 9

6 – 8

6 – 10

6 – 10

Lis o Arg

Trp o Tir, Fe, Leu

Ala

AAhf

Cisteínica

Plantas

Papaína

Bromelaína

Ficina

Papaya

Piña

Látex de ficus

40 – 75

20 – 65

5 – 8

5 – 8

5 – 8

Fe o Val, Leu

AAhf

Aspárticas

Animal

Fúngico

Pepsina

Quimosina

Aspergilopeptidasa A

Newlasa

Porcino, bovino

Becerro

Aspergillus saitoi

Rhizopus sp.

35 – 50

40 – 50

1 – 4

4 – 6

2 – 5

3 – 6

Fe o Tir, Leu,

Trp o Fe, Tir

Glu, Asp, Leu

Similar a la pepsina

Metalo proteasas

Animal

Bacteriana

Carboxipeptidasa A

Neutrasa ®

Termolisina

Páncreas

Bacillus amyloliquefaciens

B. thermoproteolyticus

40 – 55

7 – 8

6 – 7.5

7 – 9

Carbonilo del AA

terminal (excepto Pro,

Arg, Lis)

Fe, Leu, Val

Ile, Leu, Val, Fe

AAhf = AAs hidrofóbicos Fuente: Benítez y col., 2008

Introducción

24


1.4 Actividad biológica y funcionalidad de péptidos

1.4.1 Alimentos funcionales

En la actualidad, los péptidos obtenidos tanto de fuentes animales como vegetales han sido

identificados y algunos sintetizados químicamente, si éstos presentan alguna actividad biológica. Se

han considerado como “alimentos funcionales” a aquellos en los cuales se ha modificado su

composición y en ellos se encuentran presentes por adición o enriquecimiento algunos compuestos

modificando los procesos usuales de manufactura. Los alimentos funcionales ejercen su actividad en

múltiples sistemas, especialmente el gastrointestinal, cardiovascular e inmunológico. Se comportan

como potenciadores del desarrollo y la diferenciación, moduladores del metabolismo de nutrientes,

la expresión génica y el estrés oxidativo (Silveira y col., 2003). Algunas actividades biológicas que

pueden presentar las proteínas alimenticias y sus péptidos son: la actividad antioxidante, la

antitumoral, la antitrombótica, la antibacteriana y la inhibidora de la enzima convertidora de la

angiotensina (Möller y col., 2008).

Algunos alimentos funcionales pueden contener péptidos bioactivos obtenidos vía hidrólisis

enzimática de proteínas, estos péptidos tienen la capacidad de mejorar la bio-disponibilidad de las

proteínas propiciando un efecto benéfico al consumirlos, ya sea a través de los mismos productos o

“creando” nuevos a través de la adición o fortificación de péptidos. Éste tipo de procedimientos se ha

reportado para productos de origen animal, en especial para el grupo de los lácteos (Dziuba y

Darewicz, 2007; Figueroa-Hernández, 2007; Norton y col., 2006; Drago-Serrano y col., 2006; Torres-

Llanez y col., 2005; Meisel y Bockelmann, 1999; Knorr, 1998; Vrese y Schrezenmeir, 2008).

También, se ha reportado que algunos compuestos responsables de la funcionalidad de

alimentos son los inhibidores de proteasas que se encuentran en todas las legumbres, sobre todo en

la soya y se encargan de que las semillas no hagan uso de sus reservas proteicas hasta su

germinación. Estas sustancias pueden inhibir también enzimas proteolíticas por lo que, hasta hace

poco, se las consideraban sustancias nocivas. Sin embargo, en la actualidad se ponderan sus efectos:

como protectores evitando la proliferación de células cancerígenas, actuando como antioxidantes,

reguladores de la glucemia y antiinflamatorios (Palencia-Mendoza, 1999; Hsieh y col., 2010).

En menor grado, pero no por ello dejan de ser importantes son las antocianinas que

pertenecen al grupo de los compuestos fenólicos (flavonoides) y se caracterizan por su solubilidad en

agua y por sus colores brillantes. Se encuentran en las variedades de frijol con testa de color rojo,

rosa y negro, y además de contribuir en su identificación debido a sus diferentes coloraciones; las

Introducción

25


antocianinas tienen una gran actividad antioxidante que inhibe los radicales libres de las células,

previniendo enfermedades como el cáncer, arterosclerosis e inflamaciones. La presencia de

antocianinas en el grano de frijol negro lo hace un producto potencial para el suministro de

colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el estudio de los pigmentos del frijol negro (Phaseolus

vulgaris L.) ha despertado gran interés (Salinas-Moreno y col., 2005).

1.4.2 Péptidos con actividad biológica

En los últimos años se han realizado hidrolizados de proteínas provenientes de diversas fuentes

con la intención de obtener péptidos con potencial bioactividad ya que se ha estudiado que derivados

peptídicos pueden ser biológicamente activos (Benítez y col., 2008); los péptidos consisten en

cadenas cortas de 2 a 15 residuos aminoácidos (Torruco-Uco y col., 2009). Y se sabe que el consumo

diario de este nutriente por medio de las leguminosas, en los países en vías de desarrollo, éstas

contribuyen con el 10 % de las proteínas diarias y el 5 % del aporte energético en la dieta.

Recientes investigaciones han demostrado que los péptidos de origen animal poseen una o

varias actividades biológicas (Möller y col., 2008), incluso ha sido posible determinar la secuencia de

aminoácidos responsable de dichas actividades (Srihongthong y col., 2012; Gómez-Ruiz y col., 2008).

En este sentido la bioactividad de los péptidos de proteína de las diferentes fuentes han presentado

su funcionalidad como: antihipertensivos (Megías y col., 2009; Torruco-Uco y col., 2009; Valdéz-Ortíz

y col., 2012), antibacterianos (Srihongthong y col., 2012), anticariogénicos (Aimutis, 2004),

antiulceratívos (Tavares y col., 2011), anticarcinogénicos (Cardador-Martínez y col., 2002),

anticoagulante (Xiong y col., 2009), antitrombóticos (Fraga-Silva y col., 2010; Xiong y col., 2009) y

antioxidantes (Alemán y col., 2011; Valdés y col., 2011; Valdéz-Ortíz y col., 2012) por mencionar

algunas que incluso han sido identificados y sintetizados químicamente (Yamada y col., 2008).

En cuanto a los alimentos de origen vegetal, se han estudiado una gran variedad de

hidrolizados de proteínas (garbanzo, soya, chícharo, lenteja, frijol, entre otras) con la finalidad de

determinar si además de su alto contenido nutricional, poseen alguna actividad biológica, la cual

resultaría en un beneficio para la salud del ser humano que lo consume. Dentro de las propiedades

farmacológicas más reportadas de las diversas leguminosas destacan la actividad antioxidante y la

inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (Möller y col., 2008).

Introducción

26


1.5 Aplicación y función de péptidos en la salud

1.5.1 Problemática actual y riesgos en la salud

En la actualidad la población se encuentra propensa a diversos padecimientos desencadenados

por procesos oxidativos celulares, la presencia de agentes patógenos en el ambiente o desequilibrio

en la regulación de funciones básicas como la presión sanguínea. Por lo tanto, la administración de

diversos agentes terapéuticos para el control de estos padecimientos es una práctica frecuente. Sin

embargo, la ingesta de estos está relacionada con efectos adversos derivados del uso individual o

como resultado de su interacción farmacológica durante su uso. En este sentido, la capacidad de

diversos péptidos de regular estos procesos representa una alternativa segura y sencilla para el

tratamiento de los padecimientos asociados al envejecimiento y estrés (Gómez-Ruiz y col., 2008).

1.5.2 Actividad antibacteriana como control de patógenos

El ser humano es susceptible a enfermedades causadas por microorganismos patógenos que

pueden resultar desde inofensivos hasta letales dependiendo del número y la naturaleza de los

mismos (Haque y Chand, 2008). Los compuestos antibacterianos en su mayoría son de origen

sintético, sin embargo, en la actualidad las personas han demandado por compuestos

antibacterianos de origen natural (aceites esenciales, bacteriocinas, etc.) con la finalidad de evitar las

consecuencias a largo plazo que pudieran contener los productos químicos (Tessera y col., 2012).

Existen pocos trabajos referentes al potencial antibacteriano de proteínas e hidrolizados de

proteínas, incluso no se ha establecido el mecanismo de acción que ejercen, aunque se han

planteado algunas propuestas como la interferencia en la síntesis de enzimas metabólicas y la

alteración de la membrana celular ya sea alterando la permeabilidad o lisándola mediante la

formación de canales o poros (Montaño-Pérez y Vargas-Albores, 2002; Wong y Ng, 2005).

Es posible que la actividad antibacteriana se encuentre presente en los hidrolizados de

fuentes de origen vegetal ya que se ha demostrado que los péptidos de origen animal pueden ser

usados como agentes antibacterianos y antifúngicos (Chan y col., 2012). Para esto, las propuestas del

mecanismo de acción ejercida por los péptidos antimicrobianos son las siguientes: a) interferir en la

síntesis de enzimas metabólicas o del DNA, como en el caso de algunos péptidos de origen

microbiano, cuyo proceso aún no es bien conocido; o b) actuar directamente a nivel de la membrana

celular ya sea alterando la permeabilidad o lisándola mediante la formación de canales o poros,

como en el caso de los péptidos α-hélice (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998). Aunque se

Introducción

27


desconocen muchos detalles sobre los mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos α-

hélice, se considera que actúan directamente en la membrana celular y que su secuencia de

aminoácidos es importante (Matsuzaki, 1998), ya que si se sustituyen aminoácidos que alteren la

polaridad del péptido, su actividad disminuye. Aparentemente no requieren receptores específicos,

como se ha demostrado al sustituir aminoácidos por sus correspondientes D-enantiómeros sin

alterar su actividad, este comportamiento molecular y su carácter catiónico hacen que los péptidos

presenten una mayor afinidad por los fosfolípidos ácidos de las bacterias Gram(-) y polisacáridos de

las bacterias Gram(+), que por los fosfolípidos anfipáticos de las membranas de células de

mamíferos; lo anterior permite explicar la falta de citotoxicidad para las células animales y permite

proponer a los péptidos como agentes terapéuticos altamente específicos (Matsuzaki, 1998; Nissen-

Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998; Vaucher y col., 2010).

En general, se ha propuesto que el mecanismo de acción de los péptidos antibacterianos está

dado por los siguientes pasos (Figura 1-3): la reacción inicia con la unión entre algunos péptidos y los

fosfolípidos ácidos de las membranas microbianas mediante fuerzas electrostáticas. En seguida, los

monómeros de los péptidos anfipáticos se acomodan en la superficie de la membrana de manera

que la carga positiva de los aminoácidos básicos concuerde con las cabezas de fosfolípidos con carga

negativa; y cuando la concentración relativa entre el péptido y el lípido localmente es baja el péptido

tiende a orientarse paralelamente en la membrana y es inactivo. Cuando la concentración local

relativa del péptido se incrementa, éste tiende a tomar una posición perpendicular a la membrana y

se inserta, orientando los residuos hidrofóbicos hacia la región hidrofóbica de la membrana. La

capacidad de “aceptación” de la membrana por una mayor cantidad de péptido dependerá de la

composición lipídica y propiedades fisicoquímicas de la misma. Esto explica los diferentes grados de

susceptibilidad de una célula por un determinado péptido o grupo de péptidos, y la especificidad

hacia ciertas bacterias. Finalmente, la inserción de los péptidos en la bicapa lipídica alteran la

permeabilidad de la membrana o bien ocurre la lisis celular por la presencia de los poros (Matsuzaki,

1998; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998; Huang, 2000).

Introducción

28


Figura 1-3. Representación del mecanismo de acción de los péptidos antibacterianos del tipo alfa hélice. Dónde: a) Conformación lineal del péptido en solución acuosa donde se polarizan los aminoácidos

hidrofóbicos y los aminoácidos, b) La interacción electrostática entre los lipopolisacáridos de la membrana microbiana y los péptidos, y c) Inserción de péptidos en la membrana que dan lugar a la formación de canales

por los que fluyen elementos celulares (Fuente: Montaño-Pérez y Vargas-Albores, 2002).

1.5.3 Actividad antioxidante como control de la oxidación celular

Cada día aumentan las enfermedades crónicas y neurodegenerativas como la arteriosclerosis,

diabetes, cáncer, Alzheimer, envejecimiento prematuro, problemas cardiovasculares y el mal de

Parkinson asociadas a la presencia o producción de radicales libres, en la actualidad para

contrarrestar el efecto nocivo de los radicales libres se emplean sustancias antioxidantes de origen

natural o sintético (Jiménez-Arellanes y col., 2011). La oxidación celular es un proceso natural de

envejecimiento, debido a los radicales libres generados por una mala alimentación, la contaminación

del medio ambiente, la radiación solar y otros factores, sin embargo, se puede retrasar este proceso

con la presencia de compuestos antioxidantes en el organismo los cuales poseen la cualidad de

estabilizar a los radicales libres mediante la cesión de electrones (Medina-Godoy y col., 2012). La

caracterización de la funcionalidad antioxidante de los péptidos provenientes de diferentes

variedades de frijol permitiría su utilización como ingredientes en la elaboración de alimentos

funcionales y con ello obtener un efecto beneficioso para el ser humano produciendo una mejora en

su salud o reduciendo el riesgo de padecer alguna enfermedad asociada a los radicales libres.

Los antioxidantes son compuestos que al retardar o inhibir la degradación oxidativa de las

moléculas orgánicas, ayudan a prevenir la formación de colores y olores desagradables; estos pueden

Introducción

29


ser de origen natural o sintético, pero la mayoría de los utilizados comercialmente son de origen

sintético. Debido a que algunos de los antioxidantes sintéticos, son altamente inestables bajo las

condiciones de trabajo y en ciertos casos ocasionan efectos adversos sobre la salud de animales de

experimentación, los investigadores han intentado encontrar sustancias más estables, eficaces,

versátiles y/o menos tóxicas (Vásquez-Cardeño y col., 2007).

El daño oxidativo también tiene una gran importancia en los alimentos. Una consecuencia

habitual es la peroxidación lipídica que produce rancidez, aparición de sabores indeseables para el

consumidor y disminución de la vida comercial del consumidor (Liu y col., 2005). Para evitar estos

problemas la industria de alimentos utiliza antioxidantes de origen sintético, sin embargo, no se

descarta el empleo de antioxidantes de origen natural (carotenoides, compuestos fenólicos, vitamina

E) aún con la desventaja de ser de baja capacidad antioxidante y en su mayoría insolubles en sistemas

acuosos.

Se ha descrito el mecanismo de acción de los péptidos antioxidantes basado en su capacidad de

secuestrar radicales libres o su capacidad de formar complejos con los iones metálicos (Hernández-

Ledesma y col., 2005). Éstos péptidos actúan impidiendo que otras moléculas se unan a especies

reactivas del oxígeno, al interactuar más rápido con los radicales libres que éstos con el resto de las

moléculas presentes, es decir, el péptido actúa cediéndole un electrón al radical libre una vez que se

colisionan en un determinado microambiente de la membrana plasmática, citosol, núcleo o líquido

extracelular (Ruiz-Ruiz y col., 2013b).

Algunos trabajos han demostrado que los hidrolizados totales (HT) de frijol negro Jamapa

pueden tener una función antioxidante in vitro, incluso existen reportes donde se ha trabajado con

fracciones peptídicas de otro tipo de vegetales como chícharos, garbanzos y semillas de girasol (Ruiz-

Ruiz y col., 2013a). Además, en recientes estudios se ha demostrado que los hidrolizados

provenientes de fuentes animales como: huevo, leche y proteínas de pescado, poseen alto potencial

antioxidante (Srihongthong y col., 2012) y hay un menor número de trabajos reportados con fuentes

vegetales (Fritz y col., 2011; Yust y col., 2012), en particular con fracciones peptídicas de frijol. Ruiz-

Ruiz y col. (2013a) demostraron que al disminuir el peso molecular (PM) de los péptidos contenidos

de las fracciones proteicas, la actividad antioxidante se incrementó respecto a los hidrolizados

totales.

Se ha demostrado que las leguminosas pueden ser una fuente importante de péptidos

antioxidantes, además se ha propuesto que si tienen actividad biológica y resisten la digestión y

absorción in vivo, entonces podrían ser usados en la elaboración de alimentos funcionales para la

Introducción

30


prevención de distintas enfermedades y reducir el daño oxidativo de productos alimenticios

aumentando su vida útil (Vioque y col., 2000).

La cuantificación de la actividad antioxidante de un compuesto o de una mezcla se puede

realizar por los métodos de decoloración del radical libre 2,2-difenil-1- picril hidracilo (Marxen y col.,

2007; Mohamad y col., 2004), o por el atrapamiento de los radicales libres ABTS, DMPD o luminol (Ré

y col., 1999; Fogliano y col., 1999; Georgetti y col., 2003).

1.5.4 Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina como control de la

hipertensión

La hipertensión arterial o presión arterial alta afecta alrededor de mil millones personas en

todo el mundo (Nakahara y col., 2010). La hipertensión es un padecimiento multifactorial y uno de

los mecanismo más estudiados para su regulación y blanco de acción farmacológica es el sistema

renina-angiotensina, conformado por la renina, la enzima convertidora de angiotensina (ECA), la

aldosterona y las angiotensinas I (AGI) y II (AGII) (Keidar y col., 2007).

Y se ha demostrado que péptidos derivados de la hidrólisis enzimática de diferentes alimentos

en particular de origen animal tienen la capacidad de inhibir de forma selectiva a la ECA in vitro e in

vivo (Yamada y col., 2008). En algunos casos la cadena de aminoácidos de los péptidos que han

demostrado inhibir la ECA han sido elucidadas, resultando ser una alternativa segura y potencial para

el control de la hipertensión arterial (Rui y col., 2013). Se ha reportado que los hidrolizados totales y

las fracciones peptídicas de frijol negro Jamapa tienen capacidad de inhibir la ECA-I (Medina-Godoy y

col., 2012), y ésta actividad no ha sido estudiada con fracciones de péptidos de tamaño conocido de

otras variedades de P. vulgaris. Por lo que el estudio de péptidos de tres variedades de frijol (negro

plus, azufrado higuera y pinto Saltillo) podría abrir nuevas fuentes de péptidos con ésta actividad

biológica.

El mecanismo del sistema renina-angiotensina-aldosterona es el mayor regulador de la

fisiología humana, éste tiene el control de la presión sanguínea, volumen y electrolitos que afectan el

corazón, vasculatura y riñones. El proceso de la angiotensina comienza con las hidrólisis del

angiotensinogen por efecto de la renina para formar el decapéptido angiotensina I (Ang I). La

remoción de dos aminoácidos del carboxilo terminal por efecto de la enzima convertidora de la

angiotensina resulta en la formación de un péptido biológicamente activo, angiotensina II (Ang II). El

incremento en el nivel de Ang II en condiciones patológicas ha sido reportado en diversos sistemas

celulares, es por ello que la reducción de la Ang II es un tema de vital importancia clínica.

Introducción

31


Figura 1-4. Mecanismo de acción de la inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina I (modificado de Keidar y col., 2007).

Keidar y col. (2007) propusieron un posible mecanismo de acción en el cual la Ang II y la ECA

tomaron los roles principales para la inhibición de la Ang I; y en el cual se involucran otras

angiotensinas bioactivas, la Ang (1–7) y ACE2 en un sistema de acción más complejo (Figura 1-4). En

el cual se muestra el siguiente fenómeno: primero los Inhibidores de la enzima convertidora de la

angiotensina (IECA) actúan produciendo un bloqueo competitivo de la ECA. Éstos inhiben también la

endopeptidasa neutra que degrada la bradicinina, por lo que su administración aumenta la

producción de cininas vasodilatadoras. Finalmente, los IECA disminuyen el tono simpático y los

valores plasmáticos de ADN estimulados por la angiotensina II.

La acción antihipertensiva se ejerce primero por la vasodilatación mediada por la bradicinina,

que relaja la musculatura lisa arteriolar, unos 15 días después comienza a actuar el mecanismo

vasodilatador y antiadrenérgico causado por la inhibición de la ECA, de 3 a 6 meses más tarde se

manifiesta la acción antitrófica que poco a poco revierte el crecimiento concéntrico de la media

arteriolar, a medida que esto ocurre se reduce la resistencia vascular periférica, lo que a su vez

impide la esclerosis vascular renal y coronaria (Cachofeiro y col., 1991).

Existen inhibidores de la ECA conocidos, sin embargo, éstos tienden a ser de origen químico y

al controlar la hipertensión llegan a afectar otros órganos. Los IECA conocidos se encuentran

Introducción

32


clasificados según su grupo químico que interactúa con el zinc en: compuestos sulfidrílicos

(captopril), compuestos carboxílicos (enalapril), y compuestos fosfóricos (fosinopril / ceranapril). La

efectividad de los IECA dependerá de la dosis y el organismo a quien le sea administrado. Los IECA

que tienen bien documentado sus beneficios sobre el corazón y a largo plazo son: captopril, enalapril,

lisinopril, ramipril y trandolapril (González-García y col., 2002). Siendo el Captopril® comercial el

medicamento utilizado como control para las pruebas de I-ECA de este trabajo.

1.6 Péptidos identificados como biológicamente activos

Está reportado que los veinte aminoácidos presentes en las proteínas pueden reaccionar con

los radicales libres si la energía de éstos es alta como aquellos que contienen a los radicales hidroxilo.

Entre los aminoácidos más reactivos se incluyen los azufrados (Met y Cys), los aromáticos (Trp, Tyr,

Phe) y los que contienen anillo imidazol como la His (Samaranayaka y Li-Chan, 2011). La mayoría de

los péptidos antioxidantes derivados de fuentes alimentarias presentan intervalos de peso molecular

de 500 a 1800 Da, y con frecuencia presentan restos de aminoácidos hidrofóbicos como Val o Leu en

el amino terminal, así como Pro, His, Tyr, Met y Cys en sus secuencias (Sarmadi e Ismail, 2010).

La secuencia de aminoácidos de algunos péptidos de origen animal identificados con actividad

comprobada se presenta en el Cuadro 1-2, de péptidos obtenidos por vía química en el Cuadro 1-3, y

de péptidos obtenidos de fuentes vegetales en el Cuadro 1-4. En éstos cuadros se observa que la

mayoría de los trabajos existentes son con hidrolizados de proteínas animales además de ser los que

se han investigado desde hace más tiempo, principalmente de proteínas lácteas; seguido de trabajos

con péptidos obtenidos sintéticamente y que han sido comparados con péptidos de origen animal; y

finalmente algunos péptidos obtenidos de fuentes vegetales.

Introducción

33


Cuadro 1-2. Péptidos bioactivos obtenidos de proteínas animales.

Secuencia de aminoácidos Fuente de obtención Actividad biológica Referencia

IPP Proteínas lácteas Inhibición de la ECA-I López-Expósito y col., 2007

VPP Proteínas lácteas Inhibición de la ECA-I López-Expósito y col., 2007

LHLPLP β-caseína Inhibición de la ECA-I López-Expósito y col., 2007

LKKISQ αs2-caseína Inhibición de la ECA-I López-Expósito y col., 2007

PYVRYL αs2-caseína Inhibición de la ECA-I López-Expósito y col., 2007

HEAVNH Hemoglobina Antibacteriana y

antioxidante

Srihongthong y col., 2012

WHKVDVAH Hemoglobina Antibacteriana y

antioxidante

Srihongthong y col., 2012

VKKVLGNP Miosina porcina Inhibición de la ECA-I Katayama y col., 2004

TPIL Caseína Antioxidante Dávalos y col., 2004

TPI Caseína Antioxidante Dávalos y col., 2004

YPFPGPI Tripsina Inhibición de ECA-I,

opioide e

inmunomoduladora

Meisel y Bockelmann, 1999

YGFQNA Pepsina Opioide Meisel y Bockelmann, 1999

FKCRRWQWRMKK

LGAPSITCVRRAF

Pepsina Antibacteriana Meisel y Bockelmann, 1999

MAIPPKKNQDK Tripsina Antitrombótica Meisel y Bockelmann, 1999

RANHPF Ovoalbúmina Antihipertensiva Yamada y col., 2008

El código de aminoácidos se encuentra en el anexo 9.3.

Cuadro 1-3. Péptidos bioactivos sintetizados químicamente.


RPLKPW Sintético Antihipertensiva Yamada y col., 2008

YGLF Sintético Inhibición de la ECA-I y

opioide


TTMPLW Sintético Inhibición de la ECA-I e

inmunomoduladora



Introducción

34


Cuadro 1-4. Péptidos bioactivos obtenidos de proteínas vegetales.


TTYY Soya Antioxidante Beermann y col., 2009

TQVY Arroz Inhibición in vivo de la

ECA-I

Li y col., 2007

KNYRL Haba de mung Inhibición de la ECA-I Li y col., 2006b

VTPALR Haba de mung Inhibición de la ECA-I Li y col., 2006b

KLPAGTLF Haba de mung Inhibición de la ECA-I Li y col., 2006b

LLPHH Soya Antioxidante Wang y González de Mejía, 2005

VNPHDHEN Soya Antioxidante Wang y González de Mejía, 2005

LVNPHDHQN Soya Antioxidante Wang y González de Mejía, 2005

FRDEHLL Endospermo de arroz Antioxidante Zhang y col., 2010

LHDRGDEF Endospermo de arroz Antioxidante Zhang y col., 2010

NRYHE Garbanzo Antioxidante Zhang y col., 2011

PAGPF Colza Antioxidante Bing-Zhang y col., 2009

WPL Trigo sarraceno Antioxidante Ma y col., 2010

VPW Trigo sarraceno Antioxidante Ma y col., 2010

VFPW Trigo sarraceno Antioxidante Ma y col., 2010

PWW Trigo sarraceno Antioxidante Ma y col., 2010


Justificación

35


2. Justificación

El frijol es una de las leguminosas más consumidas en nuestro país. En México es un cultivo

tradicional que se siembra en todas las regiones agrícolas y representa el segundo producto

agrícola alimenticio después del maíz y uno de los alimentos básicos de la dieta en el medio rural,

del mismo modo está documentado que el frijol posee un alto nivel de proteína comparado con

otros productos de origen vegetal, lo que le permite tener competitividad con respecto a otras

fuentes de proteína.

En los últimos años ha existido un creciente interés por la actividad biológica que han

mostrado diversos péptidos obtenidos de la hidrólisis de proteínas de diferentes fuentes animales

como: leche, huevo, plasma de sangre, músculo de pescado; así como también de fuentes

vegetales como: la soya, garbanzo, girasol, colza, lupino, entre otros. En este sentido la

bioactividad de los péptidos de proteína de diferentes fuentes de frijol no ha sido caracterizada

por completo como: antihipertensivos, antioxidantes, y antibacterianos.

Por lo tanto, la obtención de hidrolizados de proteínas de frijol y la caracterización de los

péptidos obtenidos contribuiría con información para su posible utilización como ingredientes en

la elaboración de alimentos funcionales, los cuales permitan obtener un efecto beneficioso para

mejorar la salud del ser humano o reduciéndole el riesgo de padecer alguna enfermedad.

Objetivos

36


3. Objetivos

3.1 Objetivo general

Evaluar la actividad biológica (antioxidante, antibacteriana e inhibidora de la enzima

convertidora de la angiotensina) de péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de tres

variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.): frijol negro plus FRI-064-2109993, frijol azufrado

higuera FRI-001-220995 y frijol pinto Saltillo 1424-FRI-026-120901/C.

3.2 Objetivos particulares

Obtener harinas de frijol de las variedades: negro plus, azufrado higuera y pinto Saltillo; y

determinar su composición químico proximal.

Obtener concentrados proteicos a partir de harinas de frijol de las variedades: negro plus,

azufrado higuera y pinto Saltillo; y observar su perfil proteíco en gel de poliacrilamida -

dodecil sulfato de sodio.

Hidrolizar los concentrados proteicos de frijol utilizando la enzima Alcalasa®.

Separar los péptidos en fracciones peptídicas de: f > 10 kDa, 10 kDa > 3 kDa, 3 kDa > 1 kDa y

f < 1 kDa, por ultrafiltración.

Evaluar la actividad antibacteriana de los hidrolizados y sus fracciones peptídicas.

Evaluar la actividad antioxidante de los hidrolizados y sus fracciones peptídicas.

Evaluar la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina de las fracciones

peptídicas.

Obtener la secuencia de aminoácidos de los péptidos que presentaron actividad biológica.

Materiales y Métodos

37


4. Materiales y Métodos

4.1 Materiales biológicos y reactivos

Las semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) utilizadas fueron proporcionadas por el Instituto

Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP, México); se utilizaron semillas

de las variedades: frijol negro plus (FNP) FRI-064-2109993, frijol azufrado higuera (FAH) FRI-001-

220995 y frijol pinto Saltillo (FPS) 1424-FRI-026-120901/C.

La enzima utilizada para el proceso de hidrólisis de las proteínas de frijol fue Alcalasa®

comercial (EC 3.4.21.62, endoproteinasa de Bacillus licheniformis, 2.4 AU/g) de Novozymes® (Sigma-

Aldrich, USA) conservada a 4 °C.

Las cepas utilizadas para la determinación de la actividad antibacteriana fueron: Bacillus subtilis

(ATCC 6633), Bacillus cereus (ATCC 11778), Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus

nombrada cepa 1 (aislamientos clínicos del CINVESTAV-IPN), Staphylococcus aureus nombrada cepa 2

(ATCC 12398), Listeria monocytogenes (Scott A), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13884), Yersinia

enterocolitica, Klebsiella rinhoscleromatis (aislamientos clínicos de la FES Cuautitlán), Shigella

dysenteriae (INDRE B2188) y Enterobacter agglomerans (ATCC 27155, también llamada Pantoea

agglomerans).

Los reactivos empleados en las determinaciones fueron de grado analítico de J. T. Baker

(México), Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., USA), o Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Inc., USA).

4.2 Caracterización física de las semillas de frijol

Una vez que se eliminaron las impurezas (como hojas y piedras) de las semillas de frijol de las

tres variedades empleadas, éstas fueron caracterizadas físicamente. Se determinó la masa (g) y las

dimensiones largo, alto y ancho (cm) de cien semillas de cada variedad. Y fueron clasificadas de

acuerdo con López-Herrera (2002) quién mencionó que si la masa de 100 semillas es menor de 25 g la

especie se considera de grano pequeño, de 25 -40 g de grano mediano y superior a 40 g de grano

grande. La forma (esfericidad) de las semillas de frijol fue determinada de acuerdo con la ecuación

reportada por Sreerama y col. (2009).

⁄


38


4.3 Preparación de las harinas de semillas de frijol

Las semillas fueron reducidas de tamaño inicialmente empleando un molino para granos

(Estrella, México) y posteriormente con una licuadora (Oster 4108, México) hasta pasar por un tamiz

de pruebas físicas malla No. 40 (0.42 mm, Montinox, México) (Torruco-Uco y col., 2009). Las harinas

de frijol obtenidas fueron pesadas y conservadas en bolsas de cierre hermético a temperatura

ambiente hasta su uso (Figura 4-1).

Figura 4-1. Harinas obtenidas de las tres variedades de frijol.

Dónde: a) frijol azufrado higuera, b) frijol pinto Saltillo y c) frijol negro plus.

4.4 Caracterización químico proximal de las harinas de semillas de frijol

A las harinas de las tres variedades de frijol (FNP, FAH y FPS) se les realizó un análisis químico

proximal para caracterizarlas, de acuerdo con los procedimientos descritos por la Asociación Oficial

de Químicos Analistas (AOAC).

Se evaluó el contenido de humedad (método 925.09 AOAC, 1997), proteína utilizando el factor

N x 6.25 (método 954.01 AOAC, 1997), lípidos (método 920.39 AOAC, 1997), fibra cruda (método

962.09 AOAC, 1997), cenizas (método 923.03 AOAC, 1997), y los carbohidratos totales fueron

determinados por diferencia.


39


Figura 4-2. Caracterización químico proximal de las harinas de frijol según métodos de la AOAC. Dónde: a) determinación de humedad, b) determinación de cenizas, c) determinación de grasa,

d) determinación de proteína y e) determinación de fibra.

4.4.1 Determinación de humedad

Se utilizó el método de calentamiento directo para el cual se pesaron 3 g de harina de frijol de

cada variedad en charolas con masa constante por triplicado. Las muestras se colocaron en una

estufa con temperatura de 60 °C por 12 h (Figura 4-2a). Se calculó el porcentaje de humedad en las

muestras con la siguiente ecuación:

4.4.2 Determinación de proteína total

Se determinó por la técnica de micro-Kjeldalh para lo cual se pesaron 0.040 g de harina seca y

desengrasada en papel libre de cenizas (papel arroz) por triplicado. Simultáneamente se corrió un

blanco el cual solo contenía el papel arroz. La muestra fue colocada en un matraz tipo Kjeldalh con la


40


adición de 2 mL de H2SO4 concentrado y una mezcla de catalizadores (1.9 g de K2SO4 y 40 mg de CuO),

y digerida hasta la desaparición de color en la muestra (Figura 4-2d). Posteriormente, la muestra

digerida fue destilada en un equipo automático K-350 (BUCHI, Suiza) con la adición de NaOH al 32 %

(p/v) y el destilado recibido en 5 mL de H3BO3 al 2 % (p/v) con dos gotas del reactivo de Wesslow

(preparado con dos partes de solución etanólica al 60 % (v/v) de rojo de metilo al 0.2 % (p/v) y una

parte de solución acuosa de azul de metileno al 0.2 % (p/v)). Finalmente el destilado atrapado en el

ácido bórico se tituló con una solución valorada de HCl 0.1 N y la adición de dos gotas de fenolftaleína

al 1 % (p/v). El contenido de proteína se calculó utilizando las ecuaciones siguientes:

4.4.3 Determinación del extracto etéreo

Se pesaron 3 g de harina de frijol sin humedad dentro de un cartucho de celulosa de 33 x 80

mm (Whatman, USA) y éste se colocó dentro de un equipo Soxhlet (Pyrex, México). Las

determinaciones se realizaron por triplicado. La extracción se llevó cabo con éter etílico en

recirculación por 4 h (Figura 4-2c). Al finalizar el tiempo la muestra se retiró del equipo, se secó y se

conservó en recipientes herméticos dentro de un desecador para posteriores análisis. El residuo en el

matraz balón se llevó a peso constante y se pesó para determinar la cantidad de grasa en la muestra

con la siguiente ecuación:

4.4.4 Determinación de fibra cruda

Se pesó 1 g de muestra libre de grasa a la cual se le realizó una digestión ácida con H2SO4 al

1.25 % (v/v) en ebullición por 30 min, seguida de una digestión alcalina con NaOH al 3.52 % (v/v) bajo

las mismas condiciones para llevar a cabo una digestión completa. La muestra fue filtrada con papel

filtro libre de cenizas (Whatman No. 40) en un embudo Buchner adaptado a una bomba de vacío;

durante el proceso de filtrado se realizaron varios lavados a la muestra: con agua caliente, H2SO4 1.25

%, agua a temperatura ambiente, alcohol y éter (Figura 4-2e). Las determinaciones se realizaron por


41


triplicado. El material retenido en el papel filtro se llevó a peso constante. Después de registrar la

masa de la muestra seca, ésta se pre-calcinó para ser calcinada a 600 °C por 4 h en una mufla modelo

FB1315M (Barnstead, USA). La fibra cruda se calculó con la siguiente ecuación:

4.4.5 Determinación de cenizas totales

El contenido de cenizas totales se determinó por el método de calcinación en mufla para lo cual

se pesó 1 g de harina sin humedad en crisoles a peso constante por triplicado. Se llevó a cabo una

pre-calcinación de las muestras con un mechero Fisher para evitar el desprendimiento de gases y

pérdida de muestra dentro la mufla FB1315M (Barnstead, USA). Posteriormente, las muestras se

calcinaron a 600 °C por 4 h (Figura 4-2b). El porcentaje de cenizas se determinó con la siguiente

ecuación:

4.4.6 Carbohidratos totales

El contenido de carbohidratos fue estimado como la diferencia del 100 % menos las

determinaciones de: proteína, lípidos, fibra cruda y cenizas; tomando en cuenta el contenido de

humedad y grasa en la muestra.

4.5 Proceso de desengrasado de las harinas de frijol

El proceso de desengrasado de la harina consistió en suspenderla en una proporción 1:5 (p/v)

con hexano dentro de un matraz Erlenmeyer con baño de hielo y mantener la mezcla en agitación por

8 h (Chung y col., 2007). Posteriormente, la harina desengrasada fue separada por medio de un tamiz

de pruebas físicas malla No. 80 (0.18 mm, Montimex, México) con el fin de obtener una muestra

homogénea. Las harinas desengrasadas fueron conservadas en bolsas de cierre hermético a

temperatura ambiente hasta su posterior utilización.


42


4.6 Obtención de los concentrados proteicos de frijol

La extracción proteica se llevó a cabo por precipitación isoeléctrica de acuerdo con Carrasco-

Castilla y col. (2012). La extracción se realizó al suspender harina desengrasada al 10 % (p/v) en agua

destilada a 4 °C, se ajustó el pH de la suspensión en 8.0 mediante la adición de NaOH 1.0 N y se

mantuvo en agitación por al menos 30 min. En seguida, las muestras se centrifugaron a 12,400 x g en

una centrífuga J2-MC (Beckman Coulter, USA) por 30 min a 4 °C. Se tomó el sobrenadante para

ajustarlo a pH 4.5 con adición de HCl 1.0 N con el fin de lograr la precipitación de las proteínas y se

mantuvo en agitación por al menos 30 min. Las muestras se centrifugaron bajo las mismas

condiciones anteriores. El concentrado proteico acumulado en el fondo del recipiente fue congelado

para ser sometido a un proceso de liofilización por un periodo de 24 a 48 h en un equipo 6 Plus

(Labconco, USA) a 0.030 mBar y -77 °C en el colector. Las muestras liofilizadas fueron conservadas en

tubos falcon a temperatura ambiente y dentro de un desecador para ser caracterizadas e hidrolizadas

posteriormente.

4.7 Caracterización de los concentrados proteicos de frijol

4.7.1 Contenido total de proteína en los concentrados de frijol

Se determinó el porcentaje de proteína total con base en la cantidad de nitrógeno contenida en

los concentrados proteicos de las tres variedades de frijol por el método de micro-Kjeldahl (método

954.01 AOAC, 1997), descrito en 4.4.2. Se utilizaron 0.010 g de cada concentrado de proteína

liofilizado para este procedimiento y se llevó a cabo por triplicado.

4.7.2 Determinación de proteína soluble en los concentrados proteicos de frijol

Se llevó a cabo mediante el método de Bradford (1976), el cual se basa en la unión del

colorante azul de Comassie G-250 a las proteínas presentes en una muestra. El colorante en solución

ácida existe en dos formas una azul y otra naranja, las proteínas se unen a la forma azul para formar

un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. El

reactivo fue adquirido preparado (Sigma-Aldrich, USA) y las muestras fueron leídas a 595 nm en un

espectrofotómetro Lambda XLS (Perkin Elmer, USA). También, se adaptó esta metodología a

microplacas de 96 pozos con la adición de 200 µL del reactivo y 10 µL de la muestra, en este caso la


43


lectura fue a 620 nm. La curva tipo se elaboró utilizando albúmina de suero bovino (BSA) en

concentración de 0 - 2 mg/mL para ambos casos.

4.7.3 Perfil proteico de los concentrados de proteína de frijol

Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida/bisacrilamida con dodecilsulfato de sodio

(SDS-PAGE por sus siglas en inglés) para la observación del perfil proteico de las proteínas contenidas

en los concentrados de frijol. En una cámara Mini PROTEAN 3 cell (BIO-RAD Hercules, EUA) y a una

concentración del 15 % (p/v), se preparó el gel siguiendo el protocolo de Laemmli (1970). La

determinación se realizó en condiciones reductoras (en presencia de β–mercaptoetanol) y no

reductoras. Los concentrados de proteína fueron mezclados en proporción 1:2 (v/v) con una solución

búfer que contenía 200 g/L SDS, 25 mL/L glicerol, 10 mL/L β-mercaptoetanol, 0.20 g/L azul de

bromofenol y 10 mL de agua desionizada. El gel consistió en 2.1 g/L de SDS, 200 g/L de acrilamida

disuelta en el búfer separador (pH 8.8) y 50 g/L de acrilamida disuelta en búfer concentrador (pH 6.8).

El grosor del gel fue de 1.5 mm, con 6 cm en el separador y 2 cm en el concentrador. El gel se corrió a

una intensidad de corriente de 100 V por 90 min, las bandas proteicas fueron teñidas por inmersión

en una solución azul de Comassie R-250, 400 mL de metanol, 70 mL de ácido acético y 530 mL de

agua desionizada. El marcador de peso molecular utilizado fue RPN 2107 (fosforilasa 97 kDa,

albúmina 66 kDa, ovoalbúmina 45 kDa, anhidrasa carbónica 30 kDa, inhibidor de tripsina 20.1 kDa, α–

lactoglobulina 14.4 kDa, ECL, Amersham Biosciences).

Figura 4-3. Equipo de (a) isoelectroenfoque y (b) electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio de las proteínas de frijol.

a) b)


44


4.7.4 Electroforesis bidimensional de los concentrados de proteína de frijol

Mediante la técnica de electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida/bisacrilamida

con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE 2D) el perfil proteico de las proteínas contenidas en los

concentrados de frijol puede ser observado mediante la separación de proteínas en un equipo de

isoelectroenfoque por su punto isoeléctrico (pI) y por su masa molecular en un equipo estándar para

electroforesis (Aguilar y col., 2009). Para llevar a cabo el corrimiento de las proteínas en primera

dimensión o isoelectroenfoque las proteínas (100 µg) fueron solubilizadas en búfer de rehidratación

(urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4 %, azul de bromofenol 0.1 %, DTT 40 mM), y se aplicaron en tiras IPG

de 7 cm de largo con intervalo de pH 3-10 (ReadyStrip, BIO-RAD). Las tiras se cubrieron con aceite

mineral y se enfocaron mediante un equipo (GE, USA) por 2.5 h en un programa a pasos de 500 a

4000 V, 50 µA y 20 °C. En seguida, las tiras fueron acondicionadas al permanecer inmersas en búfer

de equilibrio 1 (urea 6 M, tris-HCl pH 8.8 5 mM, SDS 2 %, glicerol 20 %, DTT 2 %) y en búfer de

equilibrio 2 (urea 6 M, tris-HCl pH 8.8 5 mM, SDS 2 %, glicerol 20 %, yodoacetamida 2.5 %) por al

menos 30 min en cada solución. Finalmente, las tiras se colocaron en la parte superior de un gel SDS-

PAGE al 12 % y se corrieron de acuerdo con lo descrito en 4.7.3 (Figura 4-3). El marcador de peso

molecular utilizado fue SM0671 (Fermentas, USA).

4.8 Hidrólisis enzimática de las proteínas de frijol

Figura 4-4. Montaje experimental utilizado durante el proceso de hidrólisis enzimática.


45


La hidrólisis enzimática de las proteínas de frijol se realizó con el método descrito por Torruco-

Uco y col. (2009). Los concentrados proteicos (liofilizados) al 4 % (p/v) fueron suspendidos en agua

dentro de un reactor de vidrio con doble pared a una temperatura controlada de 55°C, agitación

constante por 120 min y pH ajustado en 8.0 con adición de NaOH 0.1 N mediante un equipo pH-STAT

Titrino 702 (Metrohm, Suiza) (Figura 4-4). La hidrólisis fue realizada usando la enzima Alcalasa® (EC

3.4.21.62 endoproteinasa de Bacillus licheniformis, 2.4 AU/g) de Novozymes® (Sigma-Aldrich, USA) en

proporción 0.3 AU/g (enzima/sustrato), el tiempo de reacción, las concentraciones de sustrato y

enzima fueron establecidos de acuerdo con trabajos anteriores (Ahumada-González, 2007; Torruco-

Uco y col., 2009; Boye y col., 2010) y pruebas preliminares a 1, 2 y 3 h de reacción. El grado de

hidrólisis alcanzado durante la reacción se determinó por medio de la ecuación de Adler-Nissen

(1979).

Dónde: B es el consumo (mL) de NaOH 0.1 N, NB es la normalidad del NaOH, α es el promedio

del grado de disociación de los grupos α–NH (1.105 para pH 8.0 y 55 °C, Adler-Nissen, 1986), MP es la

masa (g) de la proteína (N x fN) y htot el número total de enlaces peptídicos en el sustrato proteínico,

se utilizó el valor de 8.0 meq/g prot reportado por Arcila (2011) para frijol bayo.

4.9 Fraccionamiento de los hidrolizados proteicos por ultrafiltración

Los hidrolizados fueron fraccionados en un equipo de ultrafiltración Amicon LabscaleTM system

(Millipore, Alemania) con presión de nitrógeno a través de membranas con cortes de peso molecular

de 10 kDa (NMWL:10000), 3 kDa (NMWL:3000) y 1 kDa (NMWL:1000) hasta concentrar

aproximadamente un 80 % del volumen inicial, para finalmente obtener cuatro fracciones peptídicas,

lo que resulta similar a lo reportado por Palma-Rodríguez (2008). Después de este proceso se

obtuvieron cuatro muestras de pesos moleculares: fracción menor de 1 kDa (f<1), fracción de 1-3 kDa

(f1-3), fracción de 3-10 kDa (f3-10) y la fracción mayor de 10 kDa (f>10) de cada una de las variedades

de frijol ensayadas. A cada muestra se le determinó el contenido de proteína soluble por el método

de Bradford (1976) descrito en 4.7.2. Las muestras fueron congeladas y liofilizadas para ser utilizadas

en la determinación de la actividad antibacteriana, o sólo congeladas en el caso de la determinación

de la actividad antioxidante y la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina I.


46


4.10 Caracterización del fraccionamiento por ultrafiltración

La caracterización de las fracciones separadas por ultrafiltración se realizó con una

electroforesis en gel de poliacrilamida/bisacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 18 %, en

condiciones reductoras para la observación del perfil de las proteínas en cada una de las fracciones

obtenidas por ultrafiltración para lo cual se colocaron 5 µg de proteína en cada pozo y las condiciones

fueron las mismas que se describieron en la sección 4.7.3.

4.11 Determinación de la actividad antibacteriana de los hidrolizados totales y fracciones

peptídicas de frijol

4.11.1 Prueba de susceptibilidad microbiana

Las cepas utilizadas para la determinación de actividad antibacteriana fueron mencionadas en

4.1. De las cepas indicadoras utilizadas para esta prueba, cinco se caracterizan por ser Gram (+): B.

subtilis, B. cereus, S. aureus cepa 1, S. aureus cepa 2, L. monocytogenes; y las otras por ser Gram (-): Y.

enterocolítica, E. coli, K. pneumoniae, K. rhinoscleromatis, S. typhi, S. dysenteriae y E. agglomerans.

Las cepas indicadoras fueron reactivadas en caldo Müeller Hinton (Fluka, Suiza) y posteriormente

crecidas en agar Müeller Hinton II (Fluka, Suiza).

Se realizó la prueba de susceptibilidad microbiana por la técnica de difusión en agar según el

protocolo de Bauer y col. (1966). Las muestras analizadas fueron: las harinas de frijol desengrasadas,

los hidrolizados totales obtenidos a partir de las harinas desengrasadas, los concentrados proteicos

de frijol sin hidrolizar, los hidrolizados totales (HT) obtenidos a partir de los concentrados proteicos

de frijol y las cuatro fracciones peptídicas (f<1, f1-3, f3-10 y f>10) obtenidas a partir del proceso de

hidrólisis y ultrafiltración. Los ensayos se realizaron a diferentes concentraciones (5, 10 y 20 µg en el

sensidisco). La metodología consistió en ajustar las cepas indicadoras en solución salina al 0.9 % (p/v)

a una turbidez 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108 UFC/mL) y con ayuda de un isopo estéril

realizar la inoculación de la superficie del agar cubriendo toda la superficie de la caja Petri. De manera

simultánea se adicionó la muestra en discos de papel filtro (Whatman No. 1) de 6 mm de diámetro y a

los cuales se les dejó secar en condiciones de esterilidad. Finalmente se colocaron los sensidiscos

sobre la superficie de agar Müeller-Hinton previamente inoculado y se las cajas Petri se incubaron a

35 ± 2 °C por 24 h. Pasado este tiempo se midieron los halos formados en la superficie del agar

(Figura 4-5a).


47


Se usaron dos controles positivos que fueron cloranfenicol (30 µg) y ampicilina (10 µg), así

como agua como control negativo (Taroco y col., 2006). El control positivo se interpretó de acuerdo

con lo reportado por Konneman y col. (2004).

Figura 4-5. Determinación de la actividad antibacteriana de los hidrolizados totales y fracciones peptídicas.

Dónde: a) prueba de susceptibilidad y b) determinación de la CMI.

4.11.2 Determinación de la concentración mínima inhibitoria

Para esta prueba sólo se utilizaron los microorganismos que presentaron halos de inhibición en

la prueba de sensibilidad (4.11.1). La concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la

concentración más baja de un compuesto con características antibacterianas que inhibe el

crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación y fue determinada por la técnica

de dilución en microplaca (Langfield y col., 2004).

La prueba consistió en igualar la turbidez de cada microorganismo al estándar 0.5 de la escala

de Mc Farland y realizar una dilución 10-2 en caldo Müeller-Hinton. Posteriormente en placas de 96

pozos se adicionaron por triplicado 50 µL de la solución bacteriana (concentración final de 1.5 x 104

UFC/mL) con 50 µL de las diferentes concentraciones de proteína de las muestras (hidrolizados

totales o fracciones peptídicas de frijol en 100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL); éstas cajas se incubaron a

35 ± 2 °C por 24 h. Se incubó también un control positivo que consistió en 100 µL de solución

bacteriana y un control negativo que consistió en solución bacteriana con cloranfenicol (30 µg).

Después del periodo de incubación se agregó cloruro de tetrazolio como indicador de

crecimiento microbiano, el colorante vira de incoloro a violeta en presencia de células vivas; se

adicionaron 40 µL en cada pozo de una solución al 0.1 % (p/v) disuelto en una solución 2:3 de K2HPO4

a) b)


48


0.1 M y NaH2PO4 0.1 M. La CMI se determinó a partir de la concentración en la cual no se observó

coloración después de 30 min de haber sido adicionado el reactivo (Figura 4-5b).

4.12 Determinación de la actividad antioxidante de los hidrolizados totales y fracciones

peptídicas de frijol

4.12.1 Actividad antioxidante como captura del radical libre DPPH+

Esta técnica determina la capacidad de una muestra para capturar radicales libres 2,2-difenil-1-

picril-hidracilo (DPPH+) a una longitud de onda de 517 nm, mediante la donación de electrones (Figura

4-6); siendo dicha actividad antioxidante indicada por el cambio de coloración del rosa al amarillo del

radical en solución metanólica. El método fue descrito por Von-Gadow y col. (1997) y modificado por

Kim y col. (2002).

Figura 4-6. Estructura química (a) del radical libre difenilpicrilhidrazilo y (b) del compuesto estable difenilpicrilhidrazina (Molyneux, 2004).

Se preparó una solución metanólica 0.1 mM de DPPH+ de la cual se tomaron 2.9 mL para cada

ensayo, a esos se agregaron 0.1 mL de la muestra problema o del reactivo antioxidante de referencia.

Los ensayos se realizaron por triplicado. Las muestras a analizar fueron los hidrolizados totales de

frijol y las fracciones peptídicas de frijol obtenidas por ultrafiltración, y los antioxidantes de referencia

fueron: ácido-6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethilcromano-2-carboxílico (Trolox 0 - 1.2 mM), ácido ascórbico

(AASC 0 - 1.2 mM) y ácido gálico (AGAL 0 - 0.75 mM) utilizados para calcular la actividad antioxidante

eequivalente. La absorbancia (Abs) se leyó a los 30 y 60 min de reacción a una longitud de onda de

517 nm en un espectrofotómetro Lambda XLS (Perkin Elmer, USA) y se usó metanol como blanco. La

actividad antioxidante (% AA) en función de la captura del radical libre DPPH por las muestras se

determinó mediante la ecuación:

a) b)


49


4.12.2 Actividad antioxidante en función de la decoloración del radical libre ABTS+

Esta técnica se basa en la generación del radical catión ABTS+ (cromóforo azul-verde) mediante

la oxidación del ácido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) con K2S2O8 (Figura 4-7), y

determina la capacidad de una muestra de decolorar dichos radicales libres generados por ésta sal

diamonical (Ré y col., 1999).

Figura 4-7. Reacción de formación del radical libre ABTS+.

El radical ABTS+ se generó al preparar una solución de ABTS 7 mM con K2S2O8 2.45 mM, a la

cual en condiciones de oscuridad y temperatura ambiente se le permitió el reposo por un periodo de

18 h antes de ser utilizado, su coloración es azul/verde intenso y permanece estable por 48 h. El

radical ABTS+ fue diluido con etanol hasta obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.1 a una longitud de

onda de 734 nm. Del reactivo ajustado se tomaron 2 mL para cada ensayo, a esos se agregaron 20 µL

de la muestra problema o del reactivo antioxidante de referencia. Las muestras fueron los

hidrolizados totales de frijol y las fracciones peptídicas de frijol obtenidas por ultrafiltración, y los

antioxidantes de referencia fueron: Trolox (0 – 2.5 mM), AASC (0 – 2.5 mM) y AGAL (0 - 1 mM)

utilizados para calcular la actividad antioxidante equivalente. La absorbancia (Abs) se leyó a los 1 y 6

min de reacción a una longitud de onda de 734 nm en un espectrofotómetro Lambda XLS (Perkin

Elmer, USA) y se usó etanol como blanco. Los ensayos se realizaron por triplicado. La actividad

antioxidante (% AA) en función de la decoloración del radical libre por las muestras se determinó

mediante la ecuación:


50


4.12.3 Actividad antioxidante en función de la decoloración del radical libre DMPD+

Esta técnica permite determinar la capacidad de una muestra para decolorar los radicales libres

generados por el diclorohidrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD), y se basa en la generación

del radical DMPD+ (rosa-rojo) mediante la oxidación con FeCl3 (Fogliano y col., 1999) (Figura 4-8).

Figura 4-8. Reacción de decoloración del radical libre DMPD+ (Chagas y col., 2009).

El radical DMPD+ fue generado al preparar un 1 mL de solución acuosa de DMPD 100 mM, que

posteriormente fue adicionada en solución búfer de acetatos 0.1 M (ácido acético/acetato de sodio,

pH 5.25) con 200 µL de FeCl3 0.05 M. El radical DMPD+ fue diluido con búfer de acetatos hasta

obtener una absorbancia de 0.9 ± 0.1 a una longitud de onda de 506 nm, la solución se mantuvo en

condiciones de oscuridad. Del reactivo ajustado se mezclaron 2 mL para cada ensayo con 100 µL de la

muestra problema o del reactivo antioxidante de referencia. Las determinaciones fueron realizadas

por triplicado. Las muestras a analizar fueron los hidrolizados totales de frijol y las fracciones

peptídicas de frijol obtenidas por ultrafiltración. Los antioxidantes de referencia fueron: Trolox (0 – 1

mM), AASC (0 – 0.5 mM) y AGAL (0 – 2 mM) utilizados para calcular la actividad antioxidante

equivalente. La absorbancia (Abs) se leyó a los 10 min de reacción a una longitud de onda de 506 nm

en un espectrofotómetro Lambda XLS (Perkin Elmer, USA) y se usó búfer de acetatos como blanco. La

actividad antioxidante (% AA) en función de la decoloración del radical libre por las muestras se

determinó mediante la ecuación:


51


4.12.4 Actividad antioxidante determinada por el método de quimioluminiscencia

El uso del método quimioluminométrico en un sistema peroxidasa-luminol-hidrógeno (HRP-

luminol-H2O2) ha sido utilizado debido a su sensibilidad para el monitoreo de radicales libres y

compuestos antioxidantes. La reacción de oxidación del radical libre 3-aminoftalhidracido (luminol)

catalizada por la peroxidasa involucra la formación de un compuesto entre el H2O2 y la peroxidasa

conocido como radical luminol. Los radicales luminol en estado exitado por medio del dianión 3-

aminoptalato emiten luz hasta regresar a su estado de reposo que se alcanza mediante la adición de

un compuesto antioxidante o con el paso del tiempo (Figura 4-9).

Figura 4-9. Reacción quimioluminiscente llevada a cabo por el radical libre 3-aminoptalatohidrazilo (Douglas y Garley, 2010).

El procedimiento se realizó como lo describe Georgetti y col. (2003). Para llevar a cabo este

análisis se prepararon las soluciones con la muestra tomando en consideración un volumen de 10 L

para obtener un volumen final de reacción de 1 mL. Dentro del adaptador del luminómetro 1250 (Bio

Orbit, Finlandia, Figura 4-10) se colocó una celda de reacción con 10 µL de la muestra (fracciones

peptídicas de frijol o los antioxidantes estándar), 960 L de búfer de fosfatos (PBS 0.1 M, pH 7.4), 10

L de la solución de luminol (2 g/L disuelto en dimetilsulfóxido) y 10 L de H2O2 (5×10-5 M disuelto en

PBS). Se utilizó PBS como blanco para la calibración del equipo.


52


La reacción de oxidación se inició al adicionar 10 L de la solución enzimática de peroxidasa

(HRP 0.2 IU/mL disuelta en agua), dando seguimiento a la misma en el programa computacional

WinDaq (DataQ Instruments Inc., USA) durante 10 min para obtener las curvas de actividad

luminiscente. Los antioxidantes de referencia utilizados como control positivo fueron: Trolox (0 – 12

mM), AASC (0 – 12 mM) y AGAL (0 – 7.5 mM).

Figura 4-10. Montaje experimental del equipo de quimioluminiscencia.

Los resultados fueron expresados como porcentaje de inhibición en función del control

negativo calculados mediante la siguiente ecuación:

4.13 Determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la

angiotensina

La determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (EC

3.4.15.1), se trata de un ensayo enzimático, y se llevó a cabo siguiendo el método descrito por

Cushman y Cheung (1971). El sustrato consistió en 110 μL de una solución de hipuril-L-histidil-L-

leucina (HHL) 10 mM disuelto en búfer de fosfatos (PBS 0.1 mM, pH 8.3) con NaCl 0.3 M. Al sustrato

se añadieron 25 μL de una solución que contenía 26 mU/mL de la enzima convertidora de

angiotensina (ECA), adicionalmente se adicionaron 15 μL de la fracción de péptidos de pesos

moleculares entre 1 y 3 kDa (concentración final 20 µg/mL). Las muestras se incubaron a 37 °C por 80


53


min para posteriormente inactivar la enzima por la adición de 110 μL de ácido clorhídrico 1 N. El ácido

hipúrico fue extraído mediante agitación después de la adición de 1 mL de acetato de etilo. La

muestra fue centrifugada a 3000 × g por 10 min, se colocaron en un nuevo tubo 750 µL de la fase

orgánica y se procedió a la eliminación del acetato de etilo por evaporación. El residuo de ácido

hipúrico se disolvió en 1 mL de agua destilada y finalmente se midió la absorbancia de la muestra a

una longitud de onda de 228 nm en un espectrofotómetro Lambda XLS (Perkin Elmer, USA). La

actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la angiotensina (I-ECA) se determinó por triplicado.

El control positivo contenía al sustrato en ausencia de enzima mientras que el control negativo

contenía al sustrato y la enzima en ausencia de inhibidores. El porciento de I-ECA se determinó

mediante la siguiente ecuación:

Además, se realizó un estudio in vivo utilizando machos de ratas Wistar espontáneamente

hipertensas (RWH) donadas por la Facultad de Estudios Superiores de Iztacala de la UNAM. Todos los

procedimientos con los animales se llevaron a cabo de acuerdo con lo estipulado por SAGARPA

(NOM-062-ZOO-1999, Mexico). Inicialmente las ratas Wistar hipertensas tenían las siguientes

características: masa = 205 ± 11.8 g, frecuencia cardiaca = 468.7 ± 27.3 lpm, presión sanguínea

sistólica (PS) = 188.7 ± 8.71 mmHg, y presión sanguínea diastólica (PD) = 148.41 ± 10.06. Las ratas se

mantuvieron a 24 °C con ciclos de luz y oscuridad de 12 h y libre acceso a alimento (Rodent

Laboratory Chow 5001 Reg SAGARPA A-0207-171, México) y agua.

Para la determinación de la actividad hipotensiva de los péptidos de frijol, se utilizó la fracción

f3-10 del FAH. Y las RWH se dividieron en tres grupos: el grupo control negativo (agua destilada 2.5

mL/kg), el grupo administrado con el péptido (FAH f3-10 en 4 mg/kg), y el grupo control positivo

(Captopril® 10 mg/kg). La presión sanguínea de los animales se midió por triplicado en la cola de las

RWH con un equipo automático LE 5007 Letica1 (PanLab, España), a las 0, 1, 2, 4, y 6 h después de

haber administrado interperitonealmente la dosis correspondiente a cada uno. Los datos fueron

tratados estadísticamente y presentados como la diferencia en la presión sanguínea (PS) (Li y col.,

2006a).


54


4.14 Purificación de las fracciones peptídicas con actividad antioxidante

Las fracciones entre 1 - 3 kDa de las tres variedades de frijol (FNP, FAH y FPS) fueron separadas

a una longitud de onda de 214 nm en una columna C-18 (small pore, Grace Vydac, USA) adaptada a

un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia HPLC LC-20AT (Shimadzu, Japón), de las que se corrieron

100 µL de la muestra (1 mg/mL) en un programa en gradiente de acetonitrilo/TFA 0.1% (ácido

trifluoroacético). Se colectaron las muestras cada 5 min y se colocaron en un sistema SpeedVac para

la eliminación de solvente y concentración de la muestra (Srihongthong y col., 2012). A cada grupo se

le determinó su capacidad antioxidante como apagamiento del radical luminol, según el método

descrito en 4.12.4 (Georgetti y col., 2003). Los grupos que resultaron con actividad fueron inyectados

al cromatógrafo nuevamente y los picos fueron colectados individualmente. Se concentró la muestra

y se realizó el análisis de capacidad antioxidante a cada uno de los picos. El pico que resultó con

mayor actividad antioxidante fue analizado por espectrometría de masas.

4.15 Determinación de la masa molecular del péptido con actividad antioxidante

La determinación de la masa molecular del péptido con mayor actividad antioxidante obtenido

según el protocolo descrito en la sección 4.14 se llevó a cabo en un espectrómetro de masas MALDI-

TOF MS siguiendo método descrito por Alemán y col. (2011). Por duplicado se colocó 1 µL de muestra

sobre una placa de MALDI a la cual se le permitió secar a temperatura ambiente. En seguida, se

agregaron 0.4 µL de la matriz (3 mg/mL de ácido α-ciano-4-hidrixi-transcinámico en 50 % (v/v) de

acetonitrilo) y se le permitió secar antes de introducir la placa en un equipo 4800 Proteomics Analyzer

MALDI-TOF/TOF (Applied Biosystems, USA) donde la masa fue determinada operando con un

reflector en modo positivo a un voltaje de 20,000 V.

4.16 Determinación de la secuencia de aminoácidos por bioinformática del péptido con

actividad antioxidante

La determinación de la secuencia de aminoácidos del péptido aislado por cromatografía de

líquidos de alta eficacia y que presentó la máxima actividad antioxidante por el método de

quimioluminiscencia, se realizó mediante el sistema ExPASy (Bioinformatics Resource Portal, Suiza)

con la herramienta Find Peptide. El ingreso de los datos fue con base en la secuencia de aminoácidos

de la faseolina (UniProt: P02853) que es la proteína que se encuentra mayoritariamente en las

semillas de frijol, además se realizó el mismo procedimiento con la proteína lectina (UniProt:


55


Q8RVH1) que es la proteína que le secunda a la faseolina en la composición proteíca del frijol; y las

masas moleculares obtenidas en el experimento anterior (4.15).

4.17 Análisis estadístico de datos

Se realizaron análisis de varianza (ANOVA por sus siglas en inglés) de una vía y análisis de

varianza dos vías para los procedimientos descritos en esta sección (según la necesidad), y de acuerdo

con los diseños experimentales de Montgomery (2006), posteriormente se llevó a cabo la

comparación de medias por Duncan a un nivel de significancia de α = 5 % (Duncan, p ≤ 0.05).

Además, para el estudio in vivo se realizó el ANOVA de una vía, seguido de un estudio de t-

Student a un nivel de significancia de α = 1 y 0.1 % (t-Student, p ≤ 0.01 o p ≤ 0.001).

Ambos análisis se llevaron a cabo mediante el paquete estadístico SAS system 9.0 (SAS Institute

Inc., USA) y los gráficos fueron realizados con el programa GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software

Inc., USA).

Resultados y discusión

56


5. Resultados y Discusión

5.1 Evaluación y caracterización física de las semillas de frijol

Las semillas de frijol fueron evaluadas según lo descrito en 4.2 (Cuadro 5-1). De acuerdo con

López-Herrera (2002) si la masa de 100 semillas es menor de 25 g la especie se considera de grano

pequeño, entre 25 y 40 g de grano mediano y si supera los 40 g de grano grande. Por lo que las

semillas de frijol de la variedad negro plus (FNP) fueron clasificadas como especies de grano pequeño,

las de frijol pinto Saltillo (FPS) como especies de grano mediano y las de frijol azufrado higuera (FAH)

como especies de grano grande (Figura 5-1).

Cuadro 5-1. Características físicas de las semillas de las tres variedades de frijol

Característica Variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.)

Negro plus Azufrado higuera Pinto Saltillo

Masa (g) 0.2197 ± 0.0298 c 0.4619 ± 0.0716 a 0.2858 ± 0.0414 b

Largo (cm) 1.01 ± 0.07 c 1.29 ± 0.08 a 1.18 ± 0.07 b

Alto (cm) 0.70 ± 0.05 b 0.76 ± 0.05 a 0.69 ± 0.03 b

Ancho (cm) 0.44 ± 0.04 c 0.64 ± 0.04 a 0.47 ± 0.04 b

Esfericidad (cm3) 0.6706 ± 0.0392 a 0.6634 ± 0.0259 a 0.6156 ± 0.0215 b

En el cuadro se presentan los resultados (promedio ± desviación estándar) de la medición de cincuenta semillas. a, b, c

Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p<0.05)

Figura 5-1. Semilla de frijol de las tres variedades estudiadas en este trabajo. Dónde: a) frijol negro plus, b) frijol azufrado higuera, y c) frijol pinto Saltillo.

a)

b)

c)


57


Además, se observó de manera general que la variedad FAH es estadísticamente mayor en sus

dimensiones y masa que las variedades FNP y FPS (Duncan, p ≤ 0.05). Ya que los parámetros de

esfericidad determinados fueron cercanos a 0.6, y las semillas de las leguminosas pueden tener muy

variadas formas (lenticular, ovoide, redondeada, acorazonada, reniforme, arqueada, prismática,

globosa, etc); entonces se trata de semillas ovides ligeramente redondeadas; esta forma es aparente

la más común en las legumbres (White y González, 1990). Shahin y col. (2006) realizaron estas

mismas determinaciones con semillas de soya y reportaron esta misma forma en las semillas, incluso

las comparan con la forma de un riñon.

5.2 Obtención de las harinas de frijol

Se procesaron 1 kg de semillas de frijol de cada variedad. Durante la obtención de harina de

frijol (P. vulgaris L.) se realizó una primera molienda y un primer tamizado por malla No. 40 (0.42

mm), en éste procesos las tres variedades de frijol presentaron rendimientos alrededor de: FNP =

50.98 %, FAH = 47.53 % y FPS = 66.13 %. Durante el proceso de eliminación de grasas con hexano y el

segundo tamizado por malla No. 80 (0.18 mm), el rendimiento de las harinas disminuyó aún más

(Cuadro 5-2). Por lo que, los rendimientos finales fueron entre 31 y 38 %; ésta harina desengrasada

de tamaño igual o menor de 0.18 mm fue almacenada en bolsas de cierre hermético para su posterior

caracterización y uso en la preparación de los concentrados proteicos de frijol (FNP, FAH y FPS); y

demás experimentos de este trabajo.

Cuadro 5-2. Masas y rendimientos de las harinas de frijol después de la molienda y tamizado.

Variedad de frijol Masa inicial

(g)

Masa de harina malla No. 40

(g)

Masa de harina desengrasada

malla No. 80 (g)

Rendimiento

(%)

Negro plus 1020 520 320 31.37

Azufrado higuera 1200 570.4 390.2 32.52

Pinto Saltillo 1100 727.4 420.4 38.22


58


5.3 Caracterización químico proximal de las harinas de frijol

Los resultados de la caracterización químico proximal de las harinas de frijol de las tres

variedades estudiadas en este trabajo se presentan como porcentajes con base seca en el Cuadro 5-3,

y para este análisis se utilizaron las harinas producto del primer proceso de molienda y tamizado

(partículas de tamaño igual o menor de 0.42 mm).

Cuadro 5-3. Análisis químico proximal de las harinas de frijol (%)

Componente Variedad de frijol de la harina

Negro plus Azufrado higuera Pinto Saltillo

Humedad 7.36 ± 0.04 c 7.57 ± 0.08 b 8.02 ± 0.06 a

Proteína 16.49 ± 1.46 c 24.21 ± 0.14 a 21.56 ± 0.04 b

Grasa 1.68 ± 0.05 a 1.44 ± 0.17 b 1.43 ± 0.04 b

Fibra 5.12 ± 0.55 a 3.28 ± 0.18 b 5.42 ± 0.28 a

Cenizas 5.03 ± 0.06 a 4.60 ± 0.03 b 4.60 ± 0.07 b

Carbohidratos 64.32 ± 0.93 a 58.90 ± 0.31 b 58.97 ± 0.16 b

Los resultados se presentan en base seca como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. a, b, c,

Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05)

Estos datos fueron comparados con trabajos previos (Cuadro 5-4), observando algunas

diferencias en su composición. Dentro de éstos resultados se observó que el FNP presentó la mayor

cantidad de grasa, fibra, cenizas y carbohidratos; pero es el FAH el que presentó la mayor cantidad de

proteína, que es el componente más importante para cubrir los objetivos este trabajo.

Los valores de humedad para las tres variedades de frijol son menores con respecto a lo

reportado por otros autores (Zubirán, 1996; Torruco-Uco y col., 2009; Boye y col., 2010); esto

probablemente sea un indicador de la variación de la edad de las semillas estudiadas, ya que se ha

reportado mayor humedad en semillas jóvenes debido a que existe cierta pérdida de humedad en

almacenamiento por causa del tiempo y naturaleza de las mismas pues la dureza de la semilla es un

mecanismo para asegurar la persistencia de la especie en el pastizal, ya que las semillas duras no son

digeribles fácilmente por los animales al pasar por el tracto intestinal (White y González, 1990).

El contenido de grasas en el frijol es variable aunque siempre es bajo, y los valores obtenidos

en este trabajo son cercanos a los reportados por Torruco-Uco y col. (2009), Boye y col. (2010) y

Wang y col. (2010).


59


El contenido de fibra en los alimentos es importante ya que evita problemas relacionados a la

digestión humana, en este caso los valores de fibra total obtenidos para las variedades FNP y FPS son

mayores a lo reportado (Zubirán, 1996; Torruco-Uco y col., 2009; Siddiq y col., 2010; Boye y col.,

2010). Este dato se encuentra interesante debido a que las leguminosas comúnmente son fuentes

importantes de fibra quienes facilitan la digestión humana cuando se encuentra en las condiciones

adecuadas.

En el análisis de cenizas totales se obtuvieron valores altos que concuerdan con el reporte de

Siddiq y col. (2010) quienes determinaron ceniza totales por este mismo método; probablemente la

diferencia con los resultados obtenidos por otros grupos de trabajo (Zubirán, 1996) sea debido a que

ellos hacen énfasis en minerales específicos como son el: calcio, hierro, magnesio, sodio, potasio y

zinc; y en este caso el aumento pueda ser debido a otros micronutrientes inorgánicos presentes en

estas variedades de frijol.

En el contenido de carbohidratos calculado como extracto libre de nitrógeno, las diferencias

son mínimas (Duncan, p ≤ 0.05), aunque el FNP resultó ser aquel con el mayor contenido. En este

componente se incluyen principalmente almidones solubles presentes en los alimentos como: la

glucosa, fructosa y sacarosa.

Cuadro 5-4. Composición químico proximal en harinas de frijol reportadas previamente (%)

Fuente Zubirán, 1996

Torruco-Uco y col., 2009

Siddiq y col., 2010

Boye y col., 2010

Valdéz-Ortíz y col., 2012

Wang y col., 2010

Componente Harina promedio

Frijol negro Jamapa

Frijol negro Frijol común Frijol

azufrado higuera

Frijol pinto

Humedad 9.1 8.8 nd 9.26 nd nd

Proteína 22.5 26.8 23.24 ± 0.22 23.58 13 22.4

Grasa 2.1 1.5 3.62 ± 0.08 0.83 nd 1.01

Fibra 4.6 2.3 3.38 ± 0.11 2.49 nd nd

Cenizas 1.8 4.0 5.00 ± 0.18 3.83 nd 3.76

Carbohidratos 59.1 65.4 nd 60.01 nd nd

nd = no determinado por el equipo de trabajo en la fuente consultada

Por otro lado, se sabe que las semillas de las leguminosas son parte estructural de las plantas

donde se almacenan grandes cantidades de proteínas. El contenido de proteína determinado en el

frijol de la variedad FNP se encuentra por debajo de los valores antes reportados para otras

variedades de frijol negro (Zubirán, 1996; Torruco-Uco y col., 2009; Siddiq y col., 2010; Boye y col.,


60


2010), y es probablemente debido a características propias de la variedad. La variedad de frijol FAH

presentó mayor cantidad de proteína que la misma variedad reportada previamente por Valdéz-Ortíz

y col. (2012). Mientras que el contenido de proteína en la variedad FPS coincidió con lo reportado por

Wang y col. (2010). Existe diferencia significativa en el contenido de proteína de las tres variedades

de frijol estudiadas, siendo el FAH la variedad con mayor contenido de proteína y FNP la variedad con

menor contenido (Duncan, p ≤ 0.05).

5.4 Obtención del concentrado de proteínas de frijol

Los concentrados de proteína de frijol obtenidos por solubilización y precipitación isoeléctrica

fueron congelados, liofilizados y almacenados para posteriores análisis. El contenido de proteína en

los concentrados proteicos de frijol fue determinado por el método de micro-Kjeldahl y los resultados

se presentan en el Cuadro 5-5. De acuerdo con lo reportado, un concentrado proteico debe contener

un mínimo de 70 % de proteína en base seca y se extrae a partir de harina desengrasada obteniendo

un producto rico en azúcares insolubles y proteínas, y un aislado proteico supone una serie de etapas

encaminadas a eliminar o disminuir los componentes no proteicos para lograr un producto final con

un mínimo del 80 % de proteínas (Vioque y col., 2001; De Luna-Jiménez, 2007).

Cuadro 5-5. Contenido de proteína en los concentrados de frijol (%)

Variedad de frijol

Muestra Negro plus Azufrado higuera Pinto Saltillo

Harina 16.49 ± 1.45 Bc 24.21 ± 0.14 Ba 21.55 ± 0.04 Bb

Concentrado 79.49 ± 2.30 Aab 82.35 ± 0.82 Aa 78.41 ± 1.78 Ab

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. A,B,

Medias con la misma letra en la misma columna no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

a, ab, b, c, Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

De acuerdo con las definiciones anteriores, los resultados obtenidos lograron la concentración

de la proteína constituyente de las variedades FNP, FAH y FPS hasta niveles alrededor del 80 %. El

contenido de proteína en el concentrado proteico de FNP incrementó 4.82 veces con respecto a la

harina, el FHA 3.4 veces y el FPS 3.64 veces, esto es importante ya que refleja la capacidad de

eliminación de almidón y otros carbohidratos solubles de la harina de frijol principalmente de la

variedad FNP. Según el análisis de medias existe diferencia significativa entre harinas y concentrados

(Duncan, p ≤ 0.05); y también hay diferencia significativa entre los concentrados de proteína de las

tres variedades (Duncan, p ≤ 0.05).


61


Hernández-Álvarez y col. (2010) obtuvieron valores de 24.65 % de proteína en harina de frijol

negro Jamapa que después del tratamiento de extracción alcanzó un 80.03 % en el concentrado

proteico, éstos resultados concuerdan con los obtenidos en este trabajo (78.40 – 82.34 %). Sin

embargo, en otras variedades de frijol se han alcanzado aislados de proteína de 98.7 % en frijol rojo

(Lii y Chang, 1981) y de 98.0 % en frijol blanco (Gujska y col., 1994); muy probablemente el hecho de

no alcanzar estos niveles tan altos de extracción de proteína sean debido a la variedad de frijol

utilizada. Por otro lado, Torruco-Uco y col. (2009) reportaron un concentrado proteico máximo de

63.80 % en la variedad negro Jamapa y Valdéz-Ortíz y col. (2012) del 61 % en la variedad azufrado

higuera; lo cual permite deducir que el contenido proteico depende en gran medida de las

condiciones de extracción y la variedad de frijol estudiada.

5.5 Comparación de los perfiles electroforéticos de las harinas de frijol

5.5.1 Electroforesis de los concentrados de proteína de frijol

Figura 5-2. SDS-PAGE del concentrado de proteínas de frijol de las variedades FNP, FAH y FPS en condiciones

no reductoras y reductoras. Gel al 15 % de acrilamida con 5 µg de proteína por pozo.

En la Figura 5-2 se presenta el perfil electroforético de las proteínas de frijol en condiciones

reductoras y no reductoras. En ambas condiciones las proteínas predominantes se obtuvieron en

pesos moleculares alrededor de 50 kDa y de 30 kDa, que según lo reportado corresponden a familia


62


de las faseolinas y lectinas respectivamente (Camacho-Espinoza y col., 2010), éstos dos grupos

principales de proteínas se observaron en las tres variedades de frijol. Emani y Hall (2008) reportaron

que el 50 % de las proteínas contenidas en el frijol pertenecen al grupo de las faseolinas, las cuales a

su vez difieren en el contenido del aminoácido asparagina (Asn) lo que hace que se formen tres

estructuras de diferentes masas muy cercanas: α (51,000-53,000 Da), β (47,000-48,000 Da) y

(43,000-46,000 Da).

No se observa diferencia entre los patrones electroforéticos de las proteínas con y sin agente

desnaturalizante (-mercaptoetanol), lo cual coincide con lo reportado por Camacho-Espinoza y col.

(2010) quienes trabajaron con las variedades Azufrado regional 87, azufrado higuera y azufrado

noroeste. Con las pocas diferencias observadas, se podría deducir que es probable que las proteínas

de estas variedades de frijol no se encuentren unidas en gran medida por puentes disulfuro. Además,

es importante mencionar que la variedad FPS aparentemente contiene menor cantidad de proteínas

del grupo de las faseolinas que las variedades FNP y FAH, lo que indicaría menor probabilidad de

encontrar Asn en ésta variedad; aún más, se observaron dos bandas de peso molecular mayor de 30

kDa que no son visibles en las otras dos variedades. Por lo que, es probable que la variación en el

perfil electroforético de los concentrados de proteína de frijol, dependa del contenido de

aminoácidos de cada variedad, a sus condiciones de cultivo y otras características propias de la

semilla.

5.5.2 Electroforesis bidimensional de los concentrados de proteína de frijol

Mediante la técnica de electroforesis bidimensional se observó un grupo importante de

proteínas con pI cercanos a 5 y algunos puntos en pIs menores a 5 en el proceso de isoelectroenfoque

(1D), los puntos de proteínas observadas presentaron pesos moleculares mayores de 40 kDa al

correrse la segunda dimensión de la electroforesis (Figura 5-3).


63


Figura 5-3. Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida y dodecil-sulfato de sodio del concentrado de proteínas de frijol.

Dónde: a) frijol negro plus, b) frijol azufrado higuera y c) frijol pinto Saltillo, las flechas muestran similitudes entre los geles.


64


En la electroforesis bidimensional de las muestras de FNP y FAH se observó corrimiento en los

puntos con mayor saturación de proteína de frijol en el gel; Görg y col. (2000) atribuyen este

comportamiento a la concentración de proteínas de la misma familia quienes tienen en su mayoría

las mismas características y sugieren tomar en cuenta el gradiente de inmovilización para la

optimización del ensayo. Por otra parte, Camacho-Espinoza y col. (2010) reportaron este tipo de

puntos con corrimiento como resultado de una posible contaminación con ácidos nucleicos o

azúcares que impiden la correcta separación de las proteínas, y sugieren el uso del kit 2D Clean-Up

(Amersham Biosciences, USA), y este kit fue usado en el tratamiento previo de éstas proteínas de

frijol. Estos mismos autores reportan la presencia de proteínas de FAH con PM cercano a 50 kDa, lo

que resulta similar a lo obtenido en este trabajo.

Además de este grupo mayoritario de proteínas, se observaron tres puntos similares entre el

FNP y el FAH, cuatro puntos entre el FNP y el FPS, y dos entre el FAH y el FPS. Cada uno de estos

puntos representa una proteína diferente que podría ser analizada mediante un densitómetro y un

software adecuado, tal como lo realizaron Egito y col. (2002) para la separación e identificación

proteómica de α-, β-, κ- y, γ- caseínas en cinco péptidos derivados de leche. Además, utilizando éste

tipo de herramientas Aguilar y col. (2009) también lograron la separación de proteínas de soya y las

compararon con proteínas conocidas (α-lactoalbúmina, BSA y quimotripsina).

Por otro lado, Natarajan y col. (2006) usaron la electroforesis bidimensional en tres diferentes

intervalos de pH (3 - 10, 4 - 7 y 6 - 11) para comparar la composición proteínica de semillas de soya en

cultivos nativos (Glycine soja) y comerciales (G. max), y determinaron que el intervalo de pH permite

la localización óptima de las proteínas de ésta leguminosa. Por lo que probablemente las proteínas

contenidas en los concentrados proteicos de las variedades de frijol trabajadas en esta investigación

(FNP, FAH y FPS), pudieran ser separadas con mayor eficiencia en tiras IPG (ReadyStrip, BIO-RAD) con

intervalo de pH 4-7 durante el proceso de isoelectroenfoque, ya que los puntos isoeléctricos de las

proteínas contenidas en el frijol son principalmente ácidas, incluso si se utilizaran tiras de mayor

longitud habría mayor separación. También se propone un análisis de los puntos principales según lo

propuesto por O’Farrell (1975), quién utiliza regletas estándar en la separación de proteínas

contenidas en E. coli.


65


5.6 Hidrólisis enzimática de las proteínas de frijol

5.6.1 Hidrólisis enzimática de las proteínas contenidas en las harinas de frijol

La hidrólisis de las proteínas de frijol se llevó a cabo en harinas al 10 % (p/v) bajo los

parámetros establecidos en la metodología; el contenido de proteína en éstas muestras fue de 1.6 g,

2.4 g y 2.1 g para el FNP, FAH y FPS respectivamente. Y los resultados de la hidrólisis se presentan en

el Cuadro 5-6, donde se observa una diferencia significativa en el grado de hidrólisis según el tiempo

de reacción (Duncan, p ≤ 0.05); obteniéndose el mayor % GH en dos y tres horas; y siendo la variedad

FAH la que alcanza el mayor grado de hidrólisis. Así que es notable la diferencia entre el grado de

hidrólisis de una a dos horas de proceso; pero sin diferencia significativa en el periodo de dos a tres

horas de tratamiento. Sin embargo, los porcentajes del grado de hidrólisis pueden ser considerados

bajos si se comparan con otros trabajos realizados con concentrados de proteína (Valdéz-Ortíz y col.,

2012).

Por otro lado, se ha reportado que la enzima Alcalasa® rompe a las proteínas principalmente en

aminoácidos hidrofóbicos como: Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Val y Met (Markland y Smith, 1971), por lo que

es probable que éste tipo de reacción haya sido generada durante la hidrólisis de las proteínas de

frijol, aunque aún los carbohidratos solubles interfieren de tal forma que no hay un alto % GH. La

Alcalasa® tiene una ventaja económica ante otras enzimas de grado alimenticio como la pepsina,

tripsina, quimotripsina, papaina y termolisina; todas ellas con la capacidad de ser aprovechadas para

la obtención de péptidos activos (Li y col., 2005); y otro punto favorable en ésta enzima es su

capacidad para obtener péptidos de menos de 15 residuos de aminoácidos, en los cuales se ha

demostrado actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la angiotensina (Li y col., 2004).

Cuadro 5-6. Grado de hidrólisis alcanzado por las harinas de frijol durante el tratamiento (%)

Variedad 1 h 2 h 3 h

Negro plus 8.91 ± 0.79 Bb 21.25 ± 1.61 Aa 21.80 ± 1.43 Aa

Azufrado higuera 14.28 ± 3.09 Ab 22.04 ± 2.33 Aa 23.54 ± 0.82 Aa

Pinto Saltillo 12.94 ± 1.07 Ab 21.28 ± 2.50 Aa 22.25 ± 2.01 Aa

Los resultados se presentan en base seca como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. a,b

. Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p<0.05).

A,B. Medias con la misma letra en la misma columna no son significativamente diferentes (Duncan, p<0.05).


66


5.6.2 Hidrólisis enzimática de los concentrados proteicos de frijol

Se llevó a cabo el proceso de hidrólisis enzimática de los concentrados proteicos (liofilizados de

proteína de frijol) al 4 % (p/v), con contenido de proteína de 3.18 g, 3.29 g y 3.14 g para el FNP, FAH y

FPS, respectivamente. A partir de estas hidrólisis se obtuvieron los resultados presentados en el

Cuadro 5-7, donde se observa un incremento en el grado de hidrólisis con respecto a los hidrolizados

de harinas para las tres variedades de frijol (FNP, FAH y FPS). Esto indica que es posible obtener un

mayor grado de hidrólisis bajo las mismas condiciones de proceso, siempre y cuando la proteína se

encuentre más concentrada y libre de otros compuestos (almidones y carbohidratos solubles,

principalmente). En este caso los grados de hidrólisis no son mayores del 24.71 %, aunque

Hernández-Álvarez y col. (2010) reportaron un grado de hidrólisis máximo de 35.24 % para frijol

negro Jamapa en 60 min de reacción determinado como porcentaje de nitrógeno soluble en 10 % de

TCA (Kim y col., 1990). Por su parte Valdéz-Ortíz y col. (2012) determinaron un grado de hidrólisis de

60 % en el concentrado de la variedad azufrado higuera y hasta del 73 % para la variedad azufrado

noroeste en 120 min de reacción; y en otras semillas como la semilla de girasol se reportó el grado de

hidrólisis máximo de 18.8 % (Villanueva y col., 1999). Por lo que los resultados obtenidos en este

trabajo se encuentran en el intervalo obtenido en otros trabajos similares.

Cuadro 5-7. Grado de hidrólisis obtenido en 2 h de reacción con los concentrados de proteína de frijol (%)

Variedad Harina de frijol Concentrado proteico

Negro plus 21.25 ± 1.61 Aa

22.59 ± 0.44 Ba

Azufrado higuera 22.04 ± 2.33 Aa 24.72 ± 0.83 Aa

Pinto Saltillo 21.28 ± 2.50 Aa

22.49 ± 0.72 Ba

Los resultados se presentan en base seca como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. a,b

. Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p<0.05).

A,B. Medias con la misma letra en la misma columna no son significativamente diferentes (Duncan, p<0.05).

Para comprobar que el proceso de hidrólisis separó el grupo mayoritario de proteínas de frijol

(probablemente el de las faseolinas 50 kDa y en menor cantidad el grupo de las lectinas 30 kDa), se

elaboró un gel de electroforesis con docecil-sulfato de sodio de los concentrados proteicos y los

hidrolizados totales de frijol (Figura 5-4). En ésta imagen se puede observar que el grupo mayoritario

de proteínas (mayor de 45 kDa) y otro menor (mayor de 30 kDa) presente en las tres variedades de

frijol se ha hidrolizado, dando como resultado proteínas y péptidos con pesos moleculares menores

de 30 kDa.


67


Figura 5-4. SDS-PAGE al 15 % de los concentrados proteicos y los hidrolizados totales de proteínas de frijol. Dónde: FPS, FAH y FNP representan las proteínas y péptidos de las variedades de frijol: pinto Saltillo,

azufrado higuera y negro plus; H tot significa Hidrolizado total y las flechas indican los grupos principales.

5.7 Fraccionamiento de péptidos por ultrafiltración

Al finalizar el proceso de hidrólisis las muestras fueron sometidas a filtración por membranas

de corte molecular específico (1, 3 y 10 kDa) y con ellas se realizó una electroforesis en gel de

poliacrilamida y dodecil-sulfato de sodio para comprobar su separación (Figura 5-5). La electroforesis

en gel (SDS-PAGE) ha sido la técnica más utilizada para la caracterización de hidrolizados y proteínas a

pesar de sus limitaciones en la separación de péptidos de peso molecular bajo (Caessens y col., 1999;

Benítez y col., 2008), como en éste caso en el que a pesar de aumentar la concentración del gel, no

fue posible observar bandas con pesos moleculares menores de 3 kDa.

En la Figura 5-5 se presentan los geles obtenidos en la electroforesis SDS-PAGE al 18 % de

acrilamida de los péptidos de FNP, FAH y PFS permeados por las membranas de ultrafiltración. En la

imagen se muestra el marcador de peso molecular en el primer carril y el concentrado proteico de

cada variedad en el último carril. Respecto a los carriles centrales, los cuales contienen las fracciones

peptídicas (f>10, f3-10, f1-3, f<1), en el tercer carril se observó un grupo de proteínas abundante

donde probablemente estén presentes la mayor concentración de péptidos con pesos moleculares

mayores de 10 kDa, seguida de la fracción de péptidos con pesos de 3 a 10 kDa; y en las imágenes no


68


Figura 5-5. SDS-PAGE al 18%, de los péptidos obtenidos de la ultrafiltración de los hidrolizados de frijol a) negro plus, b) azufrado higuera y c) pinto Saltillo.

Dónde: MK es el marcador de peso molecular, (f>10, f3-10, f1-3, f<1) son las fracciones obtenidas por ultrafiltración, H tot es el hidrolizado total y Conc es el concentrado de proteínas sin hidrolizar.

a)

b)

c)


69


se observaron bandas o grupos de proteínas en las fracciones f1-3 y f<1 debido a que son pesos

moleculares muy bajos, y como ya se mencionó ésta es una de las limitaciones principales de la

electroforesis SDS-PAGE (Benítez y col., 2008); por lo cual podría utilizarse otra técnica para

corroborar la presencia de péptidos como fraccionamiento por cromatografía por exclusión de

tamaño y HPLC en fase reversa, o electroforesis capilar (Torres-Llanez y col., 2005)

Para abordar el principal objetivo de este trabajo y comprobar que cada una de éstas

fracciones peptídicas presentaba algún tipo de actividad biológica, se procedió a realizar las pruebas

in vitro de actividad antimicrobiana, actividad antioxidante y actividad inhibidora de la enzima

convertidora de la angiotensina.

5.8 Determinación de la actividad antibacteriana

5.8.1 Controles positivos - Resistencia de las cepas indicadoras a los antibióticos

Cuadro 5-8. Determinación de la resistencia de las cepas a los antibióticos de referencia (control positivo).

Diámetro de los halos de Inhibición de los controles positivos (mm)

Tinción de

Gram

Cloranfenicol (30 µg)

Ampicilina (10 µg)

Halo

Resistencia al antibiótico

Halo Resistencia al

antibiótico

B. subtilis G (+) 33.0 ± 0.4 b Susceptible

46.1 ± 0.1 a Susceptible

B. cereus G (+) 26.2 ± 1.0 a Susceptible

26.7 ± 1.3 a Intermedio

S. aureus (cepa 1) G (+) 32.6 ± 0.6 b Susceptible


S. aureus (cepa 2) G (+) 34.8 ± 0.4

b Susceptible

49.7 ± 0.6

a Susceptible

L. monocytogenes G (+) 33.4 ± 1.3 a Susceptible


Y. enterocolitica G (-) 32.5 ± 0.3 a Susceptible

17.1 ± 0.8 b Susceptible

E. coli G (-) 24.8 ± 0.7 b Susceptible


K. pneumoniae G (-) 34.9 ± 0.5 b Susceptible


K. rhinoscleromatis G (-) 35.4 ± 1.0

b Susceptible

43.6 ± 0.5

a Susceptible

S. typhi G (-) 29.6 ± 0.9 a Susceptible

11.7 ± 0.5 b Intermedio

S. dysenteriae G (-) 34.0 ± 0.3 b Susceptible


E. agglomerans G (-) 34.3 ± 0.3 b Susceptible


Los resultados se presentan como promedio del diámetro en mm ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. a,b

. Medias con la misma letra en el mismo renglón no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

Los resultados de la determinación antibacteriana se presentan en el Cuadro 5-8 como

promedio de los diámetros de los halos de inhibición obtenidos para los controles positivos que

fueron cloranfenicol y ampicilina sobre cada una de las cepas probadas como lo indica la metodología


70


en la sección 4.11, y clasificadas de acuerdo a su resistencia al antibiótico en susceptible, intermedio

o resistente como lo indica Konneman y col. (2004). De acuerdo a la clasificación estándar se observó

que todas las cepas fueron susceptibles al cloranfenicol como control positivo (antibiótico de

referencia) y casi todas fueron susceptibles a la ampicilina con excepción de B. cereus y S. typhi que

resultaron tener una resistencia intermedia, esto resalta su importancia en el momento que se desea

establecer una relación entre las características de la cepa y su resistencia al antibiótico con los

péptidos obtenidos por hidrólisis de los concentrados proteicos. Entre las cepas analizadas y los

controles positivos existen diferencias significativas (Duncan, p ≤ 0.05) respecto a los halos de

inhibición que presentaron.

De acuerdo con trabajos previos las cepas con mayor susceptibilidad a los antibióticos son las

Gram (-) debido a que su pared celular está conformada por una capa delgada de péptidoglicano

unida a una membrana exterior por lipoproteínas que fácilmente puede ser afectada por enzimas

hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte, como el cado de S. typhi,

aunque B. cereus es una excepción a este comportamiento ya que este patógeno está clasificado

como Gram (+) por lo que teóricamente debería resistir mejor ante los antibióticos.

5.8.2 Actividad antibacteriana en harinas de frijol hidrolizadas

Se realizaron ensayos preliminares con suspensiones de las harinas de frijol en cantidades de

10 y 20 µg de harina en el sensidisco y en ninguno de los casos se observó actividad antibacteriana.

En ninguna de las tres variedades se presentó actividad antibacteriana, ni a ninguna de las

concentraciones; además, no existen datos reportados acerca de actividad antibacteriana en harinas

de ningún tipo de leguminosas. De manera contraria, alrededor del sensidisco con el hidrolizado se

observó una aglomeración de bacterias, probablemente este comportamiento se debió a la alta

cantidad de azucares disponibles (glucosa, fructosa y sacarosa) en las harinas de frijol (alrededor del

60 % según los resultados presentados en el Cuadro 5-3).

5.8.3 Actividad antibacteriana en harinas desengrasadas e hidrolizadas de frijol

Las harinas desengrasadas de las tres variedades de frijol a una concentración del 10 % (p/v)

fueron sometidas a un proceso de hidrólisis enzimática con Alcalasa® seguido de un proceso de

liofilización. Posteriormente este liofilizado fue suspendidos en agua y colocados en concentraciones

de 5, 10 y 20 µg en sensidiscos para su análisis. En este tratamiento, no se observó actividad

antibacteriana en ninguna variedad de frijol ni en ninguna de las concentraciones utilizadas,


71


probablemente debido a la baja concentración de péptidos y a la alta concentración de residuos de

carbohidratos solubles. De la misma manera que en el ensayo 5.8.2, no existen datos reportados

acerca de actividad antibacteriana en harinas hidrolizadas de ningún tipo de leguminosas.

5.8.4 Actividad antibacteriana de los hidrolizados totales obtenidos a partir de la proteína

concentrada de frijol

Cuadro 5-9. Actividad antibacteriana del hidrolizado total de los concentrados proteicos de frijol

Halo formado con los hidrolizados totales de cada variedad de frijol sobre agar Müeller-Hinton

Frijol Negro Frijol Azufrado Frijol Pinto

5 µg 10 µg 20 µg 5 µg 10 µg 20 µg 5 µg 10 µg 20 µg

B. subtilis - - - - 7.25 ± 0.2 8.45 ± 0.1 - 7.35 ± 0.2 7.50 ± 0.3

B. cereus - - 10.0 ± 0.2 - - - - - -

S. aureus (cepa 1) - - - - 7.75 ± 0.5 7.95 ± 0.5 - 6.80 ± 0.1 6.90 ± 0.1

S. aureus (cepa 2) - - - - 7.75 ± 0.7 8.10 ± 0.3 - - -

L. monocytogenes - - - - - - - - -

Y. enterocolitica - - - - - - - - -

E. coli - - 8.40 ± 0.9 - - - - - -

K. pneumoniae - - - - 8.25 ± 0.3 9.50 ± 0.6 - - -

K. rhinoscleromatis - - - - - - - - 6.50 ± 0.5

S. tiphy - - 9.10 ± 0.7 - - - - - -

S. dysenteriae - 6.30 ± 0.3 6.35 ± 0.2 - 7.15 ± 0.4 8.45 ± 0.2 - 6.90 ± 0.2 7.05 ± 0.1

E. agglomerans - - - - 8.20 ± 0.6 9.75 ± 0.4 - 6.45 ± 0.3 6.65 ± 0.2

Los resultados se presentan como promedio del diámetro en mm ± desviación estándar del duplicado de los experimentos.

En la prueba de susceptibilidad microbiana determinada por difusión en agar Müeller-Hinton a

partir de los hidrolizados totales de los concentrados proteicos al 4 % (p/v) se comenzaron a observar

resultados positivos en inhibición (en cantidades de 20 µg). Los resultados para las tres variedades de

frijol en las cuales hubo actividad antibacteriana se presentan en el Cuadro 5-9; en este se observó

que los hidrolizados totales tuvieron actividad sobre nueve de las doces cepas estudiadas, además se

observó que el aumento en la actividad antibacteriana fue proporcional al aumento en la

concentración de proteína en el sensidisco. No se observó actividad en 5 µg de proteína en el

sensidisco. Al clasificarse resultó que todas las cepas fueron resistentes a los péptidos contenidos en

el hidrolizado total de frijol ya que no se midieron halos de inhibición de grandes dimensiones


72


(Konneman y col., 2004). El hidrolizado total del FNP formó el halo de inhibición más grande (10 mm),

sin embargo, no es un valor comparable con los controles positivos ya que existe entre ellos

diferencia significativa (Duncan, p ≤ 0.05). La variedad FAH presentó actividad sobre seis de las doce

cepas analizadas, mientras que el FPS sobre cinco y FNP sobre cuatro. En esta prueba preliminar S.

dysenteriae resultó ser la única cepa con susceptibilidad a los hidrolizados de las tres variedades, lo

cual resulta interesante ya que ésta enterobacteria es importante desde el punto de vista de

seguridad alimentaria, pues es causante de diversas enfermedades debido a que produce una

exotoxina termolábil que afecta el intestino (diarrea e inhibición de la absorción de azúcar y amino

ácidos) y el sistema nervioso central (neurotoxina que puede contribuir a la gravedad extrema y

naturaleza mortal de las infecciones) (O’Brien y col., 1982).

5.8.5 Actividad antibacteriana de las fracciones peptídicas de los hidrolizados de los

concentrados proteicos de frijol

Los resultados de la determinación de actividad antibacteriana determinada como

susceptibilidad de las diferentes fracciones obtenidas por ultrafiltración de los hidrolizados totales de

los concentrados proteicos de frijol se presentan en el Cuadro 5-10 para el FAH. En éstos resultados,

se observó que las fracciones peptídicas de FAH presentaron la mayor actividad antibacteriana en la

fracción de péptidos con pesos moleculares de 3 a 10 kDa con halos de inhibición de hasta 10.25 mm

(en K. pneumoniae). Las cepas sobre las cuales se observó susceptibilidad debido a la presencia de

péptidos de la fracción peptídica de 3 a 10 kDa, coinciden con las del Cuadro 5-9, en donde fue

evidente que el FAH es potencialmente un antibacteriano ante ciertas cepas indicadoras; tres de ellas

Gram(-) y dos Gram(+), además la actividad de éstas se vio incrementada al aumentar la

concentración de proteína en el sensidisco. Los mismos análisis se realizaron para las otras dos

variedades de frijol (FPS y FNP). En FPS se observó un halo de 7.0 ± 0.7 mm sobre K. pneumoniae en la

fracción de 3 a 10 kDa y fue la única cepa que presentó susceptibilidad ante los péptidos de esta

variedad de frijol. Mientras que en la variedad FNP no se observó actividad alguna. Tampoco se

observaron halos de inhibición con las fracciones peptídicas de tamaño superior de 10 kDa y menor

de 3 kDa, lo que hace suponer que la amplia gama de péptidos de distintos pesos moleculares

contenidos en los HT de frijol permiten ejercer su actividad antibacteriana sobre las cepas indicadoras

estudiadas en este trabajo.


73


Cuadro 5-10. Actividad antibacteriana de las fracciones del hidrolizado del concentrado de FAH

Halos de inhibición formados con las fracciones de FAH en agar Müeller-Hinton

Fracción > 10 kDa Fracción 3 a 10 kDa Fracción < 3 kDa

10 µg 20 µg

10 µg 20 µg

10 µg 20 µg

B. subtilis - -

7.55 ± 0.3 8.65 ± 0.9

- -

B. cereus - -

- -

- -

S. aureus (cepa 1) - -

- -

- -

S. aureus (cepa 2) - -

8.05 ± 0.2 8.35 ± 0.6

- -

L. monocytogenes - -

- -

- -

Y. enterocolitica - -

- -

- -

E. coli - -

- -

- -

K. pneumoniae - -

8.75 ± 0.4 10.25 ± 0.2

- -

K. rhinoscleromatis - -

- -

- -

S. tiphy - -

- -

- -

S. dysenteriae - -

7.25 ± 0.3 8.8 ± 0.5

- -

E. agglomerans - -

8.55 ± 0.4 9.25 ± 0.6

- -

Los resultados se presentan como promedio del diámetro en mm ± desviación estándar del duplicado de los experimentos y las cantidades como µg de proteína/sensidisco.

5.8.6 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de las fracciones peptídicas e

hidrolizados de frijol

Después de las pruebas preliminares de inhibición, se determinó la concentración mínima

inhibitoria (CMI) de cada muestra por la técnica de dilución en microplaca, y los resultados de los

hidrolizados totales y las fracciones peptídicas de cada variedad de frijol se presentan en el Cuadro

5-11. De manera general, se observó que en las fracciones de péptidos con pesos moleculares

menores de 1 kDa las CMI determinada fueron menores que en péptidos de mayor tamaño. También

se observó que el FNP inhibió a la cepa indicadora S. dysenteriae con una CMI de 100 µg/mL de

solución final, y ésta fue la menor concentración obtenida en este ensayo. En las fracciones peptídicas

de frijol se observó actividad antibacteriana en las tres variedades, principalmente en las fracciones

peptídicas con pesos moleculares menores a 1 kDa, del análisis resultó que S. dysenteriae, además de

ser inhibida por FNP también fue inhibida por el FAH (400 µg/mL de solución) y el FPS (300 µg/mL de

solución). Otras cepas indicadoras fueron inhibidas con los péptidos de pesos moleculares superiores

a 10 kDa, S. typhi (300 µg/mL de solución) y E. agglomerans (200 µg/mL de solución).


74


Cuadro 5-11. CMI determinada para las fracciones de hidrolizados de frijol.

Variedad/Cepa Fracción del hidrolizado

HT f>10 f 3-10 f 1-3 f<1

FNP

B. cereus >500 >500 >500 >500 >500

E. coli >500 >500 >500 >500 >500

S. tiphy >500 300 >500 >500 >500

S. dysenteriae 300 >500 >500 500 100

FAH

B. subtilis >500 >500 >500 >500 400

S. aureus (cepa 1) >500 >500 >500 >500 >500

K. pneumoniae >500 >500 >500 >500 >500

S. dysenteriae >500 >500 >500 >500 400

E. agglomerans >500 >500 >500 >500 >500

FPS

B. subtilis >500 >500 >500 >500 >500

S. aureus (cepa 1) >500 >500 >500 >500 >500

K. rhinoscleromatis >500 >500 >500 >500 300

S. dysenteriae >500 500 >500 >500 300

E. agglomerans >500 200 >500 >500 500

Las concentraciones finales de proteína en las muestras del hidrolizado total o las fracciones peptídicas se

presentan en µg/mL con 100 µL de muestra por pozo como resultado de un análisis por triplicado.

Previamente en se establecieron los posibles mecanismos de acción de los péptidos

antimicrobianos que involucran la interferencia en la síntesis de enzimas metabólicas o del DNA, o la

actuación del péptido directamente a nivel de la membrana celular ya sea alterando la permeabilidad

o lisándola mediante la formación de canales o poros, como en el caso de los péptidos α-hélice

(Nissen-Meyer y Nes, 1997); y aunque se desconocen muchos detalles sobre los mecanismos de

acción de los péptidos antimicrobianos α-hélice, se considera que actúan directamente en la

membrana celular y que su secuencia de aminoácidos es importante, ya que si se sustituyen

aminoácidos que alteren la polaridad del péptido, su actividad disminuye (Matsuzaki, 1998). También

se debe tomar en cuenta su comportamiento molecular y su carácter catiónico que hace que los

péptidos presenten una mayor afinidad por los fosfolípidos ácidos de las bacterias Gram(-) y

polisacáridos de las bacterias Gram(+) (Shai, 1998), esto explica el hecho de que la mayoría de las


75


bacterias inhibidas por los péptidos de frijol sean del tipo Gram(-). Por lo que es de importancia

identificar los aminoácidos presentes en la cadena α-hélice de los péptidos analizados en este trabajo.

Por otro lado, la actividad antibacteriana de hidrolizados de origen vegetal ha sido

escasamente reportada, sin embargo, dicha actividad se ha presentado en extractos de plantas o sus

semillas. Amarowicz y col. (2008) reportaron que en constituyentes de frijol (fenoles y taninos)

obtenidos por extracción acetónica la CMI fue de 125 a 250 µg/mL, aún que no se trata del mismo

tipo de muestra sin embargo éste puede ser un patrón de comparación y muestra que los

hidrolizados de frijol y sus fracciones peptídicas inhiben a los microorganismos patógenos en

concentraciones similares. Por su parte, Wong y Ng (2005) extrajeron de P. lunatus la lunatusina, y

ésta proteína de aproximadamente 7 kDa de peso molecular presentó además de actividad

antibacteriana sobre Bacillus megaterium, B. subtilis, Proteus vulgaris y Mycobacterium phlei;

también actividad antifúngica sobre Fusarium oxysporum, Mycosphaerella arachidicola y Botrytis

cinerea.

Estos antecedentes demuestran que los péptidos de frijol tienen actividad antibacteriana sobre

bacterias principalmente Gram(-) y en menor grado Gram(+), y de acuerdo con lo reportado podrían

actuar como agentes antifúngicos sobre algunas cepas indicadoras.

5.9 Determinación de la actividad antioxidante

Los métodos de determinación de la actividad antioxidante son diversos debido a que cada uno

de ellos presenta sus beneficios y limitaciones. En este caso los métodos utilizados fueron

espectrofotométricos y tienen la limitación de no ser selectivos ya que no determinan el grupo de

compuestos que actúan (como: polifenoles totales, flavonoides totales, antocianinas totales,

catequinas totales, epi-catequina, epigalocatequingalato); sin embargo, son prácticos y se pueden

estandarizar al ser comparados con antioxidantes de referencia conocidos (Fernández-Pachón y col.,

2006).

5.9.1 Método de captación del radical libre DPPH+

En el Cuadro 5-12 se presentan los resultados de la actividad antioxidante correspondiente al

concentrado proteico, hidrolizado total y fracciones peptídicas de las tres variedades de frijol en

porcentaje de captación del radical libre DPPH.


76


Se observa que existe diferencia significativa entre las muestras leídas a 30 min y 60 min lo cual

muestra un evidente incremento en la captación del radical libre DPPH+ al incrementar el tiempo de

reacción (Duncan, p ≤ 0.05). Aunque no existen reportes con este tipo de muestras para realizar las

comparaciones pertinentes, hay en la literatura trabajos con proteínas vegetales similares como el

trabajo reportado por Rocha-Guzmán y col. (2007) quienes determinaron la actividad antioxidante de

5 mg/L de extracto metanólico 50 % (v/v) de harina de frijol en periodos de tiempo de 10 min por 1 h

y reportaron entre el 20 y 30 % de inhibición del radical libre DPPH+, y demostraron que el tiempo es

importante en la reacción del DPPH+ con la muestra. En el Cuadro 5-12 también se observó que el

efecto de inhibición depende de la variedad de frijol, siendo FAH y FNP las variedades con mayor

efecto antioxidante mientras el FPS presentó la menor actividad antioxidante.

Cuadro 5-12. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por captación de DPPH+ (%)

Tiempo % AA presentada por cada fracción peptídica de proteínas de frijol

Frijol (min) Concentrado H. Total f>10 kDa 3-10 kDa 1-3 kDa f<1 kDa

FNP 30 20.26 ± 1.82Da2 23.92 ± 2.60 Ca2 20.79 ± 2.38 Da2 29.89 ± 3.90 Ba2 36.35 ± 3.33 Aa2 24.27 ± 0.46 Ba2

60 21.16 ± 1.83 Da1 26.15 ± 1.46 Ca1 27.68 ± 1.30 Da1 34.46 ± 4.65 Ba1 40.19 ± 3.83 Aa1 26.09 ± 0.97 Ba1

FAH 30 20.78 ± 0.64 Da2 23.16 ± 0.50 Ca2 14.10 ± 2.36 Da2 34.51 ± 0.70 Ba2 35.24 ± 1.21 Aa2 33.79 ± 0.58 Ba2

60 21.59 ± 0.86 Da1 24.16 ± 0.70 Ca1 18.02 ± 1.92 Da1 35.50 ± 0.63 Ba1 36.91 ± 0.94 Aa1 35.31 ± 0.71 Ba1

FPS 30 10.13 ± 0.38 Db2 15.45 ± 3.01 Cb2 14.86 ± 4.46 Db2 25.58 ± 7.19 Bb2 28.61 ± 1.92 Ab2 34.02 ± 1.68 Bb2

60 12.70 ± 0.74 Db1 17.59 ± 3.94 Cb1 20.31 ± 3.18 Db1 30.18 ± 7.97 Bb1 32.30 ± 1.80 Ab1 37.71 ± 1.63 Bb1

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. A,B,C,D

. Medias en la misma línea con la misma letra no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05). a,b

. Medias en la misma columna con la misma letra no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05). 1,2

. Medias en la misma columna y variedad con el mismo número no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

Independientemente de la variedad de frijol analizada, la fracción que contiene el grupo de

péptidos con pesos moleculares de 1-3 kDa fue la que presentó mayor actividad antioxidante con

valores de 40.19, 36.91 y 32.30 % en FNP, FAH y FPS, respectivamente. Sin embargo, los controles

positivos inhiben hasta en 91.84 ± 1.5 (1.2 mM de Trolox), 90.50 ± 0.42 (0.75 mM de ácido gálico) y

89.56 ± 0.37 % (1.2 mM de ácido ascórbico).

En este tipo de análisis, se ha reportado que algunos compuestos fenólicos y taninos extraídos

de semillas de leguminosas poseen actividad antibacteriana (Valdés y col., 2011); sin embargo, han

sido pocos los trabajos publicados en hidrolizados de origen vegetal y sus fracciones peptídicas.

Aunque no se trata del mismo radical libre, el grupo de trabajo de Torruco-Uco y col. (2009)

determinaron que el hidrolizado total de frijol negro Jamapa hidrolizado con Alcalasa durante 60 min


77


presentó hasta un 60.59 % de inhibición del radical libre 2,2-azino-bis-(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-

sulfónico). Recientemente, Wang y col. (2012b) quienes trabajaron con una proteína de origen

animal, separaron péptidos con pesos moleculares de 1 a 10 kDa a partir del hidrolizado de proteína

de huevo y demostraron que éstos péptidos tienen hasta un 62.64 ± 0.98 % de inhibición del radical

libre DPPH+; probablemente la gran diferencia que existe entre los resultados reportados y los

obtenidos en éste trabajo sean debido a la fuente de las proteínas pues es sabido que las proteínas

animales son de mayor valor biológico por su contenido de aminoácidos y muy probablemente sus

derivados (péptidos) lo sean también.

Cuadro 5-13. Equivalentes del antioxidante de referencia con respecto de las fracciones de péptidos de frijol determinada por captación del radical libre DPPH

+

Variedad

de frijol

Fracción

peptídica

Equivalentes de Trolox (mg/g)

Equivalentes de Ácido gálico

(mg/g)

Equivalentes de Ácido ascórbico

(mg/g)

FNP HT 43.75 ± 2.33 39.52 ± 1.38 43.48 ± 1.46

f > 10 52.80 ± 1.92 43.48 ± 1.46 49.16 ± 1.20

f 3-10 62.76 ± 6.84 49.16 ± 1.20 55.41 ± 4.29

f 1-3 71.18 ± 5.63 55.41 ± 4.29 60.69 ± 3.53

f < 1 50.47 ± 1.43 60.69 ± 3.53 47.70 ± 0.90

FAH HT 41.02 ± 0.84 40.32 ± 0.65 42.25 ± 0.53

f > 10 36.64 ± 2.86 42.25 ± 0.53 39.50 ± 1.80

f 3-10 62.76 ± 0.94 39.50 ± 1.80 55.89 ± 0.59

f 1-3 64.86 ± 1.40 55.89 ± 0.59 57.21 ± 0.88

f < 1 62.47 ± 1.07 57.21 ± 0.88 55.71 ± 0.67

FPS HT 33.17 ± 4.71 33.65 ± 0.56 37.32 ± 2.96

f > 10 41.02 ± 4.71 37.32 ± 2.96 42.25 ± 2.96

f 3-10 55.64 ± 11.81 42.25 ± 2.96 51.43 ± 7.41

f 1-3 58.77 ± 2.67 51.43 ± 7.41 53.39 ± 1.67

f < 1 66.80 ± 2.42 53.39 ± 1.67 58.43 ± 1.52

Los resultados se presentan en mg del antioxidante de referencia por g de muestra analizada como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. Dónde: HT representa al hidrolizado

total y; f>10, f3-10, f1-3, f<1 a las fracciones peptídicas obtenidas del hidrolizado de frijol.

Los equivalentes en función de los antioxidantes de referencia (Cuadro 5-13) reflejan la

semejanza entre la actividad antioxidante de los mismos y el potencial antioxidante de una muestra

(Jiménez-Arellanes y col., 2011). En este caso se observaron valores bajos de actividad antioxidante

en comparación con las referencias, la fracción de péptidos con pesos moleculares de 1-3 kDa del FNP

presentó la mayor equivalencia (71.18 mg/g equivalentes de Trolox). Por lo que la actividad


78


antioxidante de los péptidos de frijol analizados en este trabajo, no puede competir con las

referencias desde el punto de vista de bioactividad, sin embargo, puede ser considerado como una

alternativa ante los antioxidantes de origen químico.

5.9.2 Método de captación del radical libre ABTS+

En el Cuadro 5-14 se presentan los resultados de la actividad antioxidante correspondiente a la

técnica de decoloración del radical libre ABTS. Los porcentajes de actividad antioxidante más altos

fueron obtenidos cuando la fracción peptídica fue de peso molecular inferior a 1 kDa (Duncan, p ≤

0.05). En la fracción peptídica de 1–3 kDa se observó que la actividad antioxidante fue superior al 50

%, mientras que en la fracción de peso molecular menor de 1 kDa la actividad fue superior al 80 %. De

las tres variedades el FNP demostró tener el mayor potencial antioxidante (Duncan, p ≤ 0.05), ya que

desde el hidrolizado total se observó casi un 50 % de actividad antioxidante y llegó hasta el 99 % en la

fracción de menor tamaño. En lo que respecta a los antioxidantes de referencia, éstos llegaron hasta

el 97.25 ± 2.93 (2.5 mM de Trolox), 97.85 ± 2.87 (1 mM de ácido gálico) y 91.01 ± 3.23 (3.5 mM de

ácido ascórbico).

Cuadro 5-14. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por decoloración del ABTS+ (%)

Fracción (kDa) FNP FAH FPS

HT 48.38 ± 1.44 Ad 38.04 ± 0.32 Bd 19.90 ± 2.24 Cd

f > 10 54.48 ± 2.44 Ad 26.27 ± 3.59 Bd 30.75 ± 6.59 Cd

f 3-10 61.82 ± 4.19 Ac 55.31 ± 1.19 Bc 35.41 ± 3.92 Cc

f 1-3 78.62 ± 5.21 Ab 69.48 ± 2.61 Bb 51.62 ± 2.46 Cb

f < 1 99.17 ± 0.91 Aa 87.63 ± 0.79 Ba 82.69 ± 2.05 Ca

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. A,B,C

Letras iguales en el mismo renglón no representan diferencia significativa (Duncan, p ≤ 0.05). a,b,c,d

Letras iguales en la misma columna no representan diferencia significativa (Duncan, p ≤ 0.05)

Recientemente, Ruiz-Ruiz y col. (2013a) reportaron una actividad antioxidante de 6.09 a 28.2 %

en hidrolizados totales y fracciones de péptidos de frijol negro Jamapa (f>10, 5–10, 3–5, 1–3 y f<1

kDa) obtenidos con una combinación de Alcalasa-Flavourzima o pepsina-pancreatina; siendo sus

valores inferiores a los resultados obtenidos en éste trabajo. En otro trabajo similar determinaron

que el hidrolizado total de frijol negro Jamapa hidrolizado con Alcalasa durante 60 min presentó hasta

un 60.59 % de inhibición de éste radical libre (Torruco-Uco y col., 2009). Por su parte, Dávalos y col.

(2004) reportaron las secuencias de péptidos obtenidos de la hidrólisis de proteínas de huevo TTYY,

TPIL y TPI, los cuales presentaron actividad antioxidante (hasta de 3.8 mM equivalentes de Trolox por


79


mM del péptido) y actividad inhibitoria de la ECA-I (menor del 50 %), incluso en éste trabajo se

concluye que los aminoácidos contenidos en éstos péptidos no pueden actuar individualmente, por lo

que es probable que su modo de acción sea cooperativo y sinérgico.

Cuadro 5-15. Equivalentes del antioxidante de referencia con respecto de las fracciones de péptidos de frijol determinada por captación del radical libre ABTS+

Variedad

de frijol

Fracción

peptídica

Equivalentes de Trolox (mg/g)


(mg/g)


(mg/g)

FNP HT 282.09 ± 9.88 81.95 ± 4.09 300.67 ± 10.67

f > 10 323.84 ± 16.72 93.69 ± 4.70 345.89 ± 18.07

f 3-10 371.13 ± 28.74 107.83 ± 8.08 400.24 ± 31.06

f 1-3 489.26 ± 35.72 140.19 ± 10.04 524.67 ± 38.61

f < 1 630.00 ± 6.22 179.76 ± 1.75 676.79 ± 6.72

FAH HT 211.24 ± 2.19 62.04 ± 0.62 224.20 ± 2.37

f > 10 130.59 ± 24.57 39.36 ± 6.91 137.03 ± 26.55

f 3-10 329.53 ± 8.18 95.29 ± 2.30 352.04 ± 8.84

f 1-3 426.63 ± 17.91 122.59 ± 5.04 456.99 ± 19.36

f < 1 550.93 ± 5.40 157.53 ± 1.52 591.33 ± 5.83

FPS HT 86.94 ± 15.37 27.09 ± 4.32 89.86 ± 16.61

f > 10 161.27 ± 45.14 47.99 ± 12.69 170.19 ± 48.78

f 3-10 193.21 ± 26.86 56.97 ± 7.55 204.71 ± 29.03

f 1-3 304.23 ± 16.88 88.18 ± 4.74 324.70 ± 18.24

f < 1 517.09 ± 14.04 148.02 ± 3.95 554.75 ± 15.18

Los resultados se presentan en mg del antioxidante de referencia por g de muestra analizada como

promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. Dónde: HT representa al hidrolizado


Los equivalentes en función de los antioxidantes de referencia se presentan en el Cuadro 5-15.

Para éste análisis se observaron valores altos de actividad antioxidante tomando en consideración las

referencias; de la misma manera que ocurrió con la técnica anterior (DPPH), la fracción de péptidos

con bajos pesos moleculares del FNP presentó la mayor equivalencia (630 mg/g equivalentes de

Trolox), lo que indica un incremento en la actividad antioxidante debido al método ya que

probablemente existe una mayor afinidad entre los aminoácidos contenidos en los péptidos de frijol y

la estructura química del radical libre.

Adicionalmente, se ha asociado la actividad antioxidante a la presencia de los aminoácidos Y,

M, H, K o W en péptidos obtenidos por hidrólisis de proteínas de soya (Peña-Ramos y Xiong, 2009);


80


con este conocimiento se puede suponer que algunos de estos aminoácidos se encuentran presentes

en las fracciones ensayadas ya que la soya pertenece a la misma familia que el frijol. En otros trabajos

han reportado que los aminoácidos básicos poseen la capacidad de unirse a iones metálicos, y los

aminoácidos aromáticos y sulfurados poseen la capacidad de donar protones para estabilizar los

radicales libres (Arcan y Yemenicioğlu, 2007); lo que permite suponer que en los péptidos de frijol se

encuentren presentes estos tipos de aminoácidos. La actividad antioxidante de los HT de FNP de este

trabajo es similar a la obtenida por Torruco-Uco y col. (2009) con los HT de frijol negro Jamapa,

mientras que las variedades FAH y FPS tuvieron menores porcentajes de actividad antioxidante; lo

que permite deducir que las semillas de color negro poseen mayor potencial antioxidante que las

variedades de color café o amarillo, y posiblemente se deba a su contenido de polifenoles (Rocha-

Guzmán y col., 2007), además de la acción de los aminoácidos contenidos en la muestra. Además,

Ruiz-Ruiz y col. (2013a) reportaron que las fracciones peptídicas de frijol de bajo peso molecular

fueron responsables de al menos otra actividad biológica, como la hipertensiva.

5.9.3 Método de captación del radical libre DMPD+

En el Cuadro 5-16 se presentan los resultados de la actividad antioxidante correspondiente a

la técnica de decoloración del radical libre DMPD.

Cuadro 5-16. Actividad antioxidante de péptidos de frijol determinada por decoloración del DMPD+ (%)

Fracción (kDa) FNP FAH FPS

HT 7.78 ± 0.37 Bd

31.24 ± 1.53 Ad

11.97 ± 2.24 Bd

f >10 17.03 ± 1.74 Bd 23.32 ± 0.77 Ad 16.34 ± 6.59 Bd

f 3-10 44.22 ± 3.25 Bc 47.57 ± 3.92 Ac 27.54 ± 3.92 Bc

f 1-3 67.89 ± 2.96 Bb 66.04 ± 1.59 Ab 66.25 ± 2.05 Bb

f < 1 76.16 ± 1.23 Ba 67.09 ± 3.62 Aa 89.08 ± 2.46 Ba

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. A,B

Letras iguales en el mismo renglón no representan diferencia significativa (Duncan, p ≤ 0.05). a,b,c,d

Letras iguales en la misma columna no representan diferencia significativa (Duncan, p ≤ 0.05)

En esta determinación el incremento en el porcentaje de la actividad antioxidante en

presencia de péptidos de bajo peso molecular fue menor a la obtenida por el método de ABTS, sin

embargo, es probable que sea la técnica más adecuada para determinar la actividad antioxidante de

los hidrolizados de frijol debido a que el disolvente es una solución acuosa. Los porcentajes de

actividad antioxidante más altos fueron obtenidos cuando la fracción peptídica fue peso molecular

inferior a 1 kDa (Duncan, p ≤ 0.05), lo cual concuerda con los resultados obtenidos con el método de


81


ABTS. En la fracción peptídica de 1–3 kDa se observó que la actividad antioxidante fue de un 66 - 67 %

en las tres variedades de frijol ensayadas, mientras que en la fracción de peso molecular menor de 1

kDa la actividad fue variable (67 – 89 %) aunque superior.

Cuadro 5-17. Equivalentes del antioxidante de referencia con respecto de las fracciones de péptidos de frijol determinada por captación del radical libre DMPD+

Variedad

de frijol

Fracción

peptídica

Equivalentes de Trolox (µg/g)


(µg/g)


(µg/g)

FNP HT 12.28 ± 0.05 7.38 ± 0.03 30.72 ± 0.12

f > 10 11.05 ± 0.23 6.64 ± 0.14 27.64 ± 0.58

f 3-10 7.43 ± 0.43 4.46 ± 0.26 18.58 ± 1.08

f 1-3 4.28 ± 0.39 2.57 ± 0.24 10.7 ± 0.99

f < 1 3.17 ± 0.16 1.91 ± 0.1 7.94 ± 0.41

FAH HT 9.15 ± 0.2 5.5 ± 0.12 22.9 ± 0.51

f > 10 10.21 ± 0.1 6.13 ± 0.06 25.54 ± 0.26

f 3-10 6.98 ± 0.52 4.19 ± 0.31 17.46 ± 1.31

f 1-3 4.52 ± 0.21 2.72 ± 0.13 11.31 ± 0.53

f < 1 4.38 ± 0.48 2.63 ± 0.29 10.96 ± 1.2

FPS HT 11.72 ± 0.42 7.04 ± 0.25 29.32 ± 1.05

f > 10 11.14 ± 0.11 6.69 ± 0.06 27.87 ± 0.26

f 3-10 9.65 ± 0.14 5.8 ± 0.08 24.14 ± 0.35

f 1-3 4.49 ± 0.18 2.7 ± 0.11 11.24 ±0.44

f < 1 1.45 ± 0.13 0.87 ± 0.08 3.64 ± 0.32

Los resultados se presentan en µg del antioxidante de referencia por g de muestra analizada como

promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. Dónde: HT representa al hidrolizado


De las tres variedades el FPS demostró tener el mayor potencial como captor de radicales

libres llegando hasta el 89 % de inhibición en la fracción de menor tamaño molecular con éste

método; sin embargo, el FAH presentó la mayor actividad antioxidante en casi todas las fracciones

ensayadas (Duncan, p ≤ 0.05). La actividad antioxidante presentada por los antioxidantes de

referencia fue de 90.34 ± 0.23 (1 mM de Trolox), 91.40 ± 0.54 (0.9 mM de ácido gálico) y 94.67 ± 1.85

% (3.75 mM de ácido ascórbico). Además se observó que la desventaja del método es que su

capacidad antioxidante en relación a los antioxidantes de referencia es sumamente menor que la

obtenida por los métodos de DPPH y ABTS, lo cual parece ser un factor limitante en el uso de éste

método en determinaciones similares (Cuadro 5-17).


82


Desde el punto de vista de aplicación, el tiempo de reacción y lectura necesario para realizar

las medidas de DPPH (30 y 60 min) en comparación con el método ABTS (1 y 6 min), supone una

desventaja en adición también al elevado costo del radical libre DPPH, sin embargo, los resultados

obtenidos con el método DMPD (10 min) podrían ser más útiles ya que el sistema en el cual se lleva a

cabo la reacción involucra un medio acuoso en la prueba de actividad antioxidante, esto permitiría

deducir la actividad antioxidante de los péptidos de frijol adicionados en alimentos para consumo

humano (Kuskosky y col., 2005).

5.9.4 Método de quimioluminiscencia

Otro método utilizado para determinar la actividad antioxidante de los hidrolizados y sus

fracciones peptídicas fue el método de quimioluminiscencia (o de inhibición de los radicales libres

luminol) y cuyos resultados se presentan en el Cuadro 5-19.

Cuadro 5-18. Actividad quimioluminiscente de los controles positivos y blancos de control.

Antioxidante

de referencia % inhibición Blanco de

control % inhibición

Trolox 70.19 ± 2.71 Metanol 10.86 ± 5.20

Á. ascórbico 99.20 ± 0.06 Acetonitrilo 10.81 ± 1.63

Á. gálico 55.81 ± 2.76 PBS 0.0 ± 0.44

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos.

Para la estandarización del método se determinó la actividad antioxidante de tres

antioxidantes conocidos, utilizados como referencia (12 mM Trolox, 10 mM de ácido ascórbico y 12

mM ácido gálico) bajo los estándares de la técnica descrita en (4.12.4); además, se determinó la

posible actividad antioxidante de los disolventes utilizados en el tratamiento de los péptidos

(metanol, acetonitrilo y búfer de fosfatos) a fin de determinar alguna interferencia en la

interpretación de los resultados siguientes (Cuadro 5-18). Y se observó que la variación debido a los

disolventes utilizados fue de hasta un 10 %. Además, se observó que en este método el ácido

ascórbico fue quien inhibió hasta el 99 % del radical luminol, a diferencia de los otros métodos donde

el Trolox mostró mayor afinidad por el atrapamiento de los radicales libres.

En la determinación de la actividad antioxidante por el método de quimioluminiscencia se

observó que el potencial efecto antioxidante de las muestras depende de la variedad de frijol

empleada, siendo FAH la variedad con mayor actividad seguida de FNP y finalmente FPS (Cuadro


83


5-19). Además se observó que todas las fracciones son significativamente diferentes entre sí (Duncan,

p ≤ 0.05), siendo la fracción 1-3 kDa la de mayor actividad antioxidante seguida por la f<1 kDa lo que

indica que péptidos de bajo peso molecular tienen mayor actividad antioxidante que aquellos con

largas cadenas de péptidos lo que concuerda con Wang y col. (2012b). Las fracciones peptídicas

presentaron valores de actividad antioxidante en el intervalo de 36.07 - 94.02 %. Las fracciones con

mayor actividad antioxidante (determinada como inhibición del radical libre luminol) fueron las de

pesos moleculares de 1-3 kDa con 92.68 %, 94.02 % y 93.85 % en FNP, FAH y FPS, respectivamente;

seguidas por la fracción de péptidos de pesos moleculares menores de 1 kDa. Por su parte, el FAH

presentó actividad antioxidante significativamente mayor que las variedades FNP y FPS, hasta del

91.49 %.

Cuadro 5-19. Actividad antioxidante determinada por quimioluminiscencia de péptidos de frijol (%)

% AA presentada por cada fracción de frijol

Variedad Concentrado HT f>10 kDa 3-10 kDa 1-3 kDa f<1 kDa

FNP 36.07 ± 1.77 Fb 77.49 ± 1.43 Db 83.72 ± 2.48 Eb 87.33 ± 0.73 Cb 92.68 ± 3.07 Ab 76.32 ± 0.91 Bb

FAH 72.84 ± 2.42 Fa 74.14 ± 2.51 Da 47.06 ± 3.11 Ea 85.57 ± 1.07 Ca 94.02 ± 1.09 Aa 91.49 ± 1.15 Ba

FPS 42.77 ± 2.91 Fc 74.21 ± 1.58 Dc 41.97 ± 1.92 Ec 74.84 ± 2.42 Cc 93.85 ± 0.83 Ac 90.60 ± 1.32 Bc

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. A,B,C,D,E,F

. Medias en la misma línea con la misma letra no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05) a,b,c

. Medias en la misma columna con la misma letra no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05)

Al realizar la comparación de la actividad antioxidante de los hidrolizados totales y sus

fracciones peptídicas por el método del DPPH+ y por el método de quimioluminiscencia se

presentaron tendencias similares, sin embargo, con el método de luminiscencia se presenta un

incremento en la actividad antioxidante que puede estar asociado con la naturaleza de los radicales

(hidrofóbicos o hidrófilos), con los compuestos antioxidantes usados como referencia y con la

sensibilidad del método. Se ha reportado a la luminiscencia como un método de determinación de la

actividad antioxidante que ofrece ventajas al requerir muestras pequeñas y presentar alta

sensibilidad en el monitoreo de la reacción (Jakubowski y col., 1998) lo que permitió su aplicación

para determinar actividad antioxidante de péptidos de frijol usando cantidades pequeñas de dichos

péptidos.


84


5.9.5 Comparación de métodos de determinación de la actividad antioxidante

Figura 5-6. Comparación de la actividad antioxidante de los hidrolizados totales y las fracciones peptídicas de hidrolizados de proteína de frijol determinada por los cuatro métodos.

Dónde: HT representa al hidrolizado total; F>10, F3-10, F1-3, F<1 a las fracciones peptídicas obtenidas del hidrolizado de frijol; y DPPH, ABTS, DMPD y LUMIN a los métodos utilizados para la determinación

de la actividad antioxidante de péptidos de frijol en éste trabajo.

HT F>10 F3-10 F1-3 F>10

20

40

60

80

100

DPPH

ABTS

DMPD

LUMIN

Frijol negro plus

% A

cti

vid

ad

an

tio

xid

an

te

HT F>10 F3-10 F1-3 F>10

20

40

60

80

100

DPPH

ABTS

DMPD

LUMIN

Frijol azufrado higuera

% A

cti

vid

ad

an

tio

xid

an

te

HT F>10 F3-10 F1-3 F>10

20

40

60

80

100

DPPH

ABTS

DMPD

LUMIN

Frijol pinto Saltillo

% A

cti

vid

ad

an

tio

xid

an

te


85


En la Figura 5-6 se observa un comportamiento similar entre las diferentes técnicas de

determinación de actividad antioxidante. Sin embargo, es notorio el incremento en la actividad

antioxidante cuando esta se determinó por los métodos de quimioluminiscencia y apagamiento del

radical ABTS, presentando una mayor sensibilidad ante los radicales libres. Los métodos menos

sensibles fueron DPPH y DMPD.

En general, las fracciones con pesos moleculares de 1-3 y f<1 kDa presentaron la mayor

actividad antioxidante, éstos datos concuerdan con lo reportado por Carrasco-Castilla y col. (2012)

quienes encontraron el máximo efecto de reducción del radical ABTS en hidrolizados de frijol negro

Jamapa con pesos moleculares menores o iguales a 700 Da. Estos datos concuerdan con lo reportado

por Gallegos-Tintoré y col. (2013) quienes mencionan que los péptidos más reactivos son de pesos

moleculares entre 500 a 1800 Da, y además contienen aminoácidos hidrofóbicos.

5.10 Determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la

angiotensina

En el Cuadro 5-20 se presentan los resultados de la actividad inhibidora de la enzima

convertidora de la angiotensina I (% ECA-I) de la fracción que contiene péptidos de pesos moleculares

entre 1 y 3 kDa de las variedades de frijol estudiadas a una concentración final de 20 µg/mL. Se

observó que la actividad mínima obtenida fue del 88 % en frijol negro plus y máxima del 95 % en las

otras dos variedades de frijol (azufrado higuera y pinto Saltillo). Estos porcentajes de inhibición in

vitro sugieren el potencial antihipertensivo de éstos péptidos de proteínas hidrolizadas de frijol.

Cuadro 5-20. Inhibición de la ECA-I por los péptidos de frijol de 1-3 kDa (%)

Variedad de frijol Inhibición de la ECA-I

Negro plus 88.73 ± 1.35 b

Azufrado higuera 95.63 ± 2.24 a

Pinto Saltillo 95.54 ± 1.98 a

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos. a,b,c

Medias en la misma columna con la misma letra no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

Con éstas mismas variedades de frijol, se analizaron los hidrolizados totales y la fracción de

péptidos con pesos moleculares de 3-10 kDa bajo las mismas condiciones y concentración (Figura

5-7). Se observó que la actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la angiotensina se

incrementó conforme la fracción peptídica contenía péptidos de menor tamaño molecular. Se


86


observaro diferencias significativas entre los HT y las fracciones peptídicas, siendo mayor el efecto

cuando se utilizó la fracción f1-3 (Duncan, p ≤ 0.05). Además, al realizar el análisis estadístico las tres

variedades de frijol en su fracción de péptidos con pesos moleculares entre 1 y 3 kDa ésta presentó la

mayor inhibición de la ECA-I con los péptidos de las tres variedades de frijol (Duncan, p ≤ 0.05).

Estos resultados presentaron mayor inhibición de la ECA-I que estudios reportados con el

hidrolizado total de frijol negro Jamapa con IC50 de 0.5 mg/mL (Torruco-Uco y col., 2009). En

contraste, resultados con las fracciones peptídicas de frijol negro Jamapa con pesos moleculares en

un intervalo de 3 - 5 y de 5 – 10 kDa reportaron IC50 de 0.107 y 0.268 µg/mL de proteína (Ruiz-Ruiz y

col., 2013a), dichos resultados presentan actividad superior a las obtenida en este trabajo,

probablemente debido a que los hidrolizados fueron obtenidos con una mezcla de dos enzimas

proteolíticas (Alcalasa y Pancreatina en proporción 50:50). Otro factor importante son las diferentes

metodologías empleadas para la evaluación in vitro de la actividad de inhibición de la ECA-I, lo cual

dificulta una comparación directa (Ronca-Testoni, 1983); en este trabajo se utilizaron las condiciones

optimizadas por Hernández-Ledesma y col. (2003) lo cual permitió una mayor sensibilidad en el

ensayo. La importancia de demostrar que los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de

concentrados proteicos de frijol, permitiría deducir que éstos péptidos obtenidos de fuentes

vegetales podrían funcionar como compuestos antihipertensivos.

Figura 5-7. Inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina con el hidrolizado total y las fracciones peptídicas de proteínas de frijol.

Dónde: HT representa al hidrolizado total y; f3-10, f1-3 a las fracciones peptídicas obtenidas del hidrolizado de frijol. A,B,C Letras iguales en la misma variedad no son significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05). a,b,c Letras iguales en la misma fracción peptídica no son

significativamente diferentes (Duncan, p ≤ 0.05).

HT f3-10 f1-30

20

40

60

80

100

FNP

FAH

FPS

Ab

Aa Aa

Ba

Ba

Bb

Bc

Ba

Bb

% I

nh

ibic

ión

de l

a E

CA

-I


87


Al haber obtenido los mayores porcentajes de actividad inhibitoria de la ECA-I con fracciones

de bajo peso molecular provenientes de FAH, y también de actividad antioxidante y actividad

antibacteriana; se puede suponer que ésta variedad de frijol, específicamente sus péptidos de menor

tamaño, podría presentar otro tipo de actividad biológica ya que otros autores han reportado que un

péptido puede actuar de varias maneras en un mismo sistema (Srihongthong y col., 2012).

Cuadro 5-21. Efecto en la presión sanguínea (PS) de la administración de la F3-10 del FAH sobre RWH.

Tiempo Péptido FAH f3-10 Captopril® Control

(h) (4 mg/kg) (10 mg/kg) (agua 2.5 mL/kg)

1 -15.55 ± 12.30 - 28.44 ± 14.94 -12.86 ± 8.78

2 - 27.13 ± 11.17 * - 29.67 ± 18.89 ** - 15.70 ± 12.78

4 - 23.55 ± 12.44 * - 40.44 ± 1.07 ** - 5.11 ± 9.55

6 - 12.05 ± 13.50 - 41.11 ± 22.44 - 6.78 ± 10.25

Los valores son significativamente diferentes de la presión sanguínea basal a las 0 h, (t-Student, p≤0.01, *) y (t-Student, p≤0.001, **), n=3. Los valores de PS a las 0 h fueron 188.6 ± 13.6 para la fracción peptídica y

201.22 ± 5.6 para el Captopril.

Se observó que a una dosis de 4 mg/kg de animal (RWH) la presión sanguínea disminuyó

después de 2 h de haber sido administrado el péptido (FAH f3-10) hasta -27.13 ± 11.17 mmHg

(Cuadro 5-21). Los resultados indicaron que la fracción peptídica disminuyó la presión sanguínea con

diferencia significativa respecto al control (t-Student, p ≤ 0.01). Además, se observó que la

disminución de la PS fue similar a la que produce el control positivo a las 2 h (-29.67 ± 18.89 mmHg).

Aunque las proteínas de origen vegetal han sido escasamente estudiadas, la actividad

antihipertensiva en péptidos derivados de proteínas de leche y otras fuentes de origen animal han

sido ampliamente estudiadas y demostradas (Torres-Llanez y col., 2005). Algunos péptidos derivados

de la hidrólisis enzimática con Alcalasa de diferentes fuentes de origen vegetal como la soya, el frijol

de mung, arroz y chícharo demostraron decrementos en la actividad antihipertensiva se 31.8 mmHg

(600 mg/kg), 25.6 mmHg (600 mg/kg), 7 mmHg (100 mg/kg), y 44.4 mmHg (50 mg/kg),

respectivamente (Li y col., 2006a; Li y col., 2004; Wu y Ding, 2001; Vermeirssen y col., 2005). Éstos

resultados se encuentran en el intervalo de valores obtenidos en este trabajo. Aunque es cierto que

se requieren más experimentos para confirmar el potencial hipotensivo de los péptidos de frijiol, este

trabajo podría ser una aproximación de la demostración in vivo de dicha actividad biológica.


88


5.11 Purificación de las fracciones con actividad

5.11.1 Separación de péptidos por grupos y determinación de su actividad antioxidante

Figura 5-8. Cromatografía de liquídos de alta eficiencia (HPLC) del perfil de separación de péptidos la fracción f1-3 de: a) FNP, b) FAH y c) FPS.

a)

b)

c)


89


Figura 5-9. Actividad antioxidante de los trece grupos de péptidos colectados por HPLC del perfil de separación de péptidos la fracción f1-3 de: a) FNP, b) FAH y c) FPS; determinada por el

método de quimioluminiscencia.

35N 40N 45N 50N 55N 60N 65N 70N 75N 80N 85N 90N 95N0

25

50

75

100

% I

nh

ibic

ión

del

rad

ical

lum

no

l

35A 40A 45A 50A 55A 60A 65A 70A 75A 80A 85A 90A 95A0

25

50

75

100

% I

nh

ibic

ión

del

rad

ical

lum

ino

l

35P 40P 45P 50P 55P 60P 65P 70P 75P 80P 85P 90P 95P0

25

50

75

100

% I

nh

ibic

ión

del

rad

ical

lum

ino

l

a)

b)

c)


90


Los cromatogramas de los perfiles de los péptidos y los grupos obtenidos como resultado de la

separación por HPLC de los péptidos provenientes de frijol se presentan en la Figura 5-8. Al ser

colectadas las muestras en periodos de tiempo de 5 min, se obtuvieron 13 grupos de péptidos de

cada variedad que fueron posteriormente analizados por el método de quimioluminiscencia ya que

este método requiere la menor cantidad de muestra, ofrece alta sensibilidad y proporciona datos

reproducibles, esto para determinar en qué grupos posiblemente se encontraba el péptido o los

péptidos con mayor actividad antioxidante.

La actividad antioxidante para cada grupo de péptidos de las tres variedades de frijol fue

determinada según el método descrito en 4.12.2 y los resultados se presentan en la Figura 5-9. El

criterio para considerar el grupo como activo fue que presentara al menos el 50 % de inhibición del

radical luminol. En la variedad FNP se determinaron dos grupos importantes el 55N y 60N con

actividad antioxidante superior al 50 %. En la variedad FAH se determinaron dos grupos con actividad

importe, el 40A y 45A y en la variedad FPS el 45P y 60P. Estos grupos importantes fueron

concentrados y sometidos a cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) por segunda vez.

5.11.2 Separación de péptidos individualmente y determinación de su actividad antioxidante

La separación individual de péptidos se realizó bajo la misma gradiente de concentración de

acetonitrilo que las corridas anteriores, a cada pico se le asignó una letra y un número para poderse

identificar en pruebas posteriores. En la Figura 5-10 se presenta uno de los cromatogramas obtenidos

para la variedad de frijol azufrado higuera y las dos fracciones con actividad de inhibición grupal

superior al 80 % (40A y 45A). Se observaron para esta variedad 12 péptidos, para el FNP seis péptidos

y para la variedad FPS cinco.

En el Cuadro 5-22 se presentan los resultados de la actividad antioxidante de cada pico

colectado individualmente para las tres variedades de frijol. La variedad FAH presentó actividad en los

picos 4A y 10A con porcentajes de inhibición superiores a 80 %, en la variedad FNP se determinó un

76 % de inhibición en el pico 2P, mientras que en la variedad FNP se determinaron los picos 2N y 5N

con actividad del 75%. Se colectaron los dos péptidos importantes de la variedad azufrado higuera

para las pruebas posteriores.


91


Figura 5-10. Cromatografía de la separación individual de péptidos de los grupos a) 40A y b) 45A del FAH.

Cuadro 5-22. Actividad antioxidante (%) de los péptidos individuales colectados en la separación individual por HPLC de los péptidos de los grupos 40A y 45A del FAH.

Péptido % Inhibición

Péptido % Inhibición Péptido % Inhibición

1N 38.41 ± 9.38 1A 74.76 ± 1.15 1P 39.49 ± 4.73

2N 75.21 ± 4.27 2A 61.68 ± 5.48 2P 76.42 ± 21.12

3N 44.66 ± 1.36 3A 38.24 ± 2.74 3P 26.48 ± 7.31

4N 69.61 ± 2.38 4A 80.71 ± 4.51 4P 63.58 ± 9.95

5N 75.46 ± 8.32 5A 2.54 ± 1.36 5P 65.04 ± 4.70

6N 71.49 ± 8.45 6A 30.09 ± 10.33

7A 6.06 ± 2.57

8A 34.75 ± 14.83

9A 57.53 ± 5.13

10A 85.47 ± 5.81

11A 33.66 ± 5.10

12A 64.50 ± 7.15

13A 10.21 ± 0.03

14A 18.34 ± 1.56

15A 12.68 ± 2.05

16A 29.73 ± 0.52

17A 23.66 ± 2.02

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar del triplicado de los experimentos.

a) b)


92


5.11.3 Comparativo de la actividad antioxidante de péptidos purificados

En la Figura 5-11 se presentan un comparativo de los resultados de la actividad antioxidante de

la fracción de péptidos con pesos moleculares inferiores de 3 kDa y los grupos separados por HPLC de

la variedad FAH. Se observó que con la fracción peptídica F<3 la actividad antibacteriana determinada

en pruebas anteriores fue de 94.02 ± 1.09 % (por el método de quimioluminiscencia), mientras que al

final del tratamiento de separación y purificación por HPLC la actividad del péptido 10A fue de 96.28 ±

0.77 %. Dicha actividad fue incrementándose según el número de eluciones a través de la columna de

HPLC, los grupos 40A y 45A inicialmente presentaron 57.90 y 60.17 % de actividad respectivamente, y

en los mismos picos producto de una segunda cromatografía se observó actividad antioxidante

superior al 80 %.

Se observó que en la tercera cromatografía (purificación de los picos), se perdió actividad en el

pico 4A mientras que ésta se mantuvo en el pico 10A el cual corresponde a la elución en 9.7 % (v/v)

de acetonitrilo. Esta misma muestra fue utilizada para pruebas posteriores (10A pura). Srihongthong y

col. (2012) obtuvieron un péptido aislado por la misma técnica con 72 ± 0.99 % de actividad

antioxidante, extraído como producto de la hidrólisis de proteínas de una fuente animal (Crocodylus

siamensis), y atribuyen dicha actividad al contenido de los residuos de aminoácidos His y Tyr en la

muestra.

Figura 5-11. Comparativo de la actividad antioxidante de la fracciones (FAH f<3), grupos de péptidos (40A y 45A), picos (4A y 10A) y picos puros colectados por HPLC.

REF TX FAH f<3 FRACCION 40 PICO 4A PICO PURO 4A PICO 10A PICO PURO 10A0

25

50

75

100 aa

b

bc c

d

e

% A

cti

vid

ad

an

tio

xid

an

te


93


5.12 Identificación del péptido con actividad antioxidante

5.12.1 Determinación del peso molecular del péptido

Figura 5-12. Resultados del análisis de espectrometría de masas de la muestra 4A.


94


Figura 5-13. Resultados del análisis de espectrometría de masas de la muestra 10A.

La determinación del peso molecular del péptido que resultó activo en la sección anterior fue

realizado por duplicado en un equipo MALDI-TOF/MS donde los pesos moleculares determinados

para la muestra 4A fueron de 821.408 y 879.242 Da (Figura 5-12) y para la muestra 10A de 656.219

Da y 656.244 Da (Figura 5-13). Éstos sirvieron para realizar la identificación de la secuencia de

aminoácidos a los que pertenece este peso molecular. En Wang y col. (2012a) la secuencia de


95


aminoácidos de dos péptidos provenientes de una fuente de origen animal (Sphyrna lewini) fueron

identificadas como Trp – Asp – Arg (PM 475.50 Da) y Pro – Tyr – Phe – Asn – Lys (PM 667.80 Da); éste

último peso molecular es cercano a los obtenidos en este trabajo aunque en éste caso provienen de

una fuente vegetal (frijol común).

5.12.2 Identificación molecular del péptido

Para la identificación del péptido activo, los pesos moleculares 821.408, 879.242, 656.219 y

656.244 Da fueron ingresados en el sistema ExPASy (Bioinformatics Resource Portal, Suiza) con la

herramienta Find Peptide y basado en la secuencia de aminoácidos de la faseolina (UniProt: P02853,

Cuadro 5-23) y de la lectina (UniProt: Q8RVH1, Cuadro 5-24) que son las proteínas más abundantes

en las semillas de frijol. El sistema virtual ExPASy presentó coincidencias entre la secuencia de

aminoácidos de ambas proteínas y los pesos moleculares obtenidos anteriormente por

espectrometría de masas.

Cuadro 5-23. Análisis de aminoácidos realizado en el sistema de predicción virtual ExPASY (UniProt: P02853).

Pico Masa ingresada

por el usuario

Masa generada

por ExPASY

Masa

(Daltons) Péptido Posición

4A 821.408 821.390 -0.017 (L) QRFDQQ (S) 61-66

821.426 0.018 (P) VNNPQIH (E) 162-168

821.452 0.043 (E) AHVELVGP (K) 295-302

821.477 0.068 (I) LFLASLSA (S) 14-21

879.242 879.497 0.255 (D) VFVIPAAY (P) 323-330

10A 656.219 656.263 0.044 (V) NEGEAH (V) 291-296

656.365 0.146 (G) TIFYL (V) 140-144

656.434 0.215 (I) VILVVN (E) 286-291

656.470 0.251 (S) KAIVIL (V) 283-288

656.247 656.263 0.016 (V) NEGEAH (V) 291-296

656.365 0.118 (G) TIFYL (V) 140-144

656.434 0.187 (I) VILVVN (E) 286-291

656.470 0.223 (S) KAIVIL (V) 283-288

La secuencia de aminoácidos de la faseolina cuenta con 421 residuos de aminoácidos, y no

hay cisteína. En ésta se encontraron cinco posibles secuencias para el péptido aislado del pico 4A y

cuatro secuencias para el péptido 10A las cuales se obtuvieron por duplicado. En dicha secuencia de

aminoácidos (Cuadro 5-23) se identificaron desde un pentapéptido hasta un octapéptido (Figura

5-14).


96


10 20 30 40 50 60

MMRARVPLLL LGILFLASLS ASFATSLREE EESQDNPFYF NSDNSWNTLF KNQYGHIRVL

70 80 90 100 110 120

QRFDQQSKRL QNLEDYRLVE FRSKPETLLL PQQADAELLL VVRSGSAILV LVKPDDRREY

130 140 150 160 170 180

FFLTSDNPIF SDHQKIPAGT IFYLVNPDPK EDLRIIQLAM PVNNPQIHEF FLSSTEAQQS

190 200 210 220 230 240

YLQEFSKHIL EASFNSKFEE INRVLFEEEG QQEGVIVNID SEQIKELSKH AKSSSRKSLS

250 260 270 280 290 300

KQDNTIGNEF GNLTERTDNS LNVLISSIEM EEGALFVPHY YSKAIVILVV NEGEAHVELV

310 320 330 340 350 360

GPKGNKETLE YESYRAELSK DDVFVIPAAY PVAIKATSNV NFTGFGINAN NNNRNLLAGK

370 380 390 400 410 420

TDNVISSIGR ALDGKDVLGL TFSGSGDEVM KLINKQSGSY FVDAHHHQQE QQKGRKGAFV Y

Figura 5-14. Posición de péptidos con actividad antioxidante en la faseolina.

El mismo procedimiento se realizó con la secuencia de aminoácidos de la lectina, ésta proteína

cuenta con 275 residuos de aminoácidos. En ésta se encontraron tres posibles secuencias para el

péptido aislado del pico 4A y cuatro secuencias para el péptido 10A las cuales se obtuvieron por

duplicado. En dicha secuencia de aminoácidos (Cuadro 5-24) se identificaron desde un pentapéptido

hasta un nonapéptido (Figura 5-15).

Cuadro 5-24. Análisis de aminoácidos realizado en el sistema de predicción virtual ExPASY (UniProt: Q8RVH1).

Pico Masa ingresada

por el usuario

Masa generada

por ExPASY

Masa

(Daltons) Péptido Posición

4A 821.408 - - - -

879.242 879.333 0.090 (N) EGNTETND (V) 238-245

879.384 0.142 (D) FVNGENAE (V) 178-185

879.442 0.199 (F) ASKLSDGTT (S) 252-260

10A 656.219 656.252 0.033 (D) NGTYDS (N) 132-137

656.252 0.033 (N) GTYDSN (A) 133-138

656.300 0.080 (V) PNNSGPA (D) 100-106

656.377 0.157 (A) PIQIW (D) 75-79

656.247 656.252 0.005 (D) NGTYDS (N) 132-137

656.252 0.005 (N) GTYDSN (A) 133-138

656.300 0.052 (V) PNNSGPA (D) 100-106

656.377 0.129 (A) PIQIW (D) 75-79


97


10 20 30 40 50 60

MASSNLLSLA LFLVLLTYAN SASETSFSFQ RFNETNLILQ RDATVSSKGQ LRLTNVNDNG

70 80 90 100 110 120

EPTLSSLGRA FYSAPIQIWD NTTGAVASFA TSFTFNIDVP NNSGPADGLA FVLVPVGSQP

130 140 150 160 170 180

KTNAGLLGLF DNGTYDSNAH TVAVEFDTCI NLGWDPKQRH IGIDVNSIKS IKTTPWDFVN

190 200 210 220 230 240

GENAEVLITY NSSTKLLVTS LVYPSQKTSF IISDRVELES VLPEWVSVGF SATSGINEGN

250 260 270

TETNDVLSWS FASKLSDGTT SEGLNLANSL LNQIL

Figura 5-15. Posición de péptidos con actividad antioxidante en la lectina.

Aunque la predicción del sistema virtual determinó las posibles secuencias, y sabiendo que la

enzima utilizada durante el proceso de hidrólisis no es específica, entonces se tiene la misma

posibilidad de encontrar a cada una de ellas. Positivamente, la posibilidad de tener Leu, Ile o Val en la

secuencia de aminoácidos del péptido incrementa el potencial del péptido como antioxidante o

antihipertensivo, según los trabajos previamente reportados (Martínez-Maqueda y col., 2012;

Yamada y col., 2008).

Hay trabajos donde se ha reportado la secuencia de péptidos conformados por seis

aminoácidos con actividad biológica, la novokinina (Arg-Pro-Leu-Lys-Pro-Trp) obtenida sintéticamente

basada en la secuencia de la ovokinina (Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe) que han sido usados como péptidos

con actividad biológica antihipertensiva (Yamada y col., 2008). Por otra parte, Alemán y col. (2011)

identificaron una secuencia más grande (Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-

Ser) con peso molecular de 1410.63 Da, algo mayor que la reportada en este trabajo, sin embargo

dentro del intervalo de pesos moleculares con actividad biológica, de hecho ésta secuencia presentó

tanto actividad antioxidante como antihipertensiva; y ambas actividades fueron atribuidas a residuos

de Leu e Hyp contenidas en el péptido.

La identificación del péptido aislado con actividad antioxidante in vitro comprobada podría

permitir su aplicación como sustituto de compuestos de origen químico sobre células, incluso su uso

podría extenderse debido a que es posible que éste péptido también tenga actividad antioxidante e

inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina. Además, es importante el conocimiento de

saber que los hidrolizados de frijol, un alimento de consumo cotidiano, puede proporcionar algunos

beneficios secundarios a su solo consumo. Y de manera contrastante, la identificación de aminoácidos


98


podría permitir la síntesis química del péptido para generar nuevas alternativas para el control de

enfermedades o mejoramiento en la salud del ser humano.

Por lo que este trabajo contribuye al conocimiento del efecto biológico de los péptidos

obtenidos vía hidrólisis enzimática de proteínas de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) de tres

variedades. Se demostró que los péptidos además de presentar tres actividades biológicas in vitro

(antioxidante, antimicrobiana e inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina), también

tuvieron actividad biológica antihipertensiva in vivo.

Cabe destacar que aún son necesarios más experimentos de evaluación de la actividad

biológica de péptidos de proteínas de frijol. In vitro existe la posibilidad de encontrar una amplia

gama de actividades con potencial biológico, e in vivo se deben hacer pruebas con diferentes

fracciones y concentraciones del péptido, y vía de administración oral. Inclusive, la caracterización de

la secuencia de aminoácidos de péptidos responsables de alguna actividad biológica permitiría el

desarrollo de alternativas seguras para enfermedades frecuentes en la población.

Conclusiones

99


6. Conclusiones

Los hidrolizados de proteínas y fracciones peptídicas de frijol presentaron actividad biológica in

vitro (antioxidante, antimicrobiana e inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina I) e in

vivo (antihipertensiva).

Los hidrolizados totales de proteínas de frijol presentaron actividad antibacteriana sobre cepas

indicadoras. Principalmente los péptidos de la F<1 kDa, en los cuales se observó inhibición de Shigella

dysenteriae con concentración mínima inhibitoria de 10 a 40 µg de péptidos, siendo la variedad

azufrado higuera la que presentó el mayor efecto de inhibición del crecimiento bacteriano.

Los hidrolizados totales y las fracciones peptídicas de frijol presentaron actividad antioxidante,

y se observó la tendencia a incrementar ésta actividad biológica al disminuir la masa molecular de los

péptidos. La actividad antioxidante máxima obtenida por los métodos espectrofotométricos fue de:

DPPH+ = 40.19 ± 3.83 % (FNP, f1-3), ABTS+ = 99.17 ± 0.91 % (FNP, f<1) y DMPD+ = 89.08 ± 2.46 % (FPS,

f<1); y por el método de quimioluminiscencia de 94.02 ± 1.09 % (FAH, f1-3).

Los hidrolizados totales y las fracciones peptídicas de frijol presentaron actividad inhibidora de

la enzima convertidora de la angiotensina. El mayor porcentaje de actividad fue del 95 % con la

fracción f1-3 kDa de las variedades azufrado higuera y pinto Saltillo. Y se comprobó la actividad

antihipertensiva de los péptidos de FAH (f3-10) in vivo.

Se determinó la masa de dos péptidos con actividad antioxidante (656.219 y 879.242 Da), y por

bioinformática se determinaron múltiples coincidencias en la secuencia de las proteínas faseolina (9

secuencias) y lectina (7 secuencias).

Perspectivas

100


7. Perspectivas

Los hidrolizados de proteínas de frijol y sus fracciones peptídicas demostraron tener la capacidad

de actuar como antimicrobianos, antioxidantes, e inhibidores de la enzima convertidora de la

angiotensina; por lo tanto, se sugiere ampliar el estudio orientándolo a otras actividades biológicas in

vitro como la antifúngica o la antiinflamatoria.

Respecto a la actividad antihipertensiva aún son necesarios más experimentos de evaluación in

vivo con las diferentes fracciones peptídicas, variando las concentraciones de los péptidos, y

aministrando la dosis vía oral.

Se debe establecer un esquema de purificación de péptidos o proteínas donde se combinen

varios métodos, de tal manera que al complementarse van dejando atrás fracciones que no interesan

y se va enriqueciendo la fracción pura (como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de

exclusión y al final cromatografía de líquidos de alta resolución garantizan la pureza de la muestra).

Referencias

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Anexos

111


9. Anexos

9.1 Productos derivados de ésta Tesis

Carteles en Congresos u otras reuniones científicas

Ariza-Ortega TJ, Salas CE, Capettiti L, Soares-Lemoes V, Oliver-Salvador MC, Yáñez-Fernández J. 2012.

Determinación quimioluminométrica de la actividad antioxidante en péptidos de frijol

azufrado higuera (Phaseolus vulgaris L.). VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica.

Ariza-Ortega TJ, Ramírez-Sotelo MG, Valencia-Del Toro G, Oliver-Salvador MC, Yáñez-Fernández J.

2012. Evaluation of the antioxidant activity of Phaseolus vulgaris L. peptides by DPPH. 5th

International Congress of Food Science and Food Biotechnology in developing countries.

Ariza-Ortega TJ, Berber-Aceves GE, Ramírez-Sotelo MG, Yáñez-Fernández J. 2013. Phytochemical

screening of methanolic extracts from Jamapa and Zacatecas black bean (Phaseolus vulgaris

L.). XV National Congress of Biotechnology and Bioengineering.

Ariza-Ortega TJ, Berber-Aceves GE, Ramírez-Sotelo MG, Yáñez-Fernández J. 2013. Antioxidant activity

of methanolic extracts from Jamapa and Zacatecas black bean (Phaseolus vulgaris L.). XV

National Congress of Biotechnology and Bioengineering.

Ariza-Ortega TJ, Oliver-Salvador MC, Ramírez-Sotelo MG, Yáñez-Fernández J. 2014. Reducción del

radical libre DMPD como indicador de la actividad antioxidante de hidrolizados de proteínas

aisladas de frijol (Phaseolus vulgaris L.). VIII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica.

Exposiciones orales en Congresos u otras reuniones científicas

Ariza-Ortega TJ, Ramírez-Sotelo MG, Valencia-Del Toro G, Oliver-Salvador MC, Yañez-Fernández J.

2012. Evaluación de la actividad antimicrobiana determinada por difusión en agar de péptidos

de frijol azufrado higuera (Phaseolus vulgaris L.). VII Congreso Internacional de Ingeniería

Bioquímica.

Ariza-Ortega TJ, Salas-Bravo CE, Capettiti L, Soares-Lemoes V, Oliver-Salvador MC, Yáñez-Fernández J.

2012. Antioxidant activity of Phaseolus vulgaris L. peptides by the chemiluminescence

method. 5th International Congress of Food Science and Food Biotechnology in developing

countries.

Anexos

112


Artículos

Ariza-Ortega TJ, Berber-Aceves GE, Ramírez-Sotelo MG, Yáñez-Fernández J. 2013. Methanolic

extracts antioxidant and antimicrobial activities from five varieties of common beans (Phaseolus

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Capettini L, Yáñez-Fernández J. Obtención e identificación de péptidos con potencial actividad

antioxidante de concentrados proteicos de tres variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.).

Advances in Bioresearch. En revisión.

Ariza-Ortega TJ, Berber-Aceves GE, Yáñez-Fernández J. Propiedades tecnofuncionales de los

concentrados proteicos de cinco variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.). En proceso.

Anexos

113


9.2 Antioxidantes de referencia utilizados como control

Método de

determinación

Equivalentes de

Trolox

(mg/g)

Equivalentes de

Ácido gálico

(mg/g)

Equivalentes de

Ácido ascórbico

(mg/g)

DPPH y = 78.997 x y = 141.17 x y = 75.968 x

R2 = 0.9922 R2 = 0.9934 R2 = 0.9981

ABTS y = 36.54 x + 7.21 y = 88.32 x + 5.83 y = 23.78 x + 7.76

R² = 0.9935 R² = 0.9922 R² = 0.9948

DMPD y = 89.773 x y = 101.56 x y = 25.245 x

R² = 0.9989 R² = 0.9934 R² = 0.9963

Anexos

114


9.3 Lista de aminoácidos

Código de

una letra

Código de

tres letras

Clasificación

por tipo

Fórmula

química

Masa

monoisotópica

Masa

promedio

A Ala Apolar C3H5ON 71.03711 71.0788

R Arg** Carga positiva C6H12ON4 156.10111 156.1875

N Asn Polar C4H6O2N2 114.04293 114.1038

D Asp Carga negativa C4H5O3N 115.02694 115.0886

C Cys Apolar C3H5ONS 103.00919 103.1388

E Glu Carga negativa C5H7O3N 129.04259 129.1155

Q Gln Polar C5H8O2N2 128.05858 128.1307

G Gly Apolar C2H3ON 57.02146 57.0519

H His** Carga positiva C6H7ON3 137.05891 137.1411

I Ile* Apolar C6H11ON 113.08406 113.1594

L Leu* Apolar C6H11ON 113.08406 113.1594

K Lys* Carga positiva C6H12ON2 128.09496 128.1741

M Met* Apolar C5H9ONS 131.04049 131.1926

F Phe* Apolar C9H9ON 147.06841 147.1766

P Pro Apolar C5H7ON 97.05276 97.1167

S Ser Polar C3H5O2N 87.03203 87.0782

T Thr* Polar C4H7O2N 101.04768 101.1051

W Trp* Apolar C11H10ON2 186.07931 186.2132

Y Tyr Polar C9H9O2N 163.06333 163.1760

V Val* Apolar C5H9ON 99.06841 99.1326

El cuadro presenta la masa monoisotópica y la masa promedio de cada aminoácido. *Aminoácido esencial. **Aminoácido esencial durante la infancia y adolescencia.

Fuente: http://education.expasy.org

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Tesis de Maestría...Los hidrolizados totales de proteínas de frijol presentaron actividad antibacteriana sobre cepas indicadoras mostrando su capacidad de inhibición en amplio espectro