TRATAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ...bibliotecagbs.com/archivos/tratamientoyconservacionmuestras.pdf · se deduce de los análisis de tipo

GRUPO BIOINDICACIÓN SEVILLA

TRATAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE FANGOS

ACTIVOS. Eva Rodríguez (Gbs,SEAFSA), Laura Isac (Gbs,RNM310 de la Universidad de Sevilla), Marta Álvarez (Máster Universitario "Análisis y Tecnologías del Agua" de la Universidad de Sevilla), Andrés Zornoza (AVSA-EGEVASA) y Natividad Fernández (Gbs,SAV-DAM-PRIDESA). http://www.grupobioindicacionsevilla.com RESUMEN: La conservación y el tratamiento preliminar realizado a una muestra para cualquier tipo de análisis, es un paso imprescindible a la hora de obtener un resultado fiable. En las muestras de análisis microbiológicos de fangos activos, debido a su peculiaridad, deben realizarse lo más rápidamente posible. Sin embargo, en muchos casos, la analítica debe postergarse y es necesario seguir una metodología de conservación racional, que tenga en cuenta tanto el tipo de análisis, como el tipo de muestra a analizar.

DEFINICIONES:

IF: Índice de fango. Aquel obtenido mediante puntuación de las características macroscópicas y microscópicas del fango activado, que ofrece una visión global sobre el estado estructural de dicho fango.

Valoración macroscópica: Características del fango activado observables a través del ensayo de la V30.

Valoración microscópica: Características del fango activado apreciables a través de la observación microscópica.

Índice de Madoni o SBI (Sludge Biotic Index): Procedimiento que permite cuantificar el nivel de depuración y de actividad biológica de un sistema de tratamiento mediante fangos activos (Madoni, 1994).

Índice de Shanon: Valoración de la diversidad de especies presentes en un ecosistema en función de su densidad y en relación a la información circulante por el ecosistema. Se mide en bit de información.

Flóculo: Forma de agregación de partículas orgánicas e inorgánicas del agua residual, junto con bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas, en un proceso facilitado por la excreción de polímeros extracelulares microbianos. La estructura generada es capaz de diferenciarse de la fase líquida y permitir la separación de fases en los decantadores secundarios.

INTRODUCCIÓN

El análisis microbiológico de fangos activos aporta información adicional sobre la calidad de las

interacciones biológicas y la estructuración del flóculo de fango activo, complementando la información que

se deduce de los análisis de tipo físico-químico.

Estos resultados permiten una visión distinta e incluso, en muchos casos, imprescindible para la correcta

explotación, evitando desequilibrios y alteraciones del sistema depurador.

En muchos casos, no es posible realizar el análisis inmediatamente después a la toma de muestras como es

recomendable, bien debido a la necesidad de un transporte, bien por falta de disponibilidad de tiempo del

personal de laboratorio. En este segundo caso, es necesario realizar una conservación apropiada de la

http://www.grupobioindicacionsevilla.com/


muestra e integrarla en el planning analítico del laboratorio, dado que requiere una alta dedicación, debido a

la complejidad de estos análisis.

En esta situación, la toma de muestras y la conservación de las mismas es un paso fundamental y decisivo

para obtener unos resultados fiables, que permitan posteriormente una toma de decisiones correcta. Sin

embargo, estas operaciones no son tratadas con el suficiente detenimiento en la profusa bibliografía que

existe sobre determinación de bacterias filamentosas y protozoos del fango activo, pasando en muchos casos

desapercibidas.

En general, las premisas obtenidas gracias a la revisión bibliográfica que se ha realizado, pueden agruparse

en los siguientes apartados:

1. - MUESTREO: Es necesario tener en cuenta, como en cualquier toma de muestras, la representatividad y

homogeneidad de la suspensión tomada. Un punto adecuado sería el canal de reparto desde el reactor

biológico a los decantadores secundarios, muestreando cada reactor biológico si funcionan de forma

independiente, teniendo en cuenta que la toma de muestra ha de efectuarse a una profundidad más o menos

fija, evitándose la toma de espumas en superficie (Jenkins, 1996. Parody, 1997. Isac 2003).

Es necesario tomar un volumen mínimo de suspensión, variable éste dependiendo del autor. Así, por

ejemplo, Parody (1997) e Isac (2003) hablan de un frasco de dos litros, limpio aunque no estéril; Alonso et

al., (1981) trabajan con frascos estériles en el que al menos un tercio se reserva vacío para evitar condiciones

de anoxia en el fango (Isac, 2003). Figueredo (1996) indica un volumen de 0,5 L en un frasco de 1 L.

En general, aunque el volumen de muestra pueda ser variable en función de la analítica a realizar, todos están

de acuerdo en la necesidad de dejar una cámara de aire que asegure la presencia de oxígeno en la muestra.

2. - TRANSPORTE: En general, los diversos autores que recogen este apartado indican la necesidad de

mantener la muestra a 4ºC, sin añadir ningún conservante ni llegar a congelar (Jenkins, 1996), ya que en este

caso se romperían las estructuras de los organismos presentes.

Parody (1997) indica que en caso de que el transporte se prolongara en el tiempo, sería adecuado colocar un

difusor o aireador portátil a la muestra.

2


3. - CONSERVACIÓN: La conservación de la muestra hasta el momento de su análisis se debe realizar de

forma distinta en función del tipo de organismo a determinar: protozoos o filamentos.

Protozoos: La mayoría de autores recoge la necesidad de realizar la observación de forma inmediata a la

llegada al laboratorio (Figueredo, 1996; Alonso et al., 1981; Salvadó et al., 1995), con un máximo de cinco

horas tras la toma de muestras (Parody, 1997), sin exceder las 24 horas, ya que se alterarían las

comunidades como consecuencia de la modificación en los recipientes de las condiciones ambientales

originales (Figueredo, 1996). Cabe la posibilidad de preparar dos alícuotas de la muestra: una fijada con

Líquido de Bouin al 10%, cuyo análisis puede postergarse, y otra en fresco, para realizar las

determinaciones taxonómicas inmediatamente (Figueredo, 1996).

Filamentos: A diferencia con los protozoos, las bacterias filamentosas poseen más estabilidad cuando su

análisis es retrasado, hablando algunos autores de mantenimiento de las muestras durante algunos días a

temperatura ambiente y de un par de semanas con refrigeración (Eikelboom, 1975 y Strom y Jenkins,

1984). Si bien la identificación se hace más difícil a medida que aumenta la edad de la muestra (Strom y

Jenkins, 1984). Para la determinación de filamentos, Jenkins (1996) recomienda la conservación en

frigorífico a 4ºC. Por ejemplo, las muestras de fangos de oxidación total son más estables que aquellas con

edades escasas, manteniéndose en buen estado de 7-10 días si son de oxidación total y de 3-4 días en

plantas de alta carga y edades medias (Jenkins, 1996, Fernández et al, 2002).

La experiencia de Grupo Bioindicación Sevilla (GBS) en este tipo de análisis, junto con la realización de

sesiones interlaboratorios con participantes de toda España, ha permitido valorar, en muchas ocasiones,

deterioros de las muestras debidos a su transporte o manipulación. Esta experiencia, junto con la labor

recopilatoria de Dª Marta Álvarez, ha permitido comprobar las premisas en el protocolo de conservación de

muestras y determinar el tratamiento preliminar óptimo para suspensiones de fangos activados sin que se

altere su resultado.

MATERIAL Y MÉTODOS

En el periodo de las sesiones interlaboratorios 2003-2005 se han estudiado 7 muestras que

comprendían un rango en el que se incluía fangos muy jóvenes, en formación, hasta fangos de oxidación

total. La evolución de las muestras se ha contrastado en función de la selección de los parámetros que

definen y valoran las características del fango activo, establecida por GBS (Rodríguez et al, 2004),donde se

valoran:

3


1. - Evolución de las características macroscópicas

2. - Evolución de las características microscópicas

3. - Evolución de los filamentos

4. - Evolución de la comunidad protozoaria

Los parámetros seleccionados para constituir el IF, denominados características macro- y

microscópicas, se encuentran recogidos en la Tabla 2, realizándose el análisis según la metodología descrita

en Jiménez et al. (2001) y en sus modificaciones posteriores (Rodríguez et al, 2004).

Las identificaciones bacterianas se han realizado con base al manual de Jenkins et al. (1996) y

Seviour y Blackall (1999) y apoyadas en distintos artículos que tratan el tema (Eikelboom, 1975; Rozhich,

1982; Suárez, 1993; Laboratorio Central del Departamento de Saneamiento del Ayto de Madrid, 1996; Moro,

1998).

4


Tabla 2. Valoración del IF.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Turbidez Alta

Media Baja

0 4,5 9

Flóculos en suspensión Alta Media Baja

0 4,5 9

Sedimentabilidad Alta Media Baja

9 4,5 0

Olor Correcto Incorrecto

3 0

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS Forma Regular

Irregular 4 0

Tamaño Grande Medio Pequeño

4 7 0

Estructura Compacta Media Abierta

18 9 0

Textura Fuerte Débil

4 0

Cobertura < 10% 10-50% >50%

0 7

3,5

Filamentos en flóculos >20 5-20 <5

0 7

14

Filamentos en disolución Alta Baja

0 3

Diversidad de Protozoos >7 especies 4-7 especies <4 especies

13 7 0

ÍNDICE DE FANGO TOTAL

5


La suma de puntuaciones para ambos grupos de características se traduce en un valor final de IF del que se

definen cinco categorías, cada una de las cuales alude a una calidad distinta del fango (Tabla 3).

Tabla 3. Categorías de IF.

ÍNDICE DE FANGOS: 0-19 pésimo 20-39 malo

40-59 regular 60-79 bueno

80-100 óptimo

Los protozoos se han valorado en función de las densidades parciales de los distintos grupos funcionales

(bacterívoro nadador, bacterívoro reptante, sésil bacterívoro...), densidad total (Ind/L), Índice de Madoni e

Índice de Shannon.

Se ha valorado la conservación de tres formas:

1. - Mantenimiento de la muestra a temperatura ambiente (Conservación Amb)

2. - Mantenimiento de la muestra en frigorífico a 4ºC (Conservación Frig)

3. - Mantenimiento de la muestra con oxigenación a temperatura ambiente (Conservación Oxig)

RESULTADOS

Para proceder a la evaluación del proceso de conservación de las muestras, el periodo de estudio se

estructuró en dos fases. En la primera de ellas se realizó un estudio preliminar para valorar como

evolucionaba la muestra control tras 24 horas de conservación por distintos métodos: a temperatura

ambiente, en frigorífico y a temperatura ambiente con oxigenación, estudiándose por separado las

características macro-microscópicas del fango, los protozoos y las bacterias filamentosas. En una segunda

fase una vez definida la forma más óptima de conservación se estudió la evolución de la muestra para

tiempos superiores a las 24 horas, de cara a definir la estabilidad de la misma, para cada protocolo. Este

seguimiento se realizó a cada una de las muestras de los interlaboratorios.

En función del tratamiento de conservación, las muestras evolucionaron en cada uno de los distintos

apartados del análisis biológico de forma distinta (estudio flocular, bacterias filamentosas y protozoos). En

este punto, resulto especialmente importante el grado de oxidación .

6


Puesto que cada componente del análisis biológico evoluciona de forma diferente, para la caracterización de

protozoos y filamentos se concluyo que era conveniente separar alícuotas de la muestra original y

conservarlas de forma distinta.

PRIMERA FASE

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DEL FANGO (IF): El tratamiento de la muestra afecta de forma

muy importante a las características estructurales del fango. Como punto de partida debemos tener en cuenta

que la conservación en frigorífico (Figuras 1, 2 y 3) y la oxigenación de la muestra a temperatura ambiente

(Figuras 4 y 5) alteran la muestra bastante más que si ésta simplemente se mantuviera a temperatura

ambiente. La conservación en frigorífico ejerce un efecto de rotura sobre la microestructura del flóculo,

afectando a las características microscópicas a evaluar con el IF. Por su parte, la oxigenación facilita el que

continúe la oxidación del flóculo si ésta es en superficie; mientras que si el difusor se coloca en el centro de

la masa de fango, el flóculo se rompe.

GBS GBS GBS

Figura 1: Estructura del fango en muestra control. 200X, in vivo.

Figuras 2 y 3: Ruptura de los flóculos por efecto de la conservación de la muestra en frigorífico. 200X, in vivo

Figura 4: Estructura del fango en la muestra control.

GBS GBS

Figura 5: Oxidación flocular por efecto de la conservación de la muestra con oxigenación. 200X, in vivo

200X, in vivo.

7


Estas alteraciones repercuten igualmente a nivel macroscópico y son visualizadas en el ensayo de la V30 al

modificarse el valor final obtenido según el tipo de conservación realizada, siendo este efecto menos acusado

en las muestras de oxidación total (Figuras 6 y 7).

GBS GBS

AMB FRIG OXIG AMB FRIG OXIG

Figura 6 y 7: Variación de los resultados de la V30 en función del tipo de conservación realizada en un fango joven y uno de oxidación total. (Amb, Frig, Oxig)

De las muestras estudiadas, los fangos más jóvenes resisten peor los distintos tipos de conservación, mientras

que fangos más estabilizados no presentan tanta diferencia con el valor original de la V30. En la figura 8 se

toma como valor cero el valor de la V30 Muestra control, y se representan las desviaciones de este valor en

las distintas muestras analizadas en función del tipo de conservación: a temperatura ambiente, en el

frigorífico y a temperatura ambiente con oxigenación.

8


-240

-190

-140

-90

-40

10

60

Amb Frig Oxig

muestra 1

muestra 2

muestra 3

muestra 4

muestra 5

muestra 6

muestra 7

3 5

4

6 2 5

1

2 4

6

7

1

4

6 7

3 1

2 7 3

5

Figura 8: Desviaciones de los resultados obtenidos según el tipo de conservación en las distintas muestras estudiadas, respecto a la V30 Muestra control. (Amb, Frig, Oxig)

Las muestras 1 y 4 se corresponden con fangos en formación y presentan una gran inestabilidad en la

conservación, especialmente cuando la muestra se mantiene en frigorífico. Las muestras 3 y 7, de alta edad

de fango, son mucho más estables, siendo prácticamente independiente el resultado del sistema de

conservación usado.

Esta diferencia puede deberse a que la bajada de temperatura rompe el flóculo más fácilmente en fangos

jóvenes, donde la cohesión es débil, que en fangos de oxidación total, en los que esa unión es mucho más

fuerte y el efecto de la temperatura menor (Figura 9).

Figura 9: Liberación de bacterias libres al medio tras conservar una muestra de fango joven a 4ºC. (1000X, In vivo)

9


Puede observarse en la figura 9 que la conservación en frigorífico, realizada sobre muestras de fangos

jóvenes, libera bacterias al medio, que provocan aumento en la turbidez del clarificado.

Por lo tanto, parece claro que la evolución de las características estructurales de las muestras a temperatura

ambiente es la que menos se altera respecto a la muestra Muestra control, siendo ésta la mejor opción de

conservación. Esta aseveración se ve refrendada por las experiencias de Alonso et al. (1981) en las que las

muestras para análisis se mantienen durante varios días a temperatura ambiente y sin ningún tipo de

tratamiento. Igualmente, en todas las muestras, la estabilidad de las mismas depende de la edad del fango,

siendo más resistentes aquellas con mayores edades, dado que la cohesión flocular en éstas es mayor y, por

lo tanto, disminuye el efecto que puedan originar la oxigenación o refrigeración como sistemas de

conservación.

BACTERIAS FILAMENTOSAS: Las especies de bacterias filamentosas se mantiene prácticamente

constantes en la conservación de a 4 ºC. Presenta ligeras variaciones a temperatura ambiente y en ocasiones

hemos podido comprobar que la oxigenación de la muestra aumenta el nivel de m/ml de filamentos.

MICROFAUNA: En el caso de la población de protozoos también se observan variaciones en los

porcentajes de los grupos funcionales incluidos en el SBI en base al tratamiento que se dé a la muestra .

Como puede observarse en la Figura 10 el reparto porcentual de los grupos funcionales se mantiene más

estable a las 24 horas si la conservación se realiza con oxigenación o con temperatura ambiente, que si

utilizamos la refrigeración a 4ºC.

Muestra control

61%

37%

2%

bact sesil

bact rep

carniv suctor

Amb

59%

38%

3%Oxig

61%

37%

2%Frig

74%

23%

3%

Figura 10: Modificaciones encontradas en el porcentaje de grupos funcionales definidos en el SBI, tras diversos tratamientos de conservación. (Amb: Conservación a temperatura ambiente, Oxig: Conservación a Temperatura ambiente con oxigenación, Frig: Conservación en frigorífico; Bact sesil: Bacterívoro sesil, Bact rep: Bacterívoro reptante, Carniv suctor: Nadadores carnívoros y suctores)

10


En la tabla 4 se puede concluir el comportamiento medio de las muestras estudiadas, tras conservarlas

durante 24 horas con los distintos tratamientos.

Amb Frig OxigV30 se mantiene disminuye aumenta ligeramente

Macroscopía se mantiene disminuye (++) disminuyeMicroscopía se mantiene disminuye (++) disminuye

Bac filamentosas varia se mantiene aumentaProtozoos disminuye ligeramente disminuye (++) se mantiene

Tabla 4: Comportamientos generales de las muestras estudiadas en función del sistema de

conservación aplicado tras 24 horas. (Amb: Conservación a temperatura ambiente, Frig:

Conservación en frigorífico, Oxig: Mantenimiento a temperatura ambiente con oxigenación)

SEGUNDA FASE:

EVOLUCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MACRO-MICROSCÓPICAS (IF): En general, el ensayo de

la V30 debe realizarse en el momento de la recepción de la muestra en el laboratorio, ya que se ve alterado

en cualquier tipo de muestras por el transcurso del tiempo. Por el contrario, las características macro- y

microscópicas y por lo tanto el IF, varían en su comportamiento en función del tipo de muestra. Para aquellas

con edades de fango medias/altas se pueden postergar sus análisis durante 24 horas y, en algunos casos, hasta

48 horas si no existen problemas de bulking filamentoso. Si la muestra es de oxidación total estas

características pueden aplazarse hasta tres días sin alterarse de forma significativa.

Por la experiencia adquirida en los distintos interlaboratorios organizados por GBS, se sabe que dentro de las

características macroscópicas, la turbidez y los flóculos en suspensión son las que más se ven afectadas por

el transporte y postergación del análisis, mientras que el análisis microscópico presenta resultados más

constante.

EVOLUCIÓN DE LAS BACTERIAS FILAMENTOSAS: Si lo que se pretende es realizar una

determinación de la especie dominante así como una valoración de las bacterias dominantes, este ensayo no

presenta graves problemas al postergarse su análisis, llegando a admitirse hasta cuatro días de retraso. Sin

embargo, el recuento de los m/mL de filamentos (Arnaiz et al, 1999) debe realizarse antes de las 24 horas de

la recogida, ya que este valor se altera fácilmente.

Es de reseñar que aquellos filamentos que se encuentran en concentraciones muy bajas, pueden ver alterada

su concentración, aumentando o disminuyendo según sus parámetros de crecimiento asociados, sin llegar a

desbancar a la especie dominante si la conservación no excede a cinco días. Así, por ejemplo, el filamento

11


Tipo 0914, no detectado en la muestra Muestra control, puede aparecer transcurridas 24-48 horas. Es

característica en este caso la evolución del Tipo 1851, que mantenida la muestra a temperatura ambiente y a

4ºC, aumenta su crecimiento en el transcurso de los días.

El deterioro final de la muestra conlleva el deterioro en los filamentos (pérdidas celulares) y un aumento en

el crecimiento de Espiroquetas, Espirilos y así como el crecimiento disperso, llegando en casos extremos a

aparecer Flexibacter.

Figura 11: Deterioro en muestras conservadas a temperatura ambiente tras 48 horas, con pérdidas celulares en

algunos filamentos y aumento del crecimiento disperso. (100X, In vivo)

En muestras de edades de fango medias, el análisis de filamentos posterior a dos días, según nuestra

experiencia, es similar a la determinación in situ, si bien se detecta normalmente un aumento en el

metabolismo del azufre debido a la anoxia (Figura 12), aumento en el crecimiento epifítico en los filamentos

que dificulta la observación (muy acusado en los Tipos 1701, 0675 y 0041) (Figura 13) y, en ocasiones,

puede aparecer rotura y deterioro de los filamentos como pérdida de células en el tricoma (muy acusado en el

Tipo 1701, Sphaerotilus natans y en general en bacterias filamentosas propias de altas cargas) (Figura 14).

GBS

Figuras 12 y 13: Aumento del metabolismo del azufre y del crecimiento epifítico en bacterias filamentosas. In vivo, 400x.

12


Figura 14: Pérdida de células en el Tipo 1701 conforme pasa el tiempo desde la toma de muestras. 100x, contraste de fases.

En muestras donde se han detectado hongos es característico la aparición de esporangios, si el análisis es

posterior a las 24 horas (Figura 15).

GBS

Figura 15: Esporangios y aumentos en el crecimiento de las hifas de en el transcurso de 48 horas.

EVOLUCIÓN DE LOS PROTOZOOS Y METAZOOS: Al igual que en el análisis de las bacterias

filamentosas, las valoraciones cuantitativas de protozoos deben realizarse antes de 24 horas, pues las

densidades varían. No así el grupo funcional dominante que se mantiene constante hasta las 48 horas,

siempre que la diferencia en abundancia entre los grupos sea importante. Es decir, en muestras donde el

grupo dominante éste claramente definido, este no va a variar con el transcurso del tiempo, sin embargo en

aquellas muestras donde el reparto porcentual sea muy equitativo, pueden presentarse problemas tras 24

horas. Los índices bióticos de Shanon y Madoni siguen las directrices antes marcadas, es decir, Shanon ha de

realizarse antes de 24 horas, ya que se necesita el recuento de individuos en las distintas especies Según

nuestra experiencia en ejercicios interlaboratorios, el índice de Shannon no plantea problemas de

comparación de resultados si el análisis se realiza entre 24 y 48 horas. El SBI puede retrasarse hasta 48

horas, al definirse en función de grupos dominantes y de categorías de densidades.

Esto no quiere decir que no se encuentren alteraciones a nivel de individuos (Figura 16). El transcurso del

tiempo y las deficiencias de oxígeno afectan a las distintas especies de manera singular, dificultando su

identificación: se pierde el equilibrio osmótico quedando la vacuola contráctil inmóvil y bien marcada, así

13


como el macronúcleo (Figura 17), la relación largo/ancho/ancho peristomial se modifican , vacuolización,

etc. (Figura 18).

GBS

Figura 16: Estado de estrés en una Vorticella. In vivo. 200x.

A B

Figura 17: (A) Desequilibrio osmótico en individuo de Vorticella sp.; 400x, contraste de fases. (B) Aspecto general de distintos individuos del complejo Vorticella convallaria; 100x, contraste de fases. (C) Alta vacuolización.

14


B

A

C

Figura 18: Alteración de la relación largo/ancho/ancho peristomial de un organismo del complejo Vorticella Convallaria sometido a estrés ambiental. (A) Organismo en su estado original: 92x52x40 µm. (B) y (C) Organismo una vez que la desecación de la preparación avanzó en el tiempo: 86x62x60 y 90x75x68 µm, respectivamente.

El tiempo transcurrido desde la toma de muestras, hasta el momento del análisis modifica la situación de los

protozoos. Es característica la detección de generación de estados juveniles ("larvas trocóforas") (Figura 19)

de ciliados sésiles, así como fenómenos de conjugación (Figura 20).

Figura 19: Formación de telotroco. 400X. In vivo

Figura 20: Uronema nigricans en conjugación. 400X. In vivo

15


En general, a partir del segundo día, todos los organismos se encuentran en un estado de deterioro bastante

avanzado que en muchos casos impide la determinación

Los metazoos suelen permanecer más tiempo que los protozoos, pero también se ven afectados

notablemente, por el tiempo transcurrido desde la toma de muestras, pudiéndose observar cutículas, espinas y

restos orgánicos en general (Figura 21).

Figura 21: (A) Lóriga de Thuricola sp. y testa de ameba. (B) Restos de un rotíferos y un tardígrado. 200x, campo claro. Restos de rotífero: 100X Retos de Aelosoma, 100X Restos de Tardígrado, 100X In vivo.

A B

GBS GBS

A nivel particular, los organismos más afectados por el retraso en el análisis son los ciliados coloniales,

principalmente los del género Epistylis (Figura 22), que cierran la zona peristomial dificultando su

determinación. . Igualmente Opercularia cierra la zona peristomial, siendo imposible detectar el opérculo,

con lo que la determinación se hace realmente difícil (Figura 23).

Figura 22: Epistylis chrysemydis alterado por retraso en el análisis, en la que la zona peristomial está totalmente cerrada y la identificación es imposible. In vivo. 100x, contraste de fases.

16


B A

Figura 23: Opercularia articulata alterada por retraso en el análisis. En B se observa un individuo con el opérculo desplegado y otro con la zona peristomial completamente contraida. In vivo. 400x, contraste de fases.

Las distintas especies de Vorticella, alteran su tamaño o se deforman, con lo que las medidas realizadas no

nos permiten tomar una decisión a nivel de especie (Figura 18). En estos casos es aconsejable tomar una

alícuota de la muestra y oxigenar para intentar recuperar estos organismos, si bien esta muestra no nos

servirá para determinar el resto de parámetros (identificación de filamentos e IF).

Los pequeños flagelados y algunos ciliados no sésiles van perdiendo movilidad, en algunos casos pueden

enquistarse, dificultando su identificación y recuento (Figura 24). En concreto Bodo sp. Se inmoviliza en la

superficie flocular, dificultándose su recuento.

Si la muestra no está bien conservada y ocurren estos fenómenos, el valor calculado para el SBI puede variar

en un sentido u otro, debido a la proliferación o enquistamiento de pequeños flagelados.

Figura 24: Pequeño flagelado enquistado en muestra alterada por retraso en el análisis. In vivo. 400x, contraste de fases.

17


Los suctores retraen sus tentáculos o los pierden (Figura 25). Los organismos con coberturas externas

(Vaginicola, Thuricola, amebas testáceas) se retraen en el interior de dichas estructuras y se dificulta tanto la

determinación de la especie como su viabilidad. Algunas amebas, desnudas o testáceas, se enquistan (Figura

26).

B A

Figura 25 (A) Podophrya en estado de estrés. In vivo. 400x, contraste de fases. (B) Pérdida de tentáculos de un suctor en una muestra deteriorada. 200x, contraste de fases.

B A

Figura 26: (A) Ameba testácea formando quiste y (B) Ameba desnuda enquistada. In vivo. 400x, contraste de fases.

En general, la identificación de protozoos debe realizarse lo más pronto posible, si bien los porcentajes de

grupos funcionales pueden determinarse algo más tarde, pero siempre antes de 24 horas. Para los recuentos

de microfauna, si se conocen bien los organismos presentes, siempre es posible conservar una alícuota con

líquido de Bouin, para determinar la densidad de la población.

El efecto del tiempo para los distintos análisis queda recogido en la tabla 5, incluyendo el sistema más

óptimo de conservación para cada análisis. Estos procedimientos más óptimos son: : Conservación a

temperatura ambiente para la V30 y la macro-microscopía, conservación en frigorífico a 4ºC para

18


determinación de bacterias filamentosas y conservación a temperatura ambiente con oxigenación para

determinación de protozoos.

análisis inmediato antes 24 horas antes 48 horasV30 ++ + solo si es oxidación total

Macroscopía ++ + solo si es oxidación totalMicroscopía ++ + solo si es oxidación totalconteo m/mL ++ + no

identificación de filamentos ++ ++ ++visu/ identificación especies +++ ++ +SBI, % grupos funcionales +++ ++ ++

Tabla 5: Efecto del tiempo para los distintos análisis en función del tipo de conservación utilizada.

CONCLUSIONES: PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN

1. - Toma de muestras: El canal de la obra de reparto desde el reactor biológico hasta los decantadores

secundarios es el mejor lugar para la toma de muestras de fangos activos, gracias a la homogeneidad del licor

mixto. En el caso de turbinas es conveniente activar el sistema de oxigenación durante al menos 15 minutos

previos a la toma de muestras, para asegurar el mezclado completo en el reactor biológico. Las espumas

pueden dificultar y alterar la toma de muestras, con lo que en caso de proliferación de las mismas sería

necesario reubicar el punto de toma de muestras de forma que afecten lo menos posible. En el caso de varias

líneas que funcionen de forma independiente se debe muestrear cada línea por separado.

La muestra debe tomarse en un frasco de plástico, limpio (no necesariamente estéril) y en un volumen que

variará en función de la analítica a realizar. Para practicar sólo un análisis de organismos y de formación

flocular se recolectarán 150 mL de fango activado en un frasco de 250 mL.

2. - Transporte: La muestra se enviará al laboratorio lo más rápidamente posible en nevera, con una

temperatura en torno a los 13ºC, y procurando que no queden huecos entre las paredes del envalaje, evitando

así movimientos muy bruscos en el transporte que puedan romper los flóculos.

3. Tratamiento preliminar: Una vez recepcionada la muestra se tratará de manera diferencial en función del

tipo de análisis a determinar (Figura 27):

19


Figura 27: Distintas alícuotas de la muestra con tratamientos de conservación diferentes en

función del análisis microbiológico a realizar.

1. - ÍNDICE DE FANGO: Es conveniente realizar la V30 en el momento de recepción de la

muestra, y por lo tanto la macroscopía. Sin embargo, si la dinámica del laboratorio no lo permite, puede

postergarse el análisis durante 24 horas y en casos extremos hasta 48, si no existe bulking filamentoso. En

caso de muestras de oxidación total pude retrasarse el análisis hasta tres días.

La muestra siempre se mantendrá a temperatura ambiente.

2. - BACTERIAS FILAMENTOSAS: Es conveniente realizar, en el momento de recepción de la

muestra varios frotis bacterianos para realizar las tinciones con posterioridad. La muestra fijada puede

conservarse más de una semana sin teñir y, una vez teñida, puede conservarse durante varios meses.

El recuento de m/mL debe realizarse antes de 24 horas.

El visu de las características de los filamentos presentes, así como su valoración cuantitativa, puede

postergarse hasta cuatro días. Es conveniente tomar una alícuota de la muestra y conservar a 4ºC, ya que los

filamentos se mantienen más estables de esta manera. En ningún caso utilizar esta muestra para determinar

otros parámetros.

3. - PROTOZOOS: El visu de los distintos organismos, así como el recuento para la determinación

del Índice de Shanon es conveniente realizarlo antes de 24 horas. Es importante realizar la determinación a

nivel de especies en este periodo y anotar las características funcionales determinantes en la identificación. Si

no es posible, puede postergarse hasta las 48 horas.

En el caso de necesitar solo el Índice de Madoni y el porcentaje de grupos funcionales, puede

aplazarse hasta 48 horas.

20


Es conveniente tomar una alícuota que se oxigenará a temperatura ambiente y en superficie, para no

deteriorar los organismos. De esta forma se consigue activar a los protozoos y facilitar su identificación.

Para analistas con bastante experiencia en identificación de protozoos puede ser conveniente tomar

una alícuota y conservarla con líquido de Bouin, para aplazar el recuento de los distintos protozoos.

Este protocolo de conservación de muestras permite al analista optimizar su tiempo de trabajo y

adecuarlo al planning del laboratorio, aunque debemos tener siempre presente que estamos trabajando con

organismos y estructuras ecológicas generadas por ellos mismos y, por lo tanto, siempre que sea posible, es

mejor realizar estos ensayos cuanto antes para obtener la mayor fiabilidad en los resultados.

AGRADECIMIENTOS

Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a cada una de las empresas y centros a los

que pertenecemos, especialmente a EMASESA, por su apoyo y respaldo a nuestro trabajo.

BIBLIOGRAFÍA.

Alonso, P., Gil, J. y Rodríguez, D. (1981). Estudio de los protozoos de varias depuradoras de aguas

residuales municipales. Bol R. Soc Española His. Nat. (Biol). 79, 67-78.

Arnaiz,. . C., Jiménez, C. Y Estévez, F. (1999). Determinación rápida de microorganismosfilamentosos

en fangos activos. Tecnología del Agua 193, 102-107.

Departamento de Agua y Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid (1997). Manual de laboratorio para

el análisis de aguas residuales y lodos de depuración. Publicación del Exmo. Ayuntamiento de Madrid.

Eikelboom, D. H. (1975). Filamentous organisms observed in activated sludge. Wat. Res. 9, 365-388.

Fernández, N., Rodríguez, E., Isac, L. y Salas, M.D. (2002). "Quick wastewater treatment plants

performance estimation, based on macroscopic characteristics of activated sludge". Congreso

Internacional sobre Tecnologías de pequeña escala para la depuración y gestión de las Aguas

residuales en el ámbito Mediterráneo. Marzo de 2002, CENTA.

Figueredo, A., Campos, J. Y Ruiz, J. (1996). Protozoos como bioindicadores en procesos de depuración

biológica. Tecnología del agua 155. 33-41

21


Isac, L. (2003). Determinación de la actividad biológica aerobia. Aplicación en procesos de depuración

de aguas residuales urbanas e industriales. Tesis doctoral. Universidad de Sevilla.

Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G.T. (1996). Manual on the causes and control of activated

sludge bulking and foaming. 2nd Edition. Lewis publishers (Michigan).

Jiménez, C., Fernández, N., de la Horra, J.M., Rodríguez, E., Isac, L., Salas, M.D. y Gómez, E. (2001).

“Sistema rápido de estimación de los rendimientos en depuración de una EDAR en función de las

características macroscópicas y microscópicas del fango activado”. Tecnología del Agua 216, 40-44.

Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of

activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

Moro, P. (1998). Aparición de organismos filamentosos en fangos activos. Ingeniería Química, Junio

1998, 97-106.

Parody, F. (1997). Microorganismos filamentosos en el fango activo. Publicación de la Empresa

Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S.A. (EMASESA).

Rodríguez, E., Isac, L., Fernández, N. y Salas, M.D. (2004). "Manual de Trabajo para Análisis

Biológicos en Fangos Activados". Jornada de Transferencia de Tecnología sobre "Ejercicios

interlaboratorios en fangos activos como sistema de control de calidad en la EDAR" (Sevilla, Octubre de

2004) I.S.B.N. 608-0189-6.

Rozhich, F. (1982). Control of algal filamentous bulking at the southerly wastewater treatment plant.

Journal W.P.C.F. 54, 3.

Salvadó, H., Gracia, M. P., Amigo, J.M. ( 1995). Capability of ciliated protozoa as indicators of effluent

quality in activated sludge plants. Wat. Res. 29, 4, 1041-1050.

Seviour, R. J. y Blackall, L. L. (1999). The Microbiology of Activated Sludge. Kluwer Academic

Publishers, U.S.A.

Strom, P. y Jenkins, D. (1984). Identification and significance of filamentous microorganisms in

activated sludge. Journal W.P.C.F. 56, 449-459.

Suárez, J., Llorente, V. y Mogollón, T. (1993). Microorganismos filamentosos en las E.D.A.R.s.

Ingeniería Química, Enero 1993, 146-151.

22

Documents

TRATAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ...bibliotecagbs.com/archivos/tratamientoyconservacionmuestras.pdf · se deduce de los análisis de tipo