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Guadalajara, Jalisco, 2016.
“Determinación de la presencia de
autoanticuerpos contra antígenos asociados
a tumor, en suero de pacientes con cáncer de
pulmón, como marcadores potenciales de
diagnóstico de la enfermedad”
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
DOCTOR EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
M. en C. CARLOS ENRIQUE HIRALES CASILLAS
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADÉMICO DE
I
Dedicatoria
A mí querida esposa por siempre estar
a mi lado en las buenas y en las malas
A mis padres por todo su apoyo en el
proceso de mi formación académica
II
AGRADECIMIENTOS
Primero que nada quiero agradecer a Dios por darme salud, cordura y fuerza para superar todos
los obstáculos durante mi vida.
A mis padres por todos los sacrificios que han hecho para que yo pueda seguir con mis estudios a
todo su amor y compresión, siempre me han apoyado tanto moral como económicamente, no hay
palabras que puedan describir mi profundo agradecimiento hacia ellos.
A Gladys mi esposa, mi compañera y mejor amiga, por todo su apoyo, compresión y paciencia en
los momentos difíciles durante toda esta fase de nuestra vida, por siempre escucharme y darme
palabras de aliento, por nunca dejarme caer, eres el amor de mi vida, gracias por todo mosa.
A mis suegros el Sr. Manuel y la Sra. Tere, por toda su ayuda y apoyo, siempre me han tratado
como a un hijo ayudándome en todo lo posible, siempre les estaré agradecido por todo.
A todos mis compañeros de CIATEJ por su gran amistad, nunca olvidare los momentos que
pasamos juntos.
Al Doctor Moisés Martínez Velázquez por haberme aceptado en su grupo de investigación, por el
apoyo y la confianza en el trabajo realizado. Le agradezco todos los consejos que me dio durante
mi estancia en CIATEJ y sobre todo por su gran amistad.
Al Doctor Rodolfo Hernández Gutiérrez, quien siempre tuvo disponibilidad cuando tenía dudas,
por haberme facilitado el uso de sus equipos para la realización de mi trabajo y por qué siempre
mostro interés en el trabajo que se estaba llevando a cabo.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo económico durante los
cuatro años de posgrado, así como al Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad
Social SSA/IMSS/ISSSTE-CONACYT 2008-1-87628, por el financiamiento con el cual fue posible
la realización del presente estudio.
III
RESUMEN
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con cáncer, causando la
muerte de más de 1.59 millones de personas alrededor del mundo en 2012. Estudios recientes
han llevado a la detección de autoanticuerpos en pacientes con cáncer de pulmón así como en
personas con riesgo elevado de desarrollar la enfermedad, detectando estos autoanticuerpos
hasta 5 años antes de que se desarrolle el tumor. No está claro cómo los pacientes con cáncer
de pulmón producen anticuerpos contra sus propias proteínas, esto podría deberse a que las
proteínas tienen algunas diferencias que las hacen inmunogénicas, tales como un mal
plegamiento, glicosilación, sobreexpresión, o que se encuentran aberrantemente localizadas en
el organismo. En el terreno clínico, podemos sacar ventaja de estas características y hacer uso
de estos autoanticuerpos como marcadores tumorales, para el desarrollo de nuevas pruebas
para el diagnóstico temprano de la enfermedad. El principal objetivo del presente estudio fue
determinar la presencia de autoanticuerpos contra las proteínas recombinantes Citoqueratina
19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA y CA-125 y CRP en sueros de pacientes con cáncer de pulmón,
cuya sobreexpresión ha sido previamente demostrada, así como de las proteínas recombinantes
TPI-1, PRDX-2 y PPIA, alteradas en cáncer de mama, y proponer a aquellos como potenciales
marcadores de la enfermedad. Se realizó la amplificación de los genes que codifican para las
proteínas Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA, CA-125 y CRP, posteriormente se
llevó acabo la clonación de las secuencias en el vector pET 101 y 102. No se logró la
amplificación de CRP por falta de reactivos para la inducción del gen en la línea celular
HepG2 y no se logró la clonación de los genes que codifican para CEA y CA-125 por falta de
vector de clonación. En el caso de YKL-40 se tuvieron problemas con la purificación de la
proteína recombinante por lo cual se descartó para el desarrollo del estudio. Sólo las proteínas
recombinantes Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, TPI-1, PRDX-2 y PPIA pudieron ser expresadas
y purificadas por purificación de afinidad, con las cuales finalmente se realizaron los ensayos
de detección de autoanticuerpos por Western blot, utilizando muestras de suero de pacientes
con cáncer de pulmón y muestras de personas con alto riesgo de desarrollar la enfermedad,
tales como pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) y fumadores. Se
logró la detección de autoanticuerpos contra Citoqueratina 19, en 19 de 30 (60%) de los sueros
analizados de pacientes con cáncer de pulmón, así como en 6 de 30 (10%) de los sueros
controles analizados (EPOC y fumadores), a diferencia de Cyfra 21.1 donde la detección de
IV
autoanticuerpos no fue observada, a pesar de ser una de las principales proteínas que se
encuentran sobreexpresadas en la mayoría de los casos de cáncer de pulmón. En el caso de las
proteínas recombinantes TPI-1, PRDX-2 y PPIA, se detectó la presencia de autoanticuerpos
contra TPI-1 en sólo 1 de 30 (3%) sueros analizados de pacientes con cáncer de pulmón, sin
observarse reacción en los controles; en el caso de PRDX-2 se detectaron autoanticuerpos en 6
de 30 (20%) sueros de pacientes con cáncer de pulmón analizados, observándose una mayor
frecuencia en los controles, en los cuales se detectaron autoanticuerpos en 21 de 60 (35%)
sueros analizados. Por último, se lograron detectar autoanticuerpos contra PPIA en 3 de 30
(10%) de los sueros analizados de pacientes con cáncer de pulmón, a diferencia de los
controles en donde se logró la detección de autoanticuerpos en 3 de 60 (5%) de los sueros
analizados. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la sobreexpresión de proteínas en
cáncer de pulmón puede causar la producción de autoanticuerpos contra las proteínas
sobreexpresadas. Nuestro estudio demostró una alta frecuencia de detección de
autoanticuerpos contra Citoqueratina 19 en suero de pacientes con cáncer de pulmón, llevando
este hallazgo al análisis por densitometría de las muestras analizadas y construyendo con los
valores una curva ROC, obteniéndose así un valor de área bajo la curva de 0.8267 y una
sensibilidad/especificada de 59%/90% mostrando un elevado valor diagnostico que hace a
estos autoanticuerpos posibles candidatos para ser utilizados como marcadores de diagnóstico
de cáncer de pulmón. Sin embargo, esto no significa que estos autoanticuerpos puedan ser
utilizados como un biomarcador individual, ya que carecería de la sensibilidad y la
especificidad necesarias para el diagnóstico de cáncer. No obstante, el ensayo de detección de
autoanticuerpos contra Citoqueratina 19 podría ser utilizado en conjunto con un panel
establecido para la detección de cáncer de pulmón, para aumentar la sensibilidad y la
especificidad de ese panel.
V
ABREVIATURAS
ABC
CA 125
CEA
CIATEJ
cm
CN
C.P
CRP
Cyfra 21.1
DNA
DTT
cDNA
EBC
EBP
EDTA
EPOC
F1-3
H3PO4
HCl
His
HRP
IgG
IPTG
K2HPO4
KCl
kDa
KH2PO4
KOH
L1 y 2
LANGEBIO
Área bajo la curva
Antígeno de cáncer 125
Antígeno carcinoembrionario
Centro de Investigación y Asistencia en Diseño del Estado de Jalisco
Centímetros
Control negativo
Cáncer de pulmón
Proteína C reactiva
Fragmento de Citoqueratina 21.1
Ácido desoxirribonucleico
Ditiotreitol
Ácido desoxirribonucleico complementario
Extracto bacteriano crudo
Extracto bacteriano purificado
Ácido etilendiaminotetraacético
Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
Fracciones 1 a la 3
Ácido fosfórico
Ácido clorhídrico
Histidina
Peroxidasa de rábano picante
Inmunoglobulina G
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
Fosfato de potasio dibásico
Cloruro de potasio
Kilodaltones
Fosfato de potasio monobásico
Hidróxido de potasio
Lavado 1 y 2
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad
VI
LB
M
mg
g
ml
l
mm
mM
M
MPM
NaCl
ng
NSCLC
PAGE
pb
PBS
PCR
pI
PPIA
PRDX-2
PSA
RNA
ROC
rpm
SCLC
SDS
TAA
TAE
TBS
TEMED
TPI-1
Luria Bertani
Molar
Miligramos
Microgramos
Mililitro
Microlitro
Milímetro
Minimolar
Micromolar
Marcador de peso molecular
Cloruro de sodio
Nanogramos
Cáncer de pulmón de células no pequeñas
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Pares de bases
Buffer salino de fosfatos
Reacción en cadena de la polimerasa
Punto isoeléctrico
Ciclofilina
Peroxirredoxina 2
Persulfato de amonio
Ácido ribonucleico
Receiver Operating Characteristic
Revoluciones por minuto
Cáncer de pulmón de células pequeñas
Dodecil sulfato sódico
Antígenos asociados a tumor
Tris-acetato-EDTA
Tris buffer salino
Tetrametiletilendiamina
Triosa fosfato isomerasa 1
VII
TSA
u
UV
V
2-D
4CN
Antígenos específicos de tumores
Unidades
Ultravioleta
Volts
2 dimensiones
4-chloro-1-naphthol
VIII
INDICE
Dedicatoria----------------------------------------------------------------------------------
Agradecimientos---------------------------------------------------------------------------
Resumen------------------------------------------------------------------------------------
Abreviaturas--------------------------------------------------------------------------------
Índice----------------------------------------------------------------------------------------
Índice de tablas-----------------------------------------------------------------------------
Índice de figuras---------------------------------------------------------------------------
I
II
III
V
VIII
XIXI
XIV
1. Antecedentes------------------------------------------------------------------------------------
1.1. Epidemiologia-------------------------------------------------------------------------
1.2. Clasificación Histológica del cáncer de pulmón---------------------------------
1.3. Clasificación TNM para cáncer de pulmón---------------------------------------
1.4. Etiología del cáncer de pulmón-----------------------------------------------------
1.4.1. Humo de Cigarro-------------------------------------------------------------
1.4.2. Cáncer de pulmón en no fumadores---------------------------------------
1.4.3. Otras enfermedades pulmonares y obstrucción de vías aéreas---------
1.4.4. Contaminación del aire ambiental-----------------------------------------
1.4.5. Carcinogénesis ocupacional------------------------------------------------
1.4.5.1.Asbestos-------------------------------------------------------------------
1.4.5.2.Radón----------------------------------------------------------------------
1.5. Biomarcadores en la detección de cáncer de pulmón----------------------------
1.6. Pruebas de sangre comercialmente disponibles para ayudar a la detección
temprana de cáncer de pulmón------------------------------------------------------
1.6.1. PAILA´S test------------------------------------------------------------------
1.6.2. Early CDT-Lung test---------------------------------------------------------
2. Hipótesis------------------------------------------------------------------------------------
3. Objetivos------------------------------------------------------------------------------------
3.1. Objetivo General----------------------------------------------------------------------
3.2.Objetivos específicos-----------------------------------------------------------------
4. Métodos-------------------------------------------------------------------------------------
1
1
1
3
6
6
7
8
9
9
9
10
10
12
12
12
13
16
17
17
17
18
IX
4.1. Propagación de las líneas celulares A549, HepG2, HeLa y OVCAR-3-------
4.2. Extracción de RNA de células de las líneas celulares A549, HepG2, HeLa
y OVCAR-3----------------------------------------------------------------------------
4.3. Síntesis de cDNA---------------------------------------------------------------------
4.4. Diseño de iniciadores y amplificación de los genes que codifican para
Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40, CRP, CA125 y CEA-------------------
4.5. Electroforesis en gel de agarosa al 1%--------------------------------------------
4.6. Reamplificación y purificación de las secuencias previamente
amplificadas----------------------------------------------------------------------------
4.7. Clonación de secuencias amplificadas y transformación de células
quimiocompetentes de E. coli TOP-10---------------------------------------------
4.8. Extracción de plásmidos de células trasnformadas E. coli TOP-10-----------
4.9. Análisis de las trasnformantes mediante amplificación de la secuencias
clonadas---------------------------------------------------------------------------------
4.10. Transformación de las células E. coli BL21 StarTM
(DE3) One Shot--------
4.11. Inducción piloto---------------------------------------------------------------------
4.12. Análisis de proteínas recombinantes por SDS-PAGE-------------------------
4.13. Electrotransferencia de proteínas recombinantes y Western blot------------
4.14. Inducción masiva y purificación de proteínas recombinantes solubles------
4.15. Inducción masiva y purificación de proteínas recombinantes insolubles---
4.16. Electroelución de las proteínas recombinantes y electroforesis en 2-D-----
4.17. Ensayo de detección de antoanticuerpos por Western blot------------------
5. Resultados----------------------------------------------------------------------------------
5.1. Amplificación de los genes que codifican para Citoqueratina 19, Cyfra
21.1, YKL-40, CRP, CA125, CEA-------------------------------------------------
5.2. Clonación de las secuencias amplificadas y análisis de las transformantes
por PCR---------------------------------------------------------------------------------
5.3. Transformación de las células E. coli BL21 StarTM (DE3) One Shot e
inducción piloto-----------------------------------------------------------------------
5.4. Inducción masiva y purificación de las proteínas recombinantes TPI-1,
PRDX-2, PPIA, YKL-40, CYFRA 21.1 Y Citoqueratina19--------------------
18
18
19
20
22
22
24
24
25
25
26
26
27
29
30
32
33
36
38
38
40
43
47
X
5.5. Electroelución de las proteínas recombinantes y electroforesis en 2-D-------
5.6. Ensayo de detección de antoanticuerpos por Western blot---------------------
6. Discusión------------------------------------------------------------------------------------
7. Conclusiones-------------------------------------------------------------------------------
8. Perspectivas---------------------------------------------------------------------------------
9. Bibliografía---------------------------------------------------------------------------------
10. Anexo1--------------------------------------------------------------------------------------
10.1. Muestras----------------------------------------------------------------------------
10.2. Líneas celulares-------------------------------------------------------------------
10.3. Bacterias----------------------------------------------------------------------------
10.4. Reactivos---------------------------------------------------------------------------
10.5. KIT----------------------------------------------------------------------------------
10.6. Material-----------------------------------------------------------------------------
10.7. Equipo--------------------------------------------------------------------------------
11. Anexo 2-------------------------------------------------------------------------------------
11.1. Soluciones y buffers--------------------------------------------------------------
11.1.1. Geles de agarosa-------------------------------------------------------------
11.1.2. TAE 10X----------------------------------------------------------------------
11.1.3. TAE 1X------------------------------------------------------------------------
11.2. Crecimiento bacteriano e inducción de proteínas-----------------------------
11.2.1. Medio LB----------------------------------------------------------------------
11.2.2. Medio Super Broth-----------------------------------------------------------
11.2.3. Medio Terrific Broth---------------------------------------------------------
11.2.4. Ampicilina---------------------------------------------------------------------
11.2.5. IPTG---------------------------------------------------------------------------
11.2.6. Medio LB con ampicilina---------------------------------------------------
11.2.7. Agar LB con ampicilina-----------------------------------------------------
11.3. SDS-PAGE------------------------------------------------------------------------
11.3.1. Acrilamida al 30%-----------------------------------------------------------
11.3.2. Amostiguador Tris-HCl pH 6.8--------------------------------------------
11.3.3. Amortiguador Tris-HCl pH 8.8---------------------------------------------
48
50
58
63
64
65
72
72
72
72
72
74
75
77
80
80
80
80
80
80
80
80
80
81
81
81
81
82
82
82
82
XI
11.3.4. Persulfato de amonio---------------------------------------------------------
11.3.5. Buffer de corrida SDS-PAGE 10X----------------------------------------
11.3.6. Buffer de corrida SDS-PAGE 1X------------------------------------------
11.3.7. Buffer de carga 2x SDS-PAGE---------------------------------------------
11.3.8. Buffer de carga 1X SDS-PAGE--------------------------------------------
11.3.9. Azul de Coomassie SDS-PAGE--------------------------------------------
11.3.10. Solución para desteñir SDS-PAGE--------------------------------------
11.4. SDS-PAGE 2-D-------------------------------------------------------------------
11.4.1. DTT----------------------------------------------------------------------------
11.4.2. Azul de bromofenol----------------------------------------------------------
11.4.3. Buffer de equilibrio para 2-D-----------------------------------------------
11.4.4. Buffer de equilibrio con DTT para 2-D-----------------------------------
11.4.5. Buffer de equilibrio con iodoacetamida para 2-D------------------------
11.5. Electrotrasnferencia y Western blot--------------------------------------------
11.5.1. Buffer de transferencia de proteínas---------------------------------------
11.5.2. TBS 10X para Western blot-------------------------------------------------
11.5.3. TBS 1X para Western blot--------------------------------------------------
11.5.4. TBS 1X-Tween 20 al 0.1%-------------------------------------------------
11.5.5. TBS 1X-Tween 20 al 0.05%-----------------------------------------------
11.5.6. Buffer de Bloqueo TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 5%--------------
11.5.7. Buffer de Bloqueo TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 2.5%-----------
11.5.8. Solución de revelado para Western blot-----------------------------------
11.5.9. Rojo de Ponceau--------------------------------------------------------------
11.6. Purificación de proteínas---------------------------------------------------------
11.6.1. Buffer nativo de purificación/Buffer de lavado 1------------------------
11.6.2. Buffer nativo de lavado 2---------------------------------------------------
11.6.3. Buffer nativo de elución-----------------------------------------------------
11.6.4. Buffer desnaturalizante de purificación/Buffer de lavado 1------------
11.6.5. Buffer desnaturalizante de lavado 2---------------------------------------
11.6.6. Buffer desnaturalizante de elución-----------------------------------------
12. Anexo 3-------------------------------------------------------------------------------------
82
82
82
83
83
83
84
84
84
84
84
85
85
85
85
85
85
85
86
86
86
86
86
86
86
87
87
88
88
88
89
XII
12.1. Citoqueratina 19-------------------------------------------------------------------
13. Anexo 4-------------------------------------------------------------------------------------
13.1. Cyfra 21.1-------------------------------------------------------------------------
14. Anexo 5-------------------------------------------------------------------------------------
14.1. YKL-40-----------------------------------------------------------------------------
15. Anexo 6-------------------------------------------------------------------------------------
15.1. Proteína C Reactiva---------------------------------------------------------------
16. Anexo 7-------------------------------------------------------------------------------------
16.1. CA125------------------------------------------------------------------------------
17. Anexo 8-------------------------------------------------------------------------------------
17.1. CEA---------------------------------------------------------------------------------
18. Anexo 9-------------------------------------------------------------------------------------
18.1. Mapa y características del vector pET101/D-TOPO-------------------------
19. Anexo 10------------------------------------------------------------------------------------
19.1. Mapa y características del vector pET102/D-TOPO-------------------------
20. Anexo 11------------------------------------------------------------------------------------
20.1. Tabla de sueros de pacientes analizados en el estudio-----------------------
21. Anexo 12------------------------------------------------------------------------------------
21.1. Tabla de datos de pacientes con cáncer de pulmón analizados-------------
89
90
90
91
91
92
92
93
93
95
95
97
97
98
98
99
99
100
100
XIII
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación histológica de cáncer de pulmón---------------------------------------
Tabla 2: Clasificación TNM para cáncer de pulmón-------------------------------------------
Tabla 3. Principales carcinógenos en humo del tabaco causantes del cáncer de pulmón
Tabla 4.- Puntos isoeléctricos de las proteínas recombinantes determinados utilizando
la base de datos ExPASy---------------------------------------------------------------------------
Tabla 5. Frecuencia de detección de autoanticuerpos para las proteínas recombinantes
en los grupos evaluados----------------------------------------------------------------------------
2
4
7
49
56
XIV
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Amplificación de los genes que codifican para Citoqueratrina 19 y Cyfra
21.1---------------------------------------------------------------------------------------------------
Figura 2. Amplificación del gen que codifica para CA-125---------------------------------
Figura 3. Amplificación del gen que codifica para YKL-40---------------------------------
Figura 4. Amplificación del gen que codifica para CEA-------------------------------------
Figura 5. Obtención de plásmidos a partir de las colonias transformadas con el vector
pET101-----------------------------------------------------------------------------------------------
Figura 6. Rastreo por PCR de los genes que codifican para Cyfra 21.1, Citoqueratina
19 y YKL-40----------------------------------------------------------------------------------------
Figura 7. Cotejo de la secuencia de Citoqueratina 19 obtenida mediante secuenciación
Figura 8. Digestión parcial de la secuencia amplificada que codifica para YKL-40-----
Figura 9. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes Cyfra 21.1 y
Citoqueratina 19 por SDS-PAGE-----------------------------------------------------------------
Figura 10. Amplificación del gen que codifica para YKL-40 clonado en el vector de
expresión pET101----------------------------------------------------------------------------------
Figura 11. Análisis de la expresión de la proteína recombinante YKL-40 por SDS-
PAGE-------------------------------------------------------------------------------------------------
Figura 12. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes TPI-1, PRDX-2 y
PPIA por SDS-PAGE------------------------------------------------------------------------------
Figura 13. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes Cyfra 21.1 y
Citoqueratina 19 por SDS-PAGE-----------------------------------------------------------------
Figura 14. Análisis de las proteínas durante el proceso de purificación y fracciones
obtenidas después de la purificación-------------------------------------------------------------
Figura 15. SDS-PAGE preparativo de la proteína recombinante Citoqueratina 19
purificada por columna de níquel-----------------------------------------------------------------
Figura 16. (A) Electroforesis en 2-D de la proteína recombinante PRDX-2 después de
la electroelución-------------------------------------------------------------------------------------
Figura 17. Western blot de la proteína recombinante PRDX-2 después de la segunda
electroelución----------------------------------------------------------------------------------------
Figura 18. Western blot de la proteína recombinante PRDX-2 utilizando suero de
38
39
39
40
41
41
42
43
44
44
45
46
46
47
48
50
51
XV
controles no fumadores y anticuerpo Anti-His-------------------------------------------------
Figura 19. Western blot de la proteína recombinante YKL-40 utilizando 8 sueros de
controles no fumadores----------------------------------------------------------------------------
Figura 20. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante Citoqueratina
19 en suero de pacientes con cáncer de pulmón, EPOC y fumadores por Western blot--
Figura 21. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante TPI-1 en
suero de pacientes con cáncer de pulmón, EPOC y fumadores por Western blot---------
Figura 22. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante PRDX-2 en
suero de pacientes con cáncer de pulmón, EPOC y fumadores por Western blot----------
Figura 23. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante PPIA en
suero de pacientes con cáncer de pulmón, EPOC y fumadores por Western blot----------
Figura 24. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante Cyfra 21.1 en
suero de pacientes con cáncer de pulmón, EPOC y fumadores por Western blot------
Figura 25. Distribución de las muestras de cada grupo de acuerdo con los valores de
densitometría individuales y curva ROC generada a partir de los valores de
densitometría de todas las muestras, para el autoanticuerpo contra Citoqueratina 19-----
51
52
53
54
54
55
56
57
1
1. ANTECEDENTES
1.1.Epidemiología
El cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo; en el
año 2012 hubo alrededor de 14 millones de nuevos casos y 8,2 millones de muertes
relacionadas con el cáncer. Los principales tipos de cáncer son los siguientes: pulmonar (1.59
millones de defunciones), hepático (745,000 defunciones), gástrico (723,000 defunciones),
colorrectal (694,000 defunciones), mamario (521,000 defunciones) y cáncer de esófago
(400,000 defunciones) (Stewart et al. 2014). De acuerdo con la Organización Mundial de la
Salud (OMS), para las próximas dos décadas, se espera que la incidencia de cáncer en el
mundo aumente a 22 millones de casos por año y que el incremento en la mortalidad para el
mismo periodo sea de 13 millones de muertes anuales. El continente Americano se encuentra
en el segundo lugar de incidencia (242.5 por 100 000 habitantes) y en el tercer lugar de
mortalidad (101.0 por 100 000 habitantes) por cáncer. De los países que conforman esta
región, México es uno de los que tienen menor incidencia (131.5 por 100 000 habitantes) y
mortalidad (68.9 por 100 000 habitantes) por esta causa. En 2011, las muertes por neoplasias
malignas en México ocuparon el tercer lugar (12.1%) como causa de muerte en hombres y en
mujeres, después de las enfermedades del corazón y la diabetes mellitus. Aunque la frecuencia
varía de acuerdo con la edad, los principales cánceres en hombres fueron: próstata (16.2%),
pulmón (12.4%), estómago (8.3%), hígado (7.5%) y colon (5.1%); mientras que los más
frecuentes en mujeres fueron: mama (14.3%), cérvix (10.8%), hígado (7.8%), estómago
(7.3%) y pulmón (6.6%). Si juntamos la mortalidad por cáncer en ambos sexos, el cáncer de
pulmón pasa a ser la principal causa de muerte (19%). (Torres-Sanchez et al. 2014).
1.2.Clasificación histológica del cáncer de pulmón
Aunque el cáncer de pulmón se puede dividir en muchos subtipos, históricamente la distinción
más importante ha sido entre el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el
carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Esta situación se debe a las
importantes diferencias clínicas en la presentación, propagación metastásica, y la respuesta a
la terapia. Sin embargo, en el última década, ha habido una gran transformación en el enfoque
de diagnóstico de NSCLC, por lo ahora se presta más atención a su clasificación precisa en
pequeñas biopsias y citología (Travis 2011). La asociación internacional para el estudio del
cáncer de pulmón (IASLC)/ la Sociedad Torácica Americana (ATS)/ la Sociedad Respiratoria
2
Europea (ERS) han clasificado el adenocarcinoma de pulmón en 4 principales tipos
histológicos de cáncer de pulmón; carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma,
carcinoma de células pequeñas y carcinoma de células grandes. Estos principales tipos
pueden ser subclasificados en subtipos más específicos tales como subtipo predominante
lepídico de adenocarcinoma o la variante basaloide del carcinoma de células grandes. La
clasificación completa se muestra en la tabla 1 (Travis et al. 2013, Yeh et al. 2016).
Tabla 1. Clasificación histológica de cáncer de pulmón
Lesiones pre-invasivas
Displasia escamosa/carcinoma in situ (CIS)
Hiperplasia adenomatosa atípica (AAH)
Adenocarcinoma in situ (AIS) (no mucinosos, mucinosos, o no mucinosos
mixtos.
Hiperplasia idiopática difusa de células neuroendócrinas pulmonares
(DIPNECH)
Carcinoma de células escamosas
o Variantes
Papilar
De células claras
Células pequeñas
Basaloide
Carcinoma de células pequeñas
Carcinoma de células pequeñas combinado
Adenocarcinoma
o Adenocarcinoma mínimamente invasivo (MIA) (≤ 3mm tumor predominante
lepídico con ≤ 5mm de invasión)
No mucinosos, mucinosos, o no mucinosos mixtos
o Adenocarcinoma invasivo
Predominantemente lepídico
Predominantemente acinar
Predominantemente papilar
Predominantemente sólido con mucina
o Variantes de adenocarcinoma invasivo
Adenocarcinoma invasivo mucinoso (Antiguamente mucinoso BAC)
Coloide
Fetal (bajo y alto grado)
Entérico
Carcinoma de células grandes
o Variantes
o Carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC)
LCNEC combinado
3
o Carcinoma basaloide
o Carcinoma similar a linfoepitelioma
o Carcinoma de células claras
o Carcinoma de células grandes con fenotipo rabdoide
Carcinoma adenoescamoso
Carcinoma sarcomatoide
o Carcinoma pleomórfico
o Carcinoma de células fusiformes
o Carcinoma de células gigantes
o Carcinosarcoma
o Blastoma pulmonar
o Otros
o Tumor carcinoide
o Carcinoide típico (TC)
o Carcinoide atípico (AC)
o Carcinomas de tipo glándula salival
o Carcinoma mucoepidermoide
o Carcinoma adenoide quístico
o Carcinoma epimioepitelial
1.3.Clasificación TNM para cáncer de pulmón
La extensión anatómica de la enfermedad, como se describe por la clasificación TNM, sigue
siendo el más potente indicador de pronóstico para el cáncer de pulmón. Se utiliza a diario por
especialistas en todas las ramas de la atención del cáncer de pulmón y la investigación
(Goldstraw 2013). La práctica de dividir los casos de cáncer en grupos de acuerdo a las
denominadas etapas surgió del hecho de que las tasas de supervivencia fueron mayores para
los casos en los cuales la enfermedad estaba localizada que para aquellos en los que la
enfermedad se había extendido más allá del órgano de origen. Estos grupos se refieren a
menudo a casos tempranos y casos tardíos, implicando cierta progresión regular con el tiempo.
En realidad, la etapa de la enfermedad en el momento del diagnóstico puede ser un reflejo no
sólo de la tasa de crecimiento y la extensión de la neoplasia, sino también del tipo de tumor y
de la relación tumor-hospedero. La clasificación aplica para carcinomas de pulmón incluidos
carcinomas de células no pequeñas, carcinomas de células pequeñas y tumores carcinoides
broncopulmonares. Esta no aplica para sarcomas y otros tumores raros. El sistema TNM para
describir la extensión anatómica de la enfermedad está basado en tres componentes:
4
T – Extensión del tumor primario
N – La ausencia o la presencia y extensión de metástasis en los ganglios linfáticos
regionales
M – La ausencia o presencia de metástasis distante
La adición de números a estos tres componentes indica la extensión de la enfermedad maligna
quedando de la siguiente manera:
T0, T1, T2, T3, T4, N0, N1, N2, N3, M0, M1 (Paleri et al. 2010)
La asignación del estadio del cáncer al momento del diagnóstico es el más importante
predictor de supervivencia, y las opciones de tratamiento deben basarse en el estadio. Desde la
introducción de la asignación de estadios de tumor, ganglios y metástasis (TNM) por Pierre
Denoix, entre los años 1943 y 1952, ha habido significantes cambios incluidos la asignación
de estadios TNM en cáncer de pulmón. La unión internacional contra el cáncer (UICC)
continuó con el desarrollo de la clasificación TNM conforme estuvieron más datos
disponibles. El manual “Livre de Poche” fue la primera edición de la clasificación TNM y fue
publicada en 1968 y tras varias actualizaciones, la sexta edición fue liberada en 2002. La
séptima edición de la clasificación TNM para el cáncer de pulmón fue publicada por primera
vez por la Asociación Internacional para el estudio del cáncer de pulmón en su manual de
clasificación de estadios, y sigue siendo ésta la clasificación más actual que existe, quedando
como se muestra en la tabla 2 (Mirsadraee et al. 2012).
Tabla 2: Clasificación TNM para cáncer de pulmón
T: Tumor
TX El tumor primario no puede ser evaluado, o probado
T0 Sin evidencia de tumor primario
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor < 3 cm en su mayor dimensión, rodeado de pulmón o pleura visceral, sin
evidencia broncoscópica de invasión más proximal que el bronquio lobar (es decir,
no en el bronquio principal)
T1a Tumor < 2 cm en su mayor dimensión
T1b Tumor > 2 cm pero < 3 en su mayor dimensión
5
T2 Tumor > 3 cm pero < 7 o tumor con alguna de las siguientes características (Tumor
con estas características se clasifican T2a si < 5 cm):
Involucra el bronquio principal > 2 cm distal de la carina
Invade la pleura visceral
Asociado con atelectasia o neumonitis obstructiva que se extiende a la región hiliar
pero que no compromete todo el pulmón
T2a Tumor > 3 cm pero < 5 cm en su mayor dimensión
T2b Tumor > 5 cm pero < 7 cm en su mayor dimensión
T3 Tumor > 7 cm o uno que invade directamente cualquiera de los siguientes:
La pared torácica (incluyendo tumores del sulcus superior), diafragma, nervio
frénico, pleura mediastínica, pericardio parietal
Tumor en el bronquio principal < 2 cm distal a la carina pero sin compromiso de la
carina
Atelectasia asociada o neumonitis obstructiva de todo el pulmón
Nódulo(s) tumoral separado en el mismo lóbulo
T4 Tumor de cualquier tamaño que invade cualquiera de los siguientes:
Mediastino, corazón, grandes vasos, la tráquea, el nervio laríngeo recurrente,
esófago, cuerpo vertebral, carina
Nódulo(s) tumoral separado en un lóbulo ipsilateral diferente
N: Ganglios
NX Los ganglios linfáticos regionales no pueden ser evaluados
N0 Sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales
N1 Metástasis en ganglios linfáticos ipsilaterales peribronquiales y/o ipsilaterales
hiliares y ganglios intrapulmonares, incluyendo compromiso por extensión directa
N2 Metástasis en los ganglios linfáticos ipsilateral mediastino y/o subcarinal
N3 Metástasis en ganglios linfáticos contralaterales mediastínicos, contralaterales
hiliares, escalenos ipsilaterales o contralaterales, o supraclaviculares.
M: Metástasis
MX Metástasis a distancia no puede evaluarse
M0 Metástasis no distante
6
M1 Metástasis distante
M1a Nódulo (s) tumoral separado en un lóbulo contralateral
Tumores con nódulos pleural o efusión maligna pleural/pericardial
M1b Metástasis distante
1.4.Etiología del cáncer de pulmón
En el siglo pasado el cáncer de pulmón ha pasado de ser una enfermedad oscura a la principal
causa de muerte por cáncer a nivel mundial. El consumo de cigarrillos es el principal factor de
riesgo para el cáncer de pulmón, y la incidencia de cáncer de pulmón refleja fielmente la
prevalencia del tabaquismo, con un periodo de latencia de varias décadas. Otras importantes
causas de cáncer de pulmón son la enfermedad preexistente no maligna de pulmón, y
exposición al humo ambiental del tabaco, el radón, y carcinógenos ocupacionales. Los factores
genéticos y la dieta parecen modificar el riesgo de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón
sigue siendo una enfermedad altamente letal, con una tasa de supervivencia a 5 años, a nivel
mundial, de menos del 10%. Los esfuerzos para prevenir el inicio del tabaquismo y promover
el abandono del tabaco son el método más eficaz para reducir la enorme y creciente carga
mundial de la enfermedad causada por el cáncer de pulmón (Bilello et al. 2002).
1.4.1. Humo del cigarro
El humo del cigarro contiene por lo menos 3,500 compuestos muchos de los cuales son
carcinógenos. Hay 55 carcinógenos en el humo del cigarro (10 Hidrocarburos aromáticos
policíclicos, 3 Aza-arenos, 7 N-Nitrosaminas, 3 Aminas aromáticas, 8 Aminas aromáticas
heterocíclicas, 2 Aldehídos, 15 Compuestos orgánicos misceláneos, y 7 compuestos
inorgánicos), que han sido evaluados por la agencia internacional para la investigación del
cáncer (IARC) y para los cuales existe suficiente evidencia de carcinogenicidad en animales
de laboratorio y humanos. De estos 55, existen 20 carcinógenos que convincentemente causan
tumores de pulmón en animales de laboratorio o humanos (Tabla 3) (Hecht 1999).
7
Tabla 3. Principales carcinógenos en humo del tabaco causantes del cáncer de pulmón
Clase de carcinógeno compuesto
Hidrocarburos aromáticos
policíclicos
Aza-arenos
N-Nitrosaminas
Compuestos orgánicos
misceláneos
Compuestos inorgánicos
2. Benzo [a] pireno
3. Benzo [b] fluorantano
4. Benzo [f] fluorantano
5. Benzo [k] fluorantano
6. Dibenzo [a, i] pireno
7. Indenol [1,2,3-cd] pireno
8. Dibenzo [a,h] antraceno
9. 5-metilcriceno
10. Dibenzo [a,h] acridina
11. 7H-Dibenzo[c,g] carbazol
12. N-Nitrosodietilamina
13. 4-(Metilnitrosamina)-1- (3-piridil)-1- butanon
(NNK)
14. 1,3 Butadieno
15. Etil carbamato
16. Niquel
17. Cromo
18. Cadmio
19. Polonio-210
20. Arsénico
21. Hidracina
1.4.2. Cáncer de pulmón en no fumadores (Lung cancer in never smokers, LCINS)
Los no fumadores, en el contexto del cáncer de pulmón, se han definido comúnmente como
las personas que han fumado menos de 100 cigarrillos en su vida. A pesar de la impresión
pública de que la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón son fumadores, más de la
mitad de los casos de cáncer de pulmón diagnosticados no corresponde a fumadores o ex
fumadores, y las mujeres se ven desproporcionadamente afectadas entre los no fumadores. Los
médicos y los científicos han reconocido desde hace tiempo que el cáncer de pulmón en los no
fumadores (LCINS) es una enfermedad muy diferente al cáncer de pulmón en los fumadores
(Yang 2011). Se han propuesto varios factores etiológicos para el desarrollo de LCINS,
incluyendo la exposición al radón, los humos de cocción, asbestos, metales pesados, y el humo
8
ambiental de tabaco, la infección por virus del papiloma humano, y la susceptibilidad genética
heredada. Sin embargo, la contribución relativa de estos factores individuales entre los
diferentes grupos étnicos en el desarrollo de LCINS no ha sido bien caracterizada. El
adenocarcinoma es el subtipo histológico predominante reportado en LCINS (Subramanian et
al. 2007).
1.4.3. Otras Enfermedades Pulmonares y obstrucción de vías aéreas
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de pulmón son las
principales causas de muerte relacionadas con la exposición al humo de cigarro. Se ha
demostrado que el 50-70% de los pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón sufren de
EPOC y la función pulmonar reducida es un importante evento en cáncer de pulmón,
sugiriendo una asociación entre EPOC y cáncer de pulmón. Sin embargo, la relación causal
entre EPOC y la tumorigénesis de pulmón aún no está totalmente entendida (Yao et al. 2009).
El humo del cigarro contiene altas concentraciones de oxidantes y radicales libres (ROS),
junto con miles de partículas. Los antioxidantes locales y las enzimas metabolizadoras
inactivan muchas especies potencialmente tóxicas y en el proceso algunas veces generan más
ROS. Posteriormente se da la activación de NF-B y la subsecuente transactivación de genes
relacionados a inflamación los cuales parecen jugar un papel central tanto en EPOC como en
cáncer. Dependiendo qué genes son activados o suprimidos en los fumadores, puede ser el
principal determinante de si los fumadores permanecen libres de enfermedad o desarrollan
cáncer y/o EPOC. En la EPOC predomina la degradación de la matriz extracelular y la
excesiva apoptosis, con la pérdida de vasos sanguíneos y una incompleta reparación tisular. En
el cáncer de pulmón, predomina un excesivo daño y una incompleta reparación del ADN. Las
enfermedades divergen más adelante, con la inestabilidad genómica causando mayores
anormalidades cromosómicas, que resultan en la expansión clonal de las células que tienen
una ventaja de crecimiento que ocurre en el cáncer, mientras una respuesta inmune intensa y la
inflamación adicional predominan en la EPOC. El proceso por el cual estos eventos divergen
no está claro; puede ser consecuencia de mutaciones al azar en el ADN (Brody et al. 2006). La
fibrosis intersticial también se ha asociado con un aumento en el riesgo de cáncer de pulmón.
Aunque los mecanismos por los que la enfermedad intersticial pulmonar puede predisponer a
la malignidad no están claros, se han planteado diversas hipótesis, incluyendo la
9
transformación maligna relacionada con la inflamación crónica, hiperplasia epitelial, la
pérdida de la habilidad para la eliminación de las sustancias cancerígenas y las infecciones
(Dela Cruz et al. 2011).
1.4.4. Contaminación del aire ambiental
El crecimiento económico y el aumento de la urbanización plantean un nuevo riesgo para el
desarrollo del cáncer: la exposición de un gran número de personas a la contaminación del aire
ambiental. Se espera que la exposición a la contaminación del aire exterior se vuelva la
principal causa ambiental de muerte prematura a nivel mundial para el año 2050. Aunque el
riesgo relativo de desarrollar cáncer como resultado de la exposición a la contaminación del
aire es generalmente pequeño, el riesgo atribuible (riesgo relativo multiplicado por el número
de personas expuestas) es alto, transformando la contaminación del aire ambiental en el factor
de riesgo ambiental más importante para el cáncer de pulmón (Fajersztajn et al. 2013).
Estudios de gente expuesta de manera ocupacional al aire exterior contaminado han mostrado
frecuencias incrementadas, respecto a los controles, de aberraciones cromosómicas y
micronúcleos en linfocitos. La exposición al aire exterior contaminado en lugares de trabajo o
zonas urbanas e industriales también se asocia con cambios en la expresión de genes
implicados en el daño y reparación del ADN, inflamación, respuesta inmune y estrés
oxidativo, así como alteración en la longitud de los telómeros y efectos epigenéticos tales
como metilación del ADN (Loomis et al. 2013).
1.4.5. Carcinogénesis ocupacional
1.4.5.1.Asbestos
Es un mineral cristalino que se encuentra en depósitos en todo el mundo; es la fibra más
pequeña de origen natural. Debido a su flexibilidad, durabilidad y resistencia al calor y la
corrosión química, la llevó a ser ampliamente utilizada en la industria. La inhalación de fibras
de asbesto puede provocar una serie de enfermedades respiratorias, incluyendo el cáncer de
pulmón tanto de células pequeñas como de células no pequeñas, asbestosis, placas pleurales,
derrame pleural benigno y mesotelioma maligno. El pronóstico depende de la enfermedad
específica; la asbestosis generalmente progresa lentamente, mientras que el mesotelioma
maligno tiene un pronóstico extremadamente pobre. El tratamiento de los pacientes con
exposición al asbesto y cáncer de pulmón es idéntico al de cualquier paciente con cáncer de
10
pulmón. Debido a que la exposición al humo del cigarro aumenta el riesgo de desarrollar
cáncer de pulmón en pacientes con antecedentes de exposición al asbesto, dejar de fumar es
esencial (O'Reilly et al. 2007).
1.4.5.2.Radón
El radón es producto de la desintegración del radio (226
Ra), elemento altamente radiactivo. El
isótopo 219
Rn es producto de la desintegración del actinio, llamado actinón, y tiene una vida
media de 4 segundos. Además de todos éstos, el radón tiene 22 isótopos artificiales,
producidos por reacciones nucleares por transmutación artificial en ciclotrones y aceleradores
lineales. El isótopo más estable, y también el más abundante, es el 222
Rn, con una vida media
de 3,8 días y producto de la desintegración del 226
Ra. Al emitir partículas alfa se convierte
en 218
Po. Estas partículas alfa son partículas de alta energía y de gran masa, que constan de dos
protones y dos neutrones, y que causan mutaciones en las bases del ADN y rompimiento de
las hebras cromosómicas. Cuando las emisiones alfa tienen lugar dentro del pulmón, por la
inhalación y depósito del radón, el ADN de las células que recubren las vías respiratorias es
dañado, pudiendo desencadenar cáncer de pulmón (Samet et al. 2009).
1.5. Biomarcadores en la detección de cáncer de pulmón
La detección de cáncer de pulmón a menudo se realiza por rayos X, tomografía
computarizada, biopsia o por signos y síntomas relacionados al tumor primario (sangre en
esputo, dolor en el pecho, etc.), pero al momento de la detección el cáncer ya se encuentra
muy avanzado y muy pocos pacientes son curados con tratamiento (Beckles et al. 2003, Spiro
et al. 2007). Para muchos tipos de cáncer, los índices de supervivencia dependen de la
detección temprana de la enfermedad. Por lo general, cuanto más temprano se detecta y
diagnostica un cáncer, más éxito se tiene en el tratamiento, mejorando así la tasa de
supervivencia. La detección temprana aumenta las posibilidades de que el tumor esté aún
localizado. Basado en esta premisa, un gran número de científicos ha buscado biomarcadores
específicos de tumores por décadas; éstos nuevos biomarcadores pueden ser usados
clínicamente como marcadores de detección temprana de cáncer y para monitoreo de la terapia
o de enfermedad recurrente. Un biomarcador de cáncer adecuado es una substancia encontrada
en cantidad alterada en el cuerpo implicando que un cierto tipo de cáncer está presente;
idealmente debe ser detectable en la sangre u otros fluidos corporales a los que se puede tener
acceso de una manera no invasiva (Seibert et al. 2005). Después de años de análisis se han
11
propuesto algunas proteínas como marcadores de cáncer de pulmón, tales como el Antígeno
Carcino-Embrionario (CEA), el fragmento de la Citoqueratina 19 (Cyfra 21.1) entre otras, sin
embargo, pocos de estos marcadores son útiles en un entorno clínico de rutina, remarcando así
la necesidad de nuevas fuentes clínicamente relevantes (Xiao et al. 2005). Ha sido demostrado
en años recientes que los autoanticuerpos circulantes en el suero que reaccionan contra
proteínas intracelulares no son una característica exclusiva de enfermedades autoinmunes o
reumáticas, ya que se han encontrado en una gran variedad de enfermedades, entre éstas el
cáncer. No está completamente claro cómo las proteínas intracelulares se vuelven blanco de
los autoanticuerpos, pero se ha sugerido que modificaciones post-traduccionales asociadas con
una muerte celular aberrante pueden aumentar la inmunogenicidad bajo un ambiente pro-
inflamatorio. Otras posibilidades son que los autoantígenos específicos tales como las
proteínas fetales son expresados en cantidades anormalmente altas en los tejidos que han
experimentado transformación celular, contribuyendo a la pérdida de tolerancia inmune hacia
estos antígenos (Casiano et al. 2006). Muchos investigadores han estado interesados en el uso
de autoanticuerpos como marcadores serológicos para el diagnóstico de cáncer, especialmente
debido a la ausencia general de estos autoanticuerpos en individuos sanos y en condiciones de
no cáncer (Zhang et al. 2003). Estos anticuerpos han sido detectados en la sangre de pacientes,
incluso cinco años antes de que desarrollaran la enfermedad, mucho antes de que un escáner
por tomografía computarizada fuera capaz de detectar un tumor. En consecuencia, el
monitoreo de personas con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón,
determinando la presencia de autoanticuerpos en el suero, pudiera permitir una detección
temprana de la enfermedad, permitiendo así una intervención terapéutica oportuna (Murray et
al. 2010). Este enfoque ha llevado a la evaluación de paneles de antígenos proteicos para tratar
de diagnosticar la enfermedad en estadios tempranos. En un estudio se realizó la detección de
autoanticuerpos utilizando un panel de 7 antígenos asociados a tumor recombinantes (c-myc,
p53, ciclina B1, p62, Koc, IMP1 y survivina), mediante un ensayo enzimático, utilizando 527
sueros de pacientes con diferentes tipos de cáncer (pulmón, mama, hígado, colorectal, gástrico
y próstata), observándose en el caso de los sueros de pacientes con cáncer de pulmón, reacción
contra las proteínas ciclina B1, p53 y p62 (Zhang et al. 2003). En estudios similares se
analizaron sueros de pacientes con cáncer de pulmón, utilizando un panel de 6 antígenos
asociados a tumor recombinantes (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, Anexina 1 y SOX2),
12
obteniéndose como resultado reacción de los anticuerpos de los pacientes con cáncer contra
estas 6 proteínas, determinándose diferentes grados de especificidad y sensibilidad (Murray et
al. 2010, Boyle et al. 2011). Trabajos como éstos han llevado al desarrollo de dos pruebas
comerciales, las cuales se encuentran actualmente disponibles para la detección temprana de
cáncer de pulmón, PAULA´s Test y EarlyCDT-Lung test.
1.6. Pruebas de sangre comercialmente disponibles para ayudar a la detección
temprana de cáncer de pulmón.
Actualmente hay dos pruebas de sangre disponibles en el mercado para ayudar a la detección
de cáncer de pulmón en las etapas más tempranas, PAULA’s test (Genesys Biolabs) y
EarlyCDT-Lung test (Oncimmune), en las cuales se lleva a cabo la detección de antígenos y/o
autoanticuerpos asociados a cáncer de pulmón.
1.6.1. PAULA´S test
Esta prueba, desarrollada por Genesis Biolabs (http://genesysbiolabs.com/) y lanzada al
mercado en marzo de 2012, es una prueba de sangre basada en la detección de 4
biomarcadores asociados a cáncer de pulmón (las proteínas CEA, CA125, Cyfra 21.1 y un
autoanticuerpo contra NY-ESO-1) y sugerida para individuos asintomáticos mayores de 50
años de edad, con alto riesgo de desarrollar la enfermedad, como fumadores crónicos (más de
20 paquetes al año) y ex fumadores. Para el desarrollo de la prueba fueron necesarios 5 años
de investigación y más de $ 5 millones de dolares. Para el descubrimiento y el establecimiento
del panel de biomarcadores fue necesario el análisis de más de 1,000 muestras de sangre de
pacientes en todos los estadios de cáncer de pulmón, personas en riesgo y muestras de
pacientes con otros tipos de cáncer como el de próstata, mama y colorrectal, así como otros
grupos control como pacientes con desórdenes pulmonares no cancerosos (asma, fibrosis,
EPOC, enfisema y neumonía) de diferentes ciudades, tanto en los EE.UU. como en el Reino
Unido. La validación de la prueba fue realizada en la plataforma tecnológica Luminex xMAP,
utilizando para la evaluación un total de 380 sueros, 115 de pacientes con diagnóstico
confirmado de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), 155 fumadores con
historia similar de tabaquismo y se utilizaron los datos de validación de un grupo
independiente (n=150) para evaluar el modelo desarrollado y determinar la capacidad de la
prueba para distinguir los casos de NSCLC de los controles. El panel de 4 biomarcadores fue
capaz de discriminar los casos de NSCLC de los controles con un 74% de sensibilidad y 80%
13
de especificidad en el conjunto de entrenamiento y con un 77% de sensibilidad y 80% de
especificidad en el conjunto de validación independiente. El uso de autoanticuerpos contra
NY-ESO-1 aumentó sustancialmente la sensibilidad global de la detección de NSCLC en
comparación con los 3 marcadores tumorales solos. Estos estudios confirman el valor de usar
un panel mixto de antígenos tumorales y autoanticuerpos en la detección temprana de NSCLC
(Doseeva et al. 2015)
1.6.2. Early CDT-Lung test
Este análisis de sangre ha sido desarrollado por Oncimmune y se basa en la detección de
autoanticuerpos (o inmunobiomarcadores) en contra de un panel de 6 antígenos relacionados a
tumor (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, Anexina 1 y SOX -2). Para la validación de la
prueba Oncimmune ha analizado más de 120,000 muestras desde 2007 y esta prueba está
comercialmente disponible desde 2009 (EarlyCDT®–Lung, www.oncimmune.com). Hay
trabajos anteriores que ayudaron en el desarrollo y validación de esta prueba; en uno de estos
trabajos, se probó un panel de 6 antígenos asociados a tumor (TAAs), p53, NY-ESO-1,
CAGE, GBU4-5, Anexina 1 y SOX-2, para la detección de autoanticuerpos, utilizando tres
cohortes de pacientes recién diagnosticados con cáncer de pulmón, grupo uno (n = 145), grupo
dos (n = 241) y grupo tres (n = 269). Las muestras de suero del grupo 1 fueron evaluadas para
la búsqueda de autoanticuerpos contra p53, NY-ESO-1, CAGE y GBU4-5 y en los grupos 2 y
3 se evaluó el panel completo, demostrando valores de sensibilidad/especificidad de 36%/91%
para el grupo 1, 39/89% para el grupo 2 y 37/90% para el grupo 3, y en esta validación clínica
se reportó que no hubo diferencias significativas entre las diferentes etapas de cáncer de
pulmón, por lo tanto, se pueden detectar autoanticuerpos tanto en la etapa temprana como en
la tardía de la enfermedad (Boyle et al. 2011). En un trabajo posterior, realizado como una
post validación del trabajo desarrollado por Boyle et al., (2011), se utilizó el ensayo de
EarlyCDT-Lung test en 4 cohortes (n=574) de nuevos pacientes diagnosticados con cáncer de
pulmón, el grupo 1 (n=122) estuvo conformado con el 100% de pacientes con cáncer de
pulmón de células pequeñas, el grupo 2 (n=249) estuvo conformado por un 97% de pacientes
con cáncer de pulmón de células no pequeñas, el grupo 3 (n=122) conformado en un 100% de
pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas y por último el grupo 4 (n=81)
conformado por un 62% de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas; todas las
muestras de sangre fueron tomadas después del diagnóstico, pero previo a recibir cualquier
14
tratamiento contra el cáncer (Lam et al. 2011). Los niveles de anticuerpos fueron medidos
utilizando un panel de 6 antígenos relacionados a tumor (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5,
Anexina 1 y SOX-2). Combinando los datos de validación y post validación, la sensibilidad y
especificidad mostrada por el ensayo EarlyCDT-Lung test fue de 38%/88% analizando todas
las muestras, 34%/88% para cáncer de pulmón de células no pequeñas y 50%/88% para cáncer
de pulmón de células pequeñas (Lam et al. 2011). Hay trabajos en los que los investigadores
trataron de mejorar la sensibilidad y la especificidad del panel utilizado en el ensayo
EarlyCDT-lung test, introduciendo nuevos antígenos para evaluar. Hay un estudio en el cual
se llevó a cabo la medición de los autoanticuerpos contra un panel de 6 antígenos asociados a
tumor (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, Anexina 1 y SOX-2) o 7 antígenos asociados a
tumor (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, SOX-2, HuD y MAGE A4), en muestras de 235
pacientes con cáncer de pulmón recién diagnosticados y sus controles. También fueron
evaluados dos grupos de individuos con alto riesgo de desarrollar cáncer de pulmón, uno de
776 y otro de 836, y se determinó la sensibilidad y la especificidad de los dos paneles,
comparando entre pacientes con cáncer y el grupo en riesgo de desarrollar la enfermedad. El
ensayo de autoanticuerpos para las 235 muestras de cáncer de pulmón mostró una
sensibilidad/especificidad del 39%/89% para el panel de 6 autoanticuerpos, mientras que el
panel de 7 autoanticuerpos mostró una sensibilidad/especificidad del 41%/91%. El panel de 6
autoanticuerpos utilizado para el primer grupo de 776 individuos de alto riesgo mostró una
sensibilidad/especificidad de 40%/82%, mientras que en el segundo grupo de 836 muestras de
individuos en riesgo mostró una sensibilidad/especificidad del 47%/90%, lográndose una
reducción de 30% en falsos positivos para el panel de 7 autoanticuerpos en la prueba de casos
y controles y un 41% para el grupo de alto riesgo probados en el mismo panel (Chapman et al.
2012). En otro estudio se llevó a cabo la búsqueda de nuevos antígenos biomarcadores
utilizando un sistema de clonación y expresión de alto rendimiento, el cual permitió la
clonación y la expresión de 96 proteínas recombinantes al mismo tiempo en unas pocas
semanas. Se clonaron y expresaron 63 nuevos antígenos con diferentes proteínas de fusión y
se evaluaron estas proteínas individualmente, dejando finalmente 5 proteínas para ser
utilizadas junto con el ensayo EarlyCDT-Lung test para mejorar la sensibilidad y la
especificidad del ensayo. El resultado fue un aumento en la sensibilidad/especificidad de un
38%/86% utilizando solo el test comercial hasta un 49%/93% utilizando el ensayo EarlyCDT-
15
Lung test más los 5 nuevos antígenos, Alfa Enolasa-BirA, p53-C-BirA, Citoqueratina 8-BirA,
Citoqueratina 20-BirA y Lmyc2 (Macdonald et al. 2012). Estos estudios demuestran la
importancia de usar un panel de antígenos tumorales y autoanticuerpos para la detección
temprana de cáncer de pulmón en pacientes con alto riesgo de adquirir la enfermedad.
16
2. HIPÓTESIS
Los sueros obtenidos de pacientes con cáncer de pulmón presentarán autoanticuerpos contra
proteínas asociadas o derivadas de tumor Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA,
CA125, CRP, TPI-1, PRDX-2 y PPIA cuya expresión alterada ha sido previamente
demostrada.
17
3. OBJETIVOS
3.1.Objetivo general
Evaluar auto-anticuerpos contra los antígenos asociados o derivados de tumor Citoqueratina
19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA, CA125, CRP, TPI-1, PRDX-2 y PPIA, en muestras de suero de
pacientes con cáncer de pulmón como marcadores potenciales de diagnóstico de la
enfermedad.
3.2.Objetivos específicos
Obtener las proteínas recombinantes Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA,
CA125, CRP TPI-1, PRDX-2 y PPIA.
Determinar la presencia de auto-anticuerpos contra el grupo de proteínas
recombinantes producidas, en muestras de suero de pacientes con cáncer de pulmón, de
pacientes con EPOC y de fumadores activos.
18
4. MÉTODOS
4.1.Propagación de las líneas celulares A549, HepG2, HeLa y OVCAR-3.
La línea celular de carcinoma pulmonar A549 fue donada por el Doctor Raúl Barrera
Rodríguez del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias-SSA. Las células se crecieron
en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/ml de
penicilina y 100 g/ml de estreptomicina a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2. Se
realizaron varios lavados a los cultivos para desechar restos celulares y células muertas no
adheridas a la superficie del frasco, utilizando para el lavado PBS. Una vez que se tuvo el
crecimiento deseado, se retiraron 10 millones de células para realizar la extracción de RNA y
proteínas.
4.2.Extracción de RNA de células de las líneas celulares
A549, HepG2, HeLa y OVCAR-3.
Se llevó a cabo la extracción de RNA total de las diferentes líneas celulares, tomando
alrededor 10^6
células, las cuales se empastillaron por centrifugación utilizando un tubo
Falcon, a 1500 rpm. Se retiró el medio de cultivo utilizando una pipeta serológica y se agregó
a la pastilla 1 ml del reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se homogenizó la pastilla
utilizando una micropipeta de 1 ml y se pasó el homogenizado a un microtubo de 1.5 ml y se
dejó incubando a temperatura ambiente por 5 minutos. Pasados los 5 minutos, se agregaron
200 l de cloroformo, se tapó el tubo y se agitó de forma manual vigorosamente por 15
segundos y después se incubó durante 3 minutos a temperatura ambiente. Pasado el tiempo de
incubación se centrifugó el tubo a 10,000 rpm por 15 min a 4°C. Después de la centrifugación
se observó que la muestra se separó en dos fases, una fase acuosa incolora en la parte superior,
una interface en la parte media y en la parte baja la fase con fenol-cloroformo de color rojo. Se
tomó la fase acuosa transparente y se pasó a un tubo nuevo. Se precipitó el RNA de la fase
acuosa agregando 500 l de alcohol isopropílico. Se incubó la muestra 10 minutos a
temperatura ambiente y se centrifugó a 10,000 rpm por 10 minutos a 4 °C. Se observó en la
parte inferior del tubo una pastilla blanca la cual es el RNA precipitado. Se removió el
sobrenadante y se lavó la pastilla agregando 1 ml de etanol al 75% y la muestra se agitó con
vórtex. Se centrifugó el tubo a 5,000 rpm por 5 minutos a 4 °C y se retiró el sobrenadante. Se
19
dejó secar la pastilla hasta que ésta se volvió transparente, similar a una gota de agua. Se
reconstituyó el RNA agregando 50 l de agua inyectable estéril e inmediatamente se
cuantificó utilizando el equipo nanodrop (Thermo scientific, Waltham, MA), guardando el
resto a -80 °C.
4.3.Síntesis de cDNA
Se llevó a cabo la síntesis de cDNA utilizando el kit SuperScript® III First-Strand Synthesis
SuperMix. Para la síntesis se mezclaron los siguientes reactivos en un microtubo de 200 l:
5 g de RNA total 2.5 l
Primer (oligo dT 50 mM) 1 l
Buffer de alineamiento 1 l
Agua inyectable estéril 3.5 l
Se incubó el tubo en un termociclador Biometra T Gradient Thermocycler (Biometra) a 65°C
durante 5 minutos y pasado el tiempo de incubación se colocó el tubo en hielo durante 1
minuto y después se agregaron los siguientes reactivos al tubo:
2X First-strand Reaction Mix 10 l
SuperScript III/RNAse Out Enzyme Mix 2 l
Con ayuda de un vórtex se agitó la muestra y se centrifugó gentilmente para llevar el total de
la mezcla de reacción al fondo del tubo e inmediatamente se colocó nuevamente en el
termociclador y se incubó durante 50 minutos a 50°C. Pasado el tiempo de incubación, se
aumentó la temperatura a 85°C durante 5 minutos para inactivar la enzima. Se enfrió el tubo
en hielo y se almacenó el cDNA recién sintetizado a -20 °C.
20
4.4.Diseño de iniciadores y amplificación de los genes que codifican para Citoqueratina 19,
Cyfra 21.1, YKL-40, CRP, CA125 y CEA.
Para el diseño de los iniciadores se llevó a cabo una búsqueda de los genes codificantes para
las proteínas a trabajar en la página del National Center of Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), a continuación se muestra el número de GenBank de las
secuencias utilizadas para el diseño de los oligonucleótidos:
Genes GenBank
Citoqueratina 19 NM_002276.4
Cyfra 21.1 NM_002276.4
YKL-40 NM_001276.2
CRP X56692.1
CA125 NM_024690.1
CEA NM_004363.2
Una vez identificadas las secuencias que codifican para las proteínas de interés, se llevó a cabo
el diseño de los iniciadores utilizando el programa Primer 3 y Oligo Analyzer. En los anexos 3
al 8 se muestra la secuencia codificante de cada una de las proteínas y las regiones en las que
se unen los iniciadores diseñados. A cada uno de los iniciadores Forward se le agregó la
secuencia CACC al inicio, ya que es un requisito para que la secuencia amplificada pueda ser
clonada en los vectores de expresión del sistema Champion™ pET Directional TOPO®
Expression Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los iniciadores quedaron de la siguiente manera:
Iniciadores Secuencia Amplificado pb
Cyt-19 Forward: 5´- C ACC ATG ACT TCC TAC AGC TAT CGC AGT C- 3´
Reverse: 5´- GAG GAC CTT GGA GCC AGA CAA ATT GTT GTA- 3´
1205
CYFRA 21.1 Forward: 5´- C ACC ATG CGA AGC CAATAT GAG GT- 3´
Reverse: 5´- GAG GAC CTT GGA GGC AGA C- 3´
451
CRP Forward: 5´- C ACC ATG GAG AAG CTG TTG TGT TTC TT- 3´
Reverse: 5´- CCA CAG CTG GGG TTT GGT- 3´
673
CA125 Forward: 5´- C ACC GAT CCC AAA AGC CCT GGA- 3´
Reverse: 5´- GGG AAG GTC AGA ATT CCC AGT- 3´
2692
YKL-40 Forward: 5´- C ACC ATG GGT GTG AAG GCG TCT C - 3´
Reverse: 5´- TGC AGC GAG TGC ATC CTT- 3´
1150
CEA Forward: 5´- C ACC ATG GAG TCT CCC TCG GCC CCT- 3´
Reverse: 5´- AGA GAC TGT GAT GCT CTT GAC TAT GGA AT- 3´
2029
21
La reacción de amplificación se llevó a cabo utilizando la enzima Platinum Taq DNA
Polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA). La mezcla de reacción para la amplificación se llevó a
cabo como se muestra a continuación:
Reactivo Concentración Volumen en la mezcla de
reacción (vol. final 25 l)
Concentración final
Agua inyectable estéril -------- 14.75 -------
Buffer PCR 10X 2.5 1X
dNTP´s 10 mM 0.5 0.2 mM
MgCl2 50 mM 0.75 1.5 mM
Iniciador sentido 10 M 2.5 l 1 M
Iniciador antisentido 10 M 2.5 l 1 M
cDNA 50 ng/l 1 50 ng
Taq polimerasa 5 u/l 0.5 2.5 u
Se colocaron los tubos en el termociclador Biometra T Gradient Thermocycler (Biometra) y se
llevó a cabo la amplificación utilizando los ciclos de amplificación que se muestran a
continuación:
22
4.5.Electroforesis en gel de agarosa al 1%
Se disolvieron 0.3 g de agarosa UltraPureTM
(Invitrogen, Carlsbad, CA) en 30 ml de
amortiguador TAE 1X, se calentó la mezcla por 25 segundos en un horno de microondas y se
dejó enfriar hasta poder soportarlo en la palma de la mano; enseguida se adicionaron 3l del
reactivo SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Carlsbad, CA). La mezcla se vació en un
portageles con peine, previamente lavados y se dejó polimerizar por 30 minutos, a temperatura
ambiente. Se llenó la cámara con amortiguador TAE 1X y dentro de la cámara se colocó el gel
de agarosa. En el pozo inicial se cargaron 5 l de marcador de peso molecular 1kb Plus DNA
Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) y en cada uno de los pozos siguientes se colocaron 7 l de
la muestra, los cuales fueron mezclados con 3 l de buffer de carga 10X BlueJuice Gel
Loading Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA). El gel se corrió a un voltaje de 80 volts durante 50
minutos, se observó en el fotodocumentador Molecular Imager Gel DocTM
XR+ with Image
LabTM
Software (BIO-RAD) y se tomó una fotografía para el análisis del peso molecular de
los productos de PCR.
4.6.Reamplificación y purificación de las secuencias previamente amplificadas
La reacción de amplificación se llevó a cabo utilizando el kit Phusion® High-Fidelity PCR Kit
(New England BioLabs). La mezcla de reacción para la amplificación se llevó a cabo como se
muestra a continuación:
Componente 50 l de reacción Concentración final
Agua libre de nucleasas Llevar a 50 ----------
5X Phusion HF Buffer 10 l 1X
10 mM dNTPs 1 l 200 M
10 M Forward primer 2.5 l 0.5 M
10 M Reverse primer 2.5 l 0.5 M
DNA templado Variable < 250 ng
Phusion DNA polimerasa 0.5 l 1 unidad
Se utilizó el mismo termociclador y los mismos ciclos de amplificación mostrados
anteriormente para cada una de las secuencias reamplificadas. Posteriormente, se corrió un gel
de agarosa al 1% preparado como ya se mencionó con anterioridad. Se mezclaron 20 l de
23
buffer de carga con los 50 l de la reacción de PCR y se cargaron 10 l de esta mezcla en el
segundo pozo, 30 l en el tercer y cuarto pozo, mientras que el primer pozo se utilizó para el
marcador de peso molecular; se corrió el gel a 80 volts durante 50 minutos. Pasado el tiempo
de corrida se cortó el gel de manera vertical con ayuda de un bisturí, de tal forma que se
incluyeran en el corte los primeros dos pozos (marcador y primera muestra); después se colocó
el gel en el transiluminador Fisher Biotech Transilluminator FBTI-88 (Fisher Scientific) y se
observó el producto de amplificación con luz UV. Se llevó a cabo una incisión con el bisturí,
por encima y por debajo de la banda, para indicar el tamaño y posición de ésta y finalmente se
colocó al lado de este gel el otro fragmento que contiene los pozos 3 y 4 y se cortaron las
bandas sin exponer éstas a la luz UV. Se colocaron los fragmentos del gel en un tubo de 1.5 ml
y se llevó a cabo la purificación del ADN amplificado utilizando el kit QIAEX II Gel
Extraction Kit (150) (QIAGEN). Se agregó al tubo que contenía los pedazos de gel 1 ml de la
solución QX1. Posteriormente se agitó con vórtex durante 30 segundos el reactivo QIAEX II
(partículas de sílice), se tomaron 30 l de reactivo y se colocaron en un tubo de 1.5 ml. Se
incubó el tubo a 50°C por 10 minutos para solubilizar la agarosa y unir el ADN a las partículas
de sílice y se mezcló con vórtex cada 2 minutos para mantener las partículas en suspensión.
Pasados los 10 minutos se centrifugó la muestra durante 30 segundos a 13,000 rpm a
temperatura ambiente y se retiró el sobrenadante con una pipeta. Se lavó la pastilla agregando
al tubo 500 l de buffer QX1 y se resuspendió con un vórtex. Se centrifugó la muestra por 30
segundos a 13,000 rpm a temperatura ambiente y se retiró completamente el sobrenadante con
una pipeta, para así retirar agarosa residual contaminante. Se lavó la pastilla dos veces con 500
l de buffer PE, se centrifugó la muestra por 30 segundos a 13,000 rpm a temperatura
ambiente y se retiró completamente el sobrenadante con una pipeta, para así retirar sal residual
contaminante. Se dejó destapado el tubo para que se secara la pastilla hasta que ésta quedó
blanca (alrededor de 30 minutos). Finalmente, se eluyó el ADN unido a las perlas de sílice
agregando 20 l de agua libre de nucleasas, se resuspendió la pastilla con vórtex y se dejó
incubando por 5 minutos a temperatura ambiente; pasado el tiempo se centrifugó el tubo por
30 segundos a 13,000 rpm a temperatura ambiente y se pasó el sobrenadante a un tubo nuevo
con ayuda de una pipeta.
24
4.7.Clonación de secuencias amplificadas y transformación de células quimiocompetentes
de E.coli TOP-10
La clonación se llevó a cabo utilizando el kit “Champion™ pET101 Directional TOPO®
Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® Chemically Competent E. coli”,
mezclando los siguientes reactivos:
Reactivos E. coli químicamente competentes
Producto de PCR fresco 4 l (50 ng)
Solución salina 1 l
Agua estéril ---------
Vector TOPO 1 l (20 ng)
Volumen total 6 l
Se mezcló la reacción y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Pasados los 5
minutos se colocó la reacción de clonación en hielo, para proceder a la transformación de las
células. Se agregaron 3 l de la reacción de clonación dentro de un vial de células de E. coli
One Shot® TOP10 químicamente competentes y se mezcló gentilmente utilizando una punta
de micropipeta para agitar y mezclar completamente. Se dejó reposar en hielo por 5 minutos e
inmediatamente después se dio un choque térmico a las células por 30 segundos, a 42 °C,
colocando el tubo en el equipo Termoblock AccuBlockTM
Digital Dry Bath (Labnet
International, Inc.). Inmediatamente después se colocó el tubo con las células en hielo y se
agregaron 250 l de medio SOC, se tapó el tubo y se colocó horizontalmente en agitación a
200 rpm y 37°C por una hora. Se tomaron del tubo de las células tres diferentes volúmenes, 50
l, 100 l y 150 l y se colocaron y esparcieron con ayuda de una varilla de vidrio en placas
de agar LB con ampicilina a una concentración de 100 g/ml, previamente calentadas; se
colocaron las placas de agar en la incubadora Isotemp Incubator (Fisher Scientific) a 37°C por
24 horas.
25
4.8.Extracción de plásmidos de células transformadas E. coli TOP-10
Se tomó cada una de las colonias crecidas en las placas de agar, se inocularon en tubos con 10
ml de medio LB y ampicilina a una concentración de 100 g/ml y se incubaron en agitación a
250 rpm y 37°C por 24 horas. Posteriormente se realizó la extracción de los plásmidos
utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep Kit (250) (QIAGEN). Brevemente, se empastillaron
por centrifugación 5 ml del medio de cultivo con el crecimiento bacteriano a 13,000 rpm
durante 1 minuto a temperatura ambiente, en microtubos de 1.5 ml; con el resto del cultivo se
hicieron alícuotas mezclando en tubos de 1.5 ml, 0.85 ml de medio de cultivo con 0.15 ml de
glicerol concentrado y se guardaron a -20ºC. Se resuspendieron las células previamente
empastilladas agregando 250 l del buffer P1 y mezclando con la pipeta, subiendo y bajando
el líquido hasta que no se observó nada de pastilla en el fondo, posteriormente se agregaron
250 l de buffer P2, se tapó el tubo y se mezcló invirtiéndolo 6 veces; inmediatamente
después se agregaron 350 l de buffer N3 y se mezcló de igual forma invirtiendo el tubo 6
veces y rápidamente se centrifugó a 13,000 rpm durante un minuto. Con ayuda de una pipeta
se tomaron 800 l de sobrenadante, se depositaron en una de las columnas proporcionadas en
el kit y se centrifugaron a 13,000 rpm durante un minuto a temperatura ambiente. Se descartó
el líquido que quedó en el depósito posterior de la columna, ésta se lavó agregando 500 l de
buffer PB y nuevamente se centrifugó a 13,000 rpm durante un minuto a temperatura
ambiente. De igual forma, se descartó el líquido del depósito y se agregaron 750 l de buffer
PE para un segundo lavado, se centrifugó a 13,000 rpm durante un minuto a temperatura
ambiente, se descartó el líquido y se dio una segunda centrifugada para eliminar el buffer
residual de la columna. Para terminar, se colocó la columna en un microtubo de 1.5 ml, se le
agregaron 50 l de buffer EB y se centrifugó a 13,000 rpm por un minuto a temperatura
ambiente. Se retiró la columna del tubo y éste se tapó y se almacenó a -20 °C.
4.9.Análisis de las transformantes mediante amplificación de las secuencias clonadas
Se llevó a cabo la amplificación de los insertos clonados por PCR utilizando el kit Platinum®
PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) mezclando los siguientes reactivos:
26
DNA plasmídico 1 l
Primer Forward 1 l
Primer reverse 1 l
Platinum® PCR SuperMix
High Fidelity
22 l
Volumen total 25 l
Se utilizó el mismo termociclador y los mismos ciclos de amplificación mostrados
anteriormente para cada una de las secuencias. Posteriormente, se corrió un gel de agarosa al
1% preparado en la forma que se mencionó con anterioridad.
4.10. Transformación de las células E. coli BL21 Star™ (DE3) One Shot®
Una vez identificados los plásmidos que contienen los insertos de interés, se transformaron las
células E. coli BL21 Star™ (DE3) One Shot® proporcionadas en el kit de clonación. Se
descongeló en hielo un vial de células por cada transformación; una vez descongeladas, se
agregaron 5 l de plásmido en cada vial de células, se mezcló con mucho cuidado,
revolviendo suavemente con ayuda de la punta de la pipeta y se incubó en hielo durante 30
minutos. Pasado el tiempo de incubación se colocaron las células en el equipo termoblock
AccuBlockTM
Digital Dry Bath (Labnet International, Inc.) durante 30 segundos, a 42°C e
inmediatamente se transfirió el tubo al hielo. Se agregaron 250 l de medio SOC y se puso el
tubo en incubación a 37°C por 30 minutos a 200 rpm. Pasado el tiempo de incubación, se
agregó el volumen completo del vial a un tubo con 10 ml de medio LB suplementado con
ampicilina a una concentración de 100 g/ml y se permitió el crecimiento de las células,
incubando el tubo a 37°C durante toda la noche, con agitación a 200 rpm.
4.11. Inducción piloto
Se inocularon 10 ml de medio LB suplementado con ampicilina a una concentración de 100
g/ml, agregando 500 l del cultivo crecido toda la noche en el paso anterior y se incubó a
37°C durante 3 horas con agitación a 200 rpm; se hicieron alícuotas con el resto del medio de
cultivo crecido, mezclando en un microtubo de 1.5 ml, 850 l de medio de cultivo con 150 l
de glicerol al 100 % y se congelaron a -20°C. Pasado el tiempo de incubación, se dividió el
27
cultivo en dos partes, separando 5 ml de cultivo y depositándolos en un tubo Falcon nuevo de
15 ml, etiquetando uno de los tubos como control positivo y el otro como control negativo. Se
agregaron, al tubo etiquetado como control positivo, 5 l del inductor IPTG 1 M para que éste
quedara a una concentración final de 1 mM y se colocaron de nuevo los dos tubos en la
incubadora, dejándose incubar por 4 horas más a 37°C y 200 rpm. Pasado el tiempo de
incubación, se tomaron 100 l de medio de cultivo de cada uno de los tubos y se empastillaron
a 13,000 rpm durante 1 minuto, después se eliminó el sobrenadante y se congeló la pastilla a -
20°C para su posterior análisis. Se empastilló el resto del cultivo con crecimiento bacteriano
para el posterior análisis de proteínas solubles e insolubles.
4.12. Análisis de proteínas recombinantes por SDS-PAGE
Se llevó a cabo la electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE),
utilizando el equipo Mini PROTEAN Tetra Cell (BIO-RAD) y todos sus componentes. Se
prepararon dos geles de poliacrilamida al 6-12% para el análisis de las proteínas
recombinantes expresadas con anterioridad. Se limpiaron los vidrios agregando etanol al 70%
y limpiando éstos con una servilleta hasta que el vidrio quedó completamente limpio, después
se posicionaron los vidrios en el adaptador y se apretaron con ayuda de las pinzas de presión,
enseguida se posicionó el adaptador en su soporte y se presionó utilizando las pinzas de
presión superiores. Posteriormente se mezclaron los reactivos para la elaboración del gel
separador, como se muestra a continuación:
Componente Volumen correspondiente al 12%
Acrilamida/Bisacrilamida 30% 4 ml
Agua destilada 3.4 ml
Buffer de gel separador (1.5 M Trizma
Base, 0.4% SDS, pH 8.8)
2.5 ml
PSA 10% 100 l
TEMED 4 l
Se mezclaron perfectamente bien los reactivos en el orden indicado y rápidamente se colocó la
mezcla en los vidrios previamente armados, dejando un centímetro antes del tope de los
28
vidrios; inmediatamente después de agregar la mezcla, se agregó agua para quitar burbujas y
emparejar el gel y se dejó polimerizar por 10 minutos. Pasado el tiempo de polimerización, se
procedió a retirar el agua por inversión de los vidrios, utilizando una sanita para quitar todo el
exceso de agua y se procedió a la elaboración del gel concentrador, mezclando los reactivos
como se muestra a continuación:
Componente Volumen correspondiente al 6%
Acrilamida/Bisacrilamida 30% 1 ml
Agua destilada 2.7 ml
Buffer de gel concentrador (0.5 M Trizma
Base, 0.4% SDS, pH 6.8)
1.3 ml
PSA 10% 50 l
TEMED 4 l
Se mezclaron perfectamente bien los reactivos en el orden que se muestra en el cuadro y se
agregó la mezcla sobre el gel separador previamente hecho; una vez lleno, se colocó el peine y
se dejó polimerizar por 15 minutos. Después, se retiraron los peines y se colocaron los vidrios
en el equipo Mini PROTEAN Tetra Cell (BIO-RAD); se llenó con buffer de corrida para SDS-
PAGE (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS). Se descongelaron las pastillas de la
inducción piloto y se les agregaron 30 l de buffer de carga 1X, se mezcló bien la pastilla con
el buffer y se calentó a 100°C durante 5 minutos. En el primer pozo de uno de los geles se
agregaron 10 l del marcador de peso molecular Precision Plus Protein Unstained (BIO-RAD)
y en el gel para electrotransferencia de las proteínas se agregaron 3 l de marcador de peso
molecular Precision Plus Protein All Blue (BIO-RAD); en los pozos siguientes se agregaron
10 l de muestra de cada uno de los cultivos, empezando con el control negativo y luego la
muestra positiva (inducida). Se realizó la electroforesis a 80 volts por 20 minutos y luego se
cambió el voltaje a 180 volts por 50 minutos. Pasado el tiempo de corrida, se retiró de entre
los vidrios el gel que contenía el marcador sin colorante, se colocó en un recipiente que
contenía azul de Coomassie y se dejó tapado en agitación leve durante 20 minutos; el otro gel
se utilizó para la electrotransferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa y el
posterior ensayo de western blot. Pasado el tiempo de tinción se retiró el colorante, se agregó
29
solución para desteñir y se colocó en agitación, haciendo varios lavados con este buffer hasta
que se apreciaron claramente las bandas en el gel. Por último, se tomó una fotografía del gel
desteñido para su posterior análisis.
4.13. Electrotransferencia de proteínas recombinantes y Western blot
Se retiró el gel que se guardó para electrotransferencia y se colocó en un recipiente que
contenía buffer de transferencia (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS, 20% metanol);
posteriormente se cortó un pedazo de membrana de nitrocelulosa AmershamTM
HybondTM
-
ECL (GE Healthcare) del mismo tamaño del gel, se colocó en el buffer y se dejaron el gel y la
membrana durante 15 minutos. Pasados los 15 minutos se procedió al armado del sándwich
como se muestra a continuación:
.
Primero se colocó el casete para electrotransferencia, abierto sobre la mesa, y se colocó la
almohadilla de fibra color negro, previamente humedecida en buffer de transferencia, en la
parte transparente; posteriormente se humedeció un papel filtro y se colocó encima de la
almohadilla de fibra. Se retiró la membrana del buffer de transferencia y se colocó encima del
papel filtro, después se posicionó el gel de poliacrilamida encima de la membrana cuidando
que el marcador quedase del lado izquierdo, por último se cubrió el gel con otro papel filtro y
la almohadilla de fibra previamente humedecidos en el buffer de transferencia y se cerró el
sándwich, utilizando la parte negra del casete de electrotransferencia, apretando el cerrojo
Papel filtro
Membrana de
nitrocelulosa
Gel de
poliacrilamida
Papel filtro
30
blanco del casete. Se colocó el casete armado dentro del módulo de electrotransferencia,
quedando orientada la parte negra del casete hacia la parte negra del módulo. Se colocó tanto
el módulo como la unidad de enfriamiento de color azul, la cual estaba en congelación, dentro
de la cámara de electrotransferencia y se llenó con buffer de transferencia, se tapó la cámara y
se colocó en una hielera. Se llenó la hielera con hielo molido y se conectaron los cables de la
tapa en la fuente de poder; se llevó a cabo la transferencia de las proteínas a 110 volts durante
60 minutos. Pasado el tiempo de transferencia se tiñó la membrana sumergiéndola en rojo de
Ponceau durante 15 minutos para asegurar la correcta transferencia de las proteínas y se
destiñó sumergiendo la membrana en buffer de transferencia hasta que las bandas
desaparecieron; posteriormente se enjuagó la membrana con agua destilada y se procedió a
realizar el Western blot. Se colocó la membrana en un recipiente, se agregaron 25 ml de buffer
de bloqueo (TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 5%) y se dejó incubando a temperatura
ambiente durante 3 horas en agitación a 50 rpm. Pasado el tiempo de bloqueo se lavó la
membrana dos veces con buffer de lavado (TBS 1X-Tween 20 al 0.1%) durante 10 minutos en
agitación a 50 rpm, se retiró el buffer de lavado y se agregó el anticuerpo His-probe (H-3)
mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:3000 en el buffer de bloqueo
(TBS 1X-Tween 20 al 0.05%, leche al 2.5%) y se incubó toda la noche en agitación a 50 rpm.
Al día siguiente se hicieron dos lavados de 20 minutos con buffer de lavado (TBS 1X-Tween
20 al 0.1%), se retiró el buffer de lavado y se agregó el anticuerpo Goat Anti-Mouse IgG (H-
L)-HRP Conjugate (BIO-RAD) diluido 1:3000 en el buffer de bloqueo (TBS 1X-Tween 20 al
0.05%, leche al 2.5%) y se incubó tres horas en agitación a 50 rpm. Después de la incubación
se hicieron dos lavados de 20 minutos con buffer de lavado (TBS 1X-Tween 20 al 0.1%) y
uno más de 10 minutos con TBS 1X. Finalmente se llevó a cabo el revelado agregando 15 ml
de solución de revelado y se dejó hasta que se observó la reacción (alrededor de 10 minutos);
una vez que se observaron las bandas se retiró la solución de revelado, se enjuagó la
membrana con agua destilada, se colocó la membrana sobre papel absorbente y se tomó una
fotografía para su posterior análisis.
4.14. Inducción masiva y purificación de proteínas recombinantes solubles
Se preparó el pre-inóculo de las bacterias transformadas con los plásmidos para la expresión
de las proteínas solubles TPI-1, PRDX-2 y PPIA, inoculando 10 ml de medio de cultivo LB
31
con antibiótico (100 g/ml de ampicilina) con 500 l de las alícuotas de cada una de las
bacterias que se encontraban almacenadas en el congelador, y se dejó crecer durante toda la
noche a 37°C en agitación a 200 rpm. Al día siguiente se inocularon 200 ml de medio de
cultivo con antibiótico, agregando los 10 ml del pre-inóculo, y se dejó crecer durante 3 horas
en agitación a 200 rpm y temperatura de 37°C; pasadas las tres horas se agregaron 200 l de
IPTG 1 M, quedando éste a una concentración de 1 mM, y de nuevo se colocó en incubación
durante 4 horas más. Se empastillaron los 200 ml de medio de cultivo inducido, en tubos
Falcon de 50 ml, mediante centrifugación a 5000 rpm por 20 minutos; se eliminó el
sobrenadante y se agregaron 8 ml de buffer nativo de purificación/Buffer de lavado 1 (Native
lysis/wash buffer 1, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM Imidazole), se mezcló bien la
pastilla utilizando una pipeta y se utilizó el equipo sonicador Ultrasonic liquid processor XL-
2000 SERIES (MISIONIX) para romper las células, dando 5 pulsos de 1 minuto, con 1 minuto
de descanso entre cada pulso de sonicación, todo esto con el tubo sumergido en hielo para
evitar el calentamiento de la muestra. Después de sonicar la muestra, se tomaron alícuotas de 1
ml, se depositaron en microtubos de 1.5 ml y se centrifugaron a 13,000 rpm a temperatura
ambiente durante 20 minutos; después se tomó el sobrenadante de cada tubo, se depositó
dentro de una jeringa de 10 ml (BD Plastipac) y se pasó a través de un filtro CORNING 25mm
Syringe Filter 0.20 Micron (Corning Incorporated); se recuperó el filtrado, se depositó
nuevamente en una jeringa y se pasó por una columna de níquel de 1 ml Bio-ScaleTM
Mini
ProfinityTM
IMAC Cartridges (BIO-RAD), a una velocidad de flujo de 2 ml por minuto.
Después de pasar el lisado por la columna se realizó el lavado de esta misma pasando por la
columna 5 ml de buffer nativo de purificación/Buffer de lavado 1 (Native lysis/wash buffer 1,
300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM Imidazole), a una velocidad de flujo de 2 ml por
minuto. Posteriormente se realizó un segundo lavado, pasando por la columna 5 ml de buffer
nativo de lavado 2 (Native wash buffer 2, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 10 mM Imidazole),
a una velocidad de flujo de 2 ml por minuto. Por último, se llevó a cabo la elución de las
proteínas unidas a la columna, pasando a través de ésta 10 ml de buffer nativo de elución
(Native elution buffer, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 250 mM Imidazole), a una velocidad
de flujo de 2 ml por minuto, haciendo alícuotas de 1 ml en tubos de 1.5 ml y guardándose
éstas en congelación. Se llevó a cabo el análisis de la purificación mediante SDS-PAGE al
32
12%; el gel de poliacrilamida se preparó de igual manera como se mencionó anteriormente. Se
tomaron 50 l de cada una de las fracciones obtenidas en la purificación, se colocaron en
tubos de 1.5 ml, etiquetados con el número de alícuota, y se mezclaron con 50 l de buffer de
carga 2X; se hirvieron durante 5 minutos a 100°C y se cargaron 20 l de las muestras en el
gel. La electroforesis, la tinción y el desteñido se llevaron a cabo de la misma manera como se
mostró anteriormente.
4.15. Inducción masiva y purificación de proteínas recombinantes insolubles
Se preparó el pre inóculo de las bacterias transformadas con los plásmidos para la expresión
de las proteínas insolubles Citoqueratina 19, Cyfra 21.1 y YKL-40, inoculando 10 ml de
medio de cultivo LB con antibiótico (100 g/ml de ampicilina) con 500 l de las alícuotas de
cada una de las bacterias que se encontraban almacenadas en el congelador, y se dejó crecer
durante toda la noche a 37°C en agitación a 200 rpm. Al día siguiente se inocularon 200 ml de
medio de cultivo con antibiótico agregando los 10 ml del pre inóculo y se dejó crecer durante
3 horas en agitación a 200 rpm y temperatura de 37°C; pasadas las tres horas se agregaron 200
l de IPTG 1 M quedando éste a una concentración de 1 mM y de nuevo se colocó en
incubación durante 4 horas más. Se empastillaron los 200 ml de medio de cultivo inducido en
tubos Falcon de 50 ml, mediante centrifugación a 5000 rpm por 20 minutos, se eliminó el
sobrenadante y se agregaron 8 ml de buffer desnaturalizante de purificación/Buffer de lavado
1 (Denaturing lysis/wash buffer 1, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM Imidazole, 6 M
Urea), se mezcló bien la pastilla utilizando una pipeta y se utilizó el equipo sonicador
Ultrasonic liquid processor XL-2000 SERIES (MISIONIX) para romper las células, dando 5
pulsos de 1 minuto, con 1 minuto de descanso entre cada pulso de sonicación, todo esto con el
tubo sumergido en hielo para evitar el calentamiento de la muestra. Después de sonicar la
muestra se tomaron alícuotas de 1 ml, se depositaron en microtubos de 1.5 ml y se
centrifugaron a 13,000 rpm a temperatura ambiente durante 20 minutos, después se tomó el
sobrenadante de cada tubo, se depositó dentro de una jeringa de 10 ml (BD Plastipac) y se
pasó a través de un filtro CORNING 25mm Syringe Filter 0.20 Micron (Corning
Incorporated), se recuperó el filtrado, se depositó nuevamente en una jeringa y se pasó por una
columna de níquel de 1 ml Bio-ScaleTM
Mini ProfinityTM
IMAC Cartridges (BIO-RAD) a una
33
velocidad de flujo de 2 ml por minuto. Después de pasar el lisado por la columna se realizó el
lavado de la misma pasando 5 ml de buffer desnaturalizante de purificación/Buffer de lavado 1
(Denaturing lysis/wash buffer 1, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM Imidazole, 6 M Urea)
a una velocidad de flujo de 2 ml por minuto. Posteriormente se realizó un segundo lavado
pasando por la columna 5 ml de buffer desnaturalizante de lavado 2 (Denaturing wash buffer
2, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 10 mM Imidazole, 6 M Urea) a una velocidad de flujo de 2
ml por minuto. Por último se llevó a cabo la elución de las proteínas unidas a la columna,
pasando a través de ésta 10 ml de buffer nativo de elución (Native elution buffer, 300 mM
KCl, 50 mM KH2PO4, 250 mM Imidazole) a una velocidad de flujo de 2 ml por minuto,
haciendo alícuotas de 1 ml en tubos de 1.5 ml y guardándose éstas en congelación. Se llevó a
cabo el análisis de la purificación mediante SDS-PAGE al 12%, el gel de poliacrilamida se
preparó de igual manera como se mencionó anteriormente. Se tomaron 50 l de cada una de
las fracciones obtenidas en la purificación, se colocaron en tubos de 1.5 ml, etiquetados con el
número de alícuota, y se mezclaron con 50 l de buffer de carga 2X, se hirvieron durante 5
minutos a 100°C y se cargaron 20 l de las muestras en el gel. La electroforesis, la tinción y el
desteñido se llevaron a cabo de la misma manera como se mostró anteriormente.
4.16. Electroelución de las proteínas recombinantes y electroforesis en 2-D
Se prepararon geles de poliacrilamida al 12% utilizando un peine con espacio para marcador y
un solo espacio para la carga de la muestra (geles preparativos). Se mezclaron 100 l de las
alícuotas con alta concentración de proteínas con 100 l de buffer de carga 2X, se calentaron
las muestras a 100°C durante 5 minutos y se cargó el total en un gel preparativo; se prepararon
tantos geles preparativos como alcanzaron las muestras. La electroforesis, tinción y desteñido
se llevaron a cabo de la misma manera como se explicó anteriormente. Una vez desteñidos los
geles preparativos se cortó la banda de proteína teñida en cada uno de los geles con ayuda de
un bisturí; se cortaron los fragmentos de acrilamida en pedazos muy pequeños y se procedió al
armado del sistema de electroelución (Model 422 Electro-Eluter Electroeluter Cell, BIO-
RAD). Se colocó el “fritz” dentro del tubo de cristal y se colocó el tapón de membrana en el
adaptador de silicón. Posteriormente se agregó buffer de corrida para SDS-PAGE en el
adaptador con la membrana, cuidando no formar burbujas, y se insertó el tubo de cristal que
34
contenía el fritz dentro del adaptador hasta llegar al segundo tope. Se agregó buffer de corrida
hasta llenar la mitad del tubo de cristal y se agregaron los pedazos pequeños de acrilamida
previamente cortados, hasta llenar el tubo, después se colocó el tubo en el módulo del
electrodo y se taparon los otros orificios del módulo con los tapones de silicón. Posteriormente
se agregó buffer de corrida SDS-PAGE hasta llenar la mitad de la cámara y se posicionó
dentro de ésta el módulo del electrodo, enseguida se llenó con el mismo buffer la parte
superior del módulo, lentamente, cuidando que los fragmentos de gel de poliacrilamida no
salieran del tubo de cristal. Se programó la fuente de poder PowerPacTM
HC (BIO-RAD) a 250
Volts y 0.01 Amperes y se llevó a cabo la electroelución durante 4 horas. Pasadas las 4 horas
se retiró el tubo de cristal del módulo del electrodo y con ayuda de una pipeta de 1 ml se retiró
el resto de buffer que quedó dentro del tubo, se retiró el adaptador de silicón y con ayuda de
una pipeta de 200 l se tomó el líquido de color azul que se encontraba dentro de éste,
cuidando de no tocar la membrana; se depositó la totalidad del líquido en un tubo de 1.5 ml y
se agregaron nuevamente 200 l de buffer de corrida dentro del adaptador de silicón para
recuperar la proteína restante; se recuperó nuevamente el líquido y se juntó en el tubo de 1.5
ml. Posteriormente se hicieron alícuotas de 200 l, se agregaron 5 volúmenes de acetona (1
ml) y se colocaron las alícuotas a -20°C durante toda la noche. Al día siguiente se
centrifugaron las muestras a 13,000 rpm durante 20 minutos y se retiró el sobrenadante; se
hicieron dos lavados agregando a la pastilla 1 ml de etanol grado molecular (SIGMA) y se
centrifugó a 13,000 rpm después de cada lavado, se retiró con una pipeta de 200 l el etanol
del tubo y se dejó secar la pastilla con el tubo destapado por alrededor de 1 hora. Una vez seca
la pastilla se procedió a la preparación de la muestra para la electroforesis en 2-D; se
agregaron a la pastilla 113l de solución de rehidratación DeStreakTM
Rehydration Solution
(GE Healthcare), 6 l de DTT 1 M (GE Healthcare) y 1 l de anfolitos IPG Buffer, pH 3-10
(GE Healthcare) y se mezcló subiendo y bajando el líquido usando una pipeta hasta disolver
por completo la pastilla. Se tomó el volumen completo de la mezcla (120 l) y se depositó en
una de las canaletas de una bandeja de incubación Mini-Incubation Trays (BIO-RAD), se
colocó una tira para electroforesis en 2-D ReadyStripTM
IPG Strips 7 cm, pH 4-7 (BIO-RAD)
sobre la mezcla, cuidando que se impregnara completamente, y se dejó en incubación toda la
noche a 4°C. Al día siguiente se retiró la tira de la canaleta y se colocó en la canaleta del
equipo para electroforesis en 2-D Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare), cuidando que quedara
35
hacia arriba la parte rehidratada de la tira. En cada uno de los extremos de la tira se colocó
papel para electrodo Paper Wicks IPGphorTM
(GE Healthcare), previamente humedecido en
agua destilada, se colocaron encima del papel los electrodos y se fijaron con las pinzas que
tienen los electrodos a los costados. Posteriormente se agregó aceite mineral (BIO-RAD) en el
carril donde se encontraba la tira, hasta cubrirla completamente, así como en los carriles
aledaños a la tira, y se llevó a cabo la electroforesis utilizando las siguientes condiciones:
Voltaje Tiempo
500 V 0:30 Hr
1000 V 0:30 Hr
5000 V 1:40 Hr
Pasado el tiempo de corrida se retiró la tira, se colocó en una de las canaletas de una bandeja
de incubación y se agregó 1 ml de buffer de equilibrio (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M Urea,
30% glicerol, 2% SDS, 0.002% azul de bromofenol), el cual contenía 10 mg de DTT,
dejándose en agitación a 50 rpm durante 15 minutos. Pasado el tiempo de incubación se retiró
el buffer de equilibrio con ayuda de una pipeta, se agregó nuevamente 1 ml de buffer de
equilibrio, el cual contenía 25 mg de iodoacetamida, y se dejó nuevamente 15 minutos en
agitación. Se retiró completamente el buffer de equilibrio y se realizó un gel preparativo al
12% como se mencionó con anterioridad; se colocó el gel en la cámara de electroforesis y se
retiró el peine preparativo. Se agregaron 20 l de buffer de equilibrio dentro del pozo para
muestra, se colocó la tira ya equilibrada dentro del mismo pozo, cuidando que la región de la
tira que indica pH 4 quedara a un lado del marcador, se agregaron 3 l de marcador de peso
molecular Precision Plus Protein™ All Blue Standards (BIO-RAD) y se llevó a cabo la
electroforesis a 80 Volts durante 20 minutos, cambiando posteriormente el voltaje a 180 Volts
durante 50 minutos. El teñido y desteñido del gel se realizó como se mencionó anteriormente.
Después de desteñir los geles se llevó a cabo el corte de la proteína recombinante y se realizó
una segunda electro elución utilizando una membrana nueva.
36
4.17. Ensayo de detección de autoanticuerpos por Western Blot
Después de la segunda electroelución se recuperó alrededor de 1 ml de proteína pura, se
tomaron 100 l de proteína electroeluida y se mezclaron con 100 l de buffer de carga 2X, se
prepararon dos geles de poliacrilamida al 12% y se cargaron 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20
y 25 l de la mezcla en cada uno de los geles. Se tiñó un gel con azul de Coomassie y el otro
se utilizó para transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y posteriormente para
análisis por Western blot. Después del revelado del Western blot se analizó la membrana y se
tomó el volumen que se consideró el más óptimo para la prueba de detección de
autoanticuerpos, que en nuestro caso fue de 7.5 l (2 g) de la mezcla de proteína y buffer de
carga. Se mezclaron 200 l de proteínas con 200 l de buffer de carga 2X, se prepararon 4
geles preparativos y se cargaron 75 l (20 g) de proteínas mezcladas con buffer de carga y se
cargaron 3 l de marcador de peso molecular; se corrieron los geles y se transfirieron las
proteínas a una membrana de nitrocelulosa, como se mencionó con anterioridad. Después de la
electroelución se tiñeron las membranas con rojo de Ponceau y una vez teñida la banda de
proteína se enjuagó con agua destilada para quitar el exceso de colorante, se cortaron tiras de
alrededor de 4 mm de ancho (entre 30 y 32 tiras por membrana transferida) y se colocaron en
una bandeja de incubación Mini-Incubation Trays (BIO-RAD). Se lavaron las tiras agregando
1 ml de buffer de transferencia nuevo para eliminar por completo el colorante rojo de Ponceau
y se dio un segundo lavado con agua destilada estéril para eliminar el buffer de transferencia.
Se bloquearon las tiras agregando 1 ml de buffer TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 5% y se
dejaron incubando a temperatura ambiente durante 3 horas en agitación a 50 rpm. Pasado el
tiempo de bloqueo se lavaron las tiras dos veces con 1 ml de buffer TBS 1X-Tween 20 al
0.1% durante 10 minutos en agitación a 50 rpm. Se diluyeron los sueros de los pacientes con
cáncer de pulmón, EPOC y fumadores 1:50, mezclando 10 l de suero en 490 l de buffer
TBS 1X-Tween 20 al 0.05%, leche al 2.5% y se incubaron durante 6 horas a temperatura
ambiente en agitación a 50 rpm, después se guardaron las bandejas de incubación en
refrigeración a 4 °C durante toda la noche. Al día siguiente se sacaron las bandejas del
refrigerador y se pusieron en agitación a 50 rpm durante 1 hora, posteriormente se hicieron dos
lavados de 20 minutos agregando 1 ml de buffer TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, se retiró el buffer
de lavado y se agregó 1 ml del anticuerpo Goat Anti-Human IgG (H+L)-HRP Conjugate
37
(BIO-RAD) diluido 1:3000 en el buffer TBS 1X-Tween 20 al 0.05%, leche al 2.5%,
incubando tres horas en agitación a 50 rpm. Después de la incubación se hicieron dos lavados
de 20 minutos con buffer TBS 1X-Tween 20 al 0.1% y uno más de 10 minutos con TBS 1X.
Finalmente, se llevó a cabo el revelado agregando 1 ml del sustrato 4CN (4-chloro-1-naphthol,
BIO-RAD) y se dejó hasta que se observó la reacción (alrededor de 10 minutos). Una vez que
se observaron las bandas se retiró la solución de revelado, se enjuagó la membrana con agua
destilada, se colocaron las tiras por grupo al lado del marcador de peso molecular sobre una
base con fondo negro, y se tomó una fotografía para su posterior análisis.
38
5. RESULTADOS
5.1.Amplificación de los genes que codifican para Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40,
CRP, CA125 y CEA.
Se llevó a cabo la amplificación de los genes que codifican para Citoqueratina 19, Cyfra 21.1,
YKL-40, CRP, CA125 y CEA utilizando como molde el cDNA de distintas líneas celulares.
Para Citoqueratina 19 y Cyfra 21.1 se utilizó como molde el cDNA proveniente de la línea
celular de adenocarcinoma A549, ya que ha sido demostrado que esta línea celular expresa
grandes cantidades del RNA mensajero que codifica para Citoqueratina 19 (Ueda et al. 1999),
lográndose la amplificación de las secuencias de interés, como se muestra en la Fig. 1.
Figura 1. Amplificación de los genes que codifican para Citoqueratrina 19 (A) y Cyfra 21.1 (B) utilizando los
iniciadores para Cyt-19 y Cyfra 21.1 y cDNA de la línea celular de adenocarcinoma A549 como templado. El
tamaño de las secuencias amplificadas (1200 pb para Citoqueratina 19 y 450 pb para Cyfra 21.1) corresponde con
los tamaños esperados. Carril 1: MPM 1KB Plus DNA Ladder; carril 2: control negativo; carril 3: amplificación
de Citoqueratina 19 (A) and Cyfra 21.1 (B).
Para CA125 se utilizó como templado el cDNA de las líneas celulares de cáncer de pulmón
A549, de cáncer cervicouterino HeLa y de cáncer de hígado HepG-2, lográndose
amplificación de la secuencia únicamente en la línea celular HeLa (Fig. 2). Se observa que el
amplificado está en el tamaño esperado que es de 2700 pb.
39
Figura 2. Amplificación del gen que codifica para CA-125 utilizando cDNA de las líneas celulares A549, HeLa
y HepG-2. Se logró el amplificado únicamente con el cDNA de la línea HeLa, en el tamaño esperado que es 2700
pb. Carril 1: MPM 1KB Plus DNA Ladder; carril 2: PCR con cDNA de la línea celular A549; carril 3: PCR con
cDNA de la línea celular HeLa; carril 4: PCR con cDNA de la línea celular HepG-2.
Para YKL-40 se intentó la amplificación utilizando el cDNA de las diferentes líneas celulares
mencionadas con anterioridad, sin embargo, no se obtuvieron resultados positivos. Se llevó a
cabo la revisión bibliográfica para buscar la forma de amplificar la secuencia y se encontró
que YKL-40 es expresada en macrófagos y neutrófilos activados en personas bajo condiciones
de inflamación (Kazakova 2010). Por consiguiente, se realizó una toma de muestra de sangre
de una persona fumadora, se realizó el aislamiento de células sanguíneas, utilizando Ficoll-
paque (GE Healthcare Life Sciences) y se llevó a cabo el aislamiento de RNA y síntesis de
cDNA, de igual manera como se realizó para las líneas celulares. En la Fig. 3 se observa la
amplificación de la secuencia que codifica para YKL-40, utilizando como molde tres
diferentes concentraciones de cDNA de leucocitos; el tamaño del amplificado concuerda con
el tamaño esperado de 1150 pb.
Figura 3. Amplificación del gen que codifica para YKL-40, utilizando como templado cDNA de leucocitos de
una persona con hábito tabáquico. El tamaño de la secuencia amplificada (1150 pb) corresponde con el tamaño
esperado. Carril 1: MPM 1KB Plus DNA Ladder; Carriles 2-4: amplificación de YKL-40.
40
De igual forma, para la amplificación de la secuencia que codifica para CEA se utilizó el
cDNA de las diferentes líneas celulares, logrando la amplificación con la línea celular de
adenocarcinoma de pulmón A549. En la Fig. 4A se observa el producto amplificado en el peso
esperado (2030 pb); también se observa la amplificación de otros productos de menor tamaño,
por lo que se optó por purificar el fragmento de interés a partir del gel (Fig. 4 B).
Figura 4. (A) Amplificación del gen que codifica para CEA utilizando cDNA de la línea celular de
adenocarcinoma de pulmón A549; se observa la amplificación de otros productos de menor tamaño, además del
amplificado de 2030 pb, el cual corresponde con el tamaño esperado. (B) Purificación del fragmento de interés.
Carril 1: MPM 1KB Plus DNA Ladder; carril 2: amplificación de CEA.
En el caso de la proteína C reactiva (CRP), no se observó amplificación con ninguno de los 4
cDNAs utilizados. En la bibliografía se señala que para inducir la expresión del RNA
mensajero que codifica para CRP, es necesario utilizar un medio condicionado de monocitos o
agregar al medio diferentes concentraciones de IL-1 e IL-1 (Smith et al. 1992). Al no contar
con los reactivos ni las condiciones necesarias, se decidió no continuar con la amplificación de
este gen.
5.2.Clonación de las secuencias amplificadas y análisis de las transformantes por PCR
Se llevó a cabo la clonación de las secuencias amplificadas en el vector de expresión
Champion™ pET101 Directional TOPO® Expression Kit, con células de E. coli quimio
competentes BL21 Star™ (DE3) One Shot® (Invitrogen; Anexo 9). Se logró la clonación de
las secuencias que codifican para Citoqueratina 19, Cyfra 21.1 y YKL-40. Se observó el
crecimiento de 7 colonias transformadas con el gen de Citoqueratina 19 y Cyfra 21.1 y 14
41
colonias transformadas con el gen YKL-40 en el agar LB con ampicilina; de aquí, se llevó a
cabo la extracción de los plásmidos (Fig. 5) y se realizó la amplificación de los genes clonados
por PCR. En el caso de Cyfra 21.1 se observó la amplificación en los 7 plásmidos extraídos
(Fig. 6A) mientras que en el caso de Citoqueratina 19 y YKL-40 solo se observó amplificado
en uno solo de los plásmidos analizados (Fig. 6B y 6C).
Figura 5. Obtención de plásmidos a partir de las colonias transformadas con el vector pET101, llevando los
genes clonados que codifican para Cyfra 21.1, Citoqueratina 19 (A) y YKL-40 (B). MPM = Marcador de peso
molecular 1KB Plus DNA Ladder.
Figura 6. Rastreo por PCR de los genes que codifican para Cyfra 21.1 (A), Citoqueratina 19 (B) y YKL-40 (C),
clonados en el vector de expresión pET101, después de la extracción plasmídica por miniprep. Se logró la
amplificación de la secuencia que codifica para Cyfra 21.1 en todos los plásmidos obtenidos, mientras que sólo se
logró la amplificación de las secuencias que codifican para Citoqueratina 19 y YKL-40 en uno de los plásmidos
obtenidos. Carril 1: MPM 1KB Plus DNA Ladder.
42
ref|NM_002276.4| Homo sapiens keratin 19 (KRT19), mRNA
Length=1490
Score = 765 bits (414), Expect = 0.0
Identities = 445/458 (97%), Gaps = 10/458 (2%)
Strand=Plus/Minus
Query 134 GAGGACCTTGGAGGCAGACAAATTGTTGTAGTGATCTTCCTGTCCCTCGAGCAGGCTGCG 193
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1342 GAGGACCTTGGAGGCAGACAAATTGTTGTAGTGATCTTCCTGTCCCTCGAGCAGGCTGCG 1283
Query 194 GTAGGTGGCAATCTCCTGCTCCAGCCGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTACTCCTG 253
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1282 GTAGGTGGCAATCTCCTGCTCCAGCCGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTACTCCTG 1223
Query 254 ATTCTGCCGCTCACTATCAGCTCGCACATCGCCCAGCTGGGCTTCAATACCGCTGATCAG 313
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1222 ATTCTGCCGCTCACTATCAGCTCGCACATCGCCCAGCTGGGCTTCAATACCGCTGATCAG 1163
Query 314 CGCCTGGATATGCGCCAGCTGGGCTCCAAAGCGCGCCTCCGTTTCTGCCAGTGTGTCTTC 373
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1162 CGCCTGGATATGCGCCAGCTGGGCTCCAAAGCGCGCCTCCGTTTCTGCCAGTGTGTCTTC 1103
Query 374 CAAGGCAGCTTTCATGCTCAGCTGTGACTGCAGCTCAATCTCAAGACCCTGAAGGGTGCG 433
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1102 CAAGGCAGCTTTCATGCTCAGCTGTGACTGCAGCTCAATCTCAAGACCCTGAAGGGTGCG 1043
Query 434 CCGCAGGTCAGTAACCTCGGACCTGCTCATCTGGAGCTGCTCCGTGTGGCCCCGTGTGGC 493
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1042 CCGCAGGTCAGTAACCTCGGACCTGCTCATCTGGAGCTGCTCCGTGTGGCC--------- 992
Query 494 CAGCGACCTCCCGGTTCAATTCTTCAGGCCGGCTGATGAACCAGGCTTCAGCATCCTTCC 553
|||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 991 -AGCGACCTCCCGGTTCAATTCTTCAGTCCGGCTGGTGAACCAGGCTTCAGCATCCTTCC 933
Query 554 GGCTCTGCTCGGCCATGACCTCATATTGGCTTCGCATG 591
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 932 GGTTCTGCTCGGCCATGACCTCATATTGGCTTCGCATG 895
Una vez amplificadas las secuencias clonadas, se realizó la purificación de cada una de éstas y
se mandaron a secuenciar al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad
(LANGEBIO, CINVESTAV) para determinar tanto su identidad como su integridad. Las
secuencias obtenidas se cotejaron en la base de datos del GenBank para asegurar que la
secuencia amplificada es la esperada. En la Fig. 7 se observa el resultado al cotejar la
secuencia de Citoqueratina 19 recibida de LANGEBIO con la base de datos del GenBank.
Figura 7. Cotejo de la secuencia de Citoqueratina 19 obtenida mediante secuenciación, con la secuencia de la
base de datos del GenBank. Se observa que la secuencia obtenida por secuenciación tiene un porcentaje de
identidad del 97% con la secuencia de la base de datos, por lo cual se puede deducir que nuestra secuencia
clonada corresponde a Citoqueratina 19.
En el caso de YKL-40, la cantidad de muestra enviada no fue suficiente para llevar a cabo la
secuenciación, por lo tanto se decidió buscar otro método rápido para determinar que la
secuencia amplificada corresponde con la secuencia esperada; se tomó la decisión de llevar a
43
cabo una digestión con la enzima de restricción EcoRI, ya que esta enzima realiza un solo
corte en la secuencia correspondiente a YKL-40, dando dos fragmentos, uno de 850 pb y otro
de 300 pb. En la Fig. 8 se observa la digestión parcial de la secuencia amplificada, la cual da
los dos fragmentos en los pesos moleculares estimados.
Figura 8. Digestión parcial de la secuencia amplificada que codifica para YKL-40, utilizando la enzima de
restricción EcoRI. Se observa la digestión parcial de la secuencia original de 1150 pb, obteniéndose dos
fragmentos con tamaños de 850 pb y 300 pb, lo cual concuerda con los tamaños esperados. Carril 1: MPM 1KB
plus DNA Ladder; carril 2: YKL-40 digerido con EcoRI.
En el caso de las secuencias que codifican para CEA y CA 125, no se logró la clonación ni la
expresión de estos genes, por lo que quedan pendientes estos ensayos para futuras
investigaciones.
5.3.Transformación de las células E. coli BL21 Star™ (DE3) One Shot® e inducción piloto
Una vez que se determinó con certeza que los insertos clonados pertenecían a los genes que
codifican para Citoqueratina 19, Cyfra 21.1 y YKL-40, se procedió a la transformación de las
bacterias E. coli BL21 Star™(DE3) One Shot® y posteriormente a la expresión de las
proteínas recombinantes y el análisis por SDS-PAGE. En la Fig. 9 se muestra la inducción de
las proteínas Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19, observándose la sobreexpresión de las proteínas
recombinantes (flecha roja) con respecto al control negativo (CN). Las proteínas expresadas
presentan un tamaño de 47 kDa para Citoqueratina 19 y 21 kDa para Cyfra 21.1, lo cual
concuerda con los tamaños calculados.
44
Figura 9. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 por SDS-PAGE.
Las flechas muestran la posición de las proteínas recombinantes, las cuales tiene un peso de 21 kDa para Cyfra
21.1 y 47 kDa para Citoqueratina 19, que concuerdan con los pesos calculados. Carril 1: MPM Precision Plus
Protein All Blue; carriles 2 y 4: control negativo (Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 sin inductor); carriles 3 y 5:
Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 con inductor.
En el caso de YKL-40 no se observó la expresión de la proteína recombinante, por lo que se
llevó a cabo el análisis de la secuencia clonada utilizando el iniciador Forward específico para
el vector que viene con el kit de clonación y el iniciador Reverse que se utilizó para la
amplificación de la secuencia clonada, esto con el fin de asegurar que el inserto se encontrara
orientado correctamente.
Figura 10. Amplificación del gen que codifica para YKL-40 clonado en el vector de expresión pET101
utilizando el primer Forward T7 proporcionado por el Kit y el primer Reverse utilizado para la amplificación de
la secuencia, para comprobar que el fragmento clonado se encuentre orientado correctamente.
En la Fig. 10 se observa la secuencia amplificada, la cual se encuentra clonada en el vector
pET101 y que corresponde a YKL-40; con este ensayo se corrobora que la secuencia se
45
encuentra orientada correctamente. Debido a que no obtuvo éxito con la expresión de la
proteína se tomó la decisión de clonar nuevamente la secuencia pero utilizando esta vez el
vector de expresión Champion™ pET102 Directional TOPO® Expression Kit con células E.
coli quimio competentes BL21 Star™ (DE3) One Shot® (Invitrogen) (Anexo 10). Una vez
clonada la secuencia se realizó todo el análisis, como se mencionó anteriormente,
obteniéndose dos cepas que expresan la proteína recombinante YKL-40 (Fig. 11).
Figura 11. Análisis de la expresión de la proteína recombinante YKL-40 por SDS-PAGE. Las flechas muestran
la posición de la proteína recombinante, la cual tiene un peso de 58 kDa que concuerda con el peso calculado.
Carril 1: MPM Precision Plus Protein All Blue; carril 2: control negativo (YKL-40 2 sin inductor); carriles 3 y 4:
YKL-40 1 y 2 con inductor.
De manera paralela se realizó la inducción piloto de las proteínas recombinantes TPI-1
(Triosafosfato isomerasa 1), PRDX.2 (Peroxirredoxina 2) y PPIA (Ciclofilina A), cuyos
plásmidos fueron gentilmente donados por el Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez (CIATEJ).
Previamente ha sido demostrado que estas proteínas son inmunogénicas en pacientes con
cáncer de mama y es por ello el interés de estudiarlas en muestras de suero de pacientes con
cáncer de pulmón. El resultado de la inducción se muestra en la Fig. 12, en la cual se observa
la expresión de las tres proteínas recombinantes con los pesos esperados de 31 kDa para TPI-
1, 28 kDa para PRDX-2 y 26 kDa para PPIA.
46
Figura 12. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes TPI-1, PRDX-2 y PPIA por SDS-PAGE. Las
flechas muestran la posición de las proteínas recombinantes, las cuales tiene un peso de 31 kDa para TPI-1, 28
kDa para PRDX-2 y 26 kDa para PPIA, que concuerdan con los pesos esperados. Carril 1: MPM Precision Plus
Protein All Blue; carril 2: control negativo (TPI-1 sin inductor); carriles 3, 4 y 5: TPI-1, PRDX-2 y PPIA con
inductor.
Posteriormente se llevó a cabo el análisis de las proteínas recombinantes por Western blot,
utilizando un anticuerpo Anti-His, ya que las proteínas recombinantes cuentan con una
etiqueta de 6 histidinas para facilitar su purificación. En la Fig. 13 se muestran, tanto el gel de
la inducción de las proteínas recombinantes Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19, como la membrana
de nitrocelulosa, en la cual se observa el reconocimiento de las proteínas recombinantes con el
anticuerpo Anti-His.
Figura 13. Análisis de la expresión de las proteínas recombinantes Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 por SDS-PAGE
(A) y Western blot (B). Las flechas muestran la posición de las proteínas recombinantes las cuales tiene un peso
de 21 kDa para Cyfra 21.1 y 48 kDa para Citoqueratina 19. Se observa la reacción de los anticuerpos Anti-His
(B) contra las proteínas recombinantes. Carril 1: MPM Precision Plus Protein All Blue; carriles 2 y 4: control
negativo (Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 sin inductor); carriles 3 y 5: Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19 con inductor.
47
Una vez verificada la expresión de las proteínas recombinantes, se llevó a cabo la inducción
masiva de las mismas para su posterior purificación.
5.4.Inducción masiva y purificación de las proteínas recombinantes TPI-1, PRDX-2, PPIA,
YKL-40, Cyfra 21.1 y Citoqueratina 19
Se llevó a cabo la producción de proteínas a gran escala induciendo 200 ml de cultivo
bacteriano, y posteriormente se procedió a la purificación de las proteínas recombinantes,
utilizando columnas de níquel quelado, ya que las proteínas recombinantes presentan una
etiqueta de 6 histidinas, la cual sirve para purificarlas mediante este tipo de columna. Se
purificaron las proteínas TPI.1, PRDX-2 y PPIA utilizando el método de purificación para
proteínas solubles y Citoqueratina 19, Cyfra 21.1 y YKL-40 utilizando el método de
purificación para proteínas insolubles; ambos métodos son proporcionados por el fabricante.
En la Fig. 14 se muestra el resultado de la purificación de la proteína recombinante PPIA; se
observa la separación de las proteínas por SDS-PAGE (Fig. 14A) del extracto bacteriano
crudo (EBC), el cual está conformado por el lisado antes de ser pasado por la columna, el
extracto bacteriano purificado, el cual es el lisado recuperado después de la interacción de éste
con la columna, los lavados 1 y 2 (L1, L2) y por último las fracciones eluidas, donde se
encuentran las proteínas purificadas (Fig. 14B).
Figura 14. Análisis de las proteínas durante el proceso de purificación (A) y fracciones obtenidas después de la
purificación (B). Se realizó la electroforesis de las proteínas totales antes de ser pasadas por la columna (EBC) y
después de ser pasadas por las columnas (EBP), así como también los lavados 1 y 2 (A), se observa en el carril 2
la proteína recombinante PPIA junto con proteínas contaminantes y posteriormente se observa en el carril 3 que
la proteína ha quedado unida a la membrana al no apreciarse en el gel. Por último, se llevó a cabo el análisis de
las fracciones obtenidas después de la purificación, obteniéndose 2 fracciones con proteínas recombinantes
purificadas (B). MPM: Marcador de Peso molecular Broad Range; EBC: Extracto bacteriano crudo; EBP:
Extracto bacteriano purificado; L1 y L2: Lavados 1 y 2; F1 a F3: Fracciones eluidas 1 a 3.
48
En la Fig. 14A se observa la proteína recombinante PPIA, en el carril EBC, de un peso de 26
kDa y se observa también la presencia de otras proteínas bacterianas contaminantes; después
de pasar el lisado por la columna se observa que la proteína recombinante ya no se encuentra
en este extracto bacteriano purificado, esto es porque la proteína recombinante ha quedado
unida a la columna, a diferencia de las proteínas contaminantes que se quedan en el lisado;
después de realizar los lavados a la columna, se observa que la proteína queda unida
fuertemente a ésta, ya que la proteína no se desprende con los lavados. Posteriormente se llevó
a cabo la elución de las proteínas recombinantes unidas a la columna de níquel; en la Fig. 14B
se muestran las tres primeras fracciones, de diez que fueron tomadas, observándose proteínas
sólo en las 2 primeras fracciones; no se observaron proteínas contaminantes, sin embargo, para
asegurar la pureza de las proteínas se llevó a cabo la electroforesis en 2-D.
5.5.Electroelución de las proteínas recombinantes y electroforesis en 2-D
Después de llevar a cabo la purificación de cada una de las proteínas recombinantes se llevó a
cabo la electroelución de las mismas. Se realizó la electroforesis de las proteínas en geles
preparativos y se cortó la proteína de interés, con la finalidad de obtener una mayor
concentración de la proteína recombinante y evitar las proteínas contaminantes. En la Fig. 15
se muestra un gel preparativo SDS-PAGE, en el cual se llevó a cabo la separación de la
proteína recombinante Citoqueratina 19, después de la purificación con las columnas de
níquel; en el gel se observa una banda de mayor intensidad, la cual corresponde a la proteína
recombinante, y bandas menos intensas en la parte superior, la cuales son indicativas de
contaminación con proteínas bacterianas.
Figura 15. SDS-PAGE preparativo de la proteína recombinante Citoqueratina 19 purificada por columna de
níquel. Se observa en el gel la proteína recombinante en mayor concentración y también se observan proteínas
contaminantes por arriba y debajo de la proteína recombinante, lo cual indica que el proceso de purificación no es
100% efectivo.
49
Una vez que se llevó a cabo la electroforesis de las fracciones obtenidas en la purificación, se
procedió a cortar la banda con mayor concentración de proteína y a electroeluirla,
recuperándose en 1 ml de buffer de electroelución. Previo a la electroforesis en 2-D, se llevó a
cabo el cálculo del punto isoeléctrico de cada una de las proteínas, usando la base de datos
ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/), obteniéndose los siguientes puntos isoeléctricos
de cada una de las proteínas recombinantes:
Tabla 4.- Puntos isoeléctricos de las proteínas recombinantes determinados utilizando la base de datos ExPASy.
Proteína pI
Citoqueratina 19 5.05
Cyfra 21.1 4.81
YKL-40 8.69
TPI-1 6.45
PRDX-2 5.66
PPIA 7.68
Después de realizar el cálculo de pI, se llevó a cabo la electroforesis en 2-D, utilizando 200 l
de las proteínas electroeluidas por cada una de las tiras utilizadas (5 tiras por proteína
recombinante). En la Fig. 16A se muestra un gel posterior a la electroforesis en 2-D de la
proteína recombinante PRDX-2, en el cual se observa la proteína de interés en mayor
concentración (círculo negro), aunque también se observa un poco de contaminación a los
costados de la proteína más concentrada (cuadros en color rojo); por lo tanto, se llevó a cabo
un ensayo de Western blot, utilizando un anticuerpo Anti-His, para determinar con precisión si
esta proteína con mayor concentración es la proteína recombinante PRDX-2. En la Fig. 16B se
muestra el Western Blot, en el cual se observa la reacción de los anticuerpos contra la proteína
que se encuentra en mayor concentración, con lo cual podemos determinar que ésta es la
proteína recombinante, y las proteínas que se encuentran a los costados son contaminación.
50
Figura 16. (A) Electroforesis en 2-D de la proteína recombinante PRDX-2 después de la electroelución. Se
observa la proteína recombinante en mayor concentración (círculo negro) y también se observa un poco de
contaminación en el mismo peso a ambos costados de la proteína más concentrada (cuadros rojos). (B) Western
blot de la proteína separada por electroforesis en 2-D para confirmar que la proteína con mayor concentración es
la proteína recombinante PRDX-2. (C) Gel de electroforesis en 2-D después del corte de la proteína recombinante
para una segunda electroelución.
Una vez determinado que la proteína recombinante de interés es la más concentrada, se
procedió a cortar ésta con la ayuda de un bisturí, cortando únicamente la proteína del centro
para evitar cortar proteínas contaminantes (Fig. 16C), y se llevó a cabo nuevamente la
electroelución de la proteína recombinante, para posteriormente realizar la prueba de detección
de autoanticuerpos.
5.6.Ensayo de detección de autoanticuerpos por Western blot
Una vez que se tuvieron las proteínas recombinantes completamente puras, se llevó a cabo la
detección de autoanticuerpos contra estas proteínas en las muestras de suero de los grupos de
estudio, mediante la técnica de Western blot. Después de la segunda electroelución se llevó a
cabo la electroforesis de las proteínas recombinantes puras, cargando en el gel diferentes
concentraciones que iban desde 2.5 l hasta 20l y se llevó a cabo la detección nuevamente
por Western blot utilizando el anticuerpo Anti-His, para asegurar que las proteínas
recuperadas fueran las proteínas de interés. En la Fig. 17 se muestra la membrana de
51
nitrocelulosa después del Western blot, en la cual se observa el reconocimiento por los
anticuerpos Anti-His de la proteína recombinante. Para los ensayos posteriores con todas las
proteínas recombinantes se tomó como base la concentración de la proteína del tercer carril
(flecha roja).
Figura 17. Western blot de la proteína recombinante PRDX-2 después de la segunda electroelución. Se
mezclaron 100 l de proteína recombinante con 100 l de buffer de carga y se cargaron volúmenes que iban
desde 2.5 l (Carril 2) hasta 20 l (Carril 9). Se tomó como base para los ensayos posteriores de detección de
autoanticuerpos, la cantidad de 7.5 l (2 g) de la mezcla de buffer de carga y proteína recombinante (flecha
roja).
Una vez determinada la cantidad de proteína a utilizar, se llevó a cabo una prueba de detección
de autoanticuerpos contra las proteínas recombinantes electroeluidas, utilizando sueros de
personas sanas, basados en la premisa de que las personas sanas no producen anticuerpos
contra sus propias proteínas, esto con la finalidad de probar que las proteínas recombinantes
contaban con la pureza necesaria para la realización de las pruebas con los pacientes con
cáncer de pulmón y los controles. En la Fig. 18 se muestra el resultado de la prueba con la
proteína recombinante PRDX-2, utilizando 6 sueros de personas sanas, y como control
positivo el anticuerpo Anti-His (tira 7).
Figura 18. Western blot de la proteína recombinante PRDX-2 utilizando suero de controles no fumadores
(Líneas 1 a 6) y anticuerpo Anti-His (línea 7). No se observó reacción de los sueros con la proteína recombinante,
determinándose así la pureza de la proteína para llevar a cabo el ensayo para la detección de autoanticuerpos.
52
Se llevó a cabo el mismo procedimiento para todas las proteínas recombinantes, resultando
todas las pruebas negativas con los sueros de personas sanas a excepción de YKL-40, en la
cual se observó reacción de anticuerpos contra esta proteína recombinante (Fig. 19), por lo que
se tomó la decisión de no utilizar esta proteína con los sueros seleccionados para el estudio
(cáncer, EPOC y fumadores) ya que hay la posibilidad de que haya proteínas contaminantes en
el mismo peso que la proteína recombinante.
Figura 19. Western blot de la proteína recombinante YKL-40 utilizando 8 sueros de controles no fumadores.
Aún después de todo el proceso de purificación se observa reacción de los sueros con la proteína recombinante,
comprobando así, que puede haber proteínas contaminantes en el mismo peso, por lo cual fue descartado para
llevar a cabo el ensayo para la detección de autoanticuerpos.
Después de realizar los ensayos con las proteínas recombinantes y los sueros de personas
sanas, se llevó a cabo la electroforesis de geles preparativos con cada una de las proteínas
recombinantes, las cuales posteriormente se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.
Una vez trasferidas las proteínas, se cortaron tiras de alrededor de 4 mm de grosor, con la
ayuda de un bisturí, y se llevó a cabo la detección de autoanticuerpos contra las proteínas
recombinantes, utilizando 30 sueros de pacientes con cáncer de pulmón, 30 de pacientes con
EPOC y 30 de fumadores. En las Figs. 20 a 24 se muestran los resultados del Western blot con
las proteínas recombinantes en todos los grupos analizados.
53
Figura 20. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante Citoqueratina 19 en suero de pacientes
con cáncer de pulmón (A), EPOC (B) y fumadores (C) por Western blot. Cada una de las tiras estuvo en contacto
con el suero de un solo sujeto de estudio. Muestras positivas: C.P; 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19,
20, 21, 28, 30, 34. EPOC; 1, 2, 4, 6, 19. Fumadores; 20.
54
Figura 21. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante TPI-1 en suero de pacientes con cáncer
de pulmón (A), EPOC (B) y fumadores (C) por Western blot. Cada una de las tiras estuvo en contacto con el
suero de un solo sujeto de estudio. Muestras positivas: C.P; 18.
Figura 22. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante PRDX-2 en suero de pacientes con
cáncer de pulmón (A), EPOC (B) y fumadores (C) por Western blot. Cada una de las tiras estuvo en contacto con
el suero de un solo sujeto de estudio. Muestras positivas: C.P; 3, 6, 8, 11, 13, 18. EPOC; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11,
20, 21, 23, 24. Fumadores; 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 27.
55
Figura 23. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante PPIA en suero de pacientes con cáncer
de pulmón (A), EPOC (B) y fumadores (C) por Western blot. Cada una de las tiras estuvo en contacto con el
suero de un solo sujeto de estudio. Muestras positivas: C.P; 6, 9, 15. EPOC; 2, 33. Fumadores; 11.
56
Figura 24. Detección de autoanticuerpos contra la proteína recombinante Cyfra 21.1 en suero de pacientes con
cáncer de pulmón (A), EPOC (B) y fumadores (C) por Western blot. Cada una de las tiras estuvo en contacto con
el suero de un solo sujeto de estudio. No hubo detección de autoanticuerpos contra esta proteína recombinante.
Los resultados de los ensayos de detección de autoanticuerpos se concentran en la Tabla 2, en
la cual se muestra la frecuencia de detección, así como el porcentaje equivalente. Se observó
que no hubo detección en contra de la proteína recombinante Cyfra 21.1; en el caso de la
proteína PRDX-2 se encontró una mayor frecuencia de autoanticuerpos en el grupo de
pacientes con EPOC que en el grupo de cáncer de pulmón y en el grupo de fumadores. Por su
parte, se encontró una frecuencia relativamente mayor de autoanticuerpos para la proteína
PPIA en muestras de suero de pacientes con cáncer de pulmón, que en muestras de pacientes
con EPOC y fumadores. Por último, para la proteína TPI-1 sólo hubo una muestra positiva en
el grupo de cáncer de pulmón. Los resultados obtenidos indican que sólo los autoanticuerpos
contra Citoqueratina 19 tienen un valor diagnóstico potencial para cáncer de pulmón, ya que
se encontraron con mayor frecuencia en este grupo que en los grupos control.
Tabla 5. Frecuencia de detección de autoanticuerpos para las proteínas recombinantes en los grupos evaluados.
Grupo\Proteína Cyt-19 Cyfra 21-1 TPI-1 PRDX-2 PPIA
Cáncer 19/30; 63% 0 1/30; 3% 6/30; 20% 3/30; 10%
EPOC 5/30; 16% 0 0/30 13/30; 43% 2/30; 6%
Fumadores 1/30; 3% 0 0/30 8/30; 16% 1/30; 3%
EPOC + Fumadores 6/60; 10% 0 0 21/60; 35% 3/60; 5%
57
Además de la presencia del autoanticuerpo, pudiera ser relevante conocer la concentración del
mismo en las muestras. Por esta razón, se realizó un análisis semicuantitativo de las bandas
reactivas en cada una de las tiras positivas, por medio de densitometría, utilizando el programa
SigmaPlot 12.0. Con los valores obtenidos se realizó una gráfica de distribución de muestras
entre los grupos (Fig. 25A), en la cual se observa que los pacientes con cáncer de pulmón
presentan una mayor concentración de anticuerpos que las personas del grupo control.
Asimismo, se construyó una curva ROC para determinar el valor diagnóstico del
autoanticuerpo contra citoqueratina 19 (Fig. 25B). Este potencial biomarcador presentó un
valor de área bajo la curva (ABC) de 0.8267 y una sensibilidad y especificidad del 59%/90%,
el cual es superior al de varios biomarcadores de cáncer de pulmón reportados previamente en
la literatura.
Figura 25. (A) Distribución de las muestras de cada grupo de acuerdo con los valores de densitometría
individuales. En los controles se incluyen los pacientes con EPOC y los fumadores). (B) Curva ROC generada a
partir de los valores de densitometría de todas las muestras, para el autoanticuerpo contra Citoqueratina 19. El
valor obtenido de ABC fue de 0.8267 y una sensibilidad/especificidad del 59%/90%.
58
6. DISCUSIÓN
El sistema inmune puede responder a las células cancerosas, reaccionando contra moléculas
derivadas de éstas, tales como los antígenos específicos de tumores (TSA) o contra moléculas
que se expresan de forma diferencial por las células cancerosas y las células normales, como
los antígenos asociados a tumores (TAA) (Finn 2008). Existe un gran número de estudios que
describen la presencia de una respuesta inmune humoral (autoanticuerpos) dirigida a los TAA
en los tumores sólidos, incluido el cáncer de pulmón, y se ha descrito la presencia de estos
autoanticuerpos hasta 5 años antes de la enfermedad sintomática (Chapman et al. 2008,
Murray et al. 2010). El estudio de autoanticuerpos relacionados a antígenos de cáncer ha
mostrado potencial en la detección temprana de cáncer de pulmón (Wu et al. 2010). Un
estudio previo analizó la respuesta inmune humoral en pacientes con cáncer, encontrando
dicha respuesta contra una amplia variedad de proteínas celulares y extracelulares. Las
proteínas más relevantes encontradas en el estudio fueron derivadas de proteínas mutadas o
sobre expresadas (Reuschenbach et al. 2009). Con base en la evidencia de que la
sobreexpresión de las proteínas puede desencadenar una respuesta inmune humoral, el
presente trabajo fue desarrollado para la búsqueda de anticuerpos contra Citoqueratina 19,
Cyfra 21.1 (un fragmento de la Citoqueratina 19), YKL-40, Antígeno Carcinoembrionario
(CEA), Antígeno de cáncer 125 (CA-125) y Proteína C Reactiva (CRP), cuya sobreexpresión
en cáncer de pulmón ha sido previamente demostrada. No obstante, al final solo se lograron
obtener las proteínas recombinantes Citoqueratina 19 y Cyfra 21.1. Citoqueratina 19 es un
miembro de las queratinas ácidas de tipo 1 (CK9-CK20). La función principal de las
queratinas es mantener la integridad de las células epiteliales, ya que éstas forman parte del
citoesqueleto. Se ha demostrado la completa liberación de la proteína Citoqueratina 19 por
células tumorales humanas (Alix-Panabieres et al. 2009). Durante la apoptosis la Citoqueratina
19 es cortada por la caspasa 3 y el fragmento soluble carboxilo terminal (Cyfra 21.1) es
liberado por las células de cáncer (Dohmoto et al. 2001, Alix-Panabieres et al. 2009). Cyfra
21.1 y algunas otros proteínas, tales como el Antígeno Especifico de Neuronas (NSE) o el
Antígeno Carcinoembrionario (CEA), se encuentran comúnmente sobreexpresadas en cáncer
de pulmón, por lo que se han sugerido como marcadores diagnósticos de la enfermedad; sin
embargo, se ha demostrado que ninguno de estos marcadores, por sí solos, son óptimos para la
detección temprana de la enfermedad (Xiao et al. 2005, Zhang et al. 2013), de ahí la
59
importancia en la búsqueda de nuevas fuentes de biomarcadores tales como los
autoanticuerpos contra TAAs. En el presente estudio, se determinó la presencia de
autoanticuerpos contra citoqueratina 19, en 19 de 30 (63%) sueros de pacientes con cáncer de
pulmón. Se ha demostrado que los autoanticuerpos contra un TAA particular se encuentran
sólo en el 10-30% de los pacientes, y esto es debido a la naturaleza heterogénea del cáncer
(Tan et al. 2009). Con respecto al grupo control, se detectó la presencia de autoanticuerpos
contra citoqueratina 19 en 5 de 30 (16%) sueros de sujetos con EPOC y 1 de 30 (3%) sueros
de los fumadores. En correspondencia, varios estudios han demostrado la presencia de
autoanticuerpos en 0-3% de los sueros controles (Reuschenbach et al. 2009). En el caso del
grupo de EPOC, la frecuencia de detección de autoanticuerpos contra citoqueratina 19 está por
encima de lo reportado en la literatura y esto pudiera deberse a que algunos pacientes hubieran
ya desarrollado un proceso carcinogénico. Esta hipótesis se sostiene por el seguimiento que se
dio a los pacientes, algunos de los cuales desarrollaron nódulos, aunque se desconoce si éstos
fueron benignos o malignos, y otros pacientes desarrollaron cáncer de pulmón durante el
tiempo que duró el estudio. El hallazgo de estos resultados llevó al análisis por densitometría
de las muestras analizadas y con los valores obtenidos se construyó una curva ROC, en la cual
se obtuvo un valor de área bajo la curva (ABC) de 0.8267 y una sensibilidad/especificidad del
59%/90% para el autoanticuerpo contra Citoqueratina 19, el cual representa un elevado valor
diagnóstico (J cerda 2012). A diferencia de Citoqueratina 19, no se detectaron autoanticuerpos
contra Cyfra 21.1 en los tres grupos de estudio, a pesar de que ésta es una de las principales
proteínas sobreexpresadas en la mayoría de los casos de cáncer de pulmón. Es importante
resaltar que Cyfra 21.1 corresponde al fragmento C-terminal de la Citoqueratina 19. La
ausencia de autoanticuerpos contra Cyfra 21.1 sugiere que el extremo N-terminal de la
Citoqueratina 19 es el inmunogénico, por lo que sería relevante mapear los determinantes
inmunogénicos en esta región. Hasta donde sabemos, este es el primer reporte en el que se
lleva a cabo la detección de autoanticuerpos contra Citoqueratina 19 y se demuestra la
ausencia de los mismos contra Cyfra 21.1, en sueros de pacientes con cáncer de pulmón. En el
estudio también se incluyeron las proteínas recombinantes Triosafosfato Isomerasa (TPI-1),
Peroxirredoxina 2 (PRDX-2) y Ciclofilina A o Peptidil Propil Isomerasa A (PPIA), cuyas
cepas productoras fueron donadas por el Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez y que han sido
previamente utilizadas para la detección de autoanticuerpos en cáncer de mama.
60
Triosafosfato isomerasa es una enzima homodimérica que funciona en un paso no linear de la
glucólisis, convirtiendo dihidroxiacetona fosfato (DAHP) en gliceraldehído 3-fosfato (GAP).
Tanto DHAP como GAP son producidos a partir del catabolismo de la fructosa 1,6-bifosfato
por la enzima aldolasa; sin embargo, solo GAP puede ser utilizado en los pasos remanentes de
la glucólisis. Por lo tanto, TPI es responsable de la ganancia neta de ATP derivado de la
glucólisis, así como de la producción de una molécula extra de piruvato por molécula de
glucosa. Esta mejora de la glucólisis es importante en la bioenergética tanto de metabolismo
aeróbico como anaeróbico (Roland et al. 2013). Se han realizado estudios de análisis del
proteoma de tejidos cancerosos tales como adenocarcinoma, para identificar proteínas
altamente expresadas en estos tumores, encontrándose a la TPI entre las proteínas
sobreexpresadas en tejidos de cáncer de pulmón, comparado con tejido pulmonar adyacente
normal (Chen et al. 2002, Kuramitsu et al. 2006, Zhang et al. 2009). Además, ha sido
reportada la detección de TPI como antígeno y también de autoanticuerpos contra esta
proteína en pacientes con cáncer de pulmón, y la frecuencia de detección de autoanticuerpos
fue significativamente más alta en carcinoma de células escamosas, en comparación con otros
tipos de cáncer de pulmón (Kuramitsu et al. 2006). En uno de estos estudios, el suero de 20
pacientes recién diagnosticados con carcinoma escamoso de pulmón y de 20 individuos sanos
fue analizado para determinar la reactividad basada en anticuerpos contra proteínas de cáncer
de pulmón, separadas por electroforesis en 2-D, lográndose la detección de autoanticuerpos
contra TPI en el 20% de los pacientes con carcinoma escamoso de pulmón, en comparación
con los controles normales, en los cuales no se detectaron autoanticuerpos (Yang et al. 2007).
En nuestro estudio se logró la detección de autoanticuerpos contra TPI en solo 1 de los 30
(3%) pacientes analizados con cáncer de pulmón, mientras que en los controles no se
detectaron autoanticuerpos contra esta proteína recombinante, concordando este último
resultado con el estudio antes mencionado. En cuanto al suero del paciente que resultó
positivo, se logró determinar que este paciente fue diagnosticado con carcinoma de células
escamosas (Anexo 12), lo cual es consistente con lo reportado por F. Yang et al. en el 2007.
Las peroxirredoxinas son una familia de peroxidasas de 25 kDa que pueden reducir el
peróxido de hidrógeno (H2O2) usando un electrón de la tiorredoxina u otras sustancias. La
familia de las peroxirredoxinas en mamíferos está dividida en 6 grupos (Prx I-VI) con base en
su homología en la secuencia de aminoácidos. Éstas se encuentran localizadas en el citosol y
61
juegan un papel en el sistema de señalización celular. Reportes previos han mostrado que Prx
II tiene propiedades proliferativas y anti-apoptóticas, induciendo así cambios carcinogénicos
(Noh et al. 2001). Estudios previos han demostrado que las isoformas de peroxirredoxinas I,
II, III y V fueron más predominantemente expresadas en epitelios bronquial y alveolar, así
como en macrófagos alveolares en pulmones de ratones. La isoforma I, III y la tiorredoxina se
encontraron sobreexpresadas en tejidos con cáncer, comparados con los tejidos normales de
pulmón (Park et al. 2006). En un estudio similar se llevó a cabo el estudio de la expresión de
todas las peroxirredoxinas en tejido de pulmón normal y en carcinoma de pulmón en humanos,
determinándose la expresión de peroxirredoxina I, III, V y VI en el epitelio bronquial sin
malignidad, en los pulmones humanos. Los resultados también indicaron que las
peroxirredoxinas I, II, IV y VI se encontraban sobreexpresadas en carcinoma de pulmón y que
estas peroxirredoxinas estaban diferencialmente expresadas en varios subtipos de cáncer de
pulmón, mostrando mayor positividad en adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas y
presentando menor positividad o resultado negativo en carcinoma de células pequeñas. La
sobreexpresión de peroxirredoxina II y VI estuvo significativamente asociada con la
progresión del tumor (Lehtonen et al. 2004). A pesar de estar comprobada la sobreexpresión
de peroxirredoxinas en cáncer de pulmón, no hay estudios relacionados con peroxirredoxina II
y la búsqueda de autoanticuerpos contra esta enzima en pacientes con cáncer de pulmón. Sólo
peroxirredoxina I se encuentra relacionada con la producción de autoanticuerpos contra esta
enzima en cáncer de pulmón de células no pequeñas (Chang et al. 2005). En nuestro estudio,
se logró la detección de autoanticuerpos contra peroxirredoxina II en 6 de 30 (20%) sueros de
pacientes con cáncer de pulmón, siendo el principal tipo histológico adenocarcinoma. En
cuanto a los sueros de sujetos con EPOC y fumadores, se logró la detección de
autoanticuerpos contra PRDX-2 en 13 de 30 (43%) y 8 de 30 (16%) sueros analizados,
respectivamente. No hay reportes de estudios en los cuales se haya detectado la
sobreexpresión de PRDX-2 ni la presencia de autoanticuerpos contra esta enzima en personas
con EPOC ni fumadores. Hay un estudio en el cual se llevó a cabo el análisis proteico en
tejidos de pulmón de fumadores y pacientes con EPOC, en el que se encontró una
sobreexpresión de las proteínas MMP-1 y una proteína similar a tiorredoxina II en pacientes
con EPOC (Lee et al. 2009).
62
Otra de las proteínas evaluadas en nuestro estudio fue la Ciclofilina A. Ciclofilina A (CypA)
es una peptidil- prolil cis-trans isomerasa (PPIasa), la cual fue originalmente identificada
como un receptor intracelular para Ciclosporina A (CsA) y que podría desempeñar un papel
importante en el plegamiento, el tráfico y el ensamble de proteínas, como inmunomodulador y
en señalización celular. La forma secretada de CypA puede actuar como factor de crecimiento
en varios tipos celulares. Por otro lado, CypA también está involucrada en la patogénesis en
varias enfermedades, incluyendo infección viral, enfermedad cardiovascular y cáncer
(Obchoei et al. 2009). Aunque se sabe muy poco acerca de la función de Cyp A en las células
cancerosas, se ha reportado recientemente que Cyp A está sobreexpresada en muchos tipos de
cáncer, incluidos cáncer de células pancreáticas, cáncer de células escamosas orales y cáncer
de pulmón de células no pequeñas (Choi et al. 2007). En otro estudio, en el que se analizó la
sobreexpresión de Cyp A en varios tipos celulares de cáncer de pulmón, así como en células
de tejido pulmonar normal, se encontró que la línea celular de cáncer de pulmón de células no
pequeñas, H446, mostró una alta expresión de Cyp A. También se observó que la proteína Cyp
A exógena puede estimular considerablemente el crecimiento de las células H446 en función
de su actividad PPIasa (Yang et al. 2007). En un estudio similar, se logró la detección por
MALDI-TOF de dos proteínas sobreexpresadas en especímenes de tumores de pulmón, Cyp A
y el factor inhibidor de migración de macrófagos; también se llevó a cabo la confirmación de
la sobreexpresión por Western blot, y Cyp A fue localizada en las células tumorales por
inmunohistoquímica (Campa et al. 2003). Se ha demostrado la producción de autoanticuerpos
contra Cyp A únicamente en suero de pacientes con cáncer de mama (Tamesa et al. 2009); no
hay estudios relacionados con la sobreexpresión y la producción de autoanticuerpos en casos
de cáncer de pulmón. En nuestro estudio, se logró la detección de autoanticuerpos contra Cyp
A en 3 de 30 (10%) pacientes con cáncer de pulmón; en cuanto a los sueros de sujetos con
EPOC y fumadores, se logró la detección de autoanticuerpos contra Cyp A en 2 de 30 (6%) y
1 de 30 (3%) de los sueros analizados, respectivamente. No hay reportes de estudios en los
cuales se haya detectado la sobreexpresión de Cyp A ni la presencia de autoanticuerpos contra
esta proteína en personas con EPOC ni fumadores.
63
7. CONCLUSIONES
Este estudio confirma la importancia de la búsqueda de nuevas fuentes de
biomarcadores para la detección temprana de cáncer de pulmón, como lo son los
autoanticuerpos contra antígenos asociados o derivados de tumor.
Se logró demostrar la presencia de autoanticuerpos en sueros de pacientes con cáncer
de pulmón, contra las proteínas recombinantes Citoqueratina 19, TPI-1, PRDX-2 y
Cyp A.
La proteína que presentó una mayor frecuencia de detección de autoanticuerpos, en
sueros de pacientes con cáncer de pulmón comparados con los controles, fue la
Citoqueratina 19, la cual podría ser propuesta como un marcador potencial de
diagnóstico de la enfermedad. Sin embargo, esto no significa que esta proteína por sí
sola pueda ser utilizada como biomarcador, ya que una prueba con un sólo
autoanticuerpo carece de la sensibilidad y la especificidad necesarias para el
diagnóstico de cáncer; por lo tanto, el ensayo de detección de autoanticuerpos contra
Citoqueratina 19 podría ser utilizado en conjunto con un panel establecido para la
detección de cáncer de pulmón, ya sean los paneles que se encuentran actualmente en
el mercado (PAULA´s Test y EarlyCDT-Lung) o agregar los autoanticuerpos al panel
de detección de las proteínas Citoqueratina 19, Cyfra 21.1, YKL-40, CEA, CA125 y
CRP utilizado en anteriores trabajos del grupo de investigación, para aumentar la
sensibilidad y la especificidad de ese panel.
64
8. PERSPECTIVAS
Llevar a cabo un ensayo de ELISA utilizando la proteína recombinante Citoqueratina
19 como antígeno para la detección cuantitativa de autoanticuerpos, ampliando el
número de muestras, tanto de los pacientes con cáncer de pulmón como de los
controles.
Agregar la prueba de detección de autoanticuerpos contra Citoqueratina 19 a un panel
de biomarcadores ya establecido y determinar si esta adición incrementa la
sensibilidad/especificidad del panel completo.
Llevar a cabo la amplificación, clonación y expresión de la proteína recombinante CRP
y realizar los ensayos de detección de autoanticuerpos en los 3 grupos de estudio.
Llevar a cabo la clonación y expresión de las proteínas recombinantes CEA y CA-125
y continuar con los ensayos de detección de autoanticuerpos contra estas proteínas.
Continuar con la purificación de la proteína recombinante YKL-40 y continuar con los
ensayos de detección de autoanticuerpos contra esta proteína.
65
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72
10. ANEXO 1
10.1 Muestras.
30 sueros de pacientes con cáncer de pulmón
30 sueros de fumadores
30 sueros de pacientes con EPOC
10.2. Líneas celulares.
A549
HepG-2
OVCAR-3
HeLa
10.3. Bacterias.
TOP-10
BL21 Star DE3
10.4. Reactivos.
Acrilamida (SIGMA)
Aceite mineral (BIO-RAD)
Acetona (SIGMA)
Ácido clorhídrico (SIGMA)
Ácido acético glacial (SIGMA)
Agar (SIGMA)
Agarosa UltraPureTM
Agarose (Invitrogen)
Agua destilada
Agua desionizada
Agua inyectable (PiSA)
Agua tridestilada
Albumina (SIGMA)*
Alcohol etílico absoluto (SIGMA)
Alcohol isopropílico (SIGMA)
Alcohol metílico (SIGMA)
Ampicilina sódica (SIGMA)
73
Azul brillante R-250 (BIO-RAD)
Azul brillante G-250 (BIO-RAD)
Azul de bromofenol (SIGMA)
BIS (SIGMA)
Buffer de carga 10X BlueJuice Gel Loading Gel (Invitrogen)
Cloroformo (SIGMA)
Cloruro de potasio (SIGMA)
Cloruro de sodio (SIGMA)
DTT (GE Healthcare)
EDTA (SIGMA)
Fosfato de potasio monobásico (SIGMA)
Fosfato de sodio monobásico (SIGMA)
Fosfato de sodio dibásico (SIGMA)
Glicerol (SIGMA)
Glicina (SIGMA)
Goat Anti-Human IgG (H+L)-HRP Conjugate (BIO-RAD)
Goat Anti-Mouse IgG (H-L)-HRP Conjugate (BIO-RAD)
His-probe (H-3) mouse monoclonal IgG1
Hidróxido de potasio (SIGMA)
Hidróxido de sodio (SIGMA)
Imidazol (SIGMA)
Iodacetamida (GE Heathcare)
Buffer IPG para electroforesis en 2-D IPG Buffer, pH 4-7 (GE Healthcare)
Buffer IPG para electroforesis en 2-D IPG Buffer, pH 3-10 (GE Healthcare)
IPTG (Promega)*
Leche descremada en polvo Svelty (Nestlé)
Marcador de peso molecular 1KB Plus DNA Ladder (Invitrogen)*
Marcador de peso molecular Precision Plus Protein Standars (BIO-RAD)
Medio LB (SIGMA)
74
Membrana de nitrocelulosa AmershamTM
HybondTM
-ECL (GE Healthcare)
Membrana de nitrocelulosa, 0.45m (BIO-RAD)
Membrana para electroelución Model 422 electro-eluter Clear membrane Caps (BIO-
RAD)
Mercaptoetanol (SIGMA)
Persulfato de amonio (SIGMA)
Peróxido de hidrogeno (ZUUM )*
SDS (SIGMA)
Solución de Rehidratación DeStrakTM
Rehydration Solution (GE Healthcare)
SYBR® Safe DNA Gel Stain (ThermoFisher SCIENTIFIC)
TEMED (SIGMA)
Tiras para electroforesis en 2-D ReadyStripTM
IPG Strips 7 cm, pH 4-7 (BIO-RAD)
Tiras para electroforesis en 2-D ReadyStripTM
IPG Strips 7 cm, pH 5-8 (BIO-RAD)
Tiras para electroforesis en 2-D ReadyStripTM
IPG Strips 7 cm, pH 3-10 (BIO-RAD)
Trizma base (SIGMA)
Triton X-100 (SIGMA)*
Trizol (Invitrogen)
Tween- 20 (SIGMA)*
Urea (SIGMA)
HRP Color Development Reagent, 4 CN (BIO-RAD)
10.5. KIT
Columnas de purificación Bio-Scale™ Mini Profinity™ IMAC Cartridges
DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific)
Champion™ pET101 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3)
One Shot® Chemically Competent E. coli
Champion™ pET102 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3)
One Shot® Chemically Competent E. coli
Platinum PCR SuperMix (Invitrogen)
Platinum Taq DNA Polimerasa (Invitrogen)
75
ProteoSilverTM
Silver Stain Kit (SIGMA)
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) (QIAGEN)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) (QIAGEN)
Phusion® High-Fidelity PCR Kit
SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix
10.6. Material
Adaptadores de silicón para electro-elución Model 422 electro-eluter Silicone
Adaptors (BIO-RAD)
Botes de plástico con tapa 50 ml (Sterilin)
Botes de plástico con tapa 250 ml (sterilin)
Botes de vidrio con tapa 500 ml (WHEATON)
Cajas de Petri (Plásticos y derivados de Durango S.A.)*
Cubetas para electroporación Sigma-Aldrich electroporation cuvettes (SIGMA-
ALDRICH)
Espátula
Frasco de vidrio con tapa 100 ml (WHEATON)
Frasco de vidrio con tapa 250 ml (WHEATON)
Frasco de vidrio con tapa 500 ml (WHEATON)
Frasco de vidrio con tapa 1000 ml (WHEATON)
Fibras para electro-transferencia Mini Trans-Blot Fiber Pads (BIO-RAD)
Filtros para electro-transferencia Mini Trans Blot Filter Paper (BIO-RAD)
Fritz para electro-elución Model 422 electro-eluter Fritz (BIO-RAD)
Filtros para jeringa CORNING 25mm Syringe Filter 0.20 Micron (Corning
Incorporated)
Guantes de látex (AMBIDERM)*
Guantes de Nitrilo (AMBIDERM)*
Gradillas
Incubadoras para Tiras Mini-Incubation Trays (BIO-RAD)
Jeringas 5ml (TERUMO)*
76
Matraz aforado 100 ml KIMAX (KIMBLE)
Matraz aforado 500 ml KIMAX(KIMBLE)
Matraz aforado 1000 ml KIMAX (KIMBLE)
Matraz Erlenmeyer 200 ml KIMAX (KIMBLE)
Matraz Erlenmeyer 1000 ml KIMAX (KIMBLE)
Micropipeta PIPETMAN Classic 0.2-2 l (GILSON)
Micropipeta PIPETMAN Classic 0.5-10 l (GILSON)
Micropipeta PIPETMAN Classic 0.2-20 l (GILSON)
Micropipeta PIPETMAN Classic 50-200 l (GILSON)
Micropipeta PIPETMAN Classic 100-1000 l (GILSON)
Microtubos 1.5 ml (Axygen)
Microtubos 0.5 ml (Axygen)
Microtubos 0.2 ml (Axygen)
Papel aluminio (Reynolds Wrap)
Papel para electrodo para electroforesis en 2-D Paper Wicks IPGphorTM
(GE
Healthcare)
Parafilm M (Bemis)
Pipetas serológicas 5ml (Pyrex)
Pipetas serológicas 10ml (Pyrex)
Portageles
Portaobjetos (Madesa)
Probeta 10 ml KIMAX (KIMBLE)
Probeta 100 ml KIMAX (KIMBLE)
Probeta 250 ml KIMAX (KIMBLE)
Probeta 500 ml KIMAX (KIMBLE)
Probeta 1000 ml KIMAX (KIMBLE)
Propipetero (Bel-Art Products)*
Puntas para micropipetas 0.1-10 l (NEPTUNE)
Puntas para micropipetas 10-100 l (Corning Inc)
77
Puntas para micropipetas 100-1000ml (NEPTUNE)
Soporte para vidrios para electroforesis de geles de acrilamida Mini PROTEAN
System Casting Stand (BIO-RAD)
Soporte para vidrios para electroforesis de geles de acrilamida Mini PROTEAN
System Casting Frame (BIO-RAD)
Tubos de vidrio para electro-elución Model 422 electro-eluter Glass-Tubes
Tubos Falcon 15ml (Corning Inc)
Tubos Falcon 50ml (Corning Inc)
Tubos para toma de muestra (BD Vacutainer)
Vaso de precipitado 50 ml KIMAX (KIMBLE)
Vaso de precipitado 100 ml KIMAX (KIMBLE)
Vaso de precipitado 500 ml KIMAX (KIMBLE)
Vaso de precipitado 1000 ml KIMAX (KIMBLE)
Vidrios para equipo de electroforesis para geles de acrilamida Mini PROTEAN 3
System Glass Plates Spacer Plates (BIO-RAD)
Vidrios para equipo de electroforesis para geles de acrilamida Mini PROTEAN 3
System Glass Plates Short Plates (BIO-RAD)
10.7. Equipo
Agitador Orbital Platform Vari Mix (Thermolyne)
Agitador Rotor R-06 (SOLBAT)
Agitador RotoMix Type 48200 (Thermoline)
Autoclave Sterilizer SE510 (Yamato)
Balanza analítica BP 221S (Sartorius)
Campana de Bioseguridad para cultivo celular LabGard Class II, Type A2 Biological
safety Cabinet (NUAIRE)
Campana de Bioseguridad Purified Biological Safety Cabinet Class II Type A2
(LABCONCO)
Campana de extracción (Novatech)
Campana de flujo laminar (Lumina)
Campana de flujo laminar (LabTech)
78
Campana de flujo laminar (VECO)
Centrífuga Eppendorf Centrifuge 5804 (Eppendorf)
Centrífuga Large Capacity Centrifuge MF 600 (Hanil Science Industrial)
Centrífuga para cultivo celular Centrifuge 5810 R 15 amp Version (Eppendorf)
Centrífuga Universal 320 R (Hettich Zentrifugen)
Congelador (TOR-REY)
Equipo de Electroelución Model 422 Electro-Eluter Electroeluter Cell (BIO-RAD)
Equipo de Electroforesis de geles de acrilamida Mini PROTEAN Tetra Cell (BIO-
RAD)
Equipo de Electroforesis de geles de agarosa Mini-Sub Cell GT (BIO-RAD)
Equipo de electrotransferencia Mini Trans-Blot Cell (BIO-RAD)
Espectrofotómetro NANODROP 2000 Spectrophotometer (Thermo SCIENTIFIC)
Fuente de poder PowerPacTM
HC (BIO-RAD)
Fotodocumentador Molecular Imager Gel DocTM
XR+ with Image LabTM
Software
(BIO-RAD)
Horno de microondas (LG)
Incubadora con agitación MAxQ 4450 (Thermo SCIENTIFIC)
Incubadora de CO2 Series 8000 DH CO2 Incubator (Thermo SCIENTIFIC)
Incubadora Shaker (New Brunswick Scientific)
Incubadora Shaker KS 3000i control (IKA)
Máquina de hielo Comercial Ice Machine (Cornelius)
Microcentrífuga LaboGene mini (LABOGENE)
Microcentrífuga refrigerada Sorvall Fresco (Sorvall)
Microscopio de fluorescencia (LEICA)
Potenciómetro Orion 3 STAR pH Portable (Thermo SCIENTIFIC)
Refrigerador (TOR-REY)
Sistema para electroforesis en 2-D Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare)
Sonicador Ultrasonic liquid processor XL-2000 SERIES (MISIONIX)
Termoblock AccuBlockTM
Digital Dry Bath (Labnet International, Inc.)
79
Transiluminador Fisher Biotech Transilluminator FBTI-88 (Fisher Scientific)
Termoagitador Hotplate Stirrer (Biomega Research Product Inc.)
Termociclador Biometra T Gadient Thermocycler (Biometra)
Ultracongelador -86 Ultralow Freezer (NUAIRE)
Vortex Select Vortexer (Select BioProducts)
80
11. ANEXO 2
11.1. Soluciones y Buffers
11.1.1. Geles de agarosa
11.1.2. TAE 10X
Se pesaron y mezclaron 48.4 g de Tris base y 7.44 g de EDTA sal disódica dihidratada en 800
ml de agua destilada, posteriormente se agregaron 11.42 ml de ácido acético glacial y se aforó
a 1 L en un matraz aforado. La solución se guardó en un frasco de vidrio con tapa a
temperatura ambiente.
11.1.3. TAE 1X (Tris 40 mM, EDTA 2 mM)
Se mezclaron 100 ml de TAE 10X con 900 ml de agua destilada en un matraz aforado y se
pasó la solución a un frasco de vidrio con tapa. No fue necesario ajustar el pH ya que este
quedó aproximadamente de 7.5.
11.2. Crecimiento bacteriano e inducción de proteínas
11.2.1. Medio LB (Triptona 1%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 0.5%)
Se pesaron y se mezclaron 20 g de polvo para medio LB en 800 ml de agua destilada con
ayuda de un agitador magnético; una vez disuelto en su totalidad se aforó a 1 L con ayuda de
un matraz aforado y se depositó en un frasco de vidrio con tapa. Por último, se esterilizó el
medio de cultivo en autoclave y se almacenó a 4°C.
11.2.2. Medio Super Broth (Peptona o triptona 3.2%, extracto de levadura 2%, NaCl 0.5)
Se pesaron 32 g de peptona de caseína, 20 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio y
se disolvieron en 800 ml de agua destilada con ayuda de un agitador magnético, una vez
disuelto en su totalidad se aforó a 1 L con ayuda de un matraz aforado y se depositó en un
frasco de vidrio con tapa. Por último, se esterilizó el medio de cultivo en autoclave y se
almacenó a 4°C.
11.2.3. Medio Terrific Broth (Peptona o triptona 1.2%, extracto de levadura 2.4%,
K2HPO4 72 mM, KH2PO4 17 mM, Glicerol 0.4%)
Se disolvieron en 800 ml de agua destilada 12 g de peptona de caseína, 24 g de extracto de
levadura y 4 ml de glicerol, se llevó a 900 ml con agua destilada y se esterilizó en autoclave.
En un vaso de precipitado se mezclaron 12.5424 g de K2HPO4 y 2.3135 g de KH2PO4 con 100
ml de agua destilada y se esterilizó mediante filtración a través de un filtro para jeringa de 0.22
micras. Una vez que el medio de cultivo salió del autoclave se dejó enfriar a temperatura
81
ambiente y posteriormente se agregaron los 100 ml de la solución de fosfatos y se utilizó
inmediatamente el medio de cultivo completo.
11.2.4. Ampicilina (100 mg/ml)
Se pesaron 100 mg de ampicilina y se mezclaron con 8 ml de agua destilada estéril en un tubo
Falcon de 15 ml. Una vez que se disolvió completamente la ampicilina se llevó a un volumen
de 10 ml y se hicieron alícuotas de 1 ml, las cuales se almacenaron a -20°C hasta su
utilización.
11.2.5. IPTG (1M)
Se pesaron 0.23831 g de IPTG y se mezclaron con 1 ml de agua destilada estéril en un tubo de
1.5 ml y se guardó a -20°C hasta su utilización.
11.2.6. Medio LB con ampicilina (100 g/ml)
Una vez que se tiene preparado el medio LB, como se mencionó anteriormente, se agregó la
ampicilina preparada a una concentración de 100 mg/ml para llevar a una concentración final
de 100 g/ml. Se agregó 1 l de ampicilina por cada ml de medio de cultivo, esto es, para
preparar 100 ml de medio LB con ampicilina a una concentración de 100 g/ ml, se agregaron
a los 100 ml de medio LB, 100 l de ampicilina preparada a 100 mg/ml. El medio de cultivo
estuvo a temperatura ambiente antes de agregar la ampicilina y sólo se agregó justo antes de
utilizar el medio de cultivo.
11.2.7. Agar LB con ampicilina (100 g/ml)
Se pesaron y se mezclaron 20 g de polvo para medio LB y 15 g de agar en 800 ml de agua
destilada con ayuda de un agitador magnético; una vez disuelto en su totalidad se llevó a un
litro y se esterilizó en autoclave. Se dejó enfriar a 45°C y se agregó 1ml de ampicilina a una
concentración de 100 mg/ml e inmediatamente se vacío en las cajas de Petri dentro de una
campana de bioseguridad, agregando aproximadamente 30 ml por caja y se dejó enfriar hasta
que el agar estuvo completamente firme. Se sellaron las cajas con parafilm y se almacenaron a
4°C hasta su utilización.
82
11.3. SDS-PAGE
11.3.1. Acrilamida al 30% (Acrilamida/Bisacrilamida 29:1)
Se pesaron y se mezclaron 29.2 g de Acrilamida y 0.2 g de Bisacrilamida con 70 ml de agua
destilada estéril, en agitación, con ayuda de un agitador magnético hasta disolver por completo
en un vaso previamente envuelto con aluminio. Una vez disuelta, la solución se aforó a 100
ml. Por último, se filtró la solución utilizando un filtro para jeringa de 20 micras y se colocó la
solución en un frasco ámbar en refrigeración a 4°C hasta su utilización.
11.3.2. Amortiguador Tris-HCl (Stacking gel buffer 4X, 0.5 M Tris, 0.4% SDS, pH 6.8).
Se disolvieron 6.06 g de Tris base y 0.4 g de SDS en 80 ml de agua destilada con ayuda de un
agitador magnético y se ajustó el pH a 6.8 con HCl concentrado. Posteriormente se aforó en un
matraz aforado de 100 ml y se filtró la solución utilizando un filtro para jeringa de 20 micras y
se guardó en un frasco transparente en refrigeración a 4°C hasta su utilización.
11.3.3. Amortiguador Tris-HCl (Resolving gel buffer 4X, 1.5 M Tris, 0.4% SDS, pH 8.8).
Se disolvieron 18.17 g de Tris base y 0.4 g de SDS en 80 ml de agua destilada con ayuda de
un agitador magnético y se ajustó el pH a 8.8 con HCl concentrado. Posteriormente se aforó en
un matraz aforado de 100 ml y se filtró la solución utilizando un filtro para jeringa de 20
micras y se guardó en un frasco transparente en refrigeración a 4°C hasta su utilización.
11.3.4. Persulfato de amonio al 10%
Se disolvió 1 g de persulfato de amonio en 10 ml de agua destilada estéril, se hicieron
alícuotas de 1 ml y se almacenaron a -20°C hasta su utilización.
11.3.5. Buffer de corrida SDS-PAGE 10X
Se pesaron y se mezclaron 144 g de glicina, 30.3 g de Tris base y 10 g de SDS en 800 ml de
agua destilada con ayuda de un agitador magnético, se aforó la solución en un matraz aforado
de 1000 ml. Se almacenó la solución en un frasco transparente con tapa a temperatura
ambiente.
11.3.6. Buffer de corrida SDS-PAGE 1X (Glicina 192 mM, Tris 25 mM, SDS 0.1%)
Se mezclaron 100 ml de buffer de corrida SDS-PAGE 10X con 900 ml de agua destilada en un
matraz aforado y se pasó la solución a un frasco de vidrio con tapa. No fue necesario ajustar el
pH.
83
11.3.7. Buffer de carga 2X SDS-PAGE
Se mezclaron los siguientes reactivos:
Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 2.5 ml
Glicerol (100%) 2.0 ml
-mercaptoetanol 0.4 ml
Azul de bromofenol 0.02 g
SDS 0.4 g
Se llevó a un volumen de 10 ml con agua destilada estéril, se hicieron alícuotas de 1 ml y se
congelaron a -20°C hasta su utilización.
11.3.8. Buffer de carga 1X SDS-PAGE
Se mezclaron los siguientes reactivos:
Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 1.25 ml
Glicerol (100%) 1.0 ml
-mercaptoetanol 0.2 ml
Azul de bromofenol 0.01 g
SDS 0.2 g
Se llevó a un volumen de 10 ml con agua destilada estéril, se hicieron alícuotas de 1 ml y se
congelaron a -20°C hasta su utilización.
11.3.9. Azul de Coomassie SDS-PAGE (solución para teñir)
Metanol 250 ml
Ácido acético glacial 50 ml
Azul brillante 1.25 g
Agua destilada 200 ml
Se disolvió el azul brillante en el metanol en un frasco ámbar, posteriormente se agregó el
ácido acético glacial y por último el agua destilada. Se almacenó a temperatura ambiente.
84
11.3.10. Solución para desteñir SDS-PAGE
Agua destilada 625 ml
Ácido acético glacial 125 ml
Metanol 500 ml
Se mezclaron los reactivos y se almacenó en un frasco con tapa a temperatura ambiente.
11.4. SDS-PAGE 2-D
11.4.1. DTT 1 M
En un pedazo pequeño de aluminio se pesaron 0.07713 gr de DTT y se depositaron en un tubo
de 1.5 ml, se agregaron 500 l de agua destilada estéril y se agitó con vórtex hasta que se
disolvió por completo. Se almacenó el tubo a -20°C hasta su utilización.
11.4.2. Azul de bromofenol al 1%
Se pesaron 60 mg de Tris-base y 100 mg de azul de bromofenol y se depositaron en un tubo
Falcon de 15 ml, se llevó a un volumen de 10 mililitros con agua destilada estéril y se
almacenó a temperatura ambiente.
11.4.3. Buffer de equilibrio para 2-D (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% glicerol,
2% SDS, azul de bromofenol, 200 ml)
Se pesaron y se mezclaron los siguientes reactivos:
Concentración final Cantidad
Tris-HCl, pH 8.8 (4x
resolving gel buffer)
50 mM 10 ml
Urea (FW 60.06) 6 M 72.07
Glicerol 87 % (v/v) 30 % (v/v) 69 ml
SDS (FW 288.38) 2 % (w/v) 4.0 g
Azul de bromofenol 0.002% (w/v) 400 l de la solución al 1%
Agua destilada estéril Llevar a 200 ml
Se almacenaron en tubos Falcon de 50 ml a temperatura ambiente.
85
11.4.4. Buffer de equilibrio con DTT para 2-D
Se pesaron 10 mg de DTT, se depositaron en un tubo de 1.5 ml y se mezclaron con 1 ml de
buffer de equilibrio para 2-D hasta disolver completamente. Esta solución se preparó unos
instantes antes de ser utilizada.
11.4.5. Buffer de equilibrio con Iodoacetamida para 2-D
Se pesaron 25 mg de Iodoacetamida, se depositaron en un tubo de 1.5 ml y se mezclaron con 1
ml de buffer de equilibrio para 2-D hasta disolver completamente. Esta solución se preparó
unos instantes antes de ser utilizada.
11.5. Electrotransferencia y Western blot
11.5.1. Buffer de transferencia de proteínas
En un vaso de precipitado de 1 L se mezclaron 500 ml de agua, 200 ml de metanol y 100 ml
de buffer de corrida SDS-PAGE 10X con ayuda de un agitador magnético. Una vez disueltos
todos los reactivos se aforó la solución a 1 L con ayuda de un matraz aforado. La solución se
almacenó en un frasco con tapa a temperatura ambiente. Antes de utilizarse se enfrió la
solución durante 1 hora a -20°C.
11.5.2. TBS 10X para Western blot
Se pesaron y mezclaron 24 g de Tris base y 88 g de NaCl en 800 ml de agua destilada y se
aforó la solución a 1 L con la ayuda de un matraz aforado. Se almacenó la solución en un
frasco con tapa a 4°C.
11.5.3. TBS 1X para Western Blot (Tris 20 mM, NaCl 150 mM)
En un vaso de precipitado se mezclaron 100 ml de TBS 10X con 800 ml de agua destilada y se
ajustó el pH a 7.6, utilizando ácido clorhídrico concentrado. Se llevó la solución a 1 L
utilizando un matraz aforado y se colocó en un frasco de vidrio con tapa. Finalmente se
esterilizó la solución en autoclave, se dejó enfriar y se almacenó la solución a temperatura
ambiente.
11.5.4. TBS 1X-Tween 20 al 0.1%
En un vaso de precipitado se mezclaron 100 ml de TBS 10X y 1 ml de Tween 20 con 800 ml
de agua destilada y se ajustó el pH a 7.6, utilizando ácido clorhídrico concentrado. Se llevó la
solución a 1 L utilizando un matraz aforado y se colocó en un frasco de vidrio con tapa.
86
Finalmente se esterilizó la solución en autoclave, se dejó enfriar y se almacenó a temperatura
ambiente.
11.5.5. TBS 1X-Tween 20 al 0.05%
En un vaso de precipitado se mezclaron 100 ml de TBS 10X y 0.5 ml de Tween 20 con 800 ml
de agua destilada y se ajustó el pH a 7.6, utilizando ácido clorhídrico concentrado. Se llevó la
solución a 1 L utilizando un matraz aforado y se colocó en un frasco de vidrio con tapa.
Finalmente se esterilizó la solución en autoclave, se dejó enfriar y se almacenó a temperatura
ambiente.
11.5.6. Buffer de bloqueo (TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 5%)
Se disolvieron 5 g de leche descremada en 80 ml de TBS 1X-Tween 20 al 0.1%. Se llevó a un
volumen de 100 ml y se utilizó inmediatamente después de su preparación.
11.5.7. Buffer de bloqueo (TBS 1X-Tween 20 al 0.1%, leche 2.5%)
Se disolvieron 2.5 g de leche descremada en 80 ml de TBS 1X-Tween 20 al 0.1%. Se llevó a
un volumen de 100 ml y se utilizó inmediatamente después de su preparación.
11.5.8. Solución de revelado para Western blot
Se prepararon las soluciones A y B de la siguiente manera:
Solución A Solución B
Metanol 2.5 ml TBS 1X pH 7.6 12.5 ml
Sustrato para HRP
4CN
7.5 mg Peróxido de
hidrógeno al 30%
7.5 l
Se mezclaron las dos soluciones inmediatamente antes de ser utilizada.
11.5.9. Rojo de Ponceau (Ponceau 4R 0.1%, Ácido acético glacial 1%)
Se disolvieron en 80 ml de agua destilada, con ayuda de un agitador magnético, 1 ml de ácido
acético glacial y 100 mg de Ponceau 4N, se llevó a 100 ml en un matraz aforado y se
almacenó en un frasco de vidrio con tapa a temperatura ambiente.
11.6. Purificación de proteínas
11.6.1. Buffer nativo de purificación/Buffer de lavado 1 (Native lysis/wash buffer 1 KCl
300 mM, KH2PO4 50 mM, Imidazole 5 mM)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
87
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 0.34g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se guardó la solución en un frasco con tapa y se almacenó a temperatura
ambiente.
11.6.2. Buffer nativo de lavado 2 (Native wash buffer 2 KCl 300 mM, KH2PO4 50 mM,
Imidazole 10 mM)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 0.68 g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se guardó la solución en un frasco con tapa y se almacenó a temperatura
ambiente.
11.6.3. Buffer nativo de elución (Native elution buffer KCl 300 mM, KH2PO4 50 mM,
Imidazole 250 mM)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 17.02 g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se guardó la solución en un frasco con tapa y se almacenó a temperatura
ambiente.
88
11.6.4. Buffer desnaturalizante de purificación/Buffer de lavado 1 (Denaturing lysis/wash
buffer 1 KCl 300 mM, KH2PO4 50 mM, Imidazole 5 mM, Urea 6M)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 0.34g
Urea 360.36 g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se hicieron alícuotas y se congelaron a -20°C hasta su utilización.
11.6.5. Buffer desnaturalizante de lavado 2 (Denaturing wash buffer 2 KCl 300 mM,
KH2PO4 50 mM, Imidazole 10 mM, Urea 6M)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 0.68 g
Urea 360.36 g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se hicieron alícuotas y se congelaron a -20°C hasta su utilización.
11.6.6. Buffer desnaturalizante de elución (Denaturing elution buffer KCl 300 mM,
KH2PO4 50 mM, Imidazole 250 mM, Urea 6M)
Se pesaron los siguientes reactivos:
KCl 22.37 g
KH2PO4 6.80 g
Imidazole 17.02 g
Urea 360.36 g
Se disolvieron los reactivos en 800 ml de agua con ayuda de un agitador magnético, se ajustó
el pH a 8.0 utilizando KOH o H3PO4 y finalmente se aforó la solución a 1 L utilizando un
matraz aforado. Se hicieron alícuotas y se congelaron a -20°C hasta su utilización.
89
12. ANEXO 3
12.1. Citoqueratina 19
AGATATCCGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTCCCCCCTCCACCGGCCGCGGGCATAAAAGGCGCCAGGTGAGGGC
CTCGCCGCTCCTCCCGCGAATCGCAGCTTCTGAGACCAGGGTTGCTCCGTCCGTGCTCCGCCTCGCCATGACTTC
CTACAGCTATCGCCAGTCGTCGGCCACGTCGTCCTTCGGAGGCCTGGGCGGCGGCTCCGTGCGTTTTGGGCCGGG
GGTCGCCTTTCGCGCGCCCAGCATTCACGGGGGCTCCGGCGGCCGCGGCGTATCCGTGTCCTCCGCCCGCTTTGT
GTCCTCGTCCTCCTCGGGGGCCTACGGCGGCGGCTACGGCGGCGTCCTGACCGCGTCCGACGGGCTGCTGGCGGG
CAACGAGAAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGCCTGGCCTCCTACCTGGACAAGGTGCGCGCCCTGGAGGC
GGCCAACGGCGAGCTAGAGGTGAAGATCCGCGACTGGTACCAGAAGCAGGGGCCTGGGCCCTCCCGCGACTACAG
CCACTACTACACGACCATCCAGGACCTGCGGGACAAGATTCTTGGTGCCACCATTGAGAACTCCAGGATTGTCCT
GCAGATCGACAATGCCCGTCTGGCTGCAGATGACTTCCGAACCAAGTTTGAGACGGAACAGGCTCTGCGCATGAG
CGTGGAGGCCGACATCAACGGCCTGCGCAGGGTGCTGGATGAGCTGACCCTGGCCAGGACCGACCTGGAGATGCA
GATCGAAGGCCTGAAGGAAGAGCTGGCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAAATCAGTACGCTGAGGGGCCA
AGTGGGAGGCCAGGTCAGTGTGGAGGTGGATTCCGCTCCGGGCACCGATCTCGCCAAGATCCTGAGTGACATGCG
AAGCCAATATGAGGTCATGGCCGAGCAGAACCGGAAGGATGCTGAAGCCTGGTTCACCAGCCGGACTGAAGAATT
GAACCGGGAGGTCGCTGGCCACACGGAGCAGCTCCAGATGAGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCT
TCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCAGTCACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGA
GGCGCGCTTTGGAGCCCAGCTGGCGCATATCCAGGCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCG
AGCTGATAGTGAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAGCGGCTCATGGACATCAAGTCGCGGCTGGAGCAGGAGATTGC
CACCTACCGCAGCCTGCTCGAGGGACAGGAAGATCACTACAACAATTTGTCTGCCTCCAAGGTCCTCTGAGGCAG
CAGGCTCTGGGGCTTCTGCTGTCCTTTGGAGGGTGTCTTCTGGGTAGAGGGATGGGAAGGAAGGGACCCTTACCC
CCGGCTCTTCTCCTGACCTGCCAATAAAAATTTATGGTCCAAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Secuencia del RNA mensajero codificante para Citoqueratina 19 en sombreado color gris. Se muestran en color
rojo los iniciadores diseñados para el estudio. El RNA mensajero está conformado por 1203 pb, mientras que el
tamaño del amplificado con los iniciadores utilizados para el estudio fue de 1201 pb más los 4 pb agregados
(CACC) para la clonación dirigida en los vectores Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kits
(Invitrogen).
90
13. ANEXO 4
13.1. Cyfra 21.1 AGATATCCGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTCCCCCCTCCACCGGCCGCGGGCATAAAAGGCGCCAGGTGAGGGC
CTCGCCGCTCCTCCCGCGAATCGCAGCTTCTGAGACCAGGGTTGCTCCGTCCGTGCTCCGCCTCGCCATGACTTC
CTACAGCTATCGCCAGTCGTCGGCCACGTCGTCCTTCGGAGGCCTGGGCGGCGGCTCCGTGCGTTTTGGGCCGGG
GGTCGCCTTTCGCGCGCCCAGCATTCACGGGGGCTCCGGCGGCCGCGGCGTATCCGTGTCCTCCGCCCGCTTTGT
GTCCTCGTCCTCCTCGGGGGCCTACGGCGGCGGCTACGGCGGCGTCCTGACCGCGTCCGACGGGCTGCTGGCGGG
CAACGAGAAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGCCTGGCCTCCTACCTGGACAAGGTGCGCGCCCTGGAGGC
GGCCAACGGCGAGCTAGAGGTGAAGATCCGCGACTGGTACCAGAAGCAGGGGCCTGGGCCCTCCCGCGACTACAG
CCACTACTACACGACCATCCAGGACCTGCGGGACAAGATTCTTGGTGCCACCATTGAGAACTCCAGGATTGTCCT
GCAGATCGACAATGCCCGTCTGGCTGCAGATGACTTCCGAACCAAGTTTGAGACGGAACAGGCTCTGCGCATGAG
CGTGGAGGCCGACATCAACGGCCTGCGCAGGGTGCTGGATGAGCTGACCCTGGCCAGGACCGACCTGGAGATGCA
GATCGAAGGCCTGAAGGAAGAGCTGGCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAAATCAGTACGCTGAGGGGCCA
AGTGGGAGGCCAGGTCAGTGTGGAGGTGGATTCCGCTCCGGGCACCGATCTCGCCAAGATCCTGAGTGACATGCG
AAGCCAATATGAGGTCATGGCCGAGCAGAACCGGAAGGATGCTGAAGCCTGGTTCACCAGCCGGACTGAAGAATT
GAACCGGGAGGTCGCTGGCCACACGGAGCAGCTCCAGATGAGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCT
TCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCAGTCACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGA
GGCGCGCTTTGGAGCCCAGCTGGCGCATATCCAGGCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCG
AGCTGATAGTGAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAGCGGCTCATGGACATCAAGTCGCGGCTGGAGCAGGAGATTGC
CACCTACCGCAGCCTGCTCGAGGGACAGGAAGATCACTACAACAATTTGTCTGCCTCCAAGGTCCTCTGAGGCAG
CAGGCTCTGGGGCTTCTGCTGTCCTTTGGAGGGTGTCTTCTGGGTAGAGGGATGGGAAGGAAGGGACCCTTACCC
CCGGCTCTTCTCCTGACCTGCCAATAAAAATTTATGGTCCAAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Durante la apoptosis la Citoqueratina 19 es cortada por la caspasa 3 y el fragmento soluble carboxilo terminal
(Cyfra 21.1) es liberado por las células de cáncer (Dohmoto et al. 2001, Alix-Panabieres et al. 2009). Esta
caspasa reconoce la secuencia de aminoácidos VEVD para llevar a cabo el corte del fragmento soluble
(Panabières et al. 2013). Se muestra la secuencia codificante para el fragmento Cyfra 21.en color gris y en color
verde se observa la secuencia que codifica para los aminoácidos VEVD. Las letras en color rojo denotan la zona
en la cual se unen los iniciadores. Los iniciadores se diseñaron a partir de la secuencia que codifica para
metionina, la cual funge como codón de inicio, más próximo a la zona donde corta la caspasa 3, por tal motivo no
se logró amplificar la secuencia completa que codifica para el fragmento Cyfra 21.1.
91
14. ANEXO 5
14.1. YKL-40
CACATAGCTCAGTTCCCATAAAAGGGCTGGTTTGCCGCGTCGGGGAGTGGAGTGGGACAGGTATATAAAGGAAGT
ACAGGGCCTGGGGAAGAGGCCCTGTCTAGGTAGCTGGCACCAGGAGCCGTGGGCAAGGGAAGAGGCCACACCCTG
CCCTGCTCTGCTGCAGCCAGAATGGGTGTGAAGGCGTCTCAAACAGGCTTTGTGGTCCTGGTGCTGCTCCAGTGC
TGCTCTGCATACAAACTGGTCTGCTACTACACCAGCTGGTCCCAGTACCGGGAAGGCGATGGGAGCTGCTTCCCA
GATGCCCTTGACCGCTTCCTCTGTACCCACATCATCTACAGCTTTGCCAATATAAGCAACGATCACATCGACACC
TGGGAGTGGAATGATGTGACGCTCTACGGCATGCTCAACACACTCAAGAACAGGAACCCCAACCTGAAGACTCTC
TTGTCTGTCGGAGGATGGAACTTTGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGATAGCCTCCAACACCCAGAGTCGCCGGACT
TTCATCAAGTCAGTACCGCCATTTCTGCGCACCCATGGCTTTGATGGGCTGGACCTTGCCTGGCTCTACCCTGGA
CGGAGAGACAAACAGCATTTTACCACCCTAATCAAGGAAATGAAGGCCGAATTTATAAAGGAAGCCCAGCCAGGG
AAAAAGCAGCTCCTGCTCAGCGCAGCACTGTCTGCGGGGAAGGTCACCATTGACAGCAGCTATGACATTGCCAAG
ATATCCCAACACCTGGATTTCATTAGCATCATGACCTACGATTTTCATGGAGCCTGGCGTGGGACCACAGGCCAT
CACAGTCCCCTGTTCCGAGGTCAGGAGGATGCAAGTCCTGACAGATTCAGCAACACTGACTATGCTGTGGGGTAC
ATGTTGAGGCTGGGGGCTCCTGCCAGTAAGCTGGTGATGGGCATCCCCACCTTCGGGAGGAGCTTCACTCTGGCT
TCTTCTGAGACTGGTGTTGGAGCCCCAATCTCAGGACCGGGAATTCCAGGCCGGTTCACCAAGGAGGCAGGGACC
CTTGCCTACTATGAGATCTGTGACTTCCTCCGCGGAGCCACAGTCCATAGAATCCTCGGCCAGCAGGTCCCCTAT
GCCACCAAGGGCAACCAGTGGGTAGGATACGACGACCAGGAAAGCGTCAAAAGCAAGGTGCAGTACCTGAAGGAC
AGGCAGCTGGCGGGCGCCATGGTATGGGCCCTGGACCTGGATGACTTCCAGGGCTCCTTCTGCGGCCAGGATCTG
CGCTTCCCTCTCACCAATGCCATCAAGGATGCACTCGCTGCAACGTAGCCCTCTGTTCTGCACACAGCACGGGGG
CCAAGGATGCCCCGTCCCCCTCTGGCTCCAGCTGGCCGGGAGCCTGATCACCTGCCCTGCTGAGTCCCAGGCTGA
GCCTCAGTCTCCCTCCCTTGGGGCCTATGCAGAGGTCCACAACACACAGATTTGAGCTCAGCCCTGGTGGGCAGA
GAGGTAGGGATGGGGCTGTGGGGATAGTGAGGCATCGCAATGTAAGACTCGGGATTAGTACACACTTGTTGATTA
ATGGAAATGTTTACAGATCCCCAAGCCTGGCAAGGGAATTTCTTCAACTCCCTGCCCCCCAGCCCTCCTTATCAA
AGGACACCATTTTGGCAAGCTCTATCACCAAGGAGCCAAACATCCTACAAGACACAGTGACCATACTAATTATAC
CCCCTGCAAAGCCCAGCTTGAAACCTTCACTTAGGAACGTAATCGTGTCCCCTATCCTACTTCCCCTTCCTAATT
CCACAGCTGCTCAATAAAGTACAAGAGCTTAACAGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Secuencia del RNA mensajero codificante para YKL-40 en sombreado color gris. Se muestran en color rojo los
iniciadores diseñados para el estudio. El RNA mensajero está conformado por 1152 pb, mientras que el tamaño
del amplificado con los iniciadores utilizados para el estudio fue de 1146 pb más los 4 pb agregados (CACC)
para la clonación dirigida en los vectores Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kits (Invitrogen).
92
15. ANEXO 6
15.1. Proteína C Reactiva
GGACTTCTAGCCCCTGAACTTTCAGCCGAATACATCTTTTCCAAAGGAGTGAATTCAGGCCCTTGTATCACTGGC
AGCAGGACGTGACCATGGAGAAGCTGTTGTGTTTCTTGGTCTTGACCAGCCTCTCTCATGCTTTTGGCCAGACAG
ACATGTCGAGGAAGGCTTTTGTGTTTCCCAAAGAGTCGGATACTTCCTATGTATCCCTCAAAGCACCGTTAACGA
AGCCTCTCAAAGCCTTCACTGTGTGCCTCCACTTCTACACGGAACTGTCCTCGACCCGTGGGTACAGTATTTTCT
CGTATGCCACCAAGAGACAAGACAATGAGATTCTCATATTTTGGTCTAAGGATATAGGATACAGTTTTACAGTGG
GTGGGTCTGAAATATTATTCGAGGTTCCTGAAGTCACAGTAGCTCCAGTACACATTTGTACAAGCTGGGAGTCCG
CCTCAGGGATCGTGGAGTTCTGGGTAGATGGGAAGCCCAGGGTGAGGAAGAGTCTGAAGAAGGGATACACTGTGG
GGGCAGAAGCAAGCATCATCTTGGGGCAGGAGCAGGATTCCTTCGGTGGGAACTTTGAAGGAAGCCAGTCCCTGG
TGGGAGACATTGGAAATGTGAACATGTGGGACTTTGTGCTGTCACCAGATGAGATTAACACCATCTATCTTGGCG
GGCCCTTCAGTCCTAATGTCCTGAACTGGCGGGCACTGAAGTATGAAGTGCAAGGCGAAGTGTTCACCAAACCCC
AGCTGTGGCCCTGAGGCCCAGCTGTGGGTCCTGAAGGTACCTCCCGGTTTTTTACACCGCATGGGCCCCACGTCT
CTGTCTCTGGTACCTCCCGCTTTTTTACACTGCATGGTTCCCACGTCTCTGTCTCTGGGCCTTTGTTCCCCTATA
TGCATTGCAGGCCTGCTCCACCCTCCTCAGCGCCTGAGAATGGAGGTAAAGTGTCTGGTCTGGGAGCTCGTTAAC
TATGCTGGGAAACGGTCCAAAAGAATCAGAATTTGAGGTGTTTTGTTTTCATTTTTATTTCAAGTTGGACAGATC
TTGGAGATAATTTCTTACCTCACATAGATGAGAAAACTAACACCCAGAAAGGAGAAATGATGTTATAAAAAACTC
ATAAGGCAAGAGCTGAGAAGGAAGCGCTCATCTTCTATTTAATTCCCCACCCATGACCCCCAGAAAGCAGGAGGG
CATTGCCCACATTCACAGGGCTCTTCAGTCTCAGAATCAGGACACTGGCCAGGTGTCTGGTTTGGGTCCAGAGTG
CTCATCATCATGTCATAGAACTGCTGGGCCCAGGTCTCCTGAAATGGGAAGCCCAGCAATACCACGCAGTCCCTC
CACTTTCTCAAAGCACACTGGAAAGGCCATTAGAATTGCCCCAGCAGAGCAGATCTGCTTTTTTTCCAGAGCAAA
ATGAAGCACTAGGTATAAATATGTTGTTACTGCCAAGAACTTAAATGACTGGTTTTTGTTTGCTTGCAGTGCTTT
CTTAATTTTATGGCTCTTCTGGGAAACTCCTCCCCTTTTCCACACGAACCTTGTGGGGCTGTGAATTCTTTCTTC
ATCCCCGCATTCCCAATATACCCAGGCCACAAGAGTGGACGTGAACCACAGGGTGGCCGTGCGGCACGAG
Secuencia del RNA mensajero codificante para Proteína C Reactiva en sombreado color gris. Se muestran en
color rojo los iniciadores diseñados para el estudio. El RNA mensajero está conformado por 675 pb, mientras que
el tamaño del amplificado con los iniciadores utilizados para el estudio fue de 669 pb más los 4 pb agregados
(CACC) para la clonación dirigida en los vectores Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kits
(Invitrogen).
93
16. ANEXO 7
16.1. CA125
GAGAGGGTCCTTCAGGGTCTGCTTATGCCCTTGTTCAAGAACACCAGTGTCAGCTCTCTGTACTCTGGTTGCAGA
CTGACCTTGCTCAGGCCTGAGAAGGATGGGGCAGCCACCAGAGTGGATGCTGTCTGCACCCATCGTCCTGACCCC
AAAAGCCCTGGACTGGACAGAGAGCGGCTGTACTGGAAGCTGAGCCAGCTGACCCACGGCATCACTGAGCTGGGC
CCCTACACCCTGGACAGGCACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCAGAGCTCTATGACGACCACCAGAACT
CCTGATACCTCCACAATGCACCTGGCAACCTCGAGAACTCCAGCCTCCCTGTCTGGACCTACGACCGCCAGCCCT
CTCCTGGTGCTATTCACAATTAACTTCACCATCACTAACCTGCGGTATGAGGAGAACATGCATCACCCTGGCTCT
AGAAAGTTTAACACCACGGAGAGAGTCCTTCAGGGTCTGCTCAGGCCTGTGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCT
CTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGCCCAAGAAGGATGGGGCAGCCACCAAAGTGGATGCCATCTGC
ACCTACCGCCCTGATCCCAAAAGCCCTGGACTGGACAGAGAGCAGCTATACTGGGAGCTGAGCCAGCTAACCCAC
AGCATCACTGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGGACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACACAGCGGAGCTCT
GTGCCCACCACTAGCATTCCTGGGACCCCCACAGTGGACCTGGGAACATCTGGGACTCCAGTTTCTAAACCTGGT
CCCTCGGCTGCCAGCCCTCTCCTGGTGCTATTCACTCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCGGTATGAGGAGAAC
ATGCAGCACCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACGGAGAGGGTCCTTCAGGGCCTGCTCAGGTCCCTGTTCAAG
AGCACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACTTTGCTCAGGCCTGAAAAGGATGGGACAGCCACT
GGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCACCCTGACCCCAAAAGCCCTAGGCTGGACAGAGAGCAGCTGTATTGGGAG
CTGAGCCAGCTGACCCACAATATCACTGAGCTGGGCCACTATGCCCTGGACAACGACAGCCTCTTTGTCAATGGT
TTCACTCATCGGAGCTCTGTGTCCACCACCAGCACTCCTGGGACCCCCACAGTGTATCTGGGAGCATCTAAGACT
CCAGCCTCGATATTTGGCCCTTCAGCTGCCAGCCATCTCCTGATACTATTCACCCTCAACTTCACCATCACTAAC
CTGCGGTATGAGGAGAACATGTGGCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACTACAGAGAGGGTCCTTCAGGGCCTGCTA
AGGCCCTTGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTCCAGGCTGACCTTGCTCAGGCCAGAGAAA
GATGGGGAAGCCACCGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCGCCCTGACCCCACAGGCCCTGGGCTGGACAGAGAG
CAGCTGTATTTGGAGCTGAGCCAGCTGACCCACAGCATCACTGAGCTGGGCCCCTACACACTGGACAGGGACAGT
CTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCGGAGCTCTGTACCCACCACCAGCACCGGGGTGGTCAGCGAGGAGCCATTC
ACACTGAACTTCACCATCAACAACCTGCGCTACATGGCGGACATGGGCCAACCCGGCTCCCTCAAGTTCAACATC
ACAGACAACGTCATGAAGCACCTGCTCAGTCCTTTGTTCCAGAGGAGCAGCCTGGGTGCACGGTACACAGGCTGC
AGGGTCATCGCACTAAGGTCTGTGAAGAACGGTGCTGAGACACGGGTGGACCTCCTCTGCACCTACCTGCAGCCC
CTCAGCGGCCCAGGTCTGCCTATCAAGCAGGTGTTCCATGAGCTGAGCCAGCAGACCCATGGCATCACCCGGCTG
GGCCCCTACTCTCTGGACAAAGACAGCCTCTACCTTAACGGTTACAATGAACCTGGTCTAGATGAGCCTCCTACA
ACTCCCAAGCCAGCCACCACATTCCTGCCTCCTCTGTCAGAAGCCACAACAGCCATGGGGTACCACCTGAAGACC
CTCACACTCAACTTCACCATCTCCAATCTCCAGTATTCACCAGATATGGGCAAGGGCTCAGCTACATTCAACTCC
ACCGAGGGGGTCCTTCAGCACCTGCTCAGACCCTTGTTCCAGAAGAGCAGCATGGGCCCCTTCTACTTGGGTTGC
CAACTGATCTCCCTCAGGCCTGAGAAGGATGGGGCAGCCACTGGTGTGGACACCACCTGCACCTACCACCCTGAC
CCTGTGGGCCCCGGGCTGGACATACAGCAGCTTTACTGGGAGCTGAGTCAGCTGACCCATGGTGTCACCCAACTG
GGCTTCTATGTCCTGGACAGGGATAGCCTCTTCATCAATGGCTATGCACCCCAGAATTTATCAATCCGGGGCGAG
TACCAGATAAATTTCCACATTGTCAACTGGAACCTCAGTAATCCAGACCCCACATCCTCAGAGTACATCACCCTG
CTGAGGGACATCCAGGACAAGGTCACCACACTCTACAAAGGCAGTCAACTACATGACACATTCCGCTTCTGCCTG
GTCACCAACTTGACGATGGACTCCGTGTTGGTCACTGTCAAGGCATTGTTCTCCTCCAATTTGGACCCCAGCCTG
GTGGAGCAAGTCTTTCTAGATAAGACCCTGAATGCCTCATTCCATTGGCTGGGCTCCACCTACCAGTTGGTGGAC
ATCCATGTGACAGAAATGGAGTCATCAGTTTATCAACCAACAAGCAGCTCCAGCACCCAGCACTTCTACCCGAAT
TTCACCATCACCAACCTACCATATTCCCAGGACAAAGCCCAGCCAGGCACCACCAATTACCAGAGGAACAAAAGG
AATATTGAGGATGCGCTCAACCAACTCTTCCGAAACAGCAGCATCAAGAGTTATTTTTCTGACTGTCAAGTTTCA
ACATTCAGGTCTGTCCCCAACAGGCACCACACCGGGGTGGACTCCCTGTGTAACTTCTCGCCACTGGCTCGGAGA
94
GTAGACAGAGTTGCCATCTATGAGGAATTTCTGCGGATGACCCGGAATGGTACCCAGCTGCAGAACTTCACCCTG
GACAGGAGCAGTGTCCTTGTGGATGGGTATTCTCCCAACAGAAATGAGCCCTTAACTGGGAATTCTGACCTTCCC
TTCTGGGCTGTCATCTTCATCGGCTTGGCAGGACTCCTGGGACTCATCACATGCCTGATCTGCGGTGTCCTGGTG
ACCACCCGCCGGCGGAAGAAGGAAGGAGAATACAACGTCCAGCAACAGTGCCCAGGCTACTACCAGTCACACCTA
GACCTGGAGGATCTGCAATGACTGGAACTTGCCGGTGCCTGGGGTGCCTTTCCCCCAGCCAGGGTCCAAAGAAGC
TTGGCTGGGGCAGAAATAAACCATATTGGTCG
Secuencia del RNA mensajero codificante para Antígeno de Cáncer 125 en sombreado color gris. Se muestran en
color rojo los iniciadores diseñados para el estudio. El RNA mensajero está conformado por 3447 pb, mientras
que el tamaño del amplificado con los iniciadores utilizados para el estudio fue de 2688 pb más los 4 pb
agregados (CACC) para la clonación dirigida en los vectores Champion™ pET Directional TOPO® Expression
Kits (Invitrogen). La secuencia que codifica para CA125 forma parte del gen que codifica para mucina 16, la cual
produce una proteína que está conformada por regiones con repetidos en tándem conservados, además de
regiones transmembrana y un tallo citoplasmático (Yin et al. 2001, Yin et al. 2002). Los iniciadores que se
diseñaron para la amplificación de este gen fueron diseñados para amplificar casi por completo las regiones que
se encuentran de repetidos en tándem y las dos regiones, transmembrana y el tallo citoplasmático.
95
17. ANEXO 8
17.1. CEA
GAAGAGACTCAGGGCAGAGGGAGGAAGGACAGCAGACCAGACAGTCACAGCAGCCTTGACAAAACGTTCCTGGAA
CTCAAGCTCTTCTCCACAGAGGAGGACAGAGCAGACAGCAGAGACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAG
ATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAA
GCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCA
GCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGG
AACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCA
GAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAAC
TGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAA
GGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCT
CCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACAC
AGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTA
TGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCA
CGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTT
TATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAG
GACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCAGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGT
GGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAA
TCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAG
GAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACAAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAA
TGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCT
CTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACA
AGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGG
CCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTC
CAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTG
GGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAA
TGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGT
CACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAA
CCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCA
ACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTT
GGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGC
TGGGGCCACTGTCGGCATCATGATTGGAGTGCTGGTTGGGGTTGCTCTGATATAGCAGCCCTGGTGTAGTTTCTT
CATTTCAGGAAGACTGACAGTTGTTTTGCTTCTTCCTTAAAGCATTTGCAACAGCTACAGTCTAAAATTGCTTCT
TTACCAAGGATATTTACAGAAAAGACTCTGACCAGAGATCGAGACCATCCTAGCCAACATCGTGAAACCCCATCT
CTACTAAAAATACAAAAATGAGCTGGGCTTGGTGGCGCGCACCTGTAGTCCCAGTTACTCGGGAGGCTGAGGCAG
GAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGTGGAGATTGCAGTGAGCCCAGATCGCACCACTGCACTCCAGTCTGGCAACAG
AGCAAGACTCCATCTCAAAAAGAAAAGAAAAGAAGACTCTGACCTGTACTCTTGAATACAAGTTTCTGATACCAC
TGCACTGTCTGAGAATTTCCAAAACTTTAATGAACTAACTGACAGCTTCATGAAACTGTCCACCAAGATCAAGCA
GAGAAAATAATTAATTTCATGGGACTAAATGAACTAATGAGGATAATATTTTCATAATTTTTTATTTGAAATTTT
GCTGATTCTTTAAATGTCTTGTTTCCCAGATTTCAGGAAACTTTTTTTCTTTTAAGCTATCCACAGCTTACAGCA
ATTTGATAAAATATACTTTTGTGAACAAAAATTGAGACATTTACATTTTCTCCCTATGTGGTCGCTCCAGACTTG
GGAAACTATTCATGAATATTTATATTGTATGGTAATATAGTTATTGCACAAGTTCAATAAAAATCTGCTCTTTGT
ATGACAGAATACATTTGAAAACATTGGTTATATTACCAAGACTTTGACTAGAATGTCGTATTTGAGGATATAAAC
CCATAGGTAATAAACCCACAGGTACTACAAACAAAGTCTGAAGTCAGCCTTGGTTTGGCTTCCTAGTGTCAATTA
AACTTCTAAAAGTTTAATCTGAGATTCCTTATAAAAACTTCCAGCAAAGCAACTTTAAAAAAGTCTGTGTGGGCC
GGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGATCCGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCC
AGACCATCCTGGCTAACACAGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAGTTAGCCGGGCGTGGTGGTGG
GGGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAACGGCATGAACCCGGGAGGCAGGGCTTGCAGTGA
96
GCCAAGATCATGCCGCTGCACTCCAGCCTGGGAGACAAAGTGAGACTCCGTCAAAAAAAAAAAAAAGTCTATGTG
GTCAGTCACTACTCTTGCTGCAGTTATGAAAAGAATGAGGCCAAGTCTGATGAAAATAAACTTATTTTGAAAACA
Secuencia del RNA mensajero codificante para Antígeno carcinoembrionario (CEA) en sombreado color gris. Se
muestran en color rojo los iniciadores diseñados para el estudio. El RNA mensajero está conformado por 2109
pb, mientras que el tamaño del amplificado con los iniciadores utilizados para el estudio fue de 2025 pb más los 4
pb agregados (CACC) para la clonación dirigida en los vectores Champion™ pET Directional TOPO®
Expression Kits (Invitrogen).
97
18. ANEXO 9
18.1. Mapa y características del vector pET101/D-TOPO
98
19. ANEXO 10
19.1. Mapa y características del vector pET102/D-TOPO
99
20. ANEXO 11
20.1. Tabla de sueros de pacientes analizados en el estudio
Paciente CP Paciente
EPOC
Fumadores
1 1 1
3 2 2
4 3 3
5 4 4
6 5 5
8 6 6
10 8 8
11 10 9
12 11 10
13 12 11
15 14 12
16 15 13
17 16 14
18 17 15
19 18 19
20 19 20
21 20 21
22 21 22
23 22 23
25 23 24
26 24 25
27 25 26
28 26 27
30 28 28
32 29 29
33 30 30
34 31 31
35 32 32
36 33 33
37 34 35
100
21. ANEXO 12
21.1. Tabla de datos de pacientes con cáncer de pulmón analizados
Paciente CP Tipo histológico Etapa Edad Genero
1 Carcinoma de SCLC IV 69 F
3 Adenocarcinoma III 78 F
4 Adenocarcinoma III 74 F
5 ************ *** *** ***
6 Adenocarcinoma III 71 M
8 ************ *** *** ***
10 Adenocarcinoma IV 73 M
11 Adenocarcinoma *** 46 F
12 adenocarcinoma SCLC IV 61 F
13 Carcinoma SCLC IV 74 M
15 Carcinoma NSCLC III 80 M
16 Adenocarcinoma IV 66 F
17 Carcinoma broncogénico IV 40 F
18 Carcinoma de células
escamosas
*** 69 M
19 Adenocarcinoma III 53 F
20 ************ *** *** ***
21 Adenocarcinoma *** 52 F
22 Adenocarcinoma *** 83 M
23 ************ *** 80 F
25 ************ *** 69 M
26 ************ *** 62 F
27 ************ *** Nd ***
28 ************ *** Nd ***
30 ************ *** 79 M
32 ************ *** 71 F
33 Adenocarcinoma IV 50 M
34 ************ *** 67 M
35 Adenocarcinoma IV 52 M
36 ************ *** 85 F
37 Carcinoma SCLC ND 71 M
Líneas celulares
Organism: Homo sapiens, human
Tissue: cervix
Disease: adenocarcinoma
Cell Type: epithelial
Age: 31 years adult
Gender: female
Morphology: epithelial
Hela Markers: Y
Growth Properties: adherent
Virus Susceptibility:
Viral Testing: ATCC confirmed this cell line is positive for the presence of human papilloma (HPV) viral DNA
sequences via PCR.
Isoenzymes:
G6PD, A
DNA Profile:
Amelogenin: X
CSF1PO: 9,10
D13S317: 12,13.3
D16S539: 9,10
D5S818: 11,12
D7S820: 8,12
THO1: 7
TPOX: 8,12
vWA: 16,18
Cytogenetic Analysis: Modal number = 82; range = 70 to 164.
There is a small telocentric chromosome in 98% of the cells. 100% aneuploidy in 1385 cells examined. Four
typical HeLa marker chromosomes have been reported in the literature. HeLa Marker Chromosomes: One copy
of Ml, one copy of M2, fourfive copies of M3, and two copies of M4 as revealed by Gbanding patterns. M1 is
a rearranged long arm and centromere of chromosome 1 and the long arm of chromosome 3. M2 is a
combination of short arm of chromosome 3 and long arm of chromosome 5. M3 is an isochromosome of the
short arm of chromosome 5. M4 consists of the long arm of chromosome 11 and an arm of chromosome 19.
Note: Cytogenetic information is based on initial seed stock at ATCC. Cytogenetic instability has been reported
in the literature for some cell lines.
Refer to the Certificate of Analysis for batchspecific test results.
ATCC highly recommends that protective gloves and clothing always be used and a full face mask always be
worn when handling frozen vials. It is important to note that some vials leak when submersed in liquid nitrogen
and will slowly fill with liquid nitrogen. Upon thawing, the conversion of the liquid nitrogen back to its gas
phase may result in the vessel exploding or blowing off its cap with dangerous force creating flying debris.
1. Check all containers for leakage or breakage.
2. Remove the frozen cells from the dry ice packaging and immediately place the cells at a temperature
below 130°C, preferably in liquid nitrogen vapor, until ready for use.
To insure the highest level of viability, thaw the vial and initiate the culture as soon as possible upon receipt. If
upon arrival, continued storage of the frozen culture is necessary, it should be stored in liquid nitrogen vapor
phase and not at 70°C. Storage at 70°C will result in loss of viability.
1. Thaw the vial by gentle agitation in a 37°C water bath. To reduce the possibility of contamination, keep
the Oring and cap out of the water. Thawing should be rapid (approximately 2 minutes).
2. Remove the vial from the water bath as soon as the contents are thawed, and decontaminate by
dipping in or spraying with 70% ethanol. All of the operations from this point on should be carried out
under strict aseptic conditions.
3. Transfer the vial contents to a centrifuge tube containing 9.0 mL complete culture medium and spin at
Description
BatchSpecific Information
SAFETY PRECAUTION
Unpacking & Storage Instructions
Handling Procedure for Frozen Cells
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Product Sheet
HeLa (ATCC® CCL2™)
Please read this FIRST
Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
2
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: HeLa (ATCC® CCL2™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
Or contact your local distributor
approximately 125 xg for 5 to7 minutes.
4. Resuspend cell pellet with the recommended complete medium (see the specific batch information for
the culture recommended dilution ratio) and dispense into a 25 cm2 or a 75 cm2 culture flask. It is
important to avoid excessive alkalinity of the medium during recovery of the cells. It is suggested that,
prior to the addition of the vial contents, the culture vessel containing the complete growth medium be
placed into the incubator for at least 15 minutes to allow the medium to reach its normal pH (7.0 to 7.6).
5. Incubate the culture at 37°C in a suitable incubator. A 5% CO2 in air atmosphere is recommended if
using the medium described on this product sheet.
The flask was seeded with cells (see specific batch information) grown and completely filled with medium at
ATCC to prevent loss of cells during shipping.
1. Upon receipt visually examine the culture for macroscopic evidence of any microbial contamination.
Using an inverted microscope (preferably equipped with phasecontrast optics), carefully check for
any evidence of microbial contamination. Also check to determine if the majority of cells are still
attached to the bottom of the flask; during shipping the cultures are sometimes handled roughly and
many of the cells often detach and become suspended in the culture medium (but are still viable).
2. If the cells are still attached, aseptically remove all but 5 to 10 mL of the shipping medium. The
shipping medium can be saved for reuse. Incubate the cells at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere
until they are ready to be subcultured.
3. If the cells are not attached, aseptically remove the entire contents of the flask and centrifuge at
125 x g for 5 to 10 minutes. Remove shipping medium and save. Resuspend the pelleted cells in 10
mL of this medium and add to 25 cm2 flask. Incubate at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere until cells
are ready to be subcultured.
Volumes used in this protocol are for a 75 cm2 flask; proportionally reduce or increase amount of dissociation
medium for culture vessels of other sizes. Corning® T75 flasks (catalog #430641) are recommended for
subculturing this product.
1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of
serum which contains trypsin inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of TrypsinEDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope
until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the
cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
6. Incubate cultures at 37°C.
Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:2 to 1:6 is recommended
Medium Renewal: 2 to 3 times per week
Complete growth medium described above supplemented with 5% (v/v) DMSO. Cell culture tested DMSO is
available as ATCC Catalog No. 4X.
The cells are positive for keratin by immunoperoxidase staining.
HeLa cells have been reported to contain human papilloma virus 18 (HPV18) sequences.
P53 expression was reported to be low, and normal levels of pRB (retinoblastoma suppressor) were found.
References and other information relating to this product are available online at www.atcc.org.
Appropriate safety procedures should always be used with this material. Laboratory safety is discussed in
the current publication of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories from the U.S.
Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes
Handling Procedure for Flask Cultures
Subculturing Procedure
Cryopreservation Medium
Comments
References
Biosafety Level: 2
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Product Sheet
HeLa (ATCC® CCL2™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
2
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: HeLa (ATCC® CCL2™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
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800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
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Or contact your local distributor
for Health.
ATCC Warranty
The viability of ATCC® products is warranted for 30 days from the date of shipment, and is valid only if the
product is stored and cultured according to the information included on this product information sheet. ATCC
lists the media formulation that has been found to be effective for this strain. While other, unspecified media
may also produce satisfactory results, a change in media or the absence of an additive from the ATCC
recommended media may affect recovery, growth and/or function of this strain. If an alternative medium
formulation is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid.
Disclaimers
This product is intended for laboratory research purposes only. It is not intended for use in humans.
While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and uptodate information on this product sheet,
ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy. Citations from scientific literature and
patents are provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that such information has been
confirmed to be accurate.
This product is sent with the condition that you are responsible for its safe storage, handling, and use. ATCC
is not liable for any damages or injuries arising from receipt and/or use of this product. While reasonable effort
is made to ensure authenticity and reliability of strains on deposit, ATCC is not liable for damages arising from
the misidentification or misrepresentation of cultures.
Please see the enclosed Material Transfer Agreement (MTA) for further details regarding the use of this
product. The MTA is also available on our Web site at www.atcc.org
Additional information on this culture is available on the ATCC web site at www.atcc.org.
© ATCC 2015. All rights reserved. ATCC is a registered trademark of the American Type Culture Collection. [04/14]
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HeLa (ATCC® CCL2™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
2
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: HeLa (ATCC® CCL2™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
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Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
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Organism: Homo sapiens, human
Tissue: lung
Disease: Carcinoma
Age: 58 years
Gender: male
Morphology: epithelial
Growth Properties: adherent
Isoenzymes:
G6PD, B
DNA Profile:
Amelogenin: X,Y
CSF1PO: 10,12
D13S317: 11
D16S539: 11,12
D5S818: 11
D7S820: 8,11
THO1: 8,9.3
TPOX: 8,11
vWA: 14
Cytogenetic Analysis: This is a hypotriploid human cell line with the modal chromosome number of 66,
occurring in 24% of cells. Cells with 64 (22%), 65, and 67 chromosome counts also occurred at relatively high
frequencies; the rate with higher ploidies was low at 0.4%. There were 6 markers present in single copies in
all cells. They include der(6)t(1;6) (q11;q27); ?del(6) (p23); del(11) (q21), del(2) (q11), M4 and M5. Most cells
had two X and two Y chromosomes. However, one or both Y chromosomes were lost in 40% of 50 cells
analyzed. Chromosomes N2 and N6 had single copies per cell; and N12 and N17 usually had 4 copies. Note:
Cytogenetic information is based on initial seed stock at ATCC. Cytogenetic instability has been reported in the
literature for some cell lines.
Refer to the Certificate of Analysis for batchspecific test results.
ATCC highly recommends that protective gloves and clothing always be used and a full face mask always be
worn when handling frozen vials. It is important to note that some vials leak when submersed in liquid nitrogen
and will slowly fill with liquid nitrogen. Upon thawing, the conversion of the liquid nitrogen back to its gas
phase may result in the vessel exploding or blowing off its cap with dangerous force creating flying debris.
1. Check all containers for leakage or breakage.
2. Remove the frozen cells from the dry ice packaging and immediately place the cells at a temperature
below 130°C, preferably in liquid nitrogen vapor, until ready for use.
To insure the highest level of viability, thaw the vial and initiate the culture as soon as possible upon receipt. If
upon arrival, continued storage of the frozen culture is necessary, it should be stored in liquid nitrogen vapor
phase and not at 70°C. Storage at 70°C will result in loss of viability.
1. Thaw the vial by gentle agitation in a 37°C water bath. To reduce the possibility of contamination, keep
the Oring and cap out of the water. Thawing should be rapid (approximately 2 minutes).
2. Remove the vial from the water bath as soon as the contents are thawed, and decontaminate by
dipping in or spraying with 70% ethanol. All of the operations from this point on should be carried out
under strict aseptic conditions.
3. Transfer the vial contents to a centrifuge tube containing 9.0 mL complete culture medium. and spin at
approximately 125 x g for 5 to 7 minutes.
4. Resuspend cell pellet with the recommended complete medium (see the specific batch information for
the culture recommended dilution ratio). It is important to avoid excessive alkalinity of the medium
during recovery of the cells. It is suggested that, prior to the addition of the vial contents, the culture
vessel containing the complete growth medium be placed into the incubator for at least 15 minutes to
allow the medium to reach its normal pH (7.0 to 7.6). pH (7.0 to 7.6).
Description
BatchSpecific Information
SAFETY PRECAUTION
Unpacking & Storage Instructions
Handling Procedure for Frozen Cells
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Product Sheet
A549 (ATCC® CCL185™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
F12K Medium, Catalog No. 302004. To make the
complete growth medium, add the following
components to the base medium: fetal bovine serum to
a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: A549 (ATCC® CCL185™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
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800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
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5. Incubate the culture at 37°C in a suitable incubator. A 5% CO2 in air atmosphere is recommended if
using the medium described on this product sheet.
The flask was seeded with cells (see specific batch information) grown and completely filled with medium at
ATCC to prevent loss of cells during shipping.
1. Upon receipt visually examine the culture for macroscopic evidence of any microbial contamination.
Using an inverted microscope (preferably equipped with phasecontrast optics), carefully check for
any evidence of microbial contamination. Also check to determine if the majority of cells are still
attached to the bottom of the flask; during shipping the cultures are sometimes handled roughly and
many of the cells often detach and become suspended in the culture medium (but are still viable).
2. If the cells are still attached, aseptically remove all but 5 to 10 mL of the shipping medium. The
shipping medium can be saved for reuse. Incubate the cells at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere
until they are ready to be subcultured.
3. If the cells are not attached, aseptically remove the entire contents of the flask and centrifuge at
125 x g for 5 to 10 minutes. Remove shipping medium and save. Resuspend the pelleted cells in 10
mL of this medium and add to 25 cm2 flask. Incubate at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere until cells
are ready to be subcultured.
Volumes used in this protocol are for 75 cm2 flask; proportionally reduce or increase amount of dissociation
medium for culture vessels of other sizes. Corning® T75 flasks (catalog #430641) are recommended for
subculturing this product.
1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of
serum that contains trypsin inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of TrypsinEDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope
until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the
cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
Cultures can be established between 2 x 103 and 1 x 104 viable cells/cm2. Do not exceed 7 x 104
cels/cm2.
6. Incubate cultures at 37°C.
Interval: Maintain cultures at a cell concentration between 6 X 103 and 6 X 104 cell/cm2.
Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:8 is recommended
Medium Renewal: 2 to 3 times per week
Complete growth medium described above supplemented with 5% (v/v) DMSO.
Cell culture tested DMSO is available as ATCC Catalog No. 4X.
Studies by M. Lieber, et al. revealed that A549 cells could synthesize lecithin with a high percentage of
desaturated fatty acids utilizing the cytidine diphosphocholine pathway.
References and other information relating to this product are available online at www.atcc.org.
Appropriate safety procedures should always be used with this material. Laboratory safety is discussed in
the current publication of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories from the U.S.
Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes
for Health.
ATCC Warranty
Handling Procedure for Flask Cultures
Subculturing Procedure
Cryopreservation Medium
Comments
References
Biosafety Level: 1
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Product Sheet
A549 (ATCC® CCL185™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
F12K Medium, Catalog No. 302004. To make the
complete growth medium, add the following
components to the base medium: fetal bovine serum to
a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: A549 (ATCC® CCL185™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
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The viability of ATCC® products is warranted for 30 days from the date of shipment, and is valid only if the
product is stored and cultured according to the information included on this product information sheet. ATCC
lists the media formulation that has been found to be effective for this strain. While other, unspecified media
may also produce satisfactory results, a change in media or the absence of an additive from the ATCC
recommended media may affect recovery, growth and/or function of this strain. If an alternative medium
formulation is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid.
Disclaimers
This product is intended for laboratory research purposes only. It is not intended for use in humans.
While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and uptodate information on this product sheet,
ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy. Citations from scientific literature and
patents are provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that such information has been
confirmed to be accurate.
This product is sent with the condition that you are responsible for its safe storage, handling, and use. ATCC
is not liable for any damages or injuries arising from receipt and/or use of this product. While reasonable effort
is made to ensure authenticity and reliability of strains on deposit, ATCC is not liable for damages arising from
the misidentification or misrepresentation of cultures.
Please see the enclosed Material Transfer Agreement (MTA) for further details regarding the use of this
product. The MTA is also available on our Web site at www.atcc.org
Additional information on this culture is available on the ATCC web site at www.atcc.org.
© ATCC 2014. All rights reserved. ATCC is a registered trademark of the American Type Culture Collection. [10/30]
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A549 (ATCC® CCL185™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
F12K Medium, Catalog No. 302004. To make the
complete growth medium, add the following
components to the base medium: fetal bovine serum to
a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: A549 (ATCC® CCL185™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
Or contact your local distributor
Organism: Homo sapiens, human
Tissue: liver
Disease: hepatocellular carcinoma
Age: 15 years adolescent
Gender: male
Morphology: epithelial
Growth Properties: adherent
DNA Profile:
Amelogenin: X,Y
CSF1PO: 10,11
D13S317: 9,13
D16S539: 12,13
D5S818: 11,12
D7S820: 10
THO1: 9
TPOX: 8,9
vWA: 17
Cytogenetic Analysis: modal number = 55 (range = 50 to 60); has a rearranged chromosome 1
Refer to the Certificate of Analysis for batchspecific test results.
ATCC highly recommends that protective gloves and clothing always be used and a full face mask always be
worn when handling frozen vials. It is important to note that some vials leak when submersed in liquid nitrogen
and will slowly fill with liquid nitrogen. Upon thawing, the conversion of the liquid nitrogen back to its gas
phase may result in the vessel exploding or blowing off its cap with dangerous force creating flying debris.
1. Check all containers for leakage or breakage.
2. Remove the frozen cells from the dry ice packaging and immediately place the cells at a temperature
below 130°C, preferably in liquid nitrogen vapor, until ready for use.
To insure the highest level of viability, thaw the vial and initiate the culture as soon as possible upon receipt. If
upon arrival, continued storage of the frozen culture is necessary, it should be stored in liquid nitrogen vapor
phase and not at 70°C. Storage at 70°C will result in loss of viability.
1. Thaw the vial by gentle agitation in a 37°C water bath. To reduce the possibility of contamination, keep
the Oring and cap out of the water. Thawing should be rapid (approximately 2 minutes).
2. Remove the vial from the water bath as soon as the contents are thawed, and decontaminate by
dipping in or spraying with 70% ethanol. All of the operations from this point on should be carried out
under strict aseptic conditions.
3. Transfer the vial contents to a centrifuge tube containing 9.0 mL complete culture medium. and spin at
approximately 125 x g for 5 to7 minutes.
4. Resuspend cell pellet with the recommended complete medium (see the specific batch information for
the culture recommended dilution ratio). and dispense into a 25 cm2 culture flask. Recommended use
of Corning® T75 flasks (catalog #430641). It is important to avoid excessive alkalinity of the medium
during recovery of the cells. It is suggested that, prior to the addition of the vial contents, the culture
vessel containing the complete growth medium be placed into the incubator for at least 15 minutes to
allow the medium to reach its normal pH (7.0 to 7.6). pH (7.0 to 7.6).
5. Incubate the culture at 37°C in a suitable incubator. A 5% CO2 in air atmosphere is recommended if
using the medium described on this product sheet.
The flask was seeded with cells (see specific batch information) grown and completely filled with medium at
ATCC to prevent loss of cells during shipping.
1. Upon receipt visually examine the culture for macroscopic evidence of any microbial contamination.
Description
BatchSpecific Information
SAFETY PRECAUTION
Unpacking & Storage Instructions
Handling Procedure for Frozen Cells
Handling Procedure for Flask Cultures
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Product Sheet
Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB
8065™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB8065™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
Or contact your local distributor
Using an inverted microscope (preferably equipped with phasecontrast optics), carefully check for
any evidence of microbial contamination. Also check to determine if the majority of cells are still
attached to the bottom of the flask; during shipping the cultures are sometimes handled roughly and
many of the cells often detach and become suspended in the culture medium (but are still viable).
2. If the cells are still attached, aseptically remove all but 5 to 10 mL of the shipping medium. The
shipping medium can be saved for reuse. Incubate the cells at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere
until they are ready to be subcultured.
3. If the cells are not attached, aseptically remove the entire contents of the flask and centrifuge at
125 x g for 5 to 10 minutes. Remove shipping medium and save. Resuspend the pelleted cells in 10
mL of this medium and add to 25 cm2 flask. Recommended use of Corning® T75 flasks (catalog
#430641). Incubate at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere until cells are ready to be subcultured.
Volumes are given for a 75 cm2 flask. Corning® T75 flasks (catalog #430641) are recommended for
subculturing this product. Increase or decrease the amount of dissociation medium needed proportionally for
culture vessels of other sizes.
1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of
serum that contains trypsin inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of TrypsinEDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope
until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the
cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
6. Incubate cultures at 37°C.
Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:4 to 1:6 is recommended
Medium Renewal: Twice per week
Complete growth medium described above supplemented with 5% (v/v) DMSO. Cell culture tested DMSO is
available as ATCC Catalog No. 4X.
The cells express 3hydroxy3methylglutarylCoA reductase and hepatic triglyceride lipase activities.
The cells demonstrate decreased expression of apoAI mRNA and increased expression of catalase mRNA in
response to gramoxone (oxidative stress).
There is no evidence of a Hepatitis B virus genome in this cell line.
References and other information relating to this product are available online at www.atcc.org.
Appropriate safety procedures should always be used with this material. Laboratory safety is discussed in
the current publication of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories from the U.S.
Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes
for Health.
ATCC Warranty
The viability of ATCC® products is warranted for 30 days from the date of shipment, and is valid only if the
product is stored and cultured according to the information included on this product information sheet. ATCC
lists the media formulation that has been found to be effective for this strain. While other, unspecified media
may also produce satisfactory results, a change in media or the absence of an additive from the ATCC
recommended media may affect recovery, growth and/or function of this strain. If an alternative medium
formulation is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid.
Disclaimers
This product is intended for laboratory research purposes only. It is not intended for use in humans.
Subculturing Procedure
Cryopreservation Medium
Comments
References
Biosafety Level: 1
Page 2 of 3
Product Sheet
Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB
8065™)
Please read this FIRST
Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB8065™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
Or contact your local distributor
While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and uptodate information on this product sheet,
ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy. Citations from scientific literature and
patents are provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that such information has been
confirmed to be accurate.
This product is sent with the condition that you are responsible for its safe storage, handling, and use. ATCC
is not liable for any damages or injuries arising from receipt and/or use of this product. While reasonable effort
is made to ensure authenticity and reliability of strains on deposit, ATCC is not liable for damages arising from
the misidentification or misrepresentation of cultures.
Please see the enclosed Material Transfer Agreement (MTA) for further details regarding the use of this
product. The MTA is also available on our Web site at www.atcc.org
Additional information on this culture is available on the ATCC web site at www.atcc.org.
© ATCC 2015. All rights reserved. ATCC is a registered trademark of the American Type Culture Collection. [08/04]
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Product Sheet
Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB
8065™)
Please read this FIRST
Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor phase
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30
2003. To make the complete growth medium, add the
following components to the base medium: fetal bovine
serum to a final concentration of 10%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: Hep G2 [HEPG2] (ATCC® HB8065™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
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Organism: Homo sapiens, human
Tissue: ovary
Disease: adenocarcinoma
Cell Type: epithelial
Age: 60 years
Gender: female
Morphology: epithelial
Growth Properties: adherent
Isoenzymes:
AK1, 1
ESD, 1
G6PD, B
GLOI, 1
PGM1, 1
PGM3, 1
DNA Profile:
Amelogenin: X
CSF1PO: 11,12
D13S317: 12
D16S539: 12
D5S818: 11,12
D7S820: 10
THO1: 9,9.3
TPOX: 8
vWA: 17
Cytogenetic Analysis: The cell line is aneuploid human female, with chromosome counts in the sub to near
triploid range. Several normal chromosomes (N11, N13, N14, N15, N16, N17, and N22) are clearly under
represented. Many of these missing chromosomes are represented in the large number of cytogenetically
altered chromosomes identified as marker chromosomes. In addition to the marker chromosomes, there are a
large number of other structurally abnormal and unassignable chromosomes that are not recognized as
markers. Random loss and gain of chromosomes from cell to cell are noted in the exact chromosome counts
and in the analysis of the karyotypes.
Refer to the Certificate of Analysis for batchspecific test results.
ATCC highly recommends that protective gloves and clothing always be used and a full face mask always be
worn when handling frozen vials. It is important to note that some vials leak when submersed in liquid nitrogen
and will slowly fill with liquid nitrogen. Upon thawing, the conversion of the liquid nitrogen back to its gas
phase may result in the vessel exploding or blowing off its cap with dangerous force creating flying debris.
1. Check all containers for leakage or breakage.
2. Remove the frozen cells from the dry ice packaging and immediately place the cells at a temperature
below 130°C, preferably in liquid nitrogen vapor, until ready for use.
To insure the highest level of viability, thaw the vial and initiate the culture as soon as possible upon receipt. If
upon arrival, continued storage of the frozen culture is necessary, it should be stored in liquid nitrogen vapor
phase and not at 70°C. Storage at 70°C will result in loss of viability.
1. Thaw the vial by gentle agitation in a 37°C water bath. To reduce the possibility of contamination, keep
the Oring and cap out of the water. Thawing should be rapid (approximately 2 minutes).
2. Remove the vial from the water bath as soon as the contents are thawed, and decontaminate by
dipping in or spraying with 70% ethanol. All of the operations from this point on should be carried out
under strict aseptic conditions.
3. Transfer the vial contents to a centrifuge tube containing 9.0 mL complete culture medium. and spin at
approximately 125 x g for 5 to 7 minutes.
Description
BatchSpecific Information
SAFETY PRECAUTION
Unpacking & Storage Instructions
Handling Procedure for Frozen Cells
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Product Sheet
NIH:OVCAR3 [OVCAR3]
(ATCC® HTB161™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor
temperature
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
RPMI1640 Medium, Catalog No. 302001. To make the
complete growth medium, add the following
components to the base medium: 0.01 mg/ml bovine
insulin; fetal bovine serum to a final concentration of
20%.
Citation of Strain
If use of this culture results in a scientific publication, it
should be cited in that manuscript in the following
manner: NIH:OVCAR3 [OVCAR3] (ATCC® HTB161™)
American Type Culture Collection
PO Box 1549
Manassas, VA 20108 USA
www.atcc.org
800.638.6597 or 703.365.2700
Fax: 703.365.2750
Email: [email protected]
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4. Resuspend cell pellet with the recommended complete medium (see the specific batch information for
the culture recommended dilution ratio). It is important to avoid excessive alkalinity of the medium
during recovery of the cells. It is suggested that, prior to the addition of the vial contents, the culture
vessel containing the complete growth medium be placed into the incubator for at least 15 minutes to
allow the medium to reach its normal pH (7.0 to 7.6). pH (7.0 to 7.6).
5. Incubate the culture at 37°C in a suitable incubator. A 5% CO2 in air atmosphere is recommended if
using the medium described on this product sheet.
The flask was seeded with cells (see specific batch information) grown and completely filled with medium at
ATCC to prevent loss of cells during shipping.
1. Upon receipt visually examine the culture for macroscopic evidence of any microbial contamination.
Using an inverted microscope (preferably equipped with phasecontrast optics), carefully check for
any evidence of microbial contamination. Also check to determine if the majority of cells are still
attached to the bottom of the flask; during shipping the cultures are sometimes handled roughly and
many of the cells often detach and become suspended in the culture medium (but are still viable).
2. If the cells are still attached, aseptically remove all but 5 to 10 mL of the shipping medium. The
shipping medium can be saved for reuse. Incubate the cells at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere
until they are ready to be subcultured.
3. If the cells are not attached, aseptically remove the entire contents of the flask and centrifuge at
125 x g for 5 to 10 minutes. Remove shipping medium and save. Resuspend the pelleted cells in 10
mL of this medium and add to 25 cm2 flask. Incubate at 37°C in a 5% CO2 in air atmosphere until cells
are ready to be subcultured.
Volumes used in this protocol are for 75 sq cm flasks; proportionally reduce or increase amount of
dissociation medium for culture vessels of other sizes. Corning® T75 flasks (catalog #430641) are
recommended for subculturing this product.
1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with Ca++/Mg++ free Dulbecco's phosphatebuffered saline (DPBS) or
0.25% (w/v) Trypsin 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum which contains trypsin
inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of TrypsinEDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope
until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the
cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 2.0 to 3.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting
5. Resuspend the cell pellet in fresh growth medium. Add appropriate aliquots of the cell suspension to
new culture vessels.
6. Incubate cultures at 37°C.
Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:2 to 1:4 is recommended
Medium Renewal: Every 2 to 3 days
Complete growth medium described above supplemented with 5% (v/v) DMSO. Cell culture tested DMSO is
available as ATCC Catalog No. 4X.
Forms colonies in soft agar and has an abnormal karyotype.
Resistant to clinically relevant concentrations of adriamycin, melphalan and cisplatin.
Both cultured cells and xenografts exhibit androgen and estrogen receptors.
Xenograft models have been used to show that treatment with 17 beta estradiol can induce progesterone
receptors in this human ovarian carcinoma.
References and other information relating to this product are available online at www.atcc.org.
Handling Procedure for Flask Cultures
Subculturing Procedure
Cryopreservation Medium
Comments
References
Biosafety Level: 1
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Product Sheet
NIH:OVCAR3 [OVCAR3]
(ATCC® HTB161™)
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Storage Temp.
liquid nitrogen
vapor
temperature
Biosafety Level
1
Intended Use
This product is intended for research use only. It is not
intended for any animal or human therapeutic or
diagnostic use.
Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
RPMI1640 Medium, Catalog No. 302001. To make the
complete growth medium, add the following
components to the base medium: 0.01 mg/ml bovine
insulin; fetal bovine serum to a final concentration of
20%.
Citation of Strain
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should be cited in that manuscript in the following
manner: NIH:OVCAR3 [OVCAR3] (ATCC® HTB161™)
American Type Culture Collection
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Appropriate safety procedures should always be used with this material. Laboratory safety is discussed in
the current publication of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories from the U.S.
Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes
for Health.
ATCC Warranty
The viability of ATCC® products is warranted for 30 days from the date of shipment, and is valid only if the
product is stored and cultured according to the information included on this product information sheet. ATCC
lists the media formulation that has been found to be effective for this strain. While other, unspecified media
may also produce satisfactory results, a change in media or the absence of an additive from the ATCC
recommended media may affect recovery, growth and/or function of this strain. If an alternative medium
formulation is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid.
Disclaimers
This product is intended for laboratory research purposes only. It is not intended for use in humans.
While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and uptodate information on this product sheet,
ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy. Citations from scientific literature and
patents are provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that such information has been
confirmed to be accurate.
This product is sent with the condition that you are responsible for its safe storage, handling, and use. ATCC
is not liable for any damages or injuries arising from receipt and/or use of this product. While reasonable effort
is made to ensure authenticity and reliability of strains on deposit, ATCC is not liable for damages arising from
the misidentification or misrepresentation of cultures.
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product. The MTA is also available on our Web site at www.atcc.org
Additional information on this culture is available on the ATCC web site at www.atcc.org.
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NIH:OVCAR3 [OVCAR3]
(ATCC® HTB161™)
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liquid nitrogen
vapor
temperature
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Complete Growth Medium
The base medium for this cell line is ATCCformulated
RPMI1640 Medium, Catalog No. 302001. To make the
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insulin; fetal bovine serum to a final concentration of
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Producción científica
1501ISSN 1479-6694Future Oncol. (2014) 10(8), 1501–1513
part of
10.2217/FON.14.21 © 2014 Future Medicine Ltd
REVIEW
Current status of circulating protein biomarkers to aid the early detection of lung cancer
Carlos Enrique Hirales Casillas‡,1, José Miguel Flores Fernández‡,1, Eduardo Padilla Camberos1, Enrique J Herrera López1, Gisela Leal Pacheco1 & Moisés Martínez Velázquez*,1
1Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco Avenida Normalistas 800, Colonia Colinas de la
Normal, 44270, Guadalajara, Jalisco, México
*Author for correspondence: Tel.: +52 333 345 5200 ext. 1370; Fax: +52 333 345 5200 ext. 1001; [email protected] ‡Authors contributed equally
ABSTRACT: Considerable efforts have been undertaken to produce an effective screening method to reduce lung cancer mortality. Imaging tools such as low-dose computed tomography has shown an increase in the detection of early disease and a reduction in the rate of death. This screening modality has, however, several limitations, such as overdiagnosis and a high rate of false positives. Therefore, new screening methods, such as the use of circulating protein biomarkers, have emerged as an option that could complement imaging studies. In this review, current imaging techniques applied to lung cancer screening protocols are presented, as well as up-to-date status of circulating protein biomarker panels that may improve lung cancer diagnosis. Additionally, diverse statistical and artificial intelligence tools applied to the design and optimization of these panels are discussed along with the presentation of two commercially available blood tests recently developed to help detect lung cancer early.
KEYWORDS • blood test • data analysis methods • early detection • high-risk population • lung cancer • multiple biomarker panels • screening
Cancer is the leading cause of death in economically developed countries and the second lead-ing cause of death in developing countries [1]. The global burden of cancer continues to increase largely owing to aging and the growth of the world population alongside an increasing adoption of cancer-causing behaviors, including smoking, physical inactivity and an unbalanced diet [2]. Recent estimates indicate that approximately 12.7 million cancer cases and 7.6 million cancer deaths occurred in 2008 worldwide. Globally, lung cancer was the most frequently diagnosed cancer, as well as the leading cause of cancer death, accounting for 13% (1.6 million) of the total cases and 18% (1.4 million) of the deaths in 2008 [2].
Tobacco smoking is widely recognized as a major cause of lung cancer, accounting for 80% of lung cancer cases in men and at least 50% in women [3]. Compared with nonsmokers, the persistent smoker has a 20-fold increased risk of developing lung cancer. This risk is enhanced according to the number of cigarettes smoked per day, years of smoking, nicotine and tar content and the use of unfiltered cigarettes. The geographic pattern of incidence and mortality for lung cancer is highly related to smoking habits.
Other known risk factors for lung cancer include family history, chronic obstructive pulmo-nary disease (COPD), idiopathic pulmonary fibrosis and exposure to several occupational and environmental carcinogens, such as asbestos, arsenic, radon and polycyclic aromatic hydrocarbons [2,4]. For example, Chinese women have high lung cancer rates despite their lower prevalence of smoking, which is thought to reflect indoor air pollution from unventilated coal-fueled stoves and from cooking fumes [2].
For reprint orders, please contact: [email protected]
Future Oncol. (2014) 10(8)1502
REviEW Hirales Casillas, Flores Fernández, Padilla Camberos, Herrera López, Leal Pacheco & Martínez Velázquez
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By far the most important public health intervention that could reduce lung cancer inci-dence and deaths is changing smoking habits. Unfortunately, the overall prevalence rate of smok-ing is high, in addition to large numbers of indi-viduals with past or passive exposure to smoking, which indicates that lung cancer will continue to be a major public health problem worldwide [5].
At present, more than 75% of patients are diagnosed in the later stages III and IV, when therapeutic options are limited, having a median survival of 6–12 months from the time of diagno-sis with an overall 5-year survival of 5–10% [6]. Therefore, the key to improving lung cancer sur-vival is to diagnose it at an earlier stage, while the tumor is still quite small and locally defined [7,8].
Considerable efforts have been undertaken to produce an effective screening method in order to reduce mortality. These efforts include chest x-ray, sputum cytology, bronchoscopic proce-dures, low-dose computed tomography (LDCT) and molecular diagnosis through nucleic acid or protein biomarkers. These modalities have been evaluated both alone and combined. One of the most promising combinations of these methods consists of LDCT with a companion serum test [9]. As LDCT has a relatively high cost and pre-sents a high rate of false positives, the addition of an economical serum test could complement and improve specificity and cost–effectiveness of the LDCT screening protocol. Using this approach, a serum test could be offered to people who are at higher risk of developing lung cancer and screen those people who received a positive test result with LDCT. Alternatively, a serum test could help to discern indeterminate pulmonary nodules found in patients previously screened by LDCT [9].
With the growing awareness of lung cancer as a systemic disease, there has been a shift in the emphasis of biomarker discovery toward blood specimens. Serum or plasma biomark-ers are attractive as blood is readily available through minimally invasive procedures and their measurements can be easily standardized.
This review deals with current imaging tech-niques applied to lung cancer screening proto-cols, as well as the up-to-date status of circulat-ing protein biomarkers that may improve lung cancer diagnosis. In addition, diverse statistical and artificial intelligence (AI) tools applied to the design and optimization of multibiomarker panels are discussed and commercially avail-able blood tests recently developed for the early detection of lung cancer are presented.
Imaging strategies for early detection of lung cancer Chest x-ray alone & combined with
sputum cytologyCurrently, most lung cancer cases are clinically diagnosed in advanced stages of the disease, when patients present symptoms (e.g., cough, chest pain and weight loss), which adversely affect patient survival. An effective screening will lead to earlier detection of lung cancer, when treatment is more likely to be effective and will decrease mortality. Therefore, there has been considerable interest in developing screening tools to detect early-stage lung cancer. Historically, image tools for lung cancer screening were focused on chest x-rays. In a trial performed in London in the 1960s, male smokers were randomized to chest x-ray every 6 months for 3 years or chest x-rayed at the beginning and the end of the 3-year period. Lung cancer mortality was similar in the screened and the control group [10]. Later, in the 1970s, four randomized trials combined chest x-ray with spu-tum cytology. The US National Cancer Institute (NCI) sponsored three of them. Two trials, the Memorial Sloan–Kettering Study and the Johns Hopkins Study, randomized individuals to annual chest x-ray alone or plus sputum cytology analysis every 4 months, in order to evaluate the incre-mental benefit of sputum cytology in addition to annual chest radiography. There was no decrease in lung cancer mortality rates in the more intensely screened group in either study [10,11]. The third NCI trial, the Mayo Lung Project, randomized subjects to chest x-ray and sputum cytology every 4 months for 6 years versus chest x-ray and sputum cytology annually. The trial reported no reduced mortality from lung cancer [10]. The last trial, performed in Czechoslovakia, randomized male smokers to chest x-ray and sputum cytology every 6 months for 3 years or at the beginning and after 3 years screening. There was no difference in the number of patients who died of lung cancer [10]. These trials, however, were not designed to address the efficacy of chest x-ray versus an absence of any screening and there was no decrease in lung c ancer mortality in any of the trials.
To further determine the role of chest x-ray in screening for lung cancer, in 1992, the NCI initiated the PLCO Cancer Screening trial. An annual comparison of chest x-ray screening versus no screening for lung cancer was included. The PLCO Cancer Screening trial enrolled 154,934 men and women aged from 55 to 74 years, who were randomized to be screened or to receive their
1503
Circulating biomarkers to aid the detection of lung cancer REviEW
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usual medical care, at one of ten screening centers across the USA. Participants in the intervention arm received either three (never smokers) or four (smokers) annual x-ray screens and they were fol-lowed for at least 14 years. From this trial, it is concluded that annual chest x-ray screening did not reduce lung cancer mortality compared with usual care [11–13].
Low-dose computed tomographyA computed tomography (CT) scan is frequently the second step to follow-up on an abnormal chest x-ray finding and involves a series of x-rays that create a 3D view of the lungs. The introduction of CT represents a major advance in cross-sectional imaging due to increased scan speed, improved z-axis spatial resolution and the capacity to recon-struct multiple series from a single data acquisition [11]. The advantage of using such technology is that it allows detection of much smaller nodules (2–3 mm), which would almost certainly not be visible on a chest x-ray. The increase in sensitivity of the CT method is mainly owing to the introduction of helical variables and low doses of radiation [14]. CT has several advantages: it is a real-time moni-toring, noninvasive technique, and can be used in various stages of the disease process [15]. In general, detection of tumors by CT is more sensitive than using conventional chest x-rays [7]. In the early 1990s, projects such as the Early Lung Cancer Action Project began trials using CT imaging. Besides showing increased sensitivity of chest CT over chest x-rays for detecting lung nodules, they exhibited an increase in the detection of early disease over previous chest x-ray screening trials [16]. These studies, however, were not prospective randomized controlled trials and did not confirm any survival benefit. In 2002, the NCI funded the NLST, a randomized trial, to determine whether screening with CT, compared with chest x-ray, would reduce mortality from lung cancer among high-risk persons. A total of 53,454 individuals were enrolled and they were randomly assigned to undergo three annual screenings with either CT or a single-view postero–anterior chest x-ray. In October 2010, the trial was stopped as the available data showed that there was a significant reduction with CT screening in the rates of both death from lung cancer (20%) and death from any cause (6.7%) [17]. This study indicates that to prevent one death from lung cancer, 320 high-risk individuals need to be screened with LDCT [18]. CT screening is also being evaluated in the ongo-ing, randomized controlled European NELSON
trial. In this study, typical care without imaging is used in the control arm [11,19].
The introduction of multidetector CT has sig-nificantly improved resolution and sensitivity of the technique. However, as the large number of images generated may give false-negative results, computer-aided detection has been developed [20]. This system involves the reconstruction of 4D imaging and malignant nodules identifica-tion on the basis of increased vascularity caused by angiogenesis [15].
Recently, the National Comprehensive Cancer Network proposed screening guidelines based on the current body of evidence. These guidelines describe risk factors for lung cancer, recom-mend criteria for selecting high-risk individu-als for screening, provide recommendations for evaluation and follow-up of nodules found dur-ing screening, discuss the accuracy of LDCT screening protocols and imaging modalities and discuss the benefits and risks of screening [18]. In support, and further expanding these guide-lines, last year, The American Association for Thoracic Surgery developed guidelines for lung cancer screening, using LDCT scans for lung cancer survivors and other high-risk groups [21]. These guidelines recommend annual lung can-cer screening with LDCT for North Americans aged 55–79 years with a 30-pack-year history of smoking. Long-term lung cancer survivors should also have annual LDCT to detect second primary lung cancer until the age of 79 years. Moreover, annual LDCT should be offered to patients aged 50–79 years with a 20-pack-year smoking his-tory and other factors that produce a cumulative risk of developing lung cancer, such as COPD, environmental and occupational exposures, any prior cancer or thoracic radiation or a genetic or family history [21].
Although CT screening has the potential to diagnose early lung cancer in high-risk patients, it has also major drawbacks. Screening may require serial CT imaging and, therefore, repeated radia-tion to the chest, which has an associated risk of carcinogenesis or may lead to biopsy or surgery of asymptomatic, benign disease [8]. Screening could also present some bias. Lead-time bias occurs when the time of diagnosis is advanced by screening, but the time of death is unchanged. Thus, comparing survival rates among screened and unscreened patients can create the appear-ance of better outcomes by prolonging survival among screenees, but not altering mortality. Length-time bias refers to the tendency of the
Future Oncol. (2014) 10(8)1504
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screening test to detect cancers that take longer to become symptomatic, possibly since they are slower growing and perhaps indolent cancers. Another important screening bias is overdiag-nosis, in which cancers that would never have been important during an i ndividual’s lifetime are diagnosed and treated [5,18].
Circulating protein biomarkers for early detection of lung cancer Optimizing multibiomarker panels
The addition of biomarker analysis to LDCT screening results can improve discrimination between individuals with and without lung can-cer. Many single biomarkers may be associated with malignancy. However, no single biomarker has shown sufficient sensitivity/specificity to be considered as a diagnostic tool for the disease. Therefore, it is of paramount importance to find strategies to extract and correlate information from a large set of biomarkers. Nevertheless, achieving this task is not trivial, and powerful tools are needed to find the key information. In the case of lung cancer, each biomarker on its own has low diagnostic value owing to its limited sensitivity/specificity, which is partially owing to the heterogeneity of the disease and the risk factors associated with its development. This has led to the search for protein profiles charac-teristic of lung cancer patients, using molecular techniques, such as 2D gel electrophoresis, mass spectrometry (MS) and protein arrays [22,23]. In particular, the use of liquid chromatography-tandem MS can help identify and quantify thou-sands of proteins or peptides in serum/plasma of lung cancer patients and healthy controls [24]. Meanwhile, a proteomic profiling using matrix-assisted laser desorption ionization MS method, generates a spectrum with 200–300 peaks per analyzed sample [25]. Thus, one of the most important steps is to reduce the high dimen-sion of these spectra to extract the discrimina-tory features or the best combination of markers capable of differentiating between cancer and noncancer. To accomplish this, spectra are pro-cessed using computerized algorithms based on multivariate statistical analyses.
Although an in-depth explanation about how these methods function is beyond the scope of this review, it is important to mention that sev-eral different algorithms have been applied to elucidate significant differences between groups (cancer vs noncancer), such as logistic regres-sion (LR), linear and quadratic discriminant
analysis, random forest (RF), classification and regression trees, fuzzy logic and artificial neural networks (ANNs). These methods have led to the improvement of multibiomarker panels and to the development of classifiers that are capable to dis-criminate between cancer and noncancer samples. Table 1 summarizes the multiple biomarker panels recently developed that have been proposed to aid the detection of lung cancer. At this point, it is worth mentioning that serum biomarkers, other than antigens or autoantibodies, such as circulat-ing cell-free DNA, circulating methylated genes, mRNAs and a class of short, noncoding RNAs that regulate the translation or degradation of mRNAs, called miRNAs have also been proposed to detect lung cancer [7,26–30]. Owing to space constraints, the present review focuses just on cir-culating proteins, but we do recognize that those independent blood-based biomarkers may com-plement or improve the classification accuracy of protein-based biomarker panels measured in the same patient samples, as exemplified by recent publications on miRNAs profiling to distinguish plasma samples from lung cancer patients versus relevant noncancer controls [31–36]. Thus, these biomarkers deserve further consideration.
LR is a probabilistic method that has been used to classify subjects into two groups previ-ously determined from a set of their observed features. Zhong et al. defined a combination of tumor-associated antibodies that were best able to distinguish patient from control sam-ples. Measurements of the five most predic-tive antibody markers, tentatively paxillin, SEC15L2, BAC clone RP11-499F19, XRCC5 and MALAT1, in 46 cases and controls were combined in a LR model that achieved 91.3% sensitivity and 91.3% specificity [37]. Following a similar approach, Khattar et al. developed a five-marker combination, which afforded 90% sensitivity and 73% specificity in a training and testing strategy. The autoantibody assay used seven amino acid peptides as capture proteins. Unfortunately, parent proteins recognized by these peptides were not identified [38]. In another study, Rom et al. performed immunoassays to detect autoantibodies to ten tumor-associated antigens in sera from 22 lung cancer patients and 172 control subjects. They obtained a sensitivity of 81% and a specificity of 97% with the com-bination of autoantibodies against c-myc, Cyclin A, Cyclin B1, Cyclin D1, CDK2 and survivin [39]. Similarly, Lee et al. proposed a detection method of non-small-cell lung cancer (NSCLC),
1505
Circulating biomarkers to aid the detection of lung cancer REviEW
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combining the biomarkers A1AT, CYFRA 21-1, IGF-1, RANTES and AFP [54]. This panel was tested in a validation set with 21 NSCLC sam-ples and 28 control samples, obtaining a sensitiv-ity of 85.1% and a specificity of 95.9%. More recently, Li et al. developed a proteomic classifier
for the molecular characterization of pulmonary nodules. The 13 classifier proteins were prolow-density LRP1, BGH3, COIA1, TETN, TSP1, ALDOA, GRP78, ISLR, FRIL, LG3BP, PRDX1, FIBA and GSLG1. The classifier was validated on a set of 104 plasma samples and showed a
Table 1. Multiple biomarker panels that have been proposed to detect lung cancer.
Starting biomarkers
Optimized Panel Patients/controls (n)
Sensitivity (%) Specificity (%) Method Ref.
212 Autoantibodies against paxillin, SEC15L2, BAC clone RP11–499F19, XRCC5 and MALAT1
69/79 91.3 91.3 LR [37]
474 Autoantibodies against five proteins not fully identified 63/58 90 73 LR [38]
10 Autoantibodies against c-myc, cyclin A, cyclin B1, cyclin D1, CDK2 and survivin
22/172 81 97 LR [39]
371 LRP1, BGH3, COIA1, TETN, TSP1, ALDOA, GRP78, ISLR, FRIL, LG3BP, PRDX1, FIBA and GSLG1
124/123 71 44 LR [40]
813 Cadherin-1, CD30 ligand, endostatin, HSP90α, LRIG3, MIP-4, pleiotrophin, PRKCI, RGM-C, SCF-sR, sL-selectin and YES
291/1035 89 83 Naive Bayes [41]
5 CYFRA 21–1, NSE and CRP 175/120 92 95 Fuzzy logic [42]
84 CRP, SAA and mucin 1 24/56 70.8 92.9 DA [43]
6 CEA, RBP, A1AT and SCC 49/48 77.8 75.4 CART [44]
5 CYFRA 21–1, NSE and CRP 216/76 73.6 97.4 Fuzzy logic [45]
47 MIP-1α, CEA, SCF, TNF-RI, IFN-γ and TNF-α† 36/71 88 87 RF and CART [46]
38016 Autoantibodies against a macroarray of 1827 peptides 47/106 97.9 97.0 SVMs [47]
5 CYFRA 21–1, NSE and CRP 216/127 73.6 93.9 Fuzzy logic [48]
47 TNFα, CYFRA 21–1, MMP-2, IL-1ra, MCP-1 and sE-selectin 33/55 84.8 85.5 RF and CART [9]
25 Autoantibodies against IMPDH, PGAM, HSP70–9B, Ubiquilin, annexin A1 and annexin A2
117/79 94.8 91.1 RF and CART [8]
6 Autoantibodies against p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, annexin A1 and SOX2‡
655/655 37 90 Monte Carlo [49]
6 Autoantibodies against p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, annexin A1 and SOX2
1077/1306 38 88 Monte Carlo [50]
6 β2-microglobulin, CEA, gastrin, CA125, NSE and sIL-6R 50/90 100 100 ANNs [51]
3 CEA, gastrin and NSE 117/204 98.3 99.5 ANNs [52]
70 Prolactin, TTR, THBS1, E-selectin, CCL5, MIF, PAI-1, erbB-2, CYFRA 21.1 and SAA
30/30 73.3 93.3 RL [53]
30 A1AT, Cyfra 21–1, IGF1, RANTES and AFP§ 21/28 85.1 95.9 RF, DA, SVMs and LR
[54]
14 CYFRA 21–1, CEA, CA-125 and CRP 63/87 94.5 80 PCA and ANNs
[55]
8 Autoantibodies against p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, SOX-2, HuD and MAGE A4¶
836/836 41 91 Monte Carlo [56]
69 Autoantibodies against p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, SOX-2, HuD, MAGE A4, α-enolase, p53 C, CK8, CK20 and Lmyc2
265/265 49 93 Kolmogorov-Smirnov test
[57]
14 MMP-1, MMP-9, CYFRA 21–1, CRP, CEA, YKL-40 and CA-125 19/44 98.97 80 PCA and ANNs
[58]
17 IL-6, IL-10, IL-1ra, sIL-2Rα, SDF-1α+β, TNF-α and MIP-1α 69/67 95 23.3 RF [59]†This panel is to identify lymph node metastases in lung cancer. ‡Autoantibodies that constitute the EarlyCDT®-Lung commercial test. §This panel was identified by LR. ¶Developed with prediagnostic samples. Improved version of EarlyCDT-Lung test. ANN: Artificial neural network; CART: Classification and regression tree; DA: Discriminant analysis; LR: Logistic regression; PCA: Principal component analysis; RF: Random forest; RL: Rule learner; SVM: Support vector machine.
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sensitivity of 71% and a specificity of 44% at a cancer prevalence of 15% [40].
Discriminant analysis (DA) is another tech-nique that constructs combinations of independ-ent variables to classify cases into groups [60]. With DA, Gao et al. measured 84 biomarkers in 24 lung cancer samples and 56 control samples (32 COPD patients and 24 healthy controls). The biomarkers with higher concentration in the lung cancer samples relative to the control sam-ples were used to construct a DA classifier. The panel composed by C-reactive protein (CRP), serum amyloid A and mucin 1 showed a sensi-tivity of 70.8% and a specificity of 92.9% [43].
CART analysis provides a decision tree, in which the branches represent groups of decisions [61]. Patz et al. performed a matched case–control study including 49 lung cancer patients and 48 control subjects. Using a panel of four serum proteins, CEA, RBP, A1AT and SCC, and a CART classifier, they found a sensitivity of 77.8% and a specificity of 75.4% [44].
The RF method is based on the development of a large number of classification trees. It achieves greater stability and makes the method less prone to prediction error as a consequence of distur-bances in the data [62]. In 2009, Borgia et al. used the RF and CART tools to establish a panel of six biomarkers, MIP-1α, CEA, SCF, TNF-RI, IFN-γ and TNF-α. The study was performed with 36 patients with pathologically positive mediasti-nal lymph nodes and 71 negative patients. The sensitivity and specificity reached was of 88 and 87%, respectively [46]. Later on, Farlow et al. evaluated 47 biomarkers against patient cohorts consisting of 90 NSCLC and 43 noncancer con-trols. They found 14 analytes showing statisti-cal relevance upon evaluation. RF analysis then identified a panel of six biomarkers, TNF-α, CYFRA 21-1, IL-1ra, MMP-2, MCP-1 and sE-selectin, as being the most efficacious for diag-nosing early-stage NSCLC. When tested against a second patient cohort including 33 NSCLC and 55 noncancer controls, the panel showed a sensitivity of 84.8% and a specificity of 85.5% [9]. Using a similar approach, Farlow et al. tested a panel of six autoantibodies against IMPDH, PGAM, ubiquilin, annexin A1, annexin A2 and HSP70-9B in a patient cohort consisting of 117 NSCLC and 79 noncancer controls. This panel showed a sensitivity of 94.8% and a specificity of 91.1% [8]. Recently, Daly et al. developed a panel capable of identifying benign from indetermi-nate pulmonarynodules. Seven biomarkers, IL-6,
IL-10, IL-1ra, sIL-2Rα, SDF-1α+β, TNF-α and MIP-1α were selected using RF with a cohort of 69 lung cancer cases and 67 benign cases with nodules. This panel was validated against a cohort from the Mayo Clinic (MN, USA), comprising 20 and 61 malignant and benign lung nodules, respectively. The sensitivity and specificity of this panel was of 95.0 and 23.3%, respectively [59].
On the other hand, Boyle et al. employ-ing a Monte Carlo method, proposed a panel of six autoantibodies against the antigens p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, annexin 1 and SOX2. The study included three patient cohorts (groups 1, 2 and 3 with 145, 241 and 269 lung cancer patients, respectively). The sensitivity/specificity obtained was of 36/91, 39/89 and 37/90% in groups 1, 2 and 3, respec-tively [49]. Thereafter, Lam et al., using the same panel, carried out a postvalidation study on four new data sets that included 574 patients with lung cancer newly detected and 802 controls matched in age, gender and smoking habits. The sensitivity was of 39% at a specificity of 87%. Taking into account the training and validation sets, as well as the four groups studied, the over-all sensitivity/specificity reached was of 38/88%, totalizing 1077 cancer and 1306 control sam-ples, larger numbers than any other study [50]. This panel has been recently improved, reach-ing a sensitivity/specificity of 41/91% (see the ‘EarlyCDT-Lung test’ section) [56].
Bayesian classifiers can predict the probability that a sample can belong to a given class. In the Naive Bayes classifier, it is assumed that the effect of an attribute value on a given class is independ-ent of the values of the other attributes. Ostroff et al. proposed 44 candidate biomarkers to detect NSCLC from controls. Using a Naive Bayes clas-sifier and a greedy forward search algorithm, a 12-protein panel was found based on the follow-ing proteins cadherin-1, CD30 ligand, endosta-tin, HSP90α, LRIG3, MIP-4, pleiotrophin, PRKCI, RGM-C, SCF-sR, sL-selectin and YES, reaching 89% sensitivity and 83% s pecificity in a blinded, independent verification set [41].
Fuzzy logic and ANNs are AI tools recently used in medicine. These AI strategies allow to extract relevant information from large, noisy and uncertain data sets, such as biomarker col-lections. Diverse fuzzy logic applications to lung cancer have been reported. Schneider et al. found an optimal biomarker combination that improved the sensitivity in detecting NSCLC in a cohort of 175 lung cancer patients and 120 control subjects
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(with pulmonary diseases). The panel com-posed by CYFRA 21-1, NSE and CRP yielded a sensitivity of 92% and a specificity of 95% [42]. Later on, Schneider et al., using a fuzzy classifier and the same panel in a cohort of 216 primary lung cancer patients and 76 asbestosis patients, obtained a sensitivity of 73.6% and a specificity of 97.4% [45]. In 2010, Schneider employed the three-biomarker panel and fuzzy logic to detect lung cancer patients (different histological types and stages) from pneumoconiosis patients at high risk of developing lung cancer. The study included 216 lung cancer patients and 127 pneumoconiosis patients. The sensitivity for lung cancer detection in high-risk populations was 73.6% at a speci-ficity of 93.9% [48]. Moreover, Leidinger et al. performed a study to detect lung cancer patients. The lung cancer group consisted of 47 patients (29 patients with NSCLC and 18 with small-cell lung cancer), while the control group was 106 vol-unteers (80 without lung cancer or without other nontumor lung pathology and 26 patients with common nontumor lung pathologies). To classify, they used linear kernel support vector machines and autoantibody profiles against a macroarray of 1827 peptides. The sensitivity and specificity in this study was 97.9 and 97.0%, respectively [47]. Bigbee et al., employing a Rule Learner identified a ten-biomarker panel, prolactin, TTR, THBS1, E-selectin, CCL5, MIF, PAI-1, erbB-2, CYFRA 21.1 and serum amyloid A. This panel was tested in 30 NSCLC patients and 30 controls, showing 73.3% sensitivity and 93.3% specificity [53].
Recently, the ANNs have been applied to lung cancer research. An ANN emulates the learning capacity of the nervous system. The ANN learns to identify a pattern of association between the values of concentration of each biomarker. The output values provide a prediction of the result according to the input values. In a medical con-text, the training generally consists of presenting data of various clinical variables from each patient to the network that will be able to predict the final state observed in each patient as accurately as pos-sible. In addition, if required to evaluate the dis-criminatory ability of ANN, contingency tables, percentages of classification or receiver operating characteristic curves can be used. Table 1 shows diverse ANN applications in lung cancer detec-tion. In 2011, Wu et al. performed a study training a back propagation network with 50 lung cancer patients, 40 benign lung disease patients and 50 normal people. Their ANN had a satisfactory performance with a panel of six serum proteins,
β2-microglobulin, CEA, gastrin, CA125, NSE, sIL-6R and three metal ions (Cu2+/Zn2+, Ca2+and Mg2+), achieving a prediction rate of 85% in the test phase [51]. In another study, Feng et al. employ-ing an ANN tested some of these biomarkers, but adding 19 clinical parameters, such as symptoms, risk factors, smoking, kitchen environment and so on. Their ANN reached a prediction rate of 87.3% in the test phase [52]. Flores-Fernandez et al. evalu-ated 14 biomarkers, whose diagnostic value had been previously demonstrated, in 63 lung cancer patients and 87 controls (58 COPD patients and 29 smokers) [55,58]. A principal component analysis and ANN modeling was used to find an optimized panel composed of four biomarkers, CYFRA 21.1, CEA, CA125 and CRP. The sensitivity of this panel was of 94.5% at a specificity of 80%.
Commercially available blood tests to aid the early detection of lung cancerCurrently, there are two commercially available blood tests to aid the detection of lung cancer in the earliest stages, the Protein Assays Using Lung Cancer Analytes (PAULA’s; Genesys Biolabs, MD, USA) test and the EarlyCDT®-Lung test (Oncimmune, Nottingham, UK), whose func-tion is based on the detection of a panel of pro-teins associated with lung cancer or circulating autoantibodies (immuno-biomarkers) against a panel of tumor antigens, respectively.
PAULA’s testThis test, developed by Genesys Biolabs and launched to market in March 2012, is a blood test based on the detection of a panel of six bio-marker proteins (not declared), associated to lung cancer, intended for asymptomatic indi-viduals who are over the age of 50 years, with a high risk to develop the disease, such as heavy smokers (more than 20-pack-year) and former smokers [63]. However, while the test is commer-cially available, there is no published literature supporting the same. As stated on the com-pany website, the study has not yet been peer reviewed in a scientific or medical journal, there-fore, specific biomarkers constituting the panel are unknown and the information on the lung cancer patients and controls analyzed is lacking. Therefore, we should proceed with caution and take the information just as a statement.
EarlyCDT-Lung testThis blood test has been developed by Oncimmune and is based on the detection of autoantibodies
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(or immuno-biomarkers) against a panel of six tumor-related antigens (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, annexin 1, SOX2). For test validation, Oncimmune has analyzed more than 120,000 samples since 2007 and this test has been com-mercially available since 2009 [64]. As mentioned earlier, the test was clinically validated by Boyle et al. [49] and postvalidated by Lam et al. [50] in 2011. An important finding is that there were no significant differences between different lung can-cer stages, therefore, the test identifies early- as well as late-stage disease. Besides, the test is capable to detect both, NSCLC and small-cell lung cancer.
In addition, the test has been recently improved. In 2012, Chapman et al. evaluated the presence of autoantibodies against a panel of six (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, annexin 1, SOX2) or seven (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4–5, SOX-2, HuD and MAGE A4) anti-gens in samples from 235 patients with newly diagnosed lung cancer and matched controls. They also evaluated two prospective consecu-tive series of 776 and 836 individuals at an increased risk of developing lung cancer, and the sensitivity and specificity of the two panels were compared. The six autoantibodies panel showed a sensitivity of 39% with a specificity of 89%, while the seven autoantibodies panel gave a sensitivity of 41% with a specificity of 91%. These findings were confirmed in the at-risk population, where the seven autoantibodies panel increased the specificity of the test from 82 to 90% with no significant change in sen-sitivity [56].
More recently, Macdonald et al. carried out a searching for new biomarker antigens that might improve the EarlyCDT-Lung test per-formance, using a high-throughput cloning and expression system. They found autoantibodies against five new antigens, α enolase, p53 C, CK-8, CK-20 and Lmyc2. These antigens were combined with the commercial test and evalu-ated in two matched independent cohorts of lung cancer patients. The outcome was a rise in the sensitivity/specificity from 38/86% using only the commercial test to 49/93% using the EarlyCDT-Lung test plus the five new antigens [57]. However, further optimization and technical and clinical validation is required before these antigens can be used in the clinical setting.
The performance of the original six-antigen and the improved seven-antigen EarlyCDT-Lung test in routine clinical use was recently audited in an initial series of 1613 patients
tested by EarlyCDT-Lung test, to determine its clinical utility. The reported sensitivity/specificity (41/91%) of the test in this audit was as predicted by case–control studies pre-viously reported, making it a potentially c omplementary tool to LDCT for lung cancer detection [65].
More recently, these panels were challenged to discriminate between malignant and nonmalig-nant lung nodules, as seen in an NLST setting. A prospective audit was conducted of 423 individu-als known to have a lung nodule for whom lung cancer-associated auto antibodies were measured by EarlyCDT-Lung test. A positive result repre-sented a significant increased risk of malignancy for lung nodules ≥8mm. This varied from two-fold to 3.5-fold depending on nodule size. These data confirm the potential utility of the test in an NLST setting [66].
The ongoing clinical trial, the ECLS study will recruit 10,000 people who are at higher risk of developing lung cancer from Scotland (UK). People who agree to participate will either receive the EarlyCDT-Lung test (seven antigens) or be followed-up by usual medical care. Those who have a positive test result will be offered a chest x-ray and a series of CT scans over 2 years. This study is to find out if earlier detection may help save lives in the long term by following everyone who takes part for up to 10 years [67].
Pending issuesOver the past several years, we have witnessed a rapid progress in the field of circulating protein biomarkers to help early detection of lung can-cer. Commonly, each new set of candidate bio-markers undergoes a reduction process to pro-duce an optimized multibiomarker panel with improved diagnostic capabilities. Despite inten-sive research and major advances in the field, there are still a number of challenges before these panels are used routinely in clinical practice.
The increasing number of multibiomarker panels has underlined the necessity to validate and ultimately implement their use in a clinical setting. Unfortunately, no current standardized method exists for selecting those that are most promising for systematic validation.
The US NCI created the Early Detection Research Network to promote biomarker dis-covery and validation and to help in its transla-tion into clinical practice. This network has pro-posed a five-phase criterion for the development and evaluation of biomarkers [68]. Regrettably,
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the vast majority of biomarker panels described above falls in Phase II, where the assays are able to discriminate individuals with cancer from those without. The patients assessed in this phase have established disease, thus, the utility of the assays in detecting disease early is not demonstrated in this stage. Just a few have moved to Phase III, where specimens collected and stored from a cohort of healthy individuals who were monitored for devel-opment of cancer are used. Evidence for the capac-ity of the biomarker to detect preclinical disease is demonstrated in this phase, through retrospective longitudinal repository studies.
Another concern is regarding the reproduc-ibility of biomarkers in multiple studies. While some biomarkers are consistently informative, others fail to add a diagnostic value in a determi-nate panel. Although this could be a part of the optimization process, it can be also attributed to differences in specimen collection and handling, processing time, storage temperature, analytical technique, reagents and equipment employed, and the assay format. Accordingly, assays and pro-cedures have to be standardized and the quality of the biomarker assay results should be monitored and assessed by different research groups.
Moreover, during the biomarker discovery and validation process, data analysis tools are required to extract meaningful information from the multiple candidate biomarkers in order to gen-erate optimized panels. Nevertheless, this is not a straightforward task; complex large data sets require adequate statistical algorithms, and, in addition, a statistics expert is needed to interpret the results. Multivariate statistical methods along with AI tools are commonly used; however, which will be the proper method to analyze the panels? Discriminant multivariate analysis can handle multiple dependent variables, and it is simple enough to interpret differences between groups; however, this analysis is quite sensitive to outliers, the dependence between variables it is assumed to be linear and the variance is considered equal between diverse groups. The CART and the RF are nonparametric tests and are easy to interpret; the algorithm can identify significant variables and eliminate those not meaningful. Some disad-vantages of these methods are that eventually they could have unstable decision trees; overfitting the training data could give poor results during the testing. The logistic regression is capable of fitting nonlinear data. Some of the advantages of ANN and fuzzy logic compared with statistical meth-ods is that it seems that it is more easier for the
intelligent system to unveil information, which is not evident from the biomarker panels; this is due to the capability of the ANN to operate with nonlinear, uncertain and noisy information, and for the fuzzy system by incorporating knowledge of the operator (which can be a physician). Some disadvantages of intelligent systems are that large data sets are needed. The ANN, during training, could be under- or over-fitted. The performance of the ANN could vary from one training to another, and it is not quite clear the way in which an ANN learns to associate or discriminate use-ful information from large data sets. In general, for all of the statistical and intelligent methods, confident results can only be obtained if large data sets are used.
ConclusionEarly detection of lung cancer is an important opportunity for decreasing mortality. Recently, imaging tools, such as computed tomography, have shown an increase in the detection of early disease and a reduction in the rate of death. This screening modality has, however, several limita-tions, such as overdiagnosis and a high rate of false positives, among others. New screening methods, such as circulating biomarkers, have emerged as an option that could be used as a complement to imaging studies for the early detection of lung cancer.
Many studies have demonstrated that bio-markers, when used in combination, increase their sensitivity and specificity, enhancing the discrimination power between lung cancer patients and control subjects. Statistical and AI tools, as mentioned above, have permitted to optimize biomarker panels for that purpose. Despite these significant advances, some iden-tified panels need replication and independent clinical validation before they can be translated into clinical practice. Moreover, most panels have been evaluated in diagnostic samples; to fully assess the utility of these panels in monitoring asymptomatic patients for lung cancer, there is an urgent need to testing them in prediagnostic samples. Fortunately, some panels have already demonstrated their diagnostic value and seem ready for their clinical implementation. Among the major advances are that these panels are capable to detect both NSCLC and small-cell lung cancer [48,50] and early- and late-stage dis-ease [9,48,50], classify prediagnostic samples [56,65], as well as to discern indeterminate pulmonary nodules [40,53,59,66]. In the meantime, we will be
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awaiting the results of ECLS study with regard to its effectiveness and cost–effectiveness.
Future perspectiveWhat we expect to see in the near future is most promising multibiomarker panels moving to Phase III and upper stages of biomarker develop-ment, under a prospective-specimen-collection,
retrospective-blinded-evaluation design criteria. We envision at least two plausible scenarios where blood tests will be complementing lung cancer screening with LDCT. As exemplified by the ECLS study, a blood test could be offered in first instance to people who are at higher risk of devel-oping lung cancer, hoping that the test will enrich the population being offered x-ray/LDCT with
EXECUTivE SUMMARYBackground
Lung cancer is the leading cause of death among all cancers, as well as the most frequently diagnosed of new cancer cases.
Early detection is a key component for decreasing lung cancer mortality.
Imaging strategies for early detection of lung cancer
Chest x-ray alone and combined with sputum cytology:
ū Several randomized trials have shown that chest x-ray alone and combined with sputum cytology did not reduce lung cancer mortality.
Low-dose computed tomography:
ū The NLST have recently demonstrated a 20% reduction in lung cancer mortality with low-dose computed tomography (LDCT) screening of high-risk patients compared with annual chest x-ray;
ū However, LDCT screening presents a very high rate of false positives.
Circulating protein biomarkers for early detection of lung cancer
Optimizing multibiomarker panels:
ū In the last few years many multibiomarker panels have been developed to aid the detection of lung cancer, and proposed as a companion test to improve LDCT effectiveness;
ū Several multivariate analysis methods have been mostly used to refine biomarker panels and to develop sample classifiers.
Commercially available blood tests to aid the early detection of lung cancer
Protein Assays Using Lung Cancer Analytes (PAULA’s; Genesys Biolabs) test:
ū Specific biomarkers that constitute the PAULA’s test are currently unknown and there is no published literature that support the test validation.
EarlyCDT®-Lung test (Oncimmune):
ū EarlyCDT-Lung test has been extensively tested and validated against early-stage lung cancer patients and control patients. It has been included in the ongoing ECLS study as an initial screen to assess lung cancer risk in high-risk populations and select for a smaller population that requires further screening with LDCT.
Pending issues
Just a few multibiomarker panels have moved to Phase III of biomarker development.
There is a need to standardize assays, procedures and data analysis methods to make biomarkers reproducible in multiple studies.
Conclusion
The realm of early lung cancer diagnosis through serum biomarkers is promising. Most panels need replication and independent clinical validation to assess their utility in monitoring asymptomatic patients for lung cancer.
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people who are more likely to have cancer. This will hopefully lower the false-positive rates from chest x-ray/LDCT. In another way, a blood test could help to discriminate indeterminate pulmonary nodules found in patients previously screened by LDCT. Reasonably, blood tests may consist of dif-ferent biomarkers, depending on their diagnostic purposes and the screening protocol design.
AcknowledgementsThe authors thank K Allen of Peace Corps Mexico for s upport in drafting and revising this manuscript.
Financial & competing interests disclosureThis work was supported by a grant from CONACYT Mexico (FOSISS-2008-1-87628) to Martínez Velázquez. CE Hirales Casillas, JM Flores Fernández and G Leal Pacheco received a scholarship from CONACYT. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a finan-cial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those disclosed.
No writing assistance was utilized in the production of this manuscript.
ReferencesPapers of special note have been highlighted as:• of interest; •• of considerable interest
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a Departamento de Biotecnología Medica y Farmacéutica, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A. C. *Autor que presentará el trabajo: [email protected] Área del Conocimiento: Biotecnología clínica Abstract Lung cancer is the leading cause of cancer-related death, causing the death of more than 1.59 million people worldwide in 2012. Current studies have achieved detection of autoantibodies in patients with lung cancer and people at high risk of developing the disease, detecting these autoantibodies until five years before the tumor develops. It is not clear how patients with lung cancer produce antibodies against its own proteins, but this may be because the proteins have some differences that make them immunogenic, such as misfolding, glycosylation, overexpressed or aberrantly localized in tumor cells. Therefore, we can use these autoantibodies as tumor markers to the development of new tests for the disease. The main objective of the study is to determine the presence of antibodies against Cytoqueratin-19 and Cyfra-21.1 in serum samples from patients with lung cancer whose altered overexpression has previously been shown and propose them as potential diagnostic markers for the disease. We performed the amplification of genes that encode these proteins and cloning in the expression vector pET 101. Recombinant proteins were expressed and purified by affinity purification and finally we performed the autoantibodies detection assay by Western blot using serum samples from lung cancer patients and samples from people with high risk to developing the disease as COPD and heavy smokers. It was achieved the detection of autoantibodies against Cytokeratin 19 in a 60% of lung cancer serum samples, 16% in COPD serum samples and finally 3% in heavy smokers serum samples, unlike Cyfra 21.1 where the detection of autoantibodies was not observed, despite of being one of the major proteins that are overexpressed in the majority of lung cancer cases. Our results support the hypothesis that protein overexpression in lung cancer can cause autoantibodies production against overexpressed proteins. Keywords: Lung Cancer; Biomarkers; Overexpression; Autoantibodies Introduction Cancer figures among the leading causes of morbidity and mortality worldwide, with approximately 14 million new cases and 8.2 million cancer related deaths in 2012. The most common causes of cancer death are lung (1.51 million deaths), liver (745,000 deaths), stomach (723,000 deaths), colorectal (694,000 deaths), breast (521,000 deaths) and oesophageal cancer (400,000 deaths) [1]. The detection of lung cancer is often performed by X-ray, CT scan, biopsy or related primary tumor signs and symptoms, but when the cancer is detected, this is already in a very advanced stage and very few patients are cured with treatment [2,3]. Scientists have searched for specific tumor biomarkers for decades; these new biomarkers can be used clinically as markers for early detection of cancer and monitoring therapy or recurrent disease. A suitable cancer biomarker is a substance found in the body in
an altered amount, implying that a certain type of cancer is present; ideally should be detectable in the blood or other body fluids which can be accessed in a non-invasive way [4]. It has been shown in recent years that circulating serum autoantibodies that react against intracellular proteins are not an exclusive feature of autoimmune and rheumatic diseases, since they have been found in a variety of diseases, including cancer. Still not completely clear how intracellular proteins become the target of autoantibodies, but has been suggested that post-translational modifications associated with aberrant cell death may increase immunogenicity under a pro-inflammatory environment. Other possibilities are that specific autoantigens such as fetal proteins are aberrantly expressed in tumor cells or overexpressed in abnormally high amounts in tissues affected by cancer cells, contributing to the loss of immune tolerance to these antigens [5]. Many researchers have been interested in the use of antibodies as serological markers for the diagnosis of cancer, especially due to the general absence of these autoantibodies in healthy individuals and on a non-cancer condition [6]. These antibodies have been detected in the blood of patients, even five years before they developed the disease, long before CT scanner was able to detect a tumor. Consequently, monitoring of people with increased risk of developing lung cancer, by determining the presence of autoantibodies in the serum could allow early detection of the disease, thus allowing a timely therapeutic intervention [7]. Methods Propagation of the A549 cell line The lung carcinoma cell line A549 was donated by Dr. Raul Barrera Rodriguez of the National Institute of respiratory diseases-SSA. Cells were grown in culture medium DMEM supplemented with 10% fetal
bovine serum and antibiotics (100U/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin). The cells were maintained in an incubator at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. RNA extraction and cDNA synthesis RNA extraction from 10 million cells was performed using TRIzol® Reagent (Invitrogen) following the manufacturer's protocol. The cDNA was synthesized by RT-PCR using the SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix kit (Invitrogen) using the manufacturer's protocol. Amplifying the genes encoding cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 The amplification reaction was performed using the primers for Cyt-19 (sense primer 5´- C ACC ATG ACT TCC TAC AGC TAT CGC AGT C- 3´: antisense primer 5´- GAG GAC CTT GGA GCC AGA CAA ATT GTT GTA- 3´) and Cyfra 21.1 (sense primer: 5´- C ACC ATG CGA AGC CAATAT GAG GT- 3´: antisense primer 5´- GAG GAC CTT GGA GGC AGA C- 3´) using as template cDNA from the lung adenocarcinoma cell line A549. Cloning of amplified sequences and transforming One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells The purification of DNA segments was performed using the QIAEX II Gel Extraction kit (QIAGEN) and the inserts were cloned using the Champion™cloning kit Directional TOPO Expression pET101 (Invitrogen). Finally, the one shot E. coli Top10 chemically competent cells provided in the kit were transformed following the manufacturer's protocol. Transforming BL21 Star™ (DE3) One Shot® Cells and pilot expression. Plasmid extraction was performed using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Analysis of positive transformants by PCR was performed and the amplified sequences were sent to National Laboratory of Genomic for Biodiversity (LANGEBIO) for sequencing. When plasmids containing the insert of interest were identified, the BL21 Star™ (DE3) One Shot® Cells provided in the kit were transformed and a protein pilot expression was performed using the manufacturer's protocol. The protein expression was analyzed by SDS-PAGE and the proteins were transferred to AmershamTM HybondTM- ECL nitrocellulose membrane (GE Healthcare). To end, we performed the Western blot using His-probe (H-3) mouse
monoclonal IgG1 as primary antibody and Goat Anti-Mouse IgG (H-L)-HRP Conjugate (BIO-RAD) as secondary antibody. For the detection of proteins, the substrate HRP Color Development Reagent 4 CN (BIO-RAD) was used, using the manufacturer's protocol. Expression and purification of recombinant proteins The massive expression was performed using the same protocol as seen above. Subsequently, we performed the purification of the recombinant proteins using the nickel chelate columns Bio-ScaleTM ProfinityTM Cartridges IMAC (BIO-RAD), using the denaturing method provided by the manufacturer. Once the recombinant proteins were purified we proceeded to perform 2-D electrophoresis to verify the purity of the proteins using the ReadyStripTM IPG Strips 7 cm, pH 3-10 (BIO-RAD) [8]. The protein of interest was cut from the polyacrylamide gel and electroeluted using the 422 Electro-Eluter equipment and the eluted proteins were separated in a 12% polyacrylamide gel electrophoresis and stained with ProteoSilverTM Silver Stain Kit (SIGMA) using the manufacturer's protocol. Autoantibody detection assay The purified proteins were separated in a preparative 12% SDS-PAGE using the Mini-PROTEAN Tetra Cell (BIO-RAD). The separated proteins were then transferred to AmershamTM HybondTM- ECL nitrocellulose membrane (GE Healthcare) using the Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell equipment (BIO-RAD). The nitrocellulose membrane was cut in 2 mm strips and placed into Mini-Incubators Trays (BIO-RAD). The western blot was performed using as primary antibodies the lung cancer serum as well as serum from people with high risk to developing the disease as COPD and heavy smokers. As secondary antibody Goat Anti-Human IgG (H+L)-HRP Conjugate (BIO-RAD) was used and, for the detection of the reaction of antibodies, HRP Color Development Reagent 4 CN (BIO-RAD) was used as a substrate, using the manufacturer's protocol. Results Amplifying the genes encoding Cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 The amplification of genes that encode Cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 was performed using cDNA from A549 cell line as template. Each sequence analyzed had the molecular weight consistent with the predicted size which was 1204 bp for Cytokeratin 19 (Figure 1A) and 451 bp for Cyfra 21.1 (Figure 1B). Fig 1. Cytokeratin 19 (A) and Cyfra 21.1 (B) gene amplification by PCR using Cyt-19 and Cyfra 21.1 primers and cDNA from the cell line A549 as template. The size of the amplified sequences (1200 bp for Cytokeratin 19 and 450 bp for Cyfra 21.1) matches with the expected sizes. Line 1: MWM 1Kb Plus DNA Ladder; Line 2: negative control; Line 3: amplified Cytokeratin 19 (A) and Cyfra 21.1 (B).
Cloning and expression of cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 recombinant proteins Once the inserts were cloned in the vector, induction of the recombinant proteins was performed. The result of the induction is shown in Figure 2A. Overexpression of the recombinant proteins is observed in the expected weight for cytokeratin 19, which is 48 kDa and 22 kDa for Cyfra 21.1. Subsequently, we performed a Western blot to confirm that antibodies react against the recombinant proteins (figure 2B).
Fig. 2. (A) Coomassie stained 12% SDS-PAGE of bacterial lysate after protein expression. The arrows denote the presence of overexpressed proteins (22 kDa and 48 kDa). (B) A Western blot assay was used to detect the recombinant proteins Cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 using commercial Anti-His antibodies. Lane 1: molecular weight marker; lane 2 and 4: negative control; line 3 and 5: bacterial lysate after expression of Cyfra 21.1 and Cytokeratin 19.
Purification of cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 recombinant proteins The purification of the recombinant proteins was performed using nickel chelating columns. After the purification the fraction obtained was separated in a 12% polyacrylamide gel electrophoresis to verify the protein purity. Fig. 3A shows four fractions of each recombinant proteins obtained in the purification process. Fig. 3. (A) Fractions obtained from purification process. A 22 kDa Cyfra 21.1 and 48 kDa Cytokeratin 19 his tagged proteins were purified from the insoluble fraction using the standard Profinity IMAC denatured purification protocol. Lane 1: MWM Precision Plus Protein Unstained; Lane 2-5: Cyfra 21.1; Lane 6-9: Cytokeratin 19. (B) Coomassie stain of Cyfra 21.1 recombinant protein separated by 2-D gel electrophoresis. The red circle shows the protein that was removed for subsequent electroelution. MWM Precision Plus Protein Unstained. (C) Silver-stained SDS-PAGE gel of protein obtained by electroelution to verify the protein purity. The purified proteins were separated in 2-D electrophoresis using 7 cm IPG strips pH 3-10 (Fig. 3B) and the protein more concentrated (red circle) was cut and electroeluted. The eluted proteins were analyzed by electrophoresis and the gel was stained with silver (Fig. 3C) determining by this way that the proteins were completely pure since another proteins were not observed in the gel. Autoantibody detection assay The presence of anti-Cytokeratin 19 and Cyfra 21.1 autoantibodies in the sera of lung cancer patients was determined by using recombinant human proteins, developed by our research group, as autoantigens. Fig. 4 shows the detection of anti-Cytokeratin 19 autoantibodies in lung cancer sera. Fig. 4. Western blot detection of autoantibodies against recombinant human Cytokeratin 19 protein in the sera of lung cancer patients. Each line was in contact with sera from an individual subject.
Autoantibodies to Cytokeratin 19 protein were detected more frequently in lung cancer patients (18/30; 60%) than in COPD subjects (5/30; 16%) and heavy smoker subjects (1/30; 3%). Unlike cytokeratin 19, reaction of autoantibodies against the recombinant protein Cyfra 21.1 was not observed. Discussion It´s well known that the immune system can respond to cancer cells reacting against molecules that are unique in cancer cells such as tumor-specific antigens (TSAs) or against molecules that are expressed differently by cancer cells and normal cells as tumor-associated antigens (TAAs) [9]. There are a great number of studies that describe the presence of a humoral immune response (autoantibodies) to TAAs in solid tumors included lung cancer, and has been described the presence of these autoantibodies up to 5 years before symptomatic disease [7, 10]. Profiling cancer antigen–related autoantibodies has shown potential in early detection of lung cancer [11]. A previous study analyzed the humoral immune response in cancer patients, finding a humoral response against a wide variety of cellular and extracellular proteins. The more relevant proteins found in the study were derived from overexpressed or mutated proteins [12]. Based on the evidence that the overexpression of proteins can trigger a humoral response, the present work was developed for the searching of autoantibodies against Cytokeratin 19 and Cytokeratin 19 fragment Cyfra 21.1, whose overexpression in lung cancer has been previously demonstrated. Cytokeratin 19 is a member of the acidic type 1 (CK9-CK20) keratins. The main function of the keratins is to maintain the integrity of the epithelial cells because they constitute the cytoskeleton. It has been shown that full-length cytokeratin-19 is released by human tumor cells [13]. During apoptosis Cytokeratin 19 is cleaved by caspase 3 and the soluble fragment (Cyfra 21.1) is released by cancer cells [13, 14]. Cyfra 21.1 and some others proteins such as Neuro-Specific or Carcinoembryonic Antigens are commonly used in lung cancer diagnoses, however, it has been shown that none of these markers are optimal for the early detection of the disease [15, 16], hence the importance of searching for new sources of biomarkers such as autoantibodies against TAAs. In our study, the presence of autoantibodies against Cytokeratin 19 was detected in 18 out of 30 (60%) sera of patients with lung cancer. It has been demonstrated that autoantibodies against a particular TAA are found in only 10-30% of patients, and this is due to the heterogenic nature of cancer [17]. Regarding the control group, the presence of autoantibodies against Cytokeratin 19 was detected in 5 out of 30 (16%) sera of COPD subjects and 1 out of 30 (3%) sera of heavy smokers. Accordingly, several studies have demonstrated the presence of autoantibodies in 0-3% of sera controls [12]. In the case of COPD group, the autoantibodies detection frequency against Cytokeratin 19 is above the reported in the literature and this could be because some patients may already be developing carcinogenesis. This was corroborated with follow up on some patients and was discovered that some of them developed lung cancer. Unlike cytokeratin 19, autoantibodies against Cyfra 21.1 were not detected in the three groups of study, despite of be one of the major overexpressed proteins in the majority of lung cancer cases. To our knowledge, this is the first report that approaches Cytokeratin 19 and Cyfra 21.1autoantibodies detection in sera of lung cancer patients. Conclusion Our study demonstrated the presence of autoantibodies against Cytokeratin 19 in lung cancer patient sera. However, this does not mean that this protein can be used as biomarker alone, because a single autoantibody test lacks the sensitivity and specificity required for cancer diagnosis; nevertheless autoantibodies test against Cytokeratin 19 could be used altogether with a stablished panel for detection of lung cancer to increase sensitivity and specificity of that panel.
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![E. Coli[1]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/55b69d85bb61eb5a0a8b4786/e-coli1-55bd3c33e1a00.jpg)
