Embed Size (px)
Citation preview
1
UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
Facultad de Estomatología
Roberto Beltrán Neira
"ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO
ETANÓLICO DE CALATOLA COSTARICENSE STANDL
SOBRE CULTIVOS DE PLACA BACTERIANA DE
ORIGEN DENTAL.. ESTUDIO IN VITRO”
TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO DE CIRUJANO DENTISTA
JARLIN ELIO TANANTA PEZO
LIMA – PERÚ
2005
2
ASESORES:
Dr. Abraham Meneses López.
Dr. León Faustino Villegas Vilchez.
COMITÉ EXAMINADOR:
Presidente : Dr. Gabriel Flores Mena
Secretario : Dr. Víctor Vives Barreto
Miembro : Dr. Luis Piaggio Bravo
FECHA DE SUSTENTACIÓN : 16 DE FEBRERO DEL 2005
CALIFICATIVO : APROBADO POR UNANIMIDAD
3
En memoria a mi madre Lilia,
quien me dio lo mejor de su vida.
A mi padre Temistedes, por su abnegable
apoyo, valentía y coraje............................
4
AGRADECIMIENTOS
• Al Dr. Abraham Meneses López, maestro y amigo por sus orientaciones y
estímulo brindado en la realización del presente trabajo.
• Al Dr. León Villegas Vilchez, por su valiosa orientación y colaboración en el
diseño y ejecución del presente trabajo.
• Al Dr. Humberto Guerra, por su gran amistad y todo el permanente apoyo; así
como también al personal del Laboratorio de Microbiología del Instituto de
Medicina Tropical Alexander Von Humboldt por su colaboración en el presente
trabajo.
• Al Dr. Juan Sanz Esteban (España), por su inmenso cariño, abnegable apoyo y
estímulo para llegar hacer realidad un sueño.
• A la Compañía Misionera del Sagrado Corazón de Jesús, Hna. Sagrario Sanz
Esteban, por sus valiosas orientaciones y apoyo en mi formación personal y
profesional.
5
RESUMEN
El presente trabajo pretende evaluar la actividad antimicrobiana de un recurso natural,
planta denominada Calatola costaricense standl, la que nos permitiría prevenir la
enfermedad caries dental con mayor efectividad y tiempo de protección. Para ello se
recolectaron 5 Kg. de hojas, puestas a secar y trituradas; se procesó para obtener un
extracto etanólico. Para la prueba de susceptibilidad, se tomaron 12 muestras de placa
bacteriana de origen dental en diferentes pacientes y se diseminó en un medio de
cultivo, se hizo un pequeño pocito (en forma de sacabocado) de 6 mm. de diámetro y
se le agregó una gota de agar licuado en el fondo de cada orificio; se le agregó
dimetilsulfóxido para su fácil manipulación, se procedió a verter 0.5 ml. de la
sustancia experimental y a las 24 horas se hizo la lectura. El desarrollo de colonias
bacterianas se dio muy esporádico con la formación de halos no definidos, con un
halo promedio de 18.63 mm. El método aplicado mediante el extracto etanólico del
Calatola no posee propiedades bactericidas, pero hay indicios de una actividad
bacteriostática.
Palabras clave: Caries dental, agentes cariostáticos, inflamación, infección focal
dental, medicina herbaria, planta medicinal.
6
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... . 01
II. MARCO REFERENCIAL ........................................................................... . 02
II.1. CARIES DENTAL.................................................................................. 02
II.2. FACTOR MICROBIANO. ..................................................................... 04
II.3. FACTOR HUÉSPED................................................................................ 09
II.4. FACTOR DIETA.................................................................................... .. 10
II.5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS........................................................... 11
II.6. PROPIEDADES Y PRINCIPIOS ACTIVOS DE LAS PLANTAS...... . 14
II.7. CALATOLA costaricense standl ............................................................... 19
II.8. POSICIÓN TAXONÓMICA................................................................... 21
III. HIPÓTESIS...................................................................................................... 24
IV. OBJETIVO....................................................................................................... 24
V. METODOLOGÍA............................................................................................. 24
V.1. MATERIALES......................................................................................... 24
V.2. DISEÑO DE ESTUDIO.......................................................................... 25
V.3. POBLACIÓN MUESTRAL.................................................................... 25
V.4 . DEFINICIÓN DE VARIABLES.............................................................. 26
V.5. PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICAS...................................................... 26
VI. PROCESAMIENTO DE DATOS.................................................................... 34
VII. RESULTADOS................................................................................................. 35
VIII. DISCUSIÓN.................................................................................................... 37
IX. CONCLUSIONES........................................................................................... 38
X. SUGERENCIAS.............................................................................................. 39
XI. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................... . 40
XII. ANEXOS....................................................................................................... . 42
1
I. INTRODUCCIÓN
Desde tiempos ancestrales se ha buscado la manera de prevenir y combatir la caries
dental. Los agentes fluorados constituyen un arma eficaz en la prevención de la caries
dental, son numerosas las investigaciones y las publicaciones sobre los mecanismo
de acción, la homeostasis y la toxicología de los fluoruros en los seres humanos. Aún
todavía existen muchos aspectos que no se conocen totalmente, se sabe con seguridad
que en dosis adecuada las sales de fluoruro constituyen uno de los métodos más
eficaces en la prevención de la enfermedad de la caries dental.
En el presente trabajo se intenta evaluar la actividad antimicrobiana de un recurso
natural, el extracto etanólico de la Calatola costaricense standl; que nos permita a
prevenir la enfermedad de la caries dental con mayor efectividad y tiempo de
protección.
La química de las plantas encierra una enorme variedad de sustancias orgánicas que
son elaboradas y acumuladas por ellas en estructuras químicas a través de su
biosíntesis, ciclo y metabolismo, su distribución natural y su función biológica.
El interés por aislar y conocer las sustancias químicas de los vegetales ha sido uno de
los quehaceres que ha ocupado a los investigadores de todos los tiempos. La
fitoquímica tiene múltiples aplicaciones en varias áreas del conocimiento destacando
entre ellas la obtención de principios activos de las plantas medicinales.
Por otro lado, para la fitoquímica, se requiere de entrenamientos en técnicas sencillas
de laboratorio de química, sin embargo eso es posible para botánicos y otros
científicos con muy poca preparación, ya que se desarrolla a partir de técnicas simples
y directas.
2
II. MARCO TEÓRICO
II.1. CARIES DENTAL.
La definición de la caries en la literatura científica ha sido enfocada bajo distintos
aspectos; que a pesar que todas las definiciones son ciertas, pueden considerarse
parciales y complementarias. Por lo tanto la caries es considerada como una
enfermedad infecciosa crónica transmisible, que causa la destrucción localizada de los
tejidos dentales duros por los ácidos de los depósitos microbianos adheridos a los
dientes. La enfermedad puede afectar al esmalte, dentina y el cemento. Sus signos son
las destrucciones localizadas de los tejidos duros que pueden oscilar desde una
pérdida inicial ultra estructural de mineral a una afectación pulpar que puede llegar a
la total destrucción del diente con posible repercusiones sistémicas de tipo infeccioso (1 ).
II.1.1. CLASIFICACIÓN.
Puede clasificarse con respecto al sitio de la lesión:
- Caries de fosas y fisuras.
- Caries de superficie lisa.
- Caries radicular.
- Caries recurrente. Aparece cuando se asocia a una restauración preexistente.
La localización, configuración y progresiones de las lesiones de caries sobre
superficie individuales, están determinadas por diversos factores entre los que
destacan:
• Las acumulaciones microbianas que forman la placa bacteriana y que, a su —
están influidas por las condiciones ambientales locales para la formación y
crecimiento de la misma.
• La disponibilidad de hidratos de carbono fermentables.
• La anatomía e histología dentaria (1).
3
II.1.2. CONSECUENCIAS DE LA CARIES.
La caries dental, en lo que respecta a la amenaza potencial para la vida, tiene una
gravedad que, excepto en raros casos es limitada. Sin embargo es preciso considerar
ciertas consecuencias importantes, que en ningún caso se deben menospreciar, que es
una de las enfermedades crónicas que más afligen a la humanidad (2).
La caries dental es una enfermedad costosa. El tratamiento demanda un gran potencial
humano, requiere infraestructura muy costosa y consume tiempo. En países como el
nuestro, los honorarios que pagan los pacientes al sector privado, constituye el mayor
costo, sin olvidar el gasto de las instituciones sanitarias y el costo implicado en la
formación de los profesionales. Por otro lado, es incalculable el número de horas de
trabajo que se pierden, labores del hogar o estudio a consecuencias del tratamiento de
la enfermedad. La caries dental y sus secuelas también tienen un costo intangible muy
importante. Se trata fundamentalmente del dolor, que puede ser de intensidad
variable, aunque en realidad, el sufrimiento que produce un dolor de dientes pueden
ser agudísimo (2).
Otra consecuencia importante de la enfermedad son las secuelas funcionales. Los
dientes sanos son esenciales para la buena masticación de los alimentos, de lo que
deriva la correcta deglución y digestión de los mismos. También son importantes en la
fonación. Por otra parte las implicancias estéticas adquieren en nuestros días mayor
relevancia. En los dientes anteriores la caries puede desfigurar la sonrisa, pero además
no se debe olvidar que los dientes ayudan a dar forma al rostro. Su perdida altera la
morfología del tercio inferior de la cara, adoptándose la facies típica de los ancianos
desdentados (2).
II.1.3. ETIOLOGÍA DE LA CARIES.
(Esquema de keyes modificado)
La caries dental es considerado como una enfermedad multifactorial, resultado de la
intervención de tres factores principales: El hospedero (diente y saliva), la microbiota,
y la dieta. Es necesaria la interacción de estos tres durante un periodo de tiempo
suficiente, para que se desarrolle la caries (1).
4
II.2. FACTORES MICROBIANOS.
Han sido relativamente numerosas las teorías que, a lo largo de la historia , han
intentado explicar la etiología de la caries, sin embargo, las teorías microbianas
empiezan ha aparecer al final del siglo XIX coincidiendo lógicamente con el
desarrollo inicial de la microbiología. Así la teoría de la proteólisis – quelación que
fue descrita por Schatz y Col; en 1955 donde se describe que la caries consistiría en
primer lugar de una acción proteolítica bacteriana y enzimática sobre el componente
orgánico del diente , lo que produciría una lesión inicial que daría lugar a una
liberación de agentes quelantes (aminoácidos , ácidos orgánicos, polifosfatos) , que
serían los causantes de la disolución de los minerales del diente (1).
La teoría de Miller a final del siglo XIX donde afirma que “la caries dental es un
proceso quimioparasitaria que consta de dos etapas: Descalcificación o
reblandecimiento de los tejidos y disolución de los residuos reblandecidos. En el caso
del esmalte sin embargo , la segunda etapa esta prácticamente ausente; la
descalcificación del esmalte significa su destrucción total”. Esta teoría es la base
fundamental en la que se apoyan el conocimiento y comprensión actual de la etiología
de la caries (2,1).
- FISIOPATOLOGÍA DE LA CARIES
La caries mas frecuente es la que se origina en la corona dentaria, que esta totalmente
rodeada por esmalte. Por tanto el inicio del proceso de la enfermedad se localiza
fundamentalmente en este tejido dentario. El factor dieta, produce cambios
microbianas cuantitativos y cualitativos en la placa bacteriana, que implica el inicio y
evolución de la enfermedad. Se ha debatido mucho sobre si es una o son varias las
bacterias específicas o no específicas implicadas en el inicio de la caries. Existen
diversas opiniones, aunque todas parecen estar de acuerdo en la importancia de los
estreptococos del grupo mutans, se basa en el resultado de investigaciones,
fundamentalmente epidemiológicas, realizadas en animales y seres humanos y de las
que destacan las siguientes :
5
1.- Se han encontrado correlación significativa en los seres humanos entre los
recuentos de estreptococos del grupo mutans en placa y saliva y la prevalencia e
incidencia de caries .
2.-Este grupo bacteriano se aísla con mucha frecuencia de la superficie de los dientes
ante el desarrollo de la caries, y coloniza las lesiones de “manchas blancas” (caries
incipientes)
3.-La inmunización de animales con estreptococos el grupo de mutans reduce
significativamente la incidencia de caries.
4.-El nivel de infección de estreptococos del grupo mutans en la madre es un
pronóstico de la infección en el hijo.
5.-Estas especies han sido halladas en gran número en la saliva y placa de pacientes
con caries rampante debido a xerostomía y en niños con caries de biberón.
6.-Las propias características metabólicas de los estreptococos mutans (1).
Esta claro que al menos en países industrializados, la caries de la corona no suele
aparecer en ausencia de estreptococos del grupo mutans y sacarosa, aunque existe
circunstancias específicas que pueden hacer que otras especies bacterianas adquieran
también un papel de protagonistas en el inicio de la enfermedad. Aunque la placa
supragingival, dentogingival o de superficies lisas es la más conocida desde el punto
de vista bioquímico y microbiológico, y aunque de su conocimiento se presuponen las
características de otras placas dentales, la caries de superficie lisas como tal no es
frecuente; el proceso carioso, en definitiva afecta más las fosas y fisuras, superficies
proximales y raíz. En experimentos realizados en animales se han demostrado que son
muchos los microorganismos capaces de desarrollar lesiones de caries, por ejemplo:
Streptococcus sanguis , estreptococos del grupo Milleri y Streptococcus salivarius; y
algunas especies de Lactobacillus fundamentalmente. En el hombre parece que los
estreptococos del grupo mutans y Lactobacillus se aíslan en gran número, mientras
que Streptococcus sanguis se encuentra en niveles más bajos cuando la fisura está
cariada; esta situación se invierte cuando la fisura está libre de caries. En las
superficies proximales existen también prevalencia del Streptococcus mutans, aunque
se ha observado la presencia de gran cantidad de Actinomyces Spp pero en menor
6
proporción que los mutans. En ocasiones se pueden observar niveles moderados a
Lactobacillus, especialmente Lactobacillus casei. Se han demostrado aumentando
tanto, en la frecuencia de aislamientos como en las proporciones relativas de
estreptococos del grupo mutans , S casei y Actinomyces odontolyticas asociados con
la progresión de la lesión en superficies lisas (1).
En caries de raíz se han encontrado frecuentemente con altos niveles de bacilos Gram
positivos, en particular Actinomyces viscosus y en menor grado, Actinomyces
naeslundii, sin embargo los S mutans no dejan de estar presentes asociados con A
viscosus. Los Lactobacillus no parecen estar directamente implicadas en este proceso
(1,3) .
- CARACTERÍSTICA DE LOS MICROORGANISMOS CARIOGÉNICOS.
De entre todos los microorganismos orales, nos interesa seleccionar cuales son los
determinantes de la virulencia o cariogenicidad de los tres microorganismos más
relacionados en el inicio y desarrollo de la caries dental: Estreptococos del grupo
mutans, Lactobacillus Spp. y Actinomyces viscosus (1).
- STREPTOCOCCUS mutans.
Algunas características fenotípicas de los estreptococos del grupo mutans son
determinantes de su cariogenisidad. Es importante mencionar que no todas las cepas
poseen esta característica y que unas son más patógenas que otras. La producción de
polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa, y concretamente de glucanos
insolubles (mutanos), desempeña un papel fundamental en la colonización y
mantenimiento de Streptococcus mutans sobre el diente. Esta gran afinidad por las
superficies dentales se debe a fenómenos de adhesión, agregación y coagregación. La
síntesis de polisacáridos intracelulares por S. mutans y su capacidad de metabolizarlos
son factores de virulencia, ya que proporciona a las células un sustrato de donde
obtener la energía y mantener la producción de ácidos durante largo período de
tiempo. Además produce dextranasas y fructanasas, que son enzimas capaces de
metabolizar los polisacáridos extracelulares, sobre todo los glucanos solubles,
7
favoreciendo la producción de ácidos y constituyendo un sustrato en los períodos en
que disminuye el aporte exógeno. A partir del metabolismo de la sacarosa, estos
organismos producen principalmente ácido láctico, que es fundamental en la
virulencia debido a que aparentemente es el ácido más potente que interviene en la
desmineralización del diente. Además de acidógenos (productores de ácido) los
estreptococos del grupo mutans son acidófilos o tolerantes al ácido, propiedad que les
es muy necesaria para sobrevivir y desarrollarse con un pH bajo y acidúricos o
capaces de seguir produciendo ácido con un pH bajo. Otra característica de los
estreptococos mutans es su corto efecto post-pH que puede definirse con el tiempo
necesario para recuperar su actividad de crecimiento habitual cuando, tras estar
sometido a un pH bajo, este vuelve a la normalidad. No es de extrañar que estas
especies bacterianas sean las que consigan alcanzar mas rápidamente el pH crítico de
4.5 necesario para iniciar el proceso de desmineralización (2,1)
- FACTORES DE CARIOGENICIDAD DEL STREPTOCOCCUS mutans
• Posee producción de polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa.
• Elementos que determinan fenómenos de adhesión, agregación y coagregación
• Producción de dextranasas y fructanasas.
• Rápido metabolismo de los azúcares ácido láctico y otros ácidos orgánicos.
• Poder acidógeno, acidófilo y acidúrico.
• Efecto post pH corto.
• Pueden conseguir el pH crítico para la desmineralización del esmalte más
rápidamente que cualquier otro microorganismo (1).
- LACTOBACILLUS Spp.
Son grandes productores de ácido láctico y se encuentran entre las bacterias más
acidófilas que se conocen, al igual que los estreptococos del grupo mutans, son
8
capaces de producir ácido con un pH bajo (acidúricas). Aunque estas características
son cariogénicas, estas bacterias presentan poca afinidad por la superficie del diente,
lo que difícilmente los implica en el inicio de caries dental en superficies lisas; no
obstante son los primeros microorganismos en el frente de avance del proceso
carioso en la dentina (1).
- FACTORES DE CARIOGENICIDAD DE LACTOBACILLUS Spp.
• Poder acidógeno, acidófilo y acidúrico.
• Algunas cepas sintetizan polisacáridos extra e intracelulares a partir de la
sacarosa.
• Cierta, aunque escasa, actividad proteolítica (1).
-ACTINOMYCES Spp.
Actinomyces Spp. (especialmente A. viscosus) predomina en la placa que cubre las
lesiones de la superficie de la raíz en los dientes humanos, aunque su papel en el
inicio de las mismas es difícil de demostrar (1) .
-FACTORES DE CARIOGENICIDAD DE ACTINOMYCES Spp.
• Poder acidógeno.
• Pueden producir polisacáridos intra y extracelular a partir de la sacarosa.
• Posen fimbrias.
• Actividad proteolítica moderada (1).
9
II.3. FACTOR HUÉSPED.
Los dos factores del huésped implicados en la etiología de la caries son los dientes y
la saliva:
- DIENTE.
La anatomía e histología influyen en la susceptibilidad de diferentes zonas dentarias a
la caries. La susceptibilidad es mayor cuando las fisuras son profundas o presentan
defectos morfológicos. El tiempo transcurrido desde que un diente erupcionó, es un
factor que se debe tener muy en cuenta; hasta que no se alcanza la maduración
posteruptiva del esmalte aproximadamente 3-4 años después de su erupción el diente
es más susceptible de la enfermedad. La exposición del huésped al flúor reduce la
incidencia de caries. Se ha demostrado que el esmalte de las personas que han estado
expuestas al flúor, ya sea incorporado por vía sistémica o por vía tópica, resiste mejor
al ataque ácido. Otros factores del huésped pueden también tener influencias en la
enfermedad, entre ellos destacan: La disposición de los dientes en la arcada, osea
algunas formas de maloclusión favorecen la acumulación de placa y dificultan la
autolimpieza; de igual manera los portadores de aparatos protésicos fijos y removibles
tienen mayor susceptibilidad por motivo antes mencionados (1).
- SALIVA.
La saliva desempeña un papel primordial en el mantenimiento de las condiciones
normales de tejidos orales, y es un factor protector de gran importancia frente a la
caries.
Por una parte ejerce una acción de auto limpieza, que esta implicada en la eliminación
de restos alimenticios y microorganismos que no están adheridos a las superficies
orales. Por otra parte la saliva tiene una alta capacidad de amortiguación que ayuda ha
neutralizar los ácidos producidos en la placa bacteriana (sistema buffer). Su papel en
la remineralización de lesiones insipientes de caries y en el mantenimiento de la
estructura del diente es fundamental, ya que está sobresaturada de calcio y fosfato.
Sin embargo el papel que desempeña en la aparición de caries los factores
antimicrobianos salivales, tales como la lisozima, la lactoperoxidasa, la lactoferrina o
las inmunoglobinas no están perfectamente aclaradas. Una reducción de la secreción
10
salival (hiposalivación) sobre todo cuando es grave (xerostomía) produce cambios en
el ecosistema microbiano de la cavidad oral, y los pacientes experimentan dificultad
en la masticación, la deglución, la utilización de prótesis y, a veces en el habla. La
caries presenta una exacerbación, así como las enfermedades periodontales y los
tejidos bucales blandos están secos e inflamados (1).
II.4. FACTOR DIETA.
La caries dental puede considerarse como infección condicionada por la dieta,
estudios epidemiológicos han demostrado sin lugar ha dudas en una relación directa
entre la caries dental y el consumo de hidratos de carbono. Concretamente el azúcar
más cariógeno es la sacarosa, y existen numerosos datos que mantienen esta teoría. (1)
Estudios experimentales realizados en seres humanos, como el de Vipeholm, en el
que se sometió a una población psiquiátrica institucionalizada a diferentes dietas,
demostraron entre otros factores, el papel cariogénico de la sacarosa. Por otra parte
solo a partir de este azúcar pueden determinar bacterias orales, sobre todo los
estreptococos del grupo mutans, sintetizar polisacáridos extracelulares solubles e
insolubles. La frecuencia de consumo de azúcar influye considerablemente en el
desarrollo de la caries dental, más de la cantidad; así como también la consistencia de
los alimentos condicionan su cariogenicidad; alimentos retentivos y pegajosos que se
adhieren a la superficie del diente, como toffes, turrón, miel o bombones son
potencialmente más cariogénicos que los alimentos detergentes que estimulan la
secreción de la saliva y desaparecen rápidamente en la boca. El momento de la ingesta
tiene también importancia. Ya que se consumen alimentos ricos en azúcares, durante
las comidas, cuando el flujo salival está estimulado, la eliminación es más rápida que
cuando el mismo alimento es ingerido entre comidas, o peor aun antes de acostarse,
debido a que el flujo salival es menor y prácticamente nulo durante el sueño. Con
respecto a la dieta es interesante destacar que no se es consciente de una gran parte de
la sacarosa que se consumen, es lo que se llama azúcar escondido o sumergido y
consiste en la sacarosa que va incorporada a alimentos manufacturado, tales como el
pan de molde, el ketchup o muchos alimentos envasados (1).
11
II.5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS.
II.5.1. RECUENTOS DE STREPTOCOCCUS mutans EN SALIVA
Actualmente se realizan con sistema llamado DENTOCULT SM en tira que consta de
un vial de cristal con un medio de cultivo selectivo líquido (Mitis salivarius) y una
tira de soporte que esta tratada en uno de sus extremos para que sea adherente. Antes
de su utilización se introduce en el vial un disco de bacitracina y que ejerce un efecto
antimicrobiano frente ha otras bacterias que no son estreptococos del grupo mutans.
La tira de soporte se impregna de saliva y se introduce en el medio selectivo,
procediéndose a su incubación. La interpretación se realiza por densidad de
crecimiento en ufc /mL de saliva. Unos recuerdos altos de esta bacteria indican un
riesgo microbiológico muy elevado, debiendo el odontólogo controlar ha este paciente
con todo los medios que tenga a su alcance (1).
II.5.2. RECUENTO DE LACTOBACILLUS EN SALIVA.
El método clásico, que consistía en emplear placas de petri con agar Rogosa-
Mitchell-wisemann como medio selectivo, inoculando saliva diluida de forma seriada,
ha dado paso al sistema Dentocult LBR, que consta de una lengüeta de plástico
recubierta de medio selectivo y conectada a un tapón de rosca que cierra un tubo
transparente. Después de inocular la saliva e incubar durante el tiempo apropiado, se
realiza la lectura, de los resultados comparando la densidad de crecimiento de
colonias de Lactobacillus de la lengüeta con una tabla de densidad ya establecida.
Los resultados se interpretan en unidades formadoras de colonia por milímetro de
saliva. (ufc /mL). Los recuentos elevados pueden ser un reflejo del número de caries
abiertas o restauraciones defectuosas, o ambas. Asimismo, es un numero indicador de
la frecuencia de consumo de hidratos en saliva (1).
12
II.5.3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS MICROORGANISMOS
CARIOGÉNICOS.
Morse en 1976 encontró que las bacterias aeróbicas y las anaeróbicas facultativos
producían enzimas destructoras de tejidos, como hialuronidasa, controitin, sulfatasa y
gelatinasa (4).
En ese mismo año Keudell y Conte encuentran que los anaeróbicos obligados
también producen estas enzimas y además liberan colagenazas (34).
Los bacteroides producen estos cuatro tipos de enzimas (33), que destruyen la
sustancia fundamental, impidiendo el intercambio metabólico y destruyendo el tejido
pulpar (5).
II.5.4. CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS.
Se llaman cultivos al proceso de propagar microorganismos brindándoles las
condiciones ambientales adecuadas. Los microorganismos en crecimiento requieren
que se regulen los nutrientes, pH, temperatura, aereación, concentración de sales y
potencia iónica del medio (6,7,8).
II.5.5. MEDICINA TRADICIONAL
Desde hace milenios las drogas provenientes de plantas han sido utilizadas para
aliviar o curar enfermedades del hombre, siendo en tiempos remotos la única fuente
de medicina para el género humano. En nuestros días se estima que un 80% de la
población que vive en países en desarrollo depende fundamentalmente de la práctica
de la medicina tradicional para sus necesidades de cuidados primarios de salud y
cerca de 121 sustancias químicas son reconocidas como drogas medicinales y son
comercializadas en todo el mundo con importantes rendimientos. De los 25
medicamentos mejor vendidos durante 1991 aproximadamente la mitad son productos
provenientes o derivados de los mismos.
13
En África y la India millones de personas usan las ramitas del”NEM” como cepillo de
dientes. El “NEM” es una planta cuyo nombre científico Azadirachtin índica posee
cualidades preventivas; muchos dentistas encontraron la eficacia del “NEM” usándolo
en la consulta diaria para la prevención de enfermedades periodontales y caries dental.
No se sabe ha ciencia cierta si el “NEM” estimula los anticuerpos del organismo, o
previene el aumento de placas. (9).
Es muy frecuente ver personas que usan las ramitas del “NEM”como cepillo de diente
disponible en las regiones sur del África y sur de Asia. Las pocas investigaciones,
encontraron que la ramita del “NEM” contiene ingredientes antisépticos que pueden
mantener a los dientes muy saludables (9).
Por otro lado, una compañía Alemana utilizó el “NEM” (en extracto) como el
principal ingrediente activo en las pastas dentríficas y otras preparaciones de higiene
bucal y ha demostrado su eficacia para prevenir y sanar inflamaciones de las encías y
la enfermedad periodontal (9,10).
Hasta la actualidad no se ha obtenido el principio activo de esta planta que previene
enfermedades orales. Sin embargo se realizaron estudios de donde se obtuvo los
principios activos que actuaron como insecticidas, funguicidas y entre otros,
pudiendo fraccionar sus componentes y que aun están en prueba. También es
conocido como el “árbol botánico” por que de ello obtuvieron diversos fármacos (mas
de 500 fármacos) (10).
Con el avance de la ciencia y la técnica el mundo se enfrenta a enormes desafíos que
no excluyen a los países de América latina y el caribe. Ante el reto de superar nuestras
grandes dificultades, una fuente de esperanza, y quizás unas de las principales, es la
posibilidad de que la exhuberancia de la flora y fauna de América Latina y el caribe
finalmente se consolide como factor que constituye al desarrollo humano que
buscamos para los pueblos de nuestro país. La capacidad científico-técnica existentes,
el acceso de nuevas tecnologías y la riqueza de nuestra biodiversidad se combinan
para brindar a la humanidad un enorme potencial de desarrollo; por lo que nuestras
perspectivas tiene que contribuir en el avance y desarrollo de la tecnología médica
para combatir enfermedades y empujar a la humanidad al creciente desarrollo. La
organización panamericana de la salud ( OPS) ha asumido el compromiso de cooperar
14
con los países del continente, en las búsquedas de nuevas fuentes para su desarrollo y
ha convocado a la imprescindible contribución de profesionales de varias disciplinas
para que se exploren las relaciones entre biodiversidad, biotecnología y desarrollo
sostenible en América Latina y el Caribe. Por otra parte la toma de conciencia
mundial sobre la necesidad de conservar la diversidad biológica y emplearla de forma
sostenible, fenómeno favorecida por la conferencia de las naciones unidas sobre el
medio ambiente y el desarrollo (río de Janeiro 1992) condujo a la firma y entrega en
vigor el convenio sobre la diversidad biológica y el compromiso de poner en práctica
el programa o agenda 21 (11,12).
II.6. PROPIEDADES Y PRINCIPIO ACTIVO DE LAS PLANTAS
El uso de plantas con fines medicinales ha prevalecido durante millones de años en
nuestro país y el mundo, la medicina herbolaria tanto antiguo como moderna ha sido
la fuente de terapias muy útiles (13).
Un gran número de productos naturales han resultado del estudio científicos de
remedios tradicionales empleados por varias culturas. Muchos de ellos son derivados
de las plantas como la pilocarpia, Vineristina, emetina, fisostigmina,
digitoxina,quinina, atropina y reserpina son unos pocos ejemplos bien conocidos, en
las que podemos mencionar. (13)
Los usuarios de la medicina tradicional nos permite abordar mas atinadamente su
investigación, ya que, como es conocido, al estudiar una planta medicinal basado en
el uso tradicional ha conducido al aislamiento de: Sustancias con actividad Biológica
tal es el uso del estudio de plantas con actividad antitumoral (14).
Las propiedades medicinales de las plantas se deben a la presencia de sustancias
químicas llamadas principios activos, que tienen la capacidad de producir
transformaciones fisiológicas, las cuales pueden ser benéficas o tóxicas según el
principio activo de que se trate. Los principios activos son producidos por tejidos de
semillas, tallos, flores o raíces. Cada planta posee predominio de uno o varios de estos
principios activos, y estos compuestos pueden actuar en el organismo en forma
complementaria, o bien tener una actividad distinta, de esta forma se amplia el
15
espectro de actividad de una planta. Así tenemos por ejemplo la "salvia" (Salvia
officinalis), que posee un aceite esencial y tiamina, ambos tienen propiedades
antisépticas y fungicidas, además el aceite está formado por un compuesto esteroidal
(cetona) con propiedades estrógenas (induce la menstruación y detiene la producción
de leche). Estos componentes hacen de la salvia una planta especialmente útil en
infecciones genitales femeninas. La "manzanilla" (Matricaria chamomilla), y la
"menta" (Mentha piperita) son los ejemplos de hierbas polivalentes. Los componentes
del aceite esencial de estas plantas, las hacen eficaces para varios trastornos. La
manzanilla tiene propiedades carminativas, estomacales, antialérgicas, antiflogísticas
y antialérgicas estas propiedades son consecuencia de la presencia de azuleno y
bisabolol que se hallan en las flores (13).
Como se decía anteriormente, el valor medicinal de una planta reside en una sustancia
(principio activo) (13).
Los principios activos se clasifican según su composición química y son los
siguientes: alcaloides, glucósidos, aceites esenciales, mucílagos, ácidos orgánicos,
minerales y vitaminas (15).
- Alcaloides.
Las plantas con alcaloides, junto con las plantas con glucósidos, son las más
numerosas y, de uso difundido en medicina. Tienen muchas veces efectos
espectaculares. Este es el caso de la morfina alcaloide de la "adormidera" (Papaver
somniferum), la quinina que se obtiene de varias especies de "quina", los alcaloides de
cornezuelo del centeno, etc. Los alcaloides son sustancias orgánicas (compuestos de
carbono, oxígeno e hidrógeno) nitrogenadas. Alcanzan su máxima concentración
alrededor de la floración. No se inactivan con el secado de la planta y se pueden aislar
con disolventes químicos y, algunos - los menos - se pueden aislar con agua. Las
plantas con alcaloides actúan sobre el sistema nervioso central y periférico, algunos
son estimulantes y otros depresores. Pueden producir desde anestesia leve hasta la
narcosis. También actúan sobre los vasos sanguíneos modificando su contractibilidad.
Por último, algunas plantas tropicales tienen alcaloides con propiedades antisépticas
(la quinina). Otras plantas con alcaloides son: "tabaco", "cicuta", "chamico", "efedra",
"natri", "fumaria", "maqui", "palque o duraznillo negro", "galega", etc (15).
16
-Glicósidos.
Son plantas que tienen un compuesto químico formado por un azúcar (glucosa por
ejemplo) ligada a una parte no azúcar (aglucona o genina). Esta genina debe separarse
para ser activa. Se separa por fermentos que tiene la misma planta y se activa en
presencia de agua. Estas plantas se dividen según las características de la genina. Lo
común es que cada familia tenga un tipo de este compuesto no glucídico (genina), por
ejemplo, la familia de las crucíferas tienen genina (15).
-Glicósidos sulfurados.
En este caso se trata de una genina azufrada. Tienen propiedades antibióticas.
Requieren de un tiempo de maceración de diez minutos en agua tibia, así la genina es
aislada de la parte azúcar y se hace activa. Ejemplo de estas plantas son: "la espuela
de galán", "ajo", "cebolla", "nabo" y "rábano"(15).
-Glicósidos cianógenos.
La genina tiene nitrógeno como ácido cianhídrico,
Este proceso se produce especialmente en las semillas de las rosáceas, caprifoliáceas
y lináceas. Tienen propiedades anestésicas, antiespasmódicas e hipotensoras, mejoran
la respiración y la digestión. De este grupo son: el "cerezo", el "guindo" y el
"almendro" (15).
-Glicósidos fenólicos.
En la aglicona un grupo OH se encuentra unido a un grupo bencénico. Es común que
se encuentre en la savia de los brotes jóvenes y en la corteza de algunos árboles (sauce
y álamo). Se trata de dos compuestos principales: la arbutina y la salicina. Este
último, como se sabe tiene propiedades febrífugas y antipiréticas y actúa a nivel
central y vascular. De este principio se obtuvo la base para producir en forma sintética
el ácido acetilsalicílico. Para producir la separación de la aglicona del grupo glucídico
se requiere de una maceración de quince días en agua fría. A este grupo pertenecen el
"álamo", el "sauce" el "peral" y la "reina de los prados" (15).
17
- Glicósidos flavonoides.
La aglicona es un colorante (flavona= amarillo) que en la anigüedad era usado como
tintura. Su acción terapéutica está en sinergia con la vitamina C, luego se identifica
esta sustancia, denominada rutósido o vitamina P. Son solubles en agua, actúan sobre
el corazón y disminuyen la fragilidad capilar. De éste tipo de plantas son el
"mastuerzo", la "hierba de la plata", el "girasol", la "ruda" y el "sauco" (15).
-Glicósidos cumarínicos.
Son ésteres de ácidos compuestos, ácidos fenoles, y por lo general tienen olor a heno.
Están presentes en las gramíneas y en las umbelíferas. Poseen cualidades
antibacterianas. Son tóxicos para los animales por un efecto anti-vitamina K. De este
grupo son la "avena" y el "trébol", el "apio" y la "bardana"(15).
-Glicósidos ranunculósidos.
La familia de las ranunculáceas, además de proporcionar alcaloides, cardiotónicos,
saponinas y lactonas volátiles, proporciona una heterósido que es la unión de la
ranunculina con la glucosa. Se conserva sólo en las preparaciones alcoholadas o en las
plantas frescas. Irritan la piel y el aparato digestivo. Se utilizan muy poco por ser
tóxicas (15).
-Glicósidos antracenósidos.
La aglicona es un fenol utilizado como colorante textil. No se metaboliza en el cuerpo
humano y se elimina por vía biliar a los intestinos. Actúa como purgante a nivel del
intestino grueso. Se extrae con álcalis y requieren de ocho a doce horas para activarse.
No es aconsejable hacer uso de ellos en embarazadas y en personas on hemorroides,
pues aumentan el flujo en el intestino. De este grupo son la "frángula", la "cuscuta", el
"ruibarbo" y el "sen" (15).
-Resinas.
La resina es el producto oxidado de la esencia. Se puede obtener artificialmente, pero
existen algunas plantas que realizan en forma natural este proceso. Al enfriar la
esencia se obtiene un producto llamado alcanfor que tiene propiedades medicinales
18
distintas de la esencia. Por este hecho, las plantas con esencias tienen tres
posibilidades de uso: como droga (té o agua), como esencia, al aislarla, o como
alcanfor. Por ejemplo se puede consumir la menta como agua de menta, se puede usar
la esencia de menta, y también como mentol que es el alcanfor de la menta. Las
esencias también pueden estar unidas a glúcidos, por ejemplo, el ajo. En general, se
trata de plantas con abundantes propiedades medicinales, y consumidas en exceso
tienen efectos tóxicos irritativos. La asociación alcohol-esencia es especialmente
irritante. Las plantas con esencias tiene propiedades de tónico digestivo, desinfectante
intestinal espasmolítica, como es el caso del "ajo" y el "tomillo". Al ser de excreción
por la vía respiratoria, el "tomillo", la "menta" y el "eucalipto" son útiles para
afecciones del aparato respiratorio. La "chinita" y la "manzanilla" por vía general y
local son antihistamínicas. Otras propiedades que comparten varias de estas plantas
son las diuréticas, emenagogas y antirreumáticas. Pertenecen a este grupo de plantas
la "milenrama", el "apio", el "cilantro", el "cáñamo", el "eucalipto", el "hinojo", el
"laurel", la"lavanda" el "toronjil de olor", la "menta", la "albahaca", el "orégano", el
"anís", el "pino", el "romero", la "salvia", el "tomillo", el "tilo" y la "valeriana" (15).
-Glúcidos.
Los mucílagos son azúcares polimerizados, son sintetizados por la planta con fines
energéticos y plásticos, para el crecimiento, la reproducción y la reserva. Además
estos azúcares permiten acumular agua. Los almidones son almacenados en la semilla
y las pectinas en las paredes celulares. Estos glúcidos no se disuelven en agua sino
que la absorben y se hinchan. De esta forma cuando se aplican sobre los tejidos
producen efectos antinflamatorios y de protección local. En la piel actúan como
emolientes, como es el caso del "llantén" y de la "espuela de galán". En los intestinos
disminuyen la peristalsis y protegen la mucosa, en este caso a dosis bajas actúan como
antidiarreico, pero a altas dosis por ósmosis, son laxantes. Desgraciadamente se
absorben poco, pero a pesar de ello, algunos llegan casi hasta el tracto respiratorio y
también tienen poder descongestionante: "llantén", "tusílago", "borraja",etc. En estas
mismas plantas se han identificado sustancias con propiedades antibióticas. Este
hallazgo es un ejemplo de complementariedad, pues la presencia de estos azúcares
complejos es un excelente caldo de cultivo para los gérmenes. Sin embargo, para
evitar la descomposición la planta elabora sustancias con propiedades antisépticas
19
asegurando así al conservación. Por esta razón, estas plantas además tienen efectos
antisépticos leves. Las plantas de este grupo más conocidas son:"sanguinaria",
"borraja", "membrillero", "avena", "llantén", "vira-vira", "algarrobo", etc (15).
Existen grupos de plantas que tienen otros principios activos. Por ejemplo plantas con
ácidos orgánicos (málico, tartárico y oxálico), que tienen propiedades leves diuréticas
y laxantes. Plantas con sustancias minerales y vitaminas y por último, algunas con
propiedades antibióticas, distintas de las ya vistas o de los hongos. Pero son grupos
pequeños o mejor conocidos en el ámbito de la dietética y la alimentación. (15)
II.7. CALATOLA costaricense standl. (piyú o pindú)
La medicina tradicional en el Perú empleadas en base plantas medicinales ha sido
difundida por nuestros antepasados y transmitida de generación en generación. No es
raro observar hasta hoy en día, que una parte de nuestra población los emplea como
uno de los primeros recursos con que cuentan a la mano (15).
Las plantas medicinales han jugado un rol muy importante en la historia del Perú. La
civilización Andina se desarrolló en base al aprovechamiento de cientos de especies
que brindaban estos productos y muchas de ellas, más tarde fueron domesticadas. Se
estima que en la antigüedad, en los andes, se llegaron a utilizar hasta 500 especies de
vegetales, solamente para satisfacer las necesidades de alimentación y cientos de ellas
para satisfacer las necesidades de salud, dando renombre a la medicina tradicional
antigua.
Hoy en día, estudios etnobotánicos de la Universidad Nacional Agraria de la Molina,
nos informan una cantidad importante de plantas medicinales oriundas del Perú que
grupos étnicos y no étnicos las usan con mucha frecuencia y eficacia; algunas de
ellas han sido estudiadas científicamente tanto en nuestro país como en el extranjero.
Sin embargo, todavía quedan muchas por estudiar.
Las plantas medicinales elaboran productos llamados principios activos, que son
sustancias que ejercen cierta acción farmacológica sobre el organismo de un
individuo, logrando que se restablezca el desequilibrio orgánico (17).
20
La poca atención no solamente en salud, por parte del estado, grupos étnicos y
mestizos de la Amazonía peruana buscaron la forma de conllevarse con la naturaleza,
encontrándose con múltiples obstáculos, sin embargo las experiencias cotidianas, han
hecho que se descubran propiedades significativas, en beneficio de la comunidad,
convirtiéndose en un conocimiento tradicional que se transmite de generación en
generación.
Es el caso del Calatola costaricense standl o también conocido como “Piyú”,
“pindú” por algunas etnias de la Amazonía peruana, que ha sido, y en algunos casos
sigue siendo usado como un método preventivo de la enfermedad de la caries dental y
de las encías en estas poblaciones.(16)
Pobladores antigüos que en algún tiempo de su vida usaron este método, manifiestan
que al masticar las hojas (chacchar) de esta planta, por un lapso de 10 a 15 minutos
pueden prevenir el desarrollo de la caries por un tiempo de 10 a 12 meses como
máximo; sin embargo usándolo como terapia, que consiste en masticar de 10 a 15
minutos diarios por 5 días, pueden prevenir la enfermedad hasta por 4 a 5 años, sin
tener que volver a masticar. Éste último método exige una rigurosa dieta que consiste
en no ingerir alimentos dulces ni calientes
Una de las desventajas, por la cual se está perdiendo la costumbre del uso del
Calatola costarincese standl, como medio preventivo de las enfermedades orales, es
que produce una pigmentación oscura en la superficie del esmalte, lo cual perdura por
mucho tiempo. Dicha pigmentación se da exclusiva y estrictamente en la superficie de
los dientes que al parecer es la que protege de caries, produciendo un cambio de color
(antiestético). Ésto hace que la nueva generación al encontrarse con la
modernización (cepillos, dentríficos, fluor, etc), opten por ésto, dejando en abandono
las costumbres, que sus ancestros mantuvieron por muchos años, previniendo la
enfermedad de la caries y de las encías.
El Calatola se encuentra en climas trópicos de la Selva peruana en las Provincias del
Alto Amazonas y el Condorcanqui, donde habitan más de 7 grupos étnicos con
idiomas diferentes (Aguaruna, Wambisa, Chayawita, Quechua, Achuar, Shapra,
Candoshi), más la población mestiza. Fig. 1
21
No todos los grupos étnicos practican éste método. Los pocos pobladores que existen
y que tuvieron experiencia de esta técnica, en su mayoría se encuentran en cuatro
grupos que son: Los Aguarunas, Chayawitas, Wambisas y Achuar.
II.8. POSICIÓN TAXONÓMICA
Según el museo de Historia Natural, al que se le hizo entrega de muestras para su
clasificación. Anexo 1. Esta planta pertenece a la división Magnoliophyta, clase
Magnoliopsida, subclase Rosidae, orden Celastrales, familia Icacinaceae, género
Calatola, especie Calatola costarricense satandl, nombre vulgar “piyú” o “pindú”,
árbol de mediano tamaño que mide hasta 18 metros ó mas de alto, cuyas hojas son
aserradas y alternas. Su madera es dura y resistente de buena calidad y posee
pigmentaciones de color negro. Fig. 2.
Creo que este estudio contribuirá en el desarrollo y el rescate de la medicina
tradicional perdida por el desarrollo de la medicina moderna.
22
Figura 1. Localización del Calatola costaricense standl en el Perú
23
Figura 2. Planta de Calatola costaricense standl.
24
III. HIPÓTESIS
El extracto etanólico del Calatola costaricense satndl tiene acción antibacteriana en
cultivos de placa de origen dental
IV. OBJETIVO
IV.1. OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la acción antibacteriana In vitro del extracto etanólico del Calatola
costaricense satndl en bacterias de placa dental.
V. METODOLOGÍA
V.1. MATERIALES
• Bolsas de tela para el transporte de las hojas.
• Unidades de cordel de rafia.
• Hexano.
• Peras de vidrio para decantación de 500 ml.
• Cápsulas de porcelana grande 10-12 Cm. De diámetro.
• Beaker de vidrio de 500 ml.
• Fiolas.
• Papel de filtro Wottman No. 40.
• Agar Mueller Hinton.
• Alcohol al 90%.
• Etanol.
• Pinzas de algodón.
• Jeringas de tuberculinas.
• Placas petry estériles.
• Torundas estériles (hisopos).
• Discos de filtro estériles.
25
• Regla milimetrada.
• Fichas de registros.
EQUIPOS DE LABORATORIO
• Trituradora de hojas.
• Rotavapor.
• Balón para rotavapor de 2 L.
• Balanza con medida exacta.
• Asa de Kolle o asa de siembra.
• Pipetas.
• Estufa para cultivos de microorganismos.
• Mechero de Bunsen.
• Cámara de siembra.
• Cámara digital.
V.2. DISEÑO DEL ESTUDIO
Se realizó un estudio de tipo ensayo de laboratorio In vitro.
V.3. POBLACIÓN MUESTRAL.
A) Grupo de Estudio.
Se emplearon 12 cultivos muestrales de placa bacteriana (01 por cada niño),
recolectadas de 12 niños del AA. HH. Lomas de Zapallal, en la posta médica
de la UPCH.
B) Grupo Control A.
Se realizaron 12 cultivos donde se colocaron discos embebidos de
dimetilsulfóxido.
26
C) Grupo Control B.
Se realizaron 12 cultivos y se dejaron desarrollar la colonias sin la colocación
de ninguno de los compuestos
V.4. DEFINICIÓN DE VARIABLES
A) Variable independiente.
Sustancia de experimentación: Las sustancias de experimentación es el
extracto etanólico del Calatola costarricense standl.
B) Variable dependiente.
Evaluación de acción antibacteriana:
La variable dependiente se define por la acción antibacteriana dentro del
medio de cultivo (siembra en placas), cuyo halo se registraron en milímetros,
consistió en la medición del diámetro; en los halos de forma irregular, se midió
la parte de mayor y menor tamaño, registrando el promedio. Las medidas se
registraron bajo la siguiente escala:
Menor de 10 mm: Resistente.
Entre 10 a 15 mm: Intermedio.
Mayor de 15 mm: Susceptible.
V.5. PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN, TRANSPORTE
Y SECADO DE LAS HOJAS DEL CALATOLA costaricense standl
Existen medidas bastante sencillas que permiten aprovechar las plantas silvestres
sin alterar sus ciclos normales de crecimiento y reproducción.
Aplicándolas se evita la desaparición de las plantas silvestres medicinales de los
lugares donde viven.
27
Para ello se realizó la recolección de las hojas en el mismo lugar de procedencia
con la ayuda de una persona de la misma zona, que ha tenido experiencia con esta
planta. Se recolectaron 5 Kg. aprox. de hojas y se procedió a secarlas.
Para ello se tomaron en cuenta los siguientes criterios:
V.5.1. Criterios de inclusión.
1. Se cogieron las hojas de las plantas adultas.
2. Sólo las hojas del Calatola.
3. Hojas sanas, libres de parásitos, hongos, caracol, mohos, polvo etc.
V.5.2. Criterios de exclusión.
1. Las plantas jóvenes o poco desarrolladas.
2. Hojas muy maduras y/o maltratadas
3. Hojas de plantas en lugares contaminados, tales como:
• Calles u orillas de caminos, por las emanaciones tóxicas de los caños de
escape.
• Alrededor de industrias contaminadas.-
• Cerca de cultivos en potreros, porque en ellos se emplean plaguicidas.
• En canales, u otros cursos de agua contaminados, etc.
5. Hojas muy húmedas.
6. Hojas que se han secado naturalmente.
V.5.3. Higiene.
Las hojas no fueron lavadas por el peligro de putrefacción en poco tiempo. Se
separaron las hojas de tierra, palitos, piedras y otros que no formaban parte de
ella.
28
V.5.4. El secado.
Se recolectaron 5 Kg. de hojas frescas del Calatola, que fueron puestas a secar a temperatura ambiente de la zona de extracción (30 0C. aprox.) sin exposición solar, para su deshidratación.
En el secado directo al sol, pueden alterar los principios activos (la luz ultravioleta puede producir reacciones químicas que los destruyan) o se evaporan. Por ello es necesario secar las hojas en un ambiente techado con aireación constante, para renovar el aire humedecido por la evaporación del agua que sale de las hojas puestas a secar.
Forma de secado:.
• En capa.
Sirve especialmente para secar hojas sueltas, como en éste caso.
Las hojas se pusieron sobre una mesa tendida con tela de sacos harineros.
La hojas fueron extendidas hasta una altura máxima de 15 cm. el cual nos permitió la ventilación tanto interna como externa.
Se removió diariamente, para evitar la putrefacción de las hojas que están en contacto con la mesa.
V.5.5. Transporte.
El transporte de las hojas desde el lugar de recolección, hacia el laboratorio LID (Laboratorio de investigación y desarrollo) de la UPCH (Universidad Peruana Cayetano Heredia), se hizo en bolsas de sacos harineros limpios para evitar la contaminación y asegurar la ventilación, evitando la putrefacción en pocas horas.
V.5.6. Conservación.
Una hoja medicinal bien seca conserva sus propiedades medicinales hasta por un año. Después de ese tiempo sus principios activos se evaporan o se alteran (si la planta es aromática ya casi no tiene olor, o éste es desagradable). Otra forma de conocer si una hoja está "pasada" es por su color amarillento.
29
V.5.7. Obtención Del Extracto Etanólico
Los 5 Kg. de hojas secas fueron extendidas en una mesa y se seleccionó las hojas libres de hongos y sin maltratos. Luego se procedió a pulverizar en una trituradora del cual se obtuvo 770 g. de hojas triturada; se envasó en un recipiente de vidrio donde se le agregó 1 L de etanol QP. por cada 100 g. de hoja triturada. Se almacenó a temperatura ambiente por un lapso de 20 días para su maceración.
Luego se filtró usando un papel filtro Wotman No. 40; los remanentes se dejaron en maceración por 8 días que luego también se filtró con la misma técnica; ésto nos permitió extraer los componentes en su mayor cantidad posible.
Luego fue sometido a un rotavapor a 40 oC y vacío para extraer el etanol. Después de este proceso, aun queda residuos de etanol dentro del extracto, del cual tiene que ser eliminado totalmente, para ello se utilizó una cámara al vacío con la misma temperatura, obteniendo de ésta manera un extracto etanólico confiable.
Este método es denominado técnica de Kaupchan, anexo 2; que también tiene la ventaja de solubilizar los diferentes componentes presentes en la planta y sustraer solventes de polaridad diferente, lo que permite obtener el extracto en forma rápida. Fig. 3, 4, 5.
V.5.8. Recolección de muestra de placa bacteriana.
-Criterios de Inclusión.
1. Pacientes de 8 a 12 años de edad, del AA.HH. Lomas de zapallal. 2. De cualquier género. 3. Que tengan las Pzas. 16,11 ó 21, 26, 36, 31 ó 41, 46. 4. Que tengan: IHO, IPB é IC grado III.
Una semana antes se coordinó con el responsable de salud bucal de la posta médica, para contar con el asentimiento de los padres. Anexo 3.
Las muestras se obtuvieron de 6 superficies de las piezas seleccionadas (Silness y Löe).
30
Figura 3.- Hojas secas listas para ser trituradas
Figura 4.- Maceración y filtración.
31
Figura 5. Rotavapor y el extracto etanólico de Calatola costarricense standl,
dentro de una cámara al vacío.
32
Con una cureta se procedió a retirar la placa dental, depositándolo en un vial
estéril con 1 mL de suero fisiológico.
Los viales con las muestras fueron rotulados y transportados inmediatamente al
laboratorio, para su respectiva siembra. Fig. 6.
Figura 6.- Toma de muestras y los viales.
33
V.5.9. Dispersión de las bacterias en el medio de cultivo.
Se realizó mediante el método de siembra en placas petry.
Un día antes de la siembra se preparó el agar, utilizando las especificaciones
técnicas del fabricante: 34 g. de agar en 1 L de agua destilada caliente. Se
licuó en baño maría agitándolo en forma circular para conseguir que sea
homogéneo, se autoclavó a 121°C por 15 min. a 15 libras de presión y se
controló por 24 horas a 36° C.
Una vez controlado y cerciorado su esterilidad, se volvió a licuar el agar en
baño maría y se vertió 32 mL de agar en 24 placas estériles dejándolo enfriar
por unos 15 a 20 min. Con un hisopo estéril, se cargó del frasco con muestra y
se diseminó sobre la superficie de agar de las 24 placas. Luego se tomó a 12
de las 24 placas diseminadas, se dividió en dos mitades, y con la ayuda de un
extractor de agar, se hizo un pequeño pocito (en forma de sacabocado) de 6
mm. aprox. de diámetro en una mitad de la placa y se le agregó una gota de
agar licuado en el fondo de cada orificio, para evitar la filtración de la
sustancia entre el agar y la superficie de la placa.
El extracto etanólico del Calatola tiene una consistencia muy densa que no
puede ser manipulado fácilmente; para ello se le agregó dimetilsulfóxido para
disolverlo sin alterar sus propiedades, en una proporción de 1:2 (1mL de
extracto y 2 mL de dimetilsulfóxido), ésto nos ayudó a manipular, con la
ayuda de una jeringa de tuberculina estéril, se procedió a verter
cuidadosamente 0.5 ml de la sustancia experimental, (extracto etanólico del
Calatola costarricense stanl mas dimetilsulfóxido) en los 12 orificios (grupo
de estudio). A las otras mitades, se le colocó un disco de filtro embebido de
dimetilsulfóxido en cada mitad (grupo control A). Gráfico. 1, 2.
Se enumeró cada mitad y se sometió a la estufa a 37ºC, para luego a las 24
horas proceder a la lectura, registrando en una ficha. Anexo 4.
Las otros 12 placas, no se hizo ningún pocitos (sacabocados) ni se agregó el
extracto etanólico (grupo control B).
34
V.5.10. Prueba de susceptibilidad.
La susceptibilidad de la sustancia está traducido por el área donde no hay
desarrollo de microorganismos al rededor de ello (halo), que se midió en
milímetros.
La resistencia a una sustancia no muestra inhibición si no desarrollo del
microorganismo invadiendo a la sustancia .
Con la ayuda de un calibrador milimetrada, se midió en milímetros el
diámetro de
inhibición (halo) presentes alrededor de la sustancia.
VI. PROCESAMIENTO DE DATOS.
Para evaluar los grupos y tiempos de cada sustancia se realizará la evaluación
estadística mediante el uso de pruebas No paramétricas en el programa de SPSS.
Versión 11.5 para Windows. Calculándose lo sgte:
El nivel de significancia estadística será del 95% (p<0.05)
Distribución de frecuencia.
35
VII. RESULTADOS
EE+DS
DS
Placa Halo > Halo< Promed. Halo> Halo< Promd.
1 17 15 16 00 00 00
2 20 19 19.5 00 00 00
3 19 19 19 00 00 00
4 13 13 13 00 00 00
5 26 23 24.5 00 00 00
6 21 19 20 00 00 00
7 23 22 22.5 00 00 00
8 20.5 20 20.25 00 00 00
9 17 17 17 00 00 00
10 20 18 19 00 00 00
11 17 16 16.5 00 00 00
12 18 14.5 16.25 00 00 00
Promedios
Totales 19.29 17.96 18.63 00 00 00
EE: Extracto Etanólico.
DS: Dimetilsulfóxido.
36
En los cuadrantes del grupo estudio, los halos de inhibición no fueron definidos, sino
mas bien muy irregulares, y el desarrollo de las colonias fueron muy pequeñas y
esporádicas a comparación del grupo control B, por lo que la medición del halo se
realizó entre las colonias más cerca al extracto, arrojando un halo promedio de 18.63
mm. Una prueba de gram de las zonas donde no hubo desarrollo de colonias, al
microscopio nos demostró la presencia de cocos gram positivos, y ausencia de cocos
gram negativos.
Lo que nos indica que existe un retardo en el desarrollo de cocos gram positivos é
inhibición de los cocos gram negativos.
37
VIII. DISCUSIÓN
Obtenido los resultados de nuestro estudio, consideramos necesario validar la
metodología que hemos escogido con el fin de encaminar la investigación hacia un
nuevo producto de menor riesgo en toxicidad, alta efectividad y mayor tiempo de
protección.
Un primer método aplicado en la prueba de susceptibilidad para nuestro estudio, se
hizo con 12 muestras de placa bacteriana, encontrando a simple vista un bajo
desarrollo de colonias bacterianas alrededor del extracto etanólico, sin la formación de
halos definidos, realizando las medidas desde las colonias más cerca al extracto;
arrojando un halo promedio de 18.63 mm. En ese sentido, resulta dificultoso la
medición del halo, y limitante ya que no se tiene otro que forme un halo definido con
que comparar. Todo ésto, más una prueba de gram, motivó a realizar un segundo
experimento con la misma técnica, con la diferencia que se usó discos embebido con
el extracto etanólico, el dimetilsulfóxido.
Una estrategia en particular al estudio, se realizó mediante siembras de muestras
extraídas de las zonas inhibidas del extracto etanólico, se encontró el desarrollo de
una sola colonia muy evidente.
Si bien estos resultados son alentadores de un posible retardo de crecimiento de
bacterias por parte del extracto, merece ser investigado en diferentes métodos por
conseguir el o los principios activos.
38
IX. CONCLUSIONES
• El método aplicado mediante el extracto etanólico del Calatola no posee propiedades
bactericida; sin embargo existen indicios de actividad bacteriostática.
• El desarrollo de colonias bacterianas en el grupo experimental se dio muy esporádico,
formando un halo no definido, con un promedio de 18.63 mm.
• En el grupo control A con respecto al disco del dimetilsulfóxido, el desarrollo de
colonias bacterianas fueron evidentes y sin dificultad, invadiendo hasta el disco, lo
cual demostraron resistencia.
• El desarrollo de colonias bacterianas en el grupo control B se dio sin ninguna
dificultad.
39
X. SUGERENCIA
En función de los resultados, proponemos diseñar estudios que determinen la acción
específica del factor de experimentación e identificar el o los principios activos.
40
XI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Liébana Ureña, J. Microbiología Oral. Edt. Interamericana. Mac Graw-Hill.
1995;(15):220-552.
2. Liébana J, Castillo A, Peis J, y col. Antimicrobial Susceptibility of 1042
Strains of Streptococcus Mutans and Streptococcus Sobrinus. Comparison fron
1985 to 1980. Oral Microbial. Inmunol, 1991; (6): 146 – 150.
3. Finegold, SM, Baron, EJ. Diagnóstico Microbiológico. Edt. Panamericana.
7ma ed. Buenos aires.1989: 450-520.
4. Morse, B. Endodontic Microbiology in the. 1981;(14):69-79.
5. Moenning, J. & Col. The Microbiológy and Chemotherapy of Odontogenic
Infections . J, Oral Max Surg, 1989; (47): 85-976.
6. Joklik, W. Introducción a las bacterias anaerobias. Anaerobios no formadores de
esporas. Edit. Médica Panamericana. 20 va ed. Buenos Aires. 1994: 60-841.
7. Ross, P. Morfología y Fisiología de bacterias y Hongos. En: Microbiología
Bucal y clínica . Edit. Científica PLM, 2da ed. México D.F. 1985: 9-16.
8. Barkhordar, R. Evaluation of antimicrobial activity in vitro of ten root canal
sealers on Streptococcus Sanguis and Streptococcus Mutans. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol. 1989; (68): 770-775.
9. Radwanski. S. Neem tre. Further uses and potential uses. World Crops and
Livestock 1977; (29): 167-168.
10. A Tree to Solve the Global Problems Neem. The Report of a Board ad hoc of
the Meeting in the science and technology for the International Development the
Council of National Reseach. The Press of the national Academy. Washington,
D.C. 1992:62-64.
41
11. AESPG . Herbal Medicinal Products in the European Union. Study Carried out
on Behalf of the European Commission. 1999: 6-38.
12. Obregón Vilches E. Fito 2000. Por la investigación, conservación y difusión del
conocimiento. 2000. de las plantas medicinales.200:6-12.
13. Famsworth, NR, Bingel, AS. Problems and prospects of discovering new drugs
from higher plants by pharmacological screening. En H. Wagner y P. Wolf.
New Natural Products and Plants Drugs With Pharmacological, Biological or
Therapeutic Activity Springer, Berlin. 1977: 8-22.
14. Famsworth, NS. The Development of Pharmacological and Chemical Research
for Aplication to Traditional Medicine in Development Countries of
Ethnopharmacology. 1980;(2):173-181.
15. Principios Activos y Propiedades de las Plantas Medicinales. Universal
pharmaceuticals. INC. http://www.diariomedico. com 14-01-2004.
16. Reynel C, Albán J, Col. Etnobotánica Campa, con Especial Referencia a las
Especies del Bosque Secundario. UNAM. 1990.
17. Alvarado Villar, M. Estudio comparativo “in Vivo” de la respuesta
inflamatoria del tejido celular subcutáneo de ratas Holtzman, a los cementos
para obturación de conductos radiculares: Endobalsam, AH plus, Endion y el
cemento experimental a base de un extracto etanólico de Plantago Major
(llantén). [Tesis Para Obtener el Título de Cirujano Dentista]. Universidad
Peruana Cayetano Heredia. Lima Perú. 2003.
42
XII. ANEXOS
43
Placa Petri con Agar
Medio de cultivo con placa dental Calatola costarisence standl
Gráfico 1. Ubicación del pocito con el extracto y el disco de dimetilsulfóxido
44
Pocito lleno del EE.
Medio de cultivo
Gráfico 2. Corte transversal de placa petry con “pocito” para
proceder a la evaluación.
45
Anexo 1. Posición Taxonómica.
46
n-HEXANO PLANTA
FOO ETANOL 50% F001 ETANOL 96%
F002
AGUA F003 INSOLUBLE F005
Ext. Agua: Diclorometano (50:50)
DICLOROMETANO F004
Ext. Hexano: Metanol 90%(50:50)
HEXANO F006 METANOL 70%
Anexo 2. Técnica de Kaupchan
47
ASENTIMIENTO
Yo...........................................................................................identificado con
DNI..........................., declaro estar enterado del trabajo de investigación; por lo que
autorizo plenamente al responsable del presente estudio, para que se tome las
muestras orales de mi menor hijo(a)..............................................de......años de edad.
Lima..............de.........................del 200...
__________________________
Firma.
Anexo 3. Hoja de asentimiento.
48
Diámetro del halo
No. de placas. D. mayor. D. menor Promedio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Anexo 4. Ficha de registro para cada sustancia de
experimentación en mm.
