UD6 ANTIGENOS ANTICUERPOS

FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS HEMATOLÓGICOS Y CITOLÓGICOS IES ALBAIDA

ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS Pag.1 UD6

UNIDAD DIDÁCTICA ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS

REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO66 1. INTRODUCCIÓN

Clásicamente se llamaba antígeno a toda molécula capaz de generar un anticuerpo. En la

actualidad sin embargo, se considera antígeno a cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola, generarlo. Aquellas moléculas que además sean capaces de generar un anticuerpo se les denomina inmunogenas. En este sentido existen moléculas demasiado pequeñas que llamamos haptenos, que para generar anticuerpos necesitan ir unidas a moléculas mas grandes llamadas carrier. Una vez que se han generado de este modo, anticuerpos contra el hapteno, éste puede unirse a los anticuerpos. El hapteno es por tanto, una molécula antigénica pero no inmunógena Propiedades inmunológicas:

Inmunogenicidad: Capacidad de inducir una respuesta inmune específica, humoral y/o celular. En este sentido, antígeno sería sinónimo de inmunógeno. células B + Ag : Células plasmáticas + células B de memoria

Antigenicidad: Capacidad de combinarse con anticuerpos y/o con receptores de células T (TCR). si una molécula es inmunogénica, también es antigénica; sin embargo, la inversa no siempre es verdad: Por ejemplo Los haptenos, por sí mismos no desencadenan respuesta inmune, pero que pueden ligarse a Ac preformados.

Alergenicidad: Capacidad de inducir algún tipo de respuesta alérgica. Los alergenos son inmunógenos que tienden a activar ciertos tipos de respuestas humorales o celulares que dan síntomas de alergia.

2.- FACTORES QUE CONDICIONAN LA INMUNOGENICIDAD

No todos los tipos de moléculas tienen la misma capacidad inmunogénica:

Las más inmunogénicas son las proteínas Los hidratos de carbono poseen menor

capacidad inmunogénica Los lípidos y los ácidos nucleícos sólo son

inmunogénicos cuando van unidos a proteínas o a carbohidratos.

Fig 1 Estructura de las proteínas

A continuación trataremos los factores que condicionan la inmunogenicidad de los antígenos, diferenciando los que dependen de la propia molécula antigénica y los que dependen del sistema biológico (el hospedador donde ocurre la respuesta inmune).



FACTORES DE LA MOLÉCULA INMUNOGÉNICA

Carácter de no-propia. La molécula ha de ser reconocida como una molécula extraña, ajena al individuo. Tenemos pues, que un primer rasgo condicionador de la inmunogenicidad es el grado de falta de parecido entre el antígeno con respecto a moléculas propias.

Tamaño molecular. A mayor tamaño, mayor inmunogenicidad. Sustancias de unos 100.000 dalton (Da) suelen ser buenos inmunógenos, mientras que las de menos de 5.000-10.000 Da son malos inmunógenos.

Heterogeneidad en la composición química. A mayor heterogeneidad de composición química, mejor inmunogenicidad. Los copolímeros sintéticos repetitivos de un solo aminoácido, o los polisacáridos a base de un solo azúcar son malos inmunógenos

Degradabilidad. Sólo las moléculas degradables por el hospedador son buenas inmunógenas. Debido a que la inmunidad humoral y la celular dependen de la activación de los linfocitos TH, que a su vez depende de que éste reconozca antígeno degradado, procesado y presentado por moléculas MHC-II de las células presentadoras de antígeno (APC). Las moléculas no degradables no son buenas inmunógenas. Por ejemplo, los polímeros de D-aminoácidos no pueden ser degradados por los macrófagos (éstos no tienen enzimas hidrolíticas adecuadas), por lo que no pueden se procesados y presentados a los linfocitos TH.

FACTORES DEL SISTEMA BIOLÓGICO

Genotipo del receptor. Cada individuo posee, una dotación genética que influye en el grado de respuesta inmune. Como por ejemplo los que codifican el BCR, el TCR, el CMH.

Dosis y ruta de administración del antígeno. o Dosis muy bajas de Ag pueden no estimular a los linfocitos (falta de respuesta); o Rutas de administración: determinan a qué órgano linfoide irá a parar el antígeno.

Por vía oral se estimula sobre todo el MALT del tracto digestivo por vía parenteral: intravenosa: el antígeno podrá quedar retenido en el bazo Subcutánea: el antígeno terminará en algún ganglio regional

Adyuvantes ( coadyuvantes). Los adyuvantes son sustancias que cuando se mezclan con un Ag y se inyectan con él, mejoran la inmunogenicidad de ese antígeno. Por ejemplo.

o Alúmina: sales insolubles de sulfato alumínico-potásico. Actúa mediante varios mecanismos:

precipita el antígeno. Al inyectarse va liberando el antígeno lentamente, con lo que se suministra un estímulo persistente (el Ag dura varios días en el lugar donde se inoculó).

El Ag precipitado tiene mayor tamaño, por lo que puede ser fagocitado más fácilmente, y por lo tanto es presentado más efectivamente.

3.- EPITOPES Y DETERMINANATES ANTIGÉNICOS

Los epitopos o determinantes antigénicos son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un TCR específico. Son las regiones inmunológicamente activas de un inmunógeno (las que se unen de hecho a un receptor de linfocitos o a un Ac libre).



Por tanto los Antígenos son estructuras complejas que suelen constar de varios tipos de epitopos, cada uno de ellos capaz de unirse con un Ac o un TCR específico diferente.

Fig 2 Epitopes

EPITOPES PARA LINFOCITOS B

Los linfocitos B reconocen epitopes sobre el Ag nativo (es decir con su estructura tridemensional natural). Los epitopos para células B de este tipo de Antígenos (proteínas nativas) suelen consistir en varios aminoácidos de la superficie de la proteína ya que son los que están más accesibles al Ac libre o al Ac de membrana (del BCR).

EPITOPES PARA LINFOCITOS T

o Los péptidos antigénicos reconocidos por células T forman un complejo trimolecular junto con el TCR del linfocito T y el MHC de la célula presentadora o diana. El antígeno reconocido por células T tiene dos zonas de unión: una para ligarse al TCR, denominada epitopo, y otra para engarzar al MHC, denominada agretopo.

o Los péptidos antigénicos implicados en el complejo trimolecular proceden del procesamiento intracelular del inmunógeno proteico original.

DIFERENCIAS EN EL MODO DE RECONOCIMIENTO POR PARTE DE CÉLULAS B Y T

DIFERENCIAS EPITOPOS DE CÉLULAS B EPITOPOS DE CÉLULAS T

Unión con el Ag Binaria: Ig - Ag Ternaria: TCR - Ag- MHC

¿Se une a Ag soluble? Sí No

¿Requiere MHC? No Sí

Naturaleza química del epitopo Proteína Lípido Polisacárido

Únicamente proteínas



4.- HAPTENOS

Se define como hapteno aquel grupo químico definido, de pequeño tamaño, que por sí mismo es incapaz de desencadenar una respuesta inmune (es decir, no es inmunógeno), pero que unido covalentemente a una molécula portadora se comporta como inmunógeno. Por ejemplo. La mayoría de los fármacos tienen moléculas pequeñas y no desencadenan reacciones de hipersensibilidad alérgica por sí solos, sino como haptenos

5.- ANTICUERPOS. INTRODUCCIÓN

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas formadas por cadenas polipeptídicas agru-padas, dependiendo del tipo de inmunoglobulina, en una o varias unidades estructurales básicas. En los vertebrados superiores se distinguen cinco tipos de Ig IgM, IgA, IgG, IgD e IgE.

FUNCIONES Las inmunoglobulinas funcionan como

La parte específica del complejo de las células B, a nivel de membrana, que reconoce al antígeno (Inmunoglobulinas de Membrana)

Moléculas circulantes, es decir ANTICUERPOS secretados por las células plasmáticas procedentes de activación, proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se localizan en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune específico.

6.- UNIDAD ESTRUCTURAL BÁSICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

La unidad básica está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas ligeras (L) idénticas entres si y dos cadenas pesadas (H) idénticas entre si también. Las cuatro cadenas se unen entres si por puentes disulfuro y otras uniones de tipo no covalente.

Las dos cadenas ligeras y las dos cadenas pesadas se agrupan de tal manera que existe una proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos de las cadenas ligeras y pesadas por una parte, y entre los dos extremos carboxílicos de las cadenas pesadas por otra



Esta estructura básica de las inmunoglobulinas puede ser fraccionada mediante la utilización de enzimas (papaína, pepsina, etc.), como fue efectuado por Porter en 1959, obteniéndose diferentes tipos de fragmentos: El tratamiento con papaína produce la ruptura específica de las cadenas H, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro que las une entre sí y los que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos:

uno denominado Fc. Constituido por las dos mitades carboxiloterminales de las cadenas pesadas unidas entre si. Este fragmento es el responsable de ciertas características biológicas como la capacidad para atravesar la placenta.

Dos denominados cada uno de ellos Fab. Constituido cada uno por una cadena ligera y la mitad aminoterminal de la cadena pesada. En este fragmento se encuentra el idiotipo que es por donde la molécula se une al antígeno. Por lo tanto cada estructura básica es bivalente, es decir tiene dos sitios de unión al antígeno por tener dos fragmentos Fab



CADENAS LIGERAS Las cadenas ligeras estan formadas por aproximadamente 220 aminoacidos con dos puentes

disulfuro intracatenarios formando bucles de unos 50 aminoacidos. Al conjunto de aminoácidos que forman un bucle se le denomina dominio. Por tanto cada cadena ligera tiene dos dominios.

Hay dos tipos de cadenas ligeras, estructuralmente diferentes, que se conocen como cadenas

ligeras tipo kappa (κ) y cadenas ligeras tipo lambda (λ). En una misma Ig existen dos cadenas kappa o dos cadenas lambda pero nunca una de cada tipo.

Al comparar distintas cadenas ligeras se observa se observa que los 100 a 110 primeros

aminoácidos difieren entre unas y otras, mientras que los 100-110 últimos son prácticamente idénticos. Ello permite distinguir dos regiones claramente diferenciables en las cadenas ligeras:

Región carboxi-terminal, constante (región CL). Esta zona es distinta entre los dos tipos de cadenas ligeras (Κ y λ ), pero constante para cada tipo.

Región amino-terminal, variable (región VL). Es la zona de unión al Antígeno

Dentro de la región variable se encuentra una zona donde hay mas variabilidad que se denomina región hipervariable. Esta región es el centro activo que permite el reconocimiento y unión al antígeno. Cada una de estas regiones hipervariables se componen de 17 a 20 aminoácidos y cambios en muy pocos aminoácidos de estas zonas suponen una enorme diversidad de posibilidades de unión al antígeno sin variar el resto de la molécula.

El resto de la parte variable es relativamente constante, de modo que sustituciones en los residuos que la constituyen, no afectan la especificidad de combinación; constituye un “sostén de trabajo” pues su misión es presentar adecuadamente en el espacio las regiones hipervariables al antígeno.



CADENAS PESADAS. La cadena pesadas posee unos 440 aminoácidos. Presentan cuatro o cinco puentes disulfuro

intracatenarios que delimitan, por tanto, cuatro o cinco dominios.

En el ser humano existen cinco tipos de cadenas pesadas que se corresponde con cada una de las clases de Inmunoglobulinas. Cada uno de los tipos de cadena pesada recibe una denominación a base de una letra griega, y determinan lo que se denomina clases o isotipos de inmunoglobulinas

Cadena H según la porción C Longitud de la porción C (en aminoácidos) Clase o isotipo de Ig

γ 330 IgG

µ 440 IgM

α 330 IgA

δ 330 IgD

ε 440 IgE

Cada cadena pesada se divide en dos regiones:

Región amino terminal variable de las cadenas pesadas (VH). Similar a la región variable de las cadenas ligeras. Tiene una región hipervariable, que junto con la región hipervariable de las cadenas ligeras forma la zona de unión al antigéno

Región carboxiterminal constante (CH). Es igual para cada clase de Inmunoglobulina. En las cadenas pesadas, a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios, existe una zona de unos 15

aminoacidos denominada zona bisagra. Esta zona es muy flexible. Esta zona permite que los brazos Fab se pueden mover y girar para alinearse mejor con respecto a los epitopos a los que se van a unir.

7. CLASES O ISOTIPOS DE INMUNOGLOBULINAS HUMANAS

En el ser humano existen 5 clases de inmunglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Además la IgG y la IgA tienen subclases.

Ig G: Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4. Se corresponden con los distintas cadenas pesadas γ (γ1, γ2, γ3, γ4)

Ig A: Ig A1, IgA2. Se corresponden con los distintas cadenas pesadas α(α1, α2)



INMUNOGLOBULINA G

Es el isotipo más abundante en suero (8-16 mg/ml), constituyendo el 80% de las Ig totales. Esta formada por la unidad básica y su componente glucídico. Es bivalente por tener dos sitios de unión al Antígenos (Fab). FUNCIONES

Capaces de atravesar activamente las membranas biológicas. La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas es de sumo interés por lo que, además de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda la “economía del organismo”, lo hace también en el feto al atravesar la placenta desde la madre. Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno, sino incluso durante la lactancia, período en el cual todavía no ha desarrollado la capacidad total de síntesis de inmunoglobulinas. Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el feto. Cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el feto, se puede desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la destrucción de glóbulos rojos fetales. Esto no se presentaría si la IgG no pasase de la madre al feto

Facilitan la fagocitosis. (opsonización). La región Fc de las Ig G se une a receptores Fc de macrófagos y neutrófilos facilitando la fagocitosis y destrucción de microorganismo recubiertos por las IgG.

Activan el complemento. La IgG se sintetiza tardíamente tras un primer contacto con el antígeno, sin embargo, tras un segundo

contacto la mayoría de las Igs formadas pertenecen a esta clase (Respuesta Secundaria).

INMUNOGLOBULINA M

Constituye aproximadamente el 10 % de las inmunoglobulinas séricas. Esta formada por cinco unidades básicas (pentámero), por tanto tiene diez zonas de unión al Antígeno (decavalente). La cinco unidades básicas se unen por puentes disulfuro, además hay una cadena peptidica denominada proteína J que es necesaria para que se de la polimerización FUNCIONES

Los anticuerpos del tipo IgM son los que mas rápidamente se forman en respuesta a un estímulo antigénico (Respuesta primaria).

No atraviesan las membranas biológicas por lo que actúan fundamentalmente a nivel intra vascular El tener gran valencia significa que posee una mayor capacidad que otras Ig para unirse a antígenos

particulados multidimensionales: (p. ej., partículas de virus, eritrocitos de otro individuo),



entrecruzándolos y provocando aglutinación, por lo que las IgM son típicas aglutininas (son de 100 a 1.000 veces más eficaces que las IgG en este papel El tener gran valencia significa que posee una mayor capacidad que otras Ig para unirse a antígenos particulados multidimensionales: (p. ej., partículas de virus, eritrocitos de otro individuo), entrecruzándolos y provocando aglutinación, por lo que las IgM son típicas aglutininas (son de 100 a 1.000 veces más eficaces que las IgG en este papel.

Activan el complemento. INMUNOGLOBULINA A

En humanos existen dos subclases: IgA1 e IgA2. En el suero predomina la subclase IgA1, constituyendo del 10 al 15% de las Ig totales (1.4-4 mg/ml), y allí aparece como monómeros pero en las secreciones seromucosas es muy abundante la IgA2, que aparece como dímero.

Las secreciones donde aparece la IgA secretoria son: saliva, lágrimas, fluido nasal, tracto bronquial, tracto genitourinario, tracto digestivo, leche materna y calostro. FUNCIONES

La propiedad más importante de esta inmunoglobulina viene determinada por su capacidad de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora. La pieza secretora es una proteina que se encuentra en la membrana de las células epiteliales de las mucosas. Esta pieza hace de receptor para la IgA dimérica formándose IgA secretora que ejerce su función en los fluidos biológicos.

Opsonización. Puede unirse a los neutrófilos por su extremo Fc pero no a los macrófagos. INMUNOGLOBULINA D Es una inmunoglobulina monomérica, por tanto divalente. Su concentración en suero es muy baja.(0,2 %. 20ug/ml FUNCIONES

En su forma libre en plasma, su función es desconocida Molécula de superficie de la membrana celular de los linfocitos B actuando como receptor de los

linfocitos B junto con la IgM INMUNOGLOBULINA E

Es una inmunoglobulina monomérica, por tanto divalente. Su concentración en suero es muy baja.(0.3 � g/ml). FUNCIONES

Se encuentra en la superficie de basófilos y mastocitos. Cuando estas Ig E se unen a un antigeno se produce la activación de estas células: Liberándose histamina que provoca un aumento de la permeabilidad vascular con extravasación de los líquidos apareciendo los típicos síntomas de reacciones alérgicas. Edema, conjuntivitis, etc.



Si las Ig E se unen a antígenos de parásitos se librean otras sustancias de los mastocitos capaces de atraer eosínofilos y neutrófilos que colaboran en la destrucción

8.- DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS BASE GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD DE LOS ANTICUERPOS

El sistema inmune posee una capacidad

ilimitada de formar anticuerpos diferentes. Como el resto de proteínas la información para la síntesis de inmunoglobulinas se encuentra codificada en el ADN. La obtención de esta infinita diversidad de los anticuerpos se explica mediante procesos de recombinación y mutación.

Recombinación. Cada linfocito inmaduro contiene en su genoma un conjunto de fragmentos de ADN para cada región de las inmunoglobulinas. Durante el proceso de maduración, la secuencia de ADN se

forma por combinación de fragmentos de cada uno de los conjuntos. Para las regiones constantes se dispone de un fragmento de cada tipo de cadena γ,µ,α,δ,ε, sin embargo para las cadenas variables se dispone de numerosos fragmentos.

Mutaciones. Después se producen mutaciones en la secuencia de ADN formada sobre todo en la zona que codifica la región variable.

VARIANTES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

ISOTIPOS. VARIANTES ISOTÍPICAS. Se denominan isotipos al conjunto de variantes de inmunoglobulinas comunes a todos los miembros sanos de una determinada especie. Los isotipos dependen de las regiones constantes tanto de cadenas pesadas como de cadenas ligeras. Los isotipos también reciben el nombre de clases, y en determinados casos se pueden diferenciar subclases. Como ya vimos, en humanos se distinguen cinco isotipos según características de las porciones constantes de cadenas pesadas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE).

ALOTIPOS. VARIANTES ALOTÍPICAS. Se deben a pequeñas diferencias (de uno a cuatro aminoácidos) que afectan a las regiones CH y CL.. Son variaciones específicas del individuo y son transmisibles a la trascendencia.

IDIOTIPOS. VARIANTES IDIOTÍPICAS. Variantes de cada anticuerpo de un mismo individuo, debidas a las secuencias de aminoácidos de las porciones VH y VL. Los Ac producidos por un determinado clon de linfocitos B y las células plasmáticas derivadas de ellos llevan el mismo idiotipo. Normalmente, los distintos clones de linfocitos B producen idiotipos distintos entre sí, no compartidos entre ellos, a los que se llama idiotipos privados.

9.- REGULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE ANTICUERPOS

Las cadenas ligeras y pesadas se sintetizan en los polirribosomas de los linfocitos B maduros. La glicosilación y polimerización se realiza en el aparato de golgi antes de su secrección de la célula



REGULACIÓN

Una vez producida la reacción Antigeno – Anticuerpo existe una serie de mecanismos que evita que el clon de células continúen sintetizando Anticuerpos. Entre estos factores están:

Concentración de Antígeno. La reacción Ag-AC provoca la disminución de la concentración de Antigenos

Linfocitos T supresores. Parecen bloquear la proliferación y diferenciación de linfocitos B Teoria de red idiotípica. Se sintetizan Anticuerpos antiidiotipo. Estos a su vez provocan la síntesis

de una segunda generación de anticuerpos anti antiidiotipo generándose una reacción en cadena que provoca la suspensión de la síntesis de anticuerpos

10.- REACCIÓN ANTIGENO-ANTICUERPO

Las inmunoglobulinas se unen a los epitopos de los antígenos por sus sitios activos, constituidos como se ha indicado anteriormente, por los segmentos variables de las cadenas pesadas y ligeras, donde intervienen principalmente las regiones hipervariables.

La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) o inmunoglobulina es semejante a la que se establece entre la enzima y su substrato o entre proteínas que pertenecen a cualquier vía de señalización intracelular. Estas interacciones se deben a la formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e hidrófobas), cada uno de los cuales por si solos son débiles. Sin embargo, como se establecen múltiples interacciones, la fuerza total de la unión puede ser muy elevada. Para que las interacciones mencionadas lleguen a ser efectivas, los grupos entre los que se establece deben estar situados a distancias muy cortas, y para que esto sea posible y se puedan producir un gran numero de interacciones, el epítopo y el paratopo deben encajar perfectamente.

AFINIDAD Y AVIDEZ. La Afinidad es la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un anticuerpo. Como los antígenos suelen tener mas de un determinante antigénico y los anticuerpos tienen mas de una valencia generalmente se establecen varias uniones antígenos anticuerpos, a la La fuerza total de la interacción que considera todas las interacciones que tienen lugar entre antígenos y



anticuerpos multivalentes (con varios sitios de unión), se denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades puesto que las distintas interacciones se estabilizan entre ellas.

ESPECIFICIDAD Y REACCIÓN CRUZADA. La unión entre el Ag y la Ig tiene una gran especificidad, de tal manera que una Ig se unirá fundamentalmente y con mayor avidez, a un antígeno determinado. Sin embargo, en algunos casos la inmunoglobulina podrá unirse a antígenos con epítopos muy similares, aunque en este caso la afinidad de la unión es mucho menor diciéndose entonces que existe una reactividad cruzada.

11.- ANTICUERPOS MONOCLONALES

Cuando se realiza una inmunización con el

objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen función de anticuerpo frente a los diferentes epitopos del antígeno. Esta producción de inmunoglobulinas es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clones linfocitarios los que se activan y diferencian para la producción de anticuerpos.

Este fenómeno es de gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una amplia barrera de protección del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los antisueros así obtenidos ofrecen dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificación de sustancias.

Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en 1975 consiguieron

la producción de anticuerpos monoespecíficos, conocidos como anticuerpos monoclonales (AcMo). Con ello se abrió un amplio campo en la Inmunología y la Biología Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo epítopo del antígeno y son entre si homogéneos PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

El método seguido para la producción de estos anticuerpos consiste en la unión (fusión) de una célula B productora de anticuerpos , con una célula de gran capacidad de crecimiento (células de mieloma) con lo cual se forma un híbrido (hibridoma) que posee la información genética necesaria para la síntesis del anticuerpo deseado, que le es aportada por la célula B, y una elevada capacidad de síntesis proteica y una gran capacidad para multiplicarse tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas últimas que son aportadas por la célula mielomatosa. De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los anticuerpos así producidos homogéneos, poseen gran especificidad. TÉCNICA DE PRODUCCIÓN 1. Se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antígeno frente al cual se desea

obtener el anticuerpo. A los veinte días de la primera dosis, se comprueba la presencia de anticuerpos dirigidos frente al antígeno en el suero del ratón.



2. Se procede al aislamiento de las células B productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad.

3. Las células así obtenidas se fusionan con células mielomatosas no secretoras de Ig utilizando polietilen glicol (PEG) que es un detergente capaz de disolver parte de la membrana celular permitiendo así la formación de hibridomas.

4. A las 24 horas se realiza la selección de los híbridos. Para ello se añade medio de cultivo con HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas en donde se encontraban las células en cultivo. Las células mielomatosas mueren, pero no las células plasmáticas ni los híbridos. Las células plasmáticas mueren al cabo de una o dos semanas quedando en la placa un cultivo puro de células híbridas.

5. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los híbridos para determinar si producen anticuerpos.

6. Posteriormente se procede a ola clonación. Es decir se siembra en pocillos de tal forma que en cada pocillo solo haya una célula. Por tanto cada célula dará lugar a un clon de células que produce un anticuerpo monoclonal.

7. Una vez seleccionado el clon adecuado se conserva congelado.

UTILIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biológico homogéneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas. Entre los usos de los AcMo:

Identificación y cuantificación de sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeñas, tales

como proteinas, hormonas, enzimas, interferones, etc. En la identificación de antígenos presentes en las membranas celulares, tales como las moléculas

CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no sólamente la cuantificación de subpoblaciones celulares, sino también su fraccionamiento y aislamiento.



En trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente en casos de amenaza de rechazo agudo.

En oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. Para ello los anticuerpos específicos frente a antígenos tumorales tales como el antígeno carcinoembrionario pueden ser marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In111 o Tc99, y así localizar su situación en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son administrados a individuos afectos de tumores. También los AcMo pueden ser utilizados en la destrucción de células tumorales en oncología, para lo cual los anticuerpos son marcados con drogas citostáticas y citotóxicas.

AcMo QUIMÉRICOS HUMANIZADOS.

Uno de los problemas del uso de AcMo en medicina es que al ser en su mayoría de origen murino, cuando son administrados a individuos, éstos producen anticuerpos frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden presentar problemas de tipo alérgico cuando se usan reiteradamente.

Para evitar este problema se estan ya obteniendo, mediante técnicas de ingeniería genética, anticuerpos humanizados de tipo quimérico. Estos anticuerpos se preparan mediante la creación de una molécula híbrida en la que se mantienen las partes del anticuerpo monoclonal de ratón que le confieren la especificidad y sustituir la región constante del anticuerpo de ratón por una región igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana.

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