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Centro Médico Nacional Siglo XXI IMSS
Universidad Autónoma MetropolitanaUnidad Iztapalapa
Licenciatura en Biología Experimental
Análisis de la expresión del complejo Sarcoglicano-Sarsocpan y de proteínas asociadas en pacientes
que sufren Distrofia Muscular
Dr. José Luis Gómez OlivaresDr. Fabio Salamanca Gómez
Dr. Ramón M. Coral Vázquez (Tutor Principal)
Alumna: K. Angélica Hernández Varela
• Son un grupo diverso de enfermedades, caracterizadas por debilidad y atrofia muscular progresiva.
• El defecto primario se hace evidente en el músculo esquelético, donde ocurren procesos de degeneración de fibras, núcleos centrales, necrosis muscular y reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposo.
Distrofias Musculares
A:Tipo Duchenne y Becker
B: Emery- Dreifuss
C: Cintura
D: Facioescapulohumeral
E: Distal
F: Oculofaringea
Complejo de Proteínas Asociadas a distrofina
•Músculos involucrados• Edad de inicio• Progresión de la enfermedad• Modelo de herencia• Proteína(s) anómala(s) o deficiente(s)
Criterios de clasificación
Analizar la expresión génica y proteica del complejo distrofina-glicoproteínasen biopsias de pacientes diagnosticados con distrofia muscular
Objetivo General
a) Clasificar a un grupo de pacientes con distrofia muscular.b) Creación de un banco de muestras DNA y biopsias musculares.c) Análisis inmunohistoquímicos de biopsias musculares.d) Identificación de las mutaciones alguno(s) gene(s) que codifica(n) para proteínas ausentes o anómalas.
Objetivos Particulares
Estrategia Experimental
Diagnóstico clínico de distrofia muscular
Biopsias de músculo esquelético
Inmunodetección por flourescencia
No detección de proteína de interés
Detección de proteína de interés
Preservación de la biopsia
Análisis de DNA
Criterios de inclusión
•Exploración física por el médico-genetista:•Fuerza •Sensibilidad•Historia clínica (antecedentes familiares)
•Examen de laboratorio•Creatinina-fosfato cinasa (CPK 200-400 U/I)•Electromiografía•Electrocardiograma
•Biopsia•Tinción de Hematoxilina y Eosina•Fibras hipertróficas•Núcleos centrales•Reemplazo de tejido muscular por conjuntivo y adiposo
Anticuerpos-primarios conjugados con fluorocromos
Biopsias
Congelación
Criostato7-10 µm
Portaobjetos
C M1 M2 M3
Microscopio de Epi-fluorescencia
Inmunoflourescencia indirecta
Distrofina, α-, β-, γ-, y δ-Sarcoglicanos, Laminina, Lamina A/C, Teletonina, Emerina
Resultados de inmunofluorescencia
92 pacientes estudiados
Distribución según tipo de distrofia:
10 Pacientes con ausencia de distrofina12 Pacientes con disminución de distrofina
4 Pacientes con disminución de Sarcoglicanos
56 Pacientes con presencia de todas las proteínas estudiadas
7 Pacientes sin fibras musculares.2 Pacientes con ausencia de disferlina
Deficiencia en distrofina
Reducción en la expresión en distrofina
Positivo para todas las proteínas
Disminución en expresión de sarcoglicanos
Reducción en la expresión γ-sarcoglicano
Deficiencia en Laminina
Número de fibras musculares reducidas
Análisis de fenotipo y relación familiar
Pedigree familiar P-57
Músculos afectados distalesEscápulas aladasFatigaCamina de puntasHiperlordosis
Disferlina Dys-3 Dys-2C P C P C P
25 22 20
Consanguinidad
I
II
Pedigree familiar P-77
CPK de 460022 añosDebilidad MuscularH.E. Reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposoEdad de inicio 14 añosCamina con fatiga
Dys-3 Dys-2Disferlina
C P C P C P
I
II
Pedigree familiar P-24
Masculino 31 añosCPK 3961
Se han aplicado otrasproteínas, Lamina,Emerina,Teletonina +
Progreso Lenta6 años-31 años
DX Cinturas, DMB
I
II
III
IV
V
VI
Pedigree familiar P-85
Femenino 3 añosCPK 979CaídasHiperlordosisGowersElectromiografíaNormalAutosómica DominanteProbarLamina A/C, caveolina
I
II
III
IV
Análisis de DNA
DNA
Amplificaciónpor PCR
Electroforesis
Secuenciación del gen LAMA2 y
comparación conbase de datos
Sangre
Purificación
Conclusiones
• El análisis de inmunofluorescencia en las biopsias de 92 pacientes que sufrían con distrofia muscular mostró había una asociación entre la deficiencia y/o disminución en algunas proteínas del complejo de glucoproteínas asociadas a distrofina.
• El estudio permitió constituir un banco de biopsias musculares de un grupo de pacientes con éste tipo de sindromes.
• En una paciente se identificó una mutación en el gen que codifica para la proteína merosina (Lamma2) que permitió identificar a los portadores dentro de la familia.
• Se identificó deficiencia de γ−sg para un paciente y de Disferlina para dos pacientes, siendo candidatos para análisis de DNA.
• En algunos pacientes que resultaron positivos en las proteínas analizadas, se realizaráanálisis de inmunotransferencia de gel a membrana o inmunofluorescencia para otras proteínas.
• En los pacientes que resultaron con deficiencia o reducción en la expresión de distrofina se les podrá realizar análisis de deleciones.
Perspectivas