UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO FACULTAD DE ...€¦ · INGENIERÍA AGRONÓMICA Previo a la Obtención del Título Título del Proyecto de Investigación: Multiplicación

UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

INGENIERÍA AGRONÓMICA

Título del Proyecto de Investigación:

Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con

plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum)

en condiciones de invernadero.

Autor:

Mayra Alejandra Bustamante Ochoa

Director del Proyecto de Investigación:

Dr. Fernando Abasolo Pacheco

Quevedo – Los Ríos – Ecuador

2019

Proyecto de Investigación

Previo a la Obtención del Título

de Ingeniera Agrónoma.

ii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y SESIÓN DE DERECHOS

Yo, Mayra Alejandra Bustamante Ochoa, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi

autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación

profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este

documento.

La Universidad Técnica Estatal de Quevedo, puede hacer uso de los derechos

correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual,

por su Reglamento y por la Normativa Institucional vigente.

Atentamente;

-------------------------------------------------


C.I: 0503924896

iii

CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO

DE INVESTIGACIÓN

El suscrito Dr. Fernando Abasolo Pacheco, Docente de la Universidad Técnica Estatal de

Quevedo, certifica que el estudiante Mayra Alejandra Bustamante Ochoa, realizó el

Proyecto de Investigación titulado “Multiplicación de micorrizas en tres diferentes

sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca

(Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero”, previo a la obtención del título de

Ingeniera Agrónoma, bajo mi dirección, habiendo cumplido con las disposiciones

reglamentarias establecidas para el efecto.

Atentamente;

-------------------------------------------------


Director del Proyecto de Investigación

iv

REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE PREVENCIÓN

DE COINCIDENCIA Y/O PLAGIO ACADÉMICO

-------------------------------------------------


Director del Proyecto de Investigación

v

UNIVERSIDAD TECNICA ESTATAL DE QUEVEDO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:

Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de

sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero.

Presentado a la Comisión Académica como requisito previo a la obtención del título

de:

Ingeniera Agrónoma

Aprobado por:

Dr. Hayron Canchignia Martínez

Presidente del Tribunal

Quevedo – Los Ríos – Ecuador

2019

Dr. Pablo Ramos Corrales

Miembro del Tribunal

Dr. Favio Herrera Eguez

Miembro del Tribunal

vi

AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a Dios, por estar cuidándome en cada

momento de mi vida, guiándome por el camino del bien, brindándome la sabiduría para

realizar cada actividad como estudiante, inteligencia para terminar con éxito esta etapa de

mi vida universitaria y poder como profesional servir a la sociedad. Al concluir un trabajo

lleno de dificultades como un proyecto de investigación, del cual te exige tu mayor

esfuerzo y voluntad. Sin embargo este aporte de gran magnitud fue posible gracias a la

participación de personas que de una u otra manera se han hecho presentes en consejos,

motivación y ayuda.

Dr. Fernando Abasolo mi más sinceros agradecimiento por permitir que este proyecto de

investigación se realice, poniendo su confianza en mí y facilitando todos los medios

posibles. Quiero expresar mi agradecimiento a la Dra. Carmita Suarez Capello por

brindarme sus conocimientos, la ayuda necesaria y sobre todo ser una gran maestra y

amiga. También expresar mi agradecimiento a la Fundación Maquita - Buena Fe y a sus

colaboradores, por permitirme realizar el proyecto de investigación, brindando

infraestructura y materiales posibles, en especial al Ing. Carlos Zambrano por su

amabilidad, paciencia y las ideas oportunas orientadas en el proyecto.

Y por último mi más sentido y profundo agradecimiento en especial a mi amada familia

Bustamante Ochoa, quienes son lo fundamental en mi vida, gracias por su apoyo en esta

larga y ardua experiencia universitaria. A mis padres José David y Cecibel Angélica por

cada esfuerzo que realizaron para culminar mi formación profesional y enseñarme que todo

lo que me proponga lo puedo lograr, a mi hermana Vanessa Estefanía por su capacidad de

superación e inteligencia, a mi hermana María José por su paciencia y el empeño a cada

cosa que realiza y a mi hermana Leylis Eliana por ser valiente, inteligente y tener la

capacidad de las palabras adecuadas para cada momento.

¡Gracias familia!

vii

DEDICATORIA

Mi Proyecto de Investigación lo dedico llena de amor,

esperanza y mucho sacrificio, en primer lugar a Dios

por guiarme y cuidarme durante mi carrera y a mis

seres amados, de manera especial a mi padre José

David Bustamante Chichandi por su sacrificio,

confianza, esfuerzo y esmero siendo el pilar

fundamental en mi formación profesional, a mi madre

Cecibel Angélica Ochoa Montiel por su amor,

paciencia y la motivación en cada actividad que

realice, y a mis hermanas: Vanessa Estefanía

Bustamante Ochoa, María José Bustamante Ochoa y

Leylis Eliana Bustamante Ochoa por ser consideradas

y tenerme paciencia.

Por el tiempo y esfuerzo a mis queridos maestros por

compartir cada conocimiento durante estos cinco años

de estudiante, permitiendo que llegue a esta última

etapa de formación profesional.


viii

RESUMEN

Los hongos micorrízicos son exigentes para colonizar y multiplicase, lo cual requieren

sustratos pobres, es decir, bajos en fósforo, permitiéndoles que las micorrizas se

multipliquen en condiciones de estrés. El objetivo de la presente investigación es la

obtención del mejor sustrato para la multiplicación de micorrizas provenientes de suelos

tropicales del Ecuador. Inoculados con cepas de micorriza LMSSK, obtenidas con fines de

investigación del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias ICIA de las Islas Canarias -

España y la micorriza nativa obtenida de la huerta de cacao nativa de la Fundación

Maquita. Se realizó tres mezclas de sustratos utilizando tierra, turba de coco y picón

“piedra”. Las semillas se desinfectaron antes de la siembra, inoculando directo al hoyo,

durante 90 días en las macetas. El experimento consistió en 6 tratamientos más un testigo

(tierra sin esterilizar), en cuatro repeticiones. Las variables a evaluar fueron el nivel de

colonización de la micorriza nativa y LMSSK en plantas trampa, determinación del

volumen y peso del sistema radicular de las plantas trampa, bajo el efecto de las

micorrizas, multiplicación de esporas para micorriza nativa y LMSSK en planas trampa y

el efecto de la micorrizas a los cambios morfológicos de sorgo (Sorghum bicolor L) y

albahaca (Ocimum basilicum). Los resultados obtenidos fueron que el sustrato más

adecuado para la multiplicación de micorrizas está dado por el sustrato tierra + turba de

coco + picón, con porcentajes de colonización entre 80 y 99 %, registrando la cepa nativa

de la huerta de cacao con 2350 esporas en 100 g/suelo y la cepa LMSSK con 2390 esporas

en 100 g/suelo, teniendo ambas cepas igual capacidad de colonización y multiplicación.

Palabras claves: Sustrato, planta trampa, inoculación, micorriza.

ix

ABSTRACT

Mycorrhizal fungi are demanding to colonize and multiply, which requires poor substrates,

that is, low phosphorus, allowing mycorrhizal infections to multiply under stressful

conditions. The objective of this research is to obtain the best substrate for the

multiplication of mycorrhizal from tropical soils of Ecuador. Inoculated with mycorrhizal

strains LMSSK, obtained for research purposes from the Canary Institute of Agricultural

Research ICIA of the Canary Islands - Spain and native mycorrhizal obtained from the

native cocoa garden of the Maquita Foundation. Three mixtures of substrates were made

using earth, coconut peat and "stone" picon. The seeds were disinfected before sowing,

inoculating directly to the hole, for 90 days in the pots. The experiment consisted of 6

treatments plus one control (unsterilized soil) in four repetitions. The variables to be

evaluated were the level of colonization of native mycorrhizal and LMSSK in trap plants,

determination of the volume and weight of the root system of trap plants, under the effect

of mycorrhizal, multiplication of spores for native mycorrhizal and LMSSK in flat trap and

the effect of mycorrhizal to the morphological changes of sorghum (Sorghum bicolor L)

and basil (Ocimum basilicum). The results obtained were that the most suitable substrate

for mycorrhizal multiplication is given by the substrate soil + coconut peat + picon, with

colonization rates between 80 and 99 %, recording the native strain of the cocoa orchard

with 2350 spores in 100 g/soil and the strain LMSSK with 2390 spores in 100 g/soil,

having both strains equal colonization and multiplication capacity.

Keywords: Substrate, trap plant, inoculation, mycorrhiza.

x

TABLA DE CONTENIDO

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y SESIÓN DE DERECHOS ii

CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN iii

REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE PREVENCIÓN DE COINCIDENCIA Y/O

PLAGIO ACADÉMICO iv

AGRADECIMIENTO vi

DEDICATORIA vii

RESUMEN viii

ABSTRACT ix

ÍNDICES DE TABLAS xiv

INDICES DE FIGURAS xv

ÍNDICE DE ANEXOS xvi

CÓDIGO DUBLÍN xvii

INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO I. CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. Problema de la Investigación 3

1.1.1. Planteamiento del problema 3

1.1.2. Formulación del problema 3

1.1.3. Sistematización del problema 3

1.2. Objetivos 4

1.2.1. Objetivo General 4

1.2.2. Objetivos Específicos 4

1.3. Justificación 5

CAPÍTULO II. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN

2.1. Marco Teórico 7

2.1.1. El suelo 7

2.1.2. La rizósfera 7

2.1.3. Simbiosis planta-hongo 8

2.1.4. Micorrizas 8

2.1.4.1. Descubrimiento de las micorrizas 9

xi

2.1.4.2. Origen de las micorrizas 9

2.1.4.3. Importancia de las micorrizas en la agricultura 9

2.1.4.4. ¿Son benéficas o dañinas? 10

2.1.4.5. Taxonomía de hongos micorrízicos 10

2.1.4.6. Ciclo de vida de hongos micorrízicos arbusculares 11

2.1.4.7. Estructuras y etapas de desarrollo. 12

2.1.4.8. Red de hifas 14

2.1.4.9. Fenología 15

2.1.4.10. Funcionamiento de las micorrizas 15

2.1.4.11. Micorrizas y crecimiento de las plantas 16

2.1.5. Producción de inóculo 16

2.1.6. Método cuantitativo de hongos micorrízicos arbuscular en raíces de las plantas 17

2.1.7. Multiplicación de hongos micorrízicos en plantas "trampa" 18

2.1.7.1. Plantas trampa 18

2.1.7.2. Selección de la planta "trampa" 18

2.1.7.3. Plantas hospederas para la reproducción de inoculante micorrízico 18

2.1.7.4. Sorgo (Sorghum bicolor L.) 19

2.1.7.5. Albahaca blanca (Ocimum basilicum) 20

CAPÍTULO III. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. Localización 23

3.2. Tipo de investigación 23

3.3. Método de investigación 23

3.4. Fuente de recopilación de información 23

3.5. Material y equipos 23

3.5.1. Material del laboratorio 24

3.5.2. Equipos de laboratorio 24

3.5.3. Material Biológico 25

3.5.4. Material de campo 25

3.5.5. Reactivos e insumos 25

3.6. Diseño de la investigación 26

3.7. Factor de estudio 26

3.8. Tratamientos Estudiados 26

3.9. Esquema del Análisis de Varianza 27

xii

3.10. Manejo del Experimento 27

3.10.1. Obtención de cepas micorrizadas y sustratos. 28

3.10.2. Preparación de los sustratos. 28

3.10.3. Distribución de la mezcla de sustratos en las macetas 29

3.11. Datos Registrados y Formas de Evaluación. 30

3.11.1. Protocolo de tinción de raíces. 30

3.11.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas

trampa de S. bicolor L. y O. basilicum. 30

3.11.3. Determinación del volumen y peso del sistema radicular de S. bicolor L. y O.

basilicum, bajo el efecto de las micorrizas. 31

3.11.4. Determinación del número de esporas en los tratamientos con micorriza

nativa y LMSSK, en plantas de S. bicolor L. y O. basilicum. 31

3.11.4.1. Aislamiento de esporas. 31

3.11.4.2. Calculo de la cantidad de esporas observadas por tratamiento. 32

3.11.5. Efecto de la micorriza en el desarrollo vegetativo de sorgo (S. bicolor L) y

albahaca (O. basilicum). 33

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Resultados 35

4.1.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las plantas trampa S.

bicolor L. y O. basilicum. 35

4.1.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas


4.1.3. Efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular de S. bicolor L.

y O. basilicum. 37

4.1.4. Determinación del peso del sistema radicular de S. bicolor L. y O. basilicum,

bajo el efecto de las micorrizas. 38

4.1.5. Multiplicación de esporas proveniente de dos tipos de micorrizas nativa y

LMSSK 60% en plantas trampa. 39

4.1.6.1. Altura y diámetro del sorgo (S. bicolor L). 41

4.1.6.2. Altura y diámetro de la albahaca (O. basilicum). 42

4.2. Discusión 43

4.2.2. Porcentaje de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas


xiii

4.2.3. Efecto de las micorrizas en el volumen y peso del radicular de S. bicolor L.

y O. basilicum. 45

4.2.4. Producción de esporas proveniente de dos tipos de micorriza: nativa y

LMSSK 60% en plantas trampa. 45

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones 48

5.2. Recomendaciones 49

CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA

6.1. Literatura Citada 51

CAPÍTULO VII. ANEXOS

xiv

ÍNDICES DE TABLAS

Tabla 1. Taxonomía de micorrizas. 11

Tabla 2. Taxonomía del sorgo. 20

Tabla 3. Taxonomía de la albahaca. 21

Tabla 4. Identificación de los tratamientos a estudio. 27

Tabla 5. Esquema del ADEVA (Análisis de varianza). 27

Tabla 6. Pesos de los componentes de la mezcla de los tratamientos. 28

Tabla 7. Composición de la soluciones madre de Hewitt (1969). 29

Tabla 8. Efecto del volumen de raíces en la multiplicación de micorrizas en

tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S.

bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en condiciones de

invernadero, 2019.

38

Tabla 9. Peso de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes

sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y

albahaca (O. basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.

39

Tabla 10. Número de esporas de micorrizas en tres diferentes sustratos en

simbiosis con plantas trampa de sorgo (S bicolor L.) y albahaca (O.

basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.

40

Tabla 11. Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de

micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas

trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en

condiciones de invernadero, 2019.

42

Tabla 12. Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de

micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas

trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en


43

xv

INDICES DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo del hongo micorrízico. 12

Figura 2. Asociaciones formadas por especies. 12

Figura 3. Estructuras de los hongos de micorriza arbuscular. Arbúsculo,

esporas de Glomus sp., y vesículas en raíces de capirona

(Calycophyllum spruceanum).

13

Figura 4. Esquema de las características morfológicas inter-radicales de los

hongos AM. (a) = apresoria; (ar) = arbúsculos de AM intercelular

de tipo Arum; (ar-c) = arbuscular y (c) = bobina de AM intracelular

de tipo París; (s) = espora inter-radical; (v) = vesículas.

14

Figura 5. Forma de colocar el sustrato en la maceta. 17

Figura 6. Obtención de micorriza nativa del cultivo de cacao. 35

Figura 7. Aspecto del tejido colonizado en raíces de Sorgo (s) y Albahaca (a)

con aumento de objetivo 10X.

36

Figura 8. Observación de las diferentes estructuras de micorrizas: hifas en

“pelotón” (a = objetivo 40X), vesículas (b = objetivo 10X),

arbúsculos (c = objetivo 10X) y esporas (d = objetivo 40X).

36

Figura 9. Porcentaje de colonización de los tratamientos. Las barras de error

indican ±ES; letras diferentes indican diferencias significativas

entre los promedios a p<0.05 (Prueba de Tukey).

37

xvi

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Croquis de cada unidad experimental. 57

Anexo 2. Croquis del área de estudio. 57

Anexo 3. Obtención de la cepa micorrízica nativa. 58

Anexo 4. Recolección y esterilización de los sustratos. 58

Anexo 5. Protocolo de la técnica de tinción de raíces. 58

Anexo 6. Observación de las estructura de micorrizas. 59

Anexo 7. Toma de datos de los tratamientos. 59

Anexo 8. Peso y volumen de raíces. 59

Anexo 9. Obtención y observación de esporas. 60

Anexo 10. Protocolo de tinción de raíces descrita por (Phillips y Hayman,

1970); (Gemma y Koske, 1989), con modificaciones de Mayra

Bustamante 2019.

60

Anexo 11. Análisis de suelo. 61

xvii

CÓDIGO DUBLÍN

Título: “Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en

simbiosis con plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y

albahaca (Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero”.

Autor: Mayra Alejandra Bustamante Ochoa.

Palabras claves: Sustrato, planta trampa, inoculación, micorriza.

Fecha de

publicación:

Editorial: Quevedo UTEQ 2019.

Resumen: Los hongos micorrízicos son exigentes para colonizar y

multiplicase, lo cual requieren sustratos pobres, es decir, bajos en

fósforo, permitiéndoles que las micorrizas se multipliquen en

condiciones de estrés. El objetivo de la presente investigación es

la obtención del mejor sustrato para la multiplicación de

micorrizas provenientes de suelos tropicales del Ecuador.

Inoculados con cepas de micorriza LMSSK, obtenidas con fines

de investigación del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias

ICIA de las Islas Canarias - España y la micorriza nativa obtenida

de la huerta de cacao nativa de la Fundación Maquita. Se realizó

tres mezclas de sustratos utilizando tierra, turba de coco y picón

“piedra”. Las semillas se desinfectaron antes de la siembra,

inoculando directo al hoyo, durante 90 días en las macetas. El

experimento consistió en 6 tratamientos más un testigo (tierra sin

esterilizar), en cuatro repeticiones. Las variables a evaluar fueron

el nivel de colonización de la micorriza nativa y LMSSK en

plantas trampa, determinación del volumen y peso del sistema

radicular de las plantas trampa, bajo el efecto de las micorrizas,

multiplicación de esporas para micorriza nativa y LMSSK en

planas trampa y el efecto de la micorriza a los cambios

morfológicos de sorgo (Sorghum bicolor L) y albahaca (Ocimum

basilicum). Los resultados obtenidos fueron que el sustrato más

adecuado para la multiplicación de micorrizas está dado por el

sustrato tierra + turba de coco + picón, con porcentajes de

colonización entre 80 y 99 %, registrando la cepa nativa de la

huerta de cacao con 2350 esporas en 100 g/suelo y la cepa

LMSSK con 2390 esporas en 100 g/suelo, teniendo ambas cepas

igual capacidad de colonización y multiplicación.

Descripción: Hojas: 80 dimensiones, 29 x 21 cm + CD-ROM 6162.

URL

1

INTRODUCCIÓN

Los hongos existentes en el suelo realizan interacciones con las raíces de las plantas,

encontrándose en un 80 % de plantas terrestre son micorrizadas, pero el 95% de las plantas

micorrizadas son colonizadas por la especie de micorriza arbuscular, aportándoles

múltiples beneficios, en la absorción de murientes, resistencia a patógenos y condiciones

de estrés biótico y abiótico. Las micorrizas son organismos del suelo que viven

simbióticamente con la mayoría de plantas, ellos les aportan beneficios, dándoles ventajas

con respecto a las plantas no micorrizadas, por ejemplo, facilitándole a la planta la toma de

nutrientes de baja disponibilidad o de poca movilidad en el suelo, evitando la acción de

microorganismo patógenos en la raíz, aumentando la tolerancia de la planta a condiciones

de stress abiótico en el suelo, entre otros beneficios (Berdugo, 2009). Siendo una

tecnología amigable con el ambiente contra el uso indiscriminado de productos

agroquímicos y la sobre fertilización, donde se degradan y los microorganismos existentes

desaparecen.

Motivo por el cual se realizó esta investigación orientada a multiplicar hongos benéficos

formadores de micorrizas (nativa – LMSSK 60%) en asociación con plantas trampas de

sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum), que faciliten la colonización y

la multiplicación en los diferentes sustratos.

La importancia de conocer las condiciones de colonización y multiplicación de las

micorrizas, se estableció el sustrato adecuado en asociación a sorgo y albahaca para la

obtención de inoculo y su posterior aplicación a los cultivos (maíz, frejol, hortalizas, cacao,

café, cítricos, etc.), sea en el campo o en viveros para su mayor supervivencia.

CAPÍTULO I

CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

3

1.1. Problema de la Investigación

1.1.1. Planteamiento del problema

Los sectores de producción del Ecuador son extensos y diversos, donde existen suelos

pobres, infértiles por el uso indiscriminado de productos químicos, la sobre fertilización,

incendios, inundaciones, la introducción de otras especies a diferentes ecosistemas. Esto

hace que se degraden y la microbiota del suelo se reduce. Eliminando interacciones que

existe entre los microorganismos del suelo especialmente de los hongos que realizan una

simbiosis con las raíces y al no realizarse esta simbiosis, los cultivos tienen bajo desarrollo

vegetativo, poca floración y por ende pocos rendimientos afectando la economía del

agricultor.

1.1.2. Formulación del problema

¿Qué sustrato con planta trampa permitiría una colonización y multiplicación de hongos

micorrízicos para obtener inóculos?

1.1.3. Sistematización del problema

Después de revisar la problemática se planean las siguientes directrices:

¿Cuál sustrato es óptimo para multiplicar hongos micorrízicos?

¿Cuál es la mayor simbiosis entre micorriza nativa y LMSSK en la zona de estudio?

4

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo General

Determinar el mejor sustrato para la multiplicación de micorrizas provenientes de

suelos tropicales del Ecuador.

1.2.2. Objetivos Específicos

Validar el protocolo de cuantificación de las micorrizas.

Identificar el tipo de inoculo que presenta mayor capacidad micorrízica.

Establecer el sustrato más adecuado para la multiplicación de micorrizas.

Establecer la mejor combinación sustratos-planta trampa para la multiplicación de

micorrizas.

5

1.3. Justificación

La presente investigación es una alternativa racional, biológica, amigable con el ambiente

y sostenible ante el uso indiscriminado de agroquímicos como pesticidas, tipos de estrés y

aplicaciones excesivas de fertilizantes altos en fósforo sin un previo análisis de suelo. Se

realizó la siguiente investigación para la multiplicación de cepas micorrizadas (nativa –

LMSSK) en asociación a sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum). Esta simbiosis

obligatoria es fundamental entre el hongo y la planta trampa, adquiriendo interés en los

suelos degradados, para la toma de murientes y la resistencia a diversos factores bióticos y

abióticos, optimizando el nivel de colonización, multiplicación y aplicación.

Es necesario realizar la multiplicación de cepas micorrizadas por medio de sustratos

esterilizados y pobres, en especial bajos en fósforo, estos brindan las condiciones

adecuadas para realizar la simbiosis utilizando plantas trampas, que son apetecidas por esta

clase de hongos micorrízicos, para la obtención de múltiples beneficios tanto para la planta

como para el suelo. Con el fin de implementar esta tecnología, los beneficiarios serían los

agricultores para que obtengan mejores rendimientos, productores de plántulas en viveros

para la resistencia a patógenos y trasplantes, las empresas para la venta de inóculos, y los

investigadores para estudios relacionados al tema.

CAPÍTULO II

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN

7

2.1. Marco Teórico

2.1.1. El suelo

De acuerdo a Marconi (2011), la palabra suelo proviene del latín solum, que significa

suelo, tierra o parcela, es la capa superficial que está formada por materia orgánica e

inorgánica de la tierra donde se realizan actividades bioquímicas y físicas, a causa de las

relaciones entre el suelo, los organismos y el medio ambiente. Del cual dependen las

actividades de la agricultura y la ganadería. En el suelo se identifican un gran número de

organismos los cuales desempeñan un papel clave en los procesos del suelo, tanto en lo

natural como en los sistemas agrarios. Sin embargo, las prácticas agrícolas convencionales,

por ejemplo; la labranza, la fertilización mineral, la aplicación de productos químicos, han

demostrado ser perjudicial para muchos grupos de microorganismos. La agricultura es

utilizar los servicios ecosistémicos del suelo natural (González, 2007).

2.1.2. La rizósfera

Las poblaciones microbianas del suelo están inmersas en las interacciones que afectan en

el desarrollo de las plantas y la calidad del suelo, las actividades fundamentales que

aseguran la estabilidad y la productividad. Investigaciones estratégicas y aplicadas han

demostrado el interés de ciertas actividades de la cooperación microbiana para ser

explotadas como una biotecnología de bajo impacto y costo para contribuir con las

prácticas agro - tecnológicas sustentables y amigables con el medio ambiente (Richardson

et al., 2009).

De acuerdo a Pedraza et al. (2010), ha sido ampliamente demostrado que los

microorganismos del suelo interactúan con las raíces de las plantas y los constituyentes del

suelo, en la interfase entre la raíz y el suelo. Esto es un gran conjunto de interacciones

entre el suelo, las raíces y los microorganismos que da lugar al desarrollo de un ambiente

dinámico conocido como la rizósfera. Donde una variedad de formas microbianas pueden

desarrollarse activamente y en equilibrio. El tipo de simbiosis más extendido en la

biosfera, el hongo ayuda al huésped a la absorción de los murientes - minerales del suelo y

a cambio le cede compuestos carbonados derivados de la fotosíntesis.

8

2.1.3. Simbiosis planta-hongo

El crecimiento del hongo de manera asimbiótica se da entre una o dos semanas hasta que

hace contacto con la raíz, formando una estructura llamada apresorio por donde penetrarán

las hifas a las células corticales de la raíz, para formar arbúsculos e incrementar el área de

contacto entre planta y hongo iniciando su fase simbiótica (Koide y Dickie, 2002). Los

arbúsculos son hifas que se dividen dicotómicamente y presentan periodos de vida cortos,

las vesículas son estructuras de almacenamiento, se forman en la parte terminal de las

hifas. Las hifas externas pueden ser de tres tipos según su morfología y funciones: Las

hifas infectivas, inician puntos de colonización en una o varias raíces; hifas absorbentes

exploran el suelo para la extracción de nutrientes y las hifas fértiles llevan esporas. Se

reconocen dos tipos básicos de colonización hifal: En el tipo morfológicos de colonización,

“Arum”, las hifas presentan crecimiento intercelular y los arbúsculos se encuentran dentro

de las células corticales de la raíz; en el tipo “Paris” las hifas presentan crecimiento

intracelular al igual que los arbúsculos, pero forman enrollamientos cuando están dentro de

la célula (Berdugo, 2009).

De acuerdo a Ferrera y Alarcón (2005), la mayoría de los simbiontes que forman

ectomicorriza, pertenecen al grupo de los hongos basidiomicetos, por formar cuerpos

fructíferos, durante períodos de lluvia. Este tipo de simbiosis es importante, ya que la

presencia del hongo en el sistema radicular es obligada, favoreciendo el crecimiento y el

desarrollo de las plantas.

2.1.4. Micorrizas

La palabra micorriza proviene de los vocablos griegos Mykos (hongo) y rhiza (raíz). Una

micorriza es una simbiosis no patogénica; una asociación obligada entre raíces de plantas y

hongos especializados, que pueden desarrollarse en un ambiente natural y medios de

cultivo (Quimí et al., 2001). El nombre de hongo se ha designado a organismos que

parecen morfológicamente entre sí, pero que no están filogenéticamente relacionados y por

lo tanto forman un grupo heterogéneo de seres vivos. Siendo ubicuitas, son el segundo

organismo más abundante en el suelo, constituidos por las estructuras somáticas

filamentosas llamadas “hifas” cuyo conjunto forman el micelio (Ferrera y Alarcón, 2005).

9

2.1.4.1. Descubrimiento de las micorrizas

Investigaciones sobre la manera en que otras especies de trufas (hongos comestibles que

pertenecen a los géneros Elaphomyces y Tuber; reino Fungi, clase Ascomycetes), se

relacionaban con las raíces de algunas especies de encinos (Quercus sp.) y otras plantas

vasculares. Hoy la conocemos como una ectomicorriza, y la describió como hifas del

hongo Elaphomyces se asocian a pequeñas raíces secundarias de ciertos árboles,

envolviéndolas completamente (Antonio y Torres, 2010). La simbiosis suele mejorar la

captación de agua y nutrientes minerales de la planta trampa a cambio de carbono

fotosintéticamente fijo. La inoculación con micorrizas puede ayudar a la planta huésped

para la absorción de nutrientes minerales, especialmente fósforo, promover el crecimiento

de plantas y mejorar la tolerancia de estrés abióticos y bióticos. Además son un

componente importante de ecosistemas naturales y agrícolas, que influyen en plantas (Cao

et al., 2013).

2.1.4.2. Origen de las micorrizas

Numerosos estudios paleobotánicos, morfoanatómicos y filogenéticos basados en técnicas

moleculares evidencian que la coevolución mantenida entre hongos micorrízicos y raíces

de plantas se remonta al Paleozoico, hace más de 400 millones de años, con el origen de

las primeras plantas terrestres. De hecho, los ancestros de los actuales briófitos y helechos

ya presentaban asociaciones que recuerdan a las ahora conocidas como micorrizas

arbusculares (García, 2009). La aparición de primeras plantas terrestres en unos 480 - 460

millones de años de antigüedad, basadas en análisis moleculares de secuenciación

proteómica sugieren una mucho más temprana terrestrialización (Heckman et al., 2001).

La colonización habría tenido lugar hace unos 600 millones de años y tanto las algas

verdes como hongos “superiores” habrían aparecido en la tierra hace más de 900 millones

de años, habiendo surgido entre la escala de tiempo geológico y evolutivo basada en el

registro fósil y basada en el “reloj molecular” (García, 2009).

2.1.4.3. Importancia de las micorrizas en la agricultura

Las micorrizas cumplen una función clave en la agricultura sostenible. En el prefacio del

libro “Mycorrhizae in sustainable agricultura” (Bethlenfalvay y Linderman, 1992),

10

concluyen que "si el objetivo es reducir los insumos químicos por razones ambientales y de

salud, entonces se necesita reestablecer hongos micorrízicos y otros microbios benéficos a

un alto nivel de la efectividad para compensar la reducción de los insumos. Esta estrategia

coincide con el punto de vista donde el grado de empobrecimiento o la desaparición de la

microflora micorrízica es un indicador del descenso en la estabilidad del sistema de planta-

suelo (Bethlenfalvay, 1993). La importancia de los hongos micorrizógenos no estriba sólo

en que pueden representar la fracción mayor de la biomasa del suelo, alcanzando hasta

20% del total de la masa seca (Bethlenfalvay, 1993). Su función clave radica en que, su

abundante micelio intra y extraradical, constituye un enlace o un puente entre las plantas

(huésped) y el suelo (Bethlenfalvay y Linderman, 1992). Cuando se forma la micorriza, se

altera la fisiología y exudación de los radicales, lo que a su vez cambia la población

microbiana (Linderman, 1992).

2.1.4.4. ¿Son benéficas o dañinas?

La micorriza no se trata solamente de una interacción entre la raíz de una planta y una

especie de hongo, sino de una comunidad muy compleja formada por diferentes especies

de hongos y la raíz de una planta trampa (huésped). Fueron cruciales para que las plantas

pudieran colonizar el medio terrestre y responder a las condiciones ambientales

cambiantes. Genera una extensa red de micelio externo que explora el suelo en búsqueda

de recursos e interconecta a las raíces de plantas de la misma especie e, incluso, de

especies diferentes. Las plantas interconectadas por la red micorrízica pueden transferir

carbono entre ellas. Actualmente, la asociación micorrízica es fundamental en las prácticas

agrícolas sostenibles y programas de restauración ambiental (Camargo et al., 2012).

2.1.4.5. Taxonomía de hongos micorrízicos

De acuerdo a Willis et al. (2013), la taxonomía de los hongos micorrízicos arbusculares se

describen 214 especies en cuatro órdenes, 13 familias y 19 géneros, en la clase

Glomeromycetes del phylum Glomeromycota. El phylum está representado en casi todos

los principales biomas terrestres, en bryophytes (musgos), hepáticas, pteridofitas, las

gimnospermas y angiospermas. Las plantas tropicales son típicamente micotróficas

arbusculares, el fenómeno que puede estar relacionado con la descomposición y

consecuente alta rotación de los ecosistemas.

11

Tabla 1: Taxonomía de micorrizas

Dominio: Eukarya

Reino: Fungi

División: Glomeromycota

Clase: Glomeromycetes

Orden: Archeosporales – Diversisporales –

Paraglomales – Glomerales.

Familia:

Archaeosporaceae y

Geosiphonaceae

Acaulosporaceae, Diversisporaceae

y Gigasporaceae

Paraglomaceae

Glomeraceae, Glomus - grupo A y

Glomus tipo B.

Fuente: (Willis et al ., 2013).

2.1.4.6. Ciclo de vida de hongos micorrízicos arbusculares

De acuerdo a Velandia (2006), este proceso es independientemente de la planta trampa,

que solo requiere condiciones de temperatura y humedad. Los hongos micorrízicos se

originan a partir de las hifas que proceden de las raíces existentes en el suelo sea de

esporas, raicillas o de las plantas trampa (Huésped), con presencia de micorrizas que se

desarrollan en un ecosistema. Cuando la hifa penetra en la capa de una célula epidérmica

de la raíz, esta forma un apresorio que producirá seguidamente una hifa colonizadora

atravesando el espacio intercelular. Las hifas crecen regularmente de forma longitudinal en

los espacios intercelulares en la zona media; mientras que en la zona interna las hifas

penetran intercelularmente y forman los arbúsculos por ramificación dicotómica repetida

(Figura 1), a niveles de los cuales se produce el intercambio de los nutrimentos (Velandia,

2006). Cuando el hongo no encuentra una raíz para colonizarla se produce un micelio

reducido, que se mantiene en crecimiento tan solo unos días tras la producción del tubo de

germinación y transcurrido este tiempo, comienza a retraer el citoplasma de las hifas hacia

la espora entrando en reposo (Azcón et al., 1998).

12

Figura: 1: Ciclo del hongo micorrízico

Fuente: (Velandia, 2006)

2.1.4.7. Estructuras y etapas de desarrollo.

De acuerdo a Brundrett (2008), las asociaciones se forman cuando las raíces del

hospedador (Planta trampa) y los hongos micorrízicos compatibles están activos en las

proximidades y las condiciones del suelo son favorables. Las etapas en la colonización de

la raíz por hongos micorrízicos (Figura 2). Se muestran las asociaciones formadas por

especies de Glomus, Gigaspora, Scutellospora y Acaulospora.

Figura: 2: Asociaciones formadas por especies

Fuente: (Brundrett, 2008)

13

a.- Estructuras en el suelo

Hifas: Una red de hifas se forma en el suelo con hifas más gruesas que funcionan

como conductos.

Hifas de absorción: Hifas finas altamente ramificadas que se cree que absorben

nutrientes.

Esporas: Estructuras esféricas asexuales grandes (para un hongo) (20 - 1000 + µm

de diámetro) formadas en hifas especializadas en el suelo o en las raíces.

b.- Estructuras en las raíces

Hifas: Estos no son septados cuando son jóvenes y se ramifican dentro de la

corteza.

Arbúsculos: Haustoria intrincadamente ramificada en las células de la corteza.

Vesículas: Estructuras de almacenaje formadas por muchos hongos

De acuerdo a Ruiz et al. (2011), los hongos de las micorrizas arbustivas son simbiontes

obligados ya que para completar su ciclo de vida deben estar asociados con raíces vivas

que las provean de carbono así como de los factores necesarios para su desarrollo y

esporulación. Dentro de la corteza de la raíz y expandiéndose hacia el suelo, los HMA

forman estructuras (Figura 3) con distintas funciones simbióticas.

Figura: 3: Estructuras de los hongos de micorriza arbuscular. Arbúsculo, esporas de

Glomus sp., y vesículas en raíces de capirona (Calycophyllum spruceanum).

Fuente: (Brundrett et al., 1984)

14

2.1.4.8. Red de hifas

Las células de la corteza están conectados a una red micelial por hifas inter e intracelulares.

Otros taxones distintos de las especies de las familias Gigasporaceae, Paraglomaceae y

Archaeosporaceae producen vesículas inter y/o intracelulares ricas en lípidos. Estos actúan

como temporales órganos de almacenamiento, que a veces se convierten en estructuras de

paredes gruesas, y las vesículas (Figura 4), pueden ser importantes en la eficacia de los

fragmentos de raíz como propágulos. Se ha demostrado que las redes miceliales de muchas

especies mantienen viabilidad si los suelos permanecen intactos, incluso después de secar,

aunque el potencial de inóculo disminuye con tiempo (Willis et al., 2013).

Figura: 4: Esquema de las características morfológicas inter-radicales de los hongos AM.

(a) = apresoria; (ar) = arbúsculos de AM intercelular de tipo Arum; (ar-c) = arbuscular y

(c) = bobina de AM intracelular de tipo París; (s) = espora inter-radical; (v) = vesículas.

Fuente: (Willis et al., 2013).

De acuerdo a Willis et al., (2013), estas redes pueden ser extensas, que representa el

0,002% del volumen en el suelo basado en un diámetro promedio de micelio de 5 µm. Hay

evidencia de transferencia de nutrientes, fósforo, nitrógeno y agua, entre los tejidos sobre

el suelo de la planta hospedadora (Planta trampa) inter e intraespecífica a través de las

hifas de hongos micorrízico, una función facilitadora que puede afectar profundamente las

relaciones entre plantas. De manera similar, el carbono translocado permanece dentro de

las estructuras fúngicas en las raíces del huésped receptor.

15

2.1.4.9. Fenología

De acuerdo a Willis et al. (2013), las espora pueden crecer hasta 20 – 30 mm, en un plazo

de 15 a 20 días. En la etapa pre-simbiótica, el exudado de la raíz fomenta el crecimiento

del tubo germinal hacia la raíz y desencadena la ramificación del tubo germinal en forma

de abanico estimulando múltiples puntos de entrada en la raíz. Los arbustos se desarrollan

dentro de 1 a 6 días de penetración en células de la corteza. Después de 4 a 15 días, se

degeneran y la célula huésped vuelve a su estado original.

El porcentaje total de la longitud de la raíz ocupada por arbúsculos varía con las especies

de hongos, la estación, los factores edáficos, la hidrología de suelo y la temperatura del

suelo. El grado de colonización de la raíz también varía con interacciones de la biota del

suelo y con la planta huésped, de los estados fenológicos del huésped y la asignación del

carbono (Willis et al., 2013).

2.1.4.10. Funcionamiento de las micorrizas

De acuerdo a Allen et al. (2003), cuando los recursos del suelo, como fósforo o nitrógeno,

limitan la fotosíntesis, el carbono está en exceso. Las hifas de hongos micorrízicos

exploran el suelo para que el fósforo y nitrógeno, transporten el nutriente a cambio del

exceso de carbono en la planta. Mientras fósforo o nitrógeno son limitantes, las plantas

huésped soportarán a los hongos micorrízicos. Las raíces de las plantas se distribuyen

horizontalmente y se extienden verticalmente en el sustrato del suelo y la roca. La energía,

forma compuestos de carbono. Estas conexiones ocurren en la membrana (del hongo):

interespacio: (planta trampa).

Las micorrizas, al aumentar la captación del fósforo y nitrógeno, crean carbono. También

aumentan la recepción de agua abriendo las estomas. Estos aumentan las tasas de carbono

con un total de ganancias del 10% al 40%. En el campo, esta mayor fijación del Dióxido de

carbono (CO2), está asociado con el cambio ambiental, como la sequía, o como una función

particular de combinaciones entre las especies de hongos y las plantas trampa (huésped).

De igual modo, con un elevado nivel de Dióxido de carbono o también llamado Anhídrido

carbónico (CO2) atmosférico, las demandas de nitrógeno y fósforo van incrementando una

mayor necesidad de micorrizas (Allen et al., 2003).

16

2.1.4.11. Micorrizas y crecimiento de las plantas

De acuerdo a Agrios (2002), las raíces de las angiospermas que crecen en la naturaleza son

siempre infectadas por hongos simbióticos que benefician a las plantas hospedantes. Las

raíces infectadas se transforman en estructuras morfológicas únicas denominadas

micorrizas, es decir, "raíces fungosas". Que son comunes en los árboles forestales,

considerando como las raíces nutricias normales de la mayoría de las plantas, incluyendo

los cereales, las hortalizas, las plantas ornamentales y los árboles. Las micorrizas no causan

enfermedad, pero la ausencia de ellas en ciertos campos ocasiona achaparramiento.

Asimismo, la fumigación de los suelos con frecuencia da como resultado la erradicación de

los hongos micorrízicos y hace que las plantas, permanezcan más pequeñas. Mejoran el

crecimiento de la planta huésped al aumentar la superficie de absorción del sistema radial;

al absorber selectivamente y al acumular ciertos nutrientes, especialmente el fósforo; al

solubilizar y hacer disponibles para la planta huésped algunos minerales.

2.1.5. Producción de inóculo

De acuerdo a Blanco y Salas (1996), los hongos micorrízicos son simbiontes obligados la

cual representa la mayor dificultad para producir un inoculo. El principal impedimento

contra la difusión del uso de los hongos micorrizados entre los productores. El método más

común de producir un inoculo es por medio de macetas, en un suelo esterilizado. Otros

medios hacen uso de la perlita, la turba de coco o de algas, el corcho, la arcilla expandida,

los sistemas hidropónicos, la técnica de película de nutrientes o cultivo axénicos de

órganos de raíz.

La inoculación puede dar resultados beneficiosos cuando el suelo es pobre en calidad o

cantidad de los hongos micorrízicos y las plantas huésped (Planta trampa) responden en

forma significativa a la colonización por micorrizas o cuando se esteriliza total o

parcialmente el medio. La mayor viabilidad económica de la inoculación, sin duda se

presenta en los cultivos (Plantas huésped) que tienen una fase de semillero o de vivero

(arboles - hortalizas), en la cual los costos de inoculación son menores y la colonización de

las raíces por los hongos micorrízicos introducidos, una vez establecida, puede mantenerse

y desarrollarse en las fases posteriores del cultivo (Blanco y Salas, 1996).

17

2.1.6. Método cuantitativo de hongos micorrízicos arbuscular en raíces

de las plantas

De acuerdo a Sieverding (1983), para obtener las diferentes cepas se usan plantas huésped

con abundantes raíces, libres de suelo y de materia orgánica, del campo a suelo esterilizado

en macetas. Por este método se obtiene, en las macetas, después de cierto tiempo (4 a 6

meses), las cepas de los hongos con las cuales la planta estaba inicialmente infectada.

Debido a que algunas cepas del hongo no están esporulando en el campo, o a que hay

pocas esporas de un tipo dado, se requiere multiplicar las cepas nativas en el invernadero,

antes del aislamiento.

El método de multiplicación es sencillo, que se lo observa en la figura 5. Se inocula, con

una muestra de suelo más raíces del campo, en macetas que tengan suelo esterilizado y se

siembra una planta hospedera (Sieverding, 1983).

Figura: 5: Forma de colocar el sustrato en la maceta.

Fuente: (Sieverding, 1983).

Para la multiplicación se utiliza suelo (sustrato) esterilizado en autoclave que tenga

aproximadamente las mismas características químicas que el suelo del campo. Se

recomienda mejorar la estructura del suelo mezclándole con arena, antes de la

esterilización. No se debe aplicar tanto fósforo al suelo “sustrato” (se recomienda un

máximo de 25 kg P/ha). Los otros elementos nutritivos nunca se aplican en abundancia

(dependiendo del contenido inicial del suelo se recomienda dosis de 50 kg N/ha, 50 kg

K/ha, 25 kg Mg/ha (Sieverding, 1983).

18

2.1.7. Multiplicación de hongos micorrízicos en plantas "trampa"

De acuerdo a García et al. (2000), cuando la cantidad de esporas presentes en una muestra

de suelo proveniente del campo es muy reducida, se recomienda reproducir los hongos en

condiciones controladas empleando plantas micotróficas y sustratos estériles. Este sistema,

conocido como cultivo en planta trampa, permite lograr dos cosas: multiplicar hongos

nativos (indígenas) colectados en el campo aumentando así la cantidad de esporas del

hongo, o promover la esporulación de hongos "escondidos" en la muestra. Las esporas en

muestras de campo no están, razón para recomendar la multiplicación de hongos en plantas

trampa, pues permite obtener esporas en todos los estadios de desarrollo y con todos los

atributos morfológicos necesarios para la identificación taxonómica.

2.1.7.1. Plantas trampa

El conocimiento de la fenología en diferentes fechas de siembra y en distintas condiciones

agroecológicas constituye uno de los aspectos agronómicos fundamentales para el cultivo y

la producción de cualquier vegetal (Barroso y Jerez, 2000). Son especies vegetales

altamente sensibles a determinados organismos ejemplo micorrizas que generalmente no

pueden vivir bien sin estar asociados.

2.1.7.2. Selección de la planta "trampa"

De acuerdo a Cuenca et al. (2003), sugieren criterios para elegir esta planta debe ser

micotróficas, de buen crecimiento, debe estar adaptado al clima (temperatura, luz, etc.) del

sitio donde los hongos serán cultivados, debe ser compatible con un amplio rango de

hongos micorrízicos, de fácil manejo de la semilla, la poda, ser tolerante a las plagas y las

enfermedades y debe crecer bien en el sustrato seleccionado.

2.1.7.3. Plantas hospederas para la reproducción de inoculante micorrízico

De acuerda a Fernández (2003), otro de los aspectos importante a la hora de la

reproducción de estos hongos es el genotipo del hospedante (Planta trampa). Con relación

a esto se debe seleccionar una especie con dependencia micorrízica, preferentemente una

19

planta de ciclo corto (4 - 6 meses), que posea a su vez un sistema radical que garantice una

adecuada producción de propágulos micorrízicos. Entre las especies que han demostrado

ser buenas hospedantes se encuentran: Brachiaria decumbens, Arachis hypogaea, Plantago

lanceolata, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Medicago sativa, Paspalum notatum,

Fragaria sp., Zea mays y Allium cepa. Las características de las plantas hospederas para

reproducir hongos micorrízicos sorgo (S. bicolor) y albahaca (O. basilicum), estudios

recientes han informado de efectos positivos en el crecimiento propiedades promotoras de

la albahaca inoculadas con hongos micorrízicos, en particular sobre su crecimiento, la

fisiología, el contenido y la calidad de los aceites esenciales (Aslani et al., 2014); (Zhou et

al., 2015).

2.1.7.4. Sorgo (Sorghum bicolor L.)

De acuerdo a Ramírez (2012), el sorgo (S. bicolor L.) es originario de ciertas regiones de

África y Asia, se cultiva desde más de cinco mil años, ocupa el ercer lugar en volumen e

producción a nivel mundial. En Ecuador, existen zonas potenciales donde se adapta muy

bien el cultivo de sorgo, desarrollarse en áreas marginales con escasas precipitaciones,

como Provincias de: Guayas, Manabí y El Oro. También se cultiva en suelos que

permanecen en descanso después de la época lluviosa, en los que antes se ha sembrado

arroz como cultivo principal; tal es el caso de los suelos de la Provincia de Los Ríos, que

aprovechan la humedad residual para toda clase de cultivos de verano.

El sistema radical adventicio fibroso se desarrolla de los nudos más bajos del tallo. La

profundidad de enraizado es generalmente de 1 a 1.3 metros, con 80% de las raíces en los

primeros 30 centímetros. El número de pelos absorbentes puede ser el doble 20 que en

maíz, las raíces de soporte pueden crecer de primordios radicales, pero no son efectivas en

la absorción de agua y nutrientes (Hernández y Roque, 2017).

Cuando la planta ya tiene establecido el sistema de raíces y comienza a absorber los

nutrientes más rápidamente. Contribuyendo a mejorar la estructura del mismo, ayudando a

mejorar las condiciones físicas, químicas y biológicas. Debido a sus cualidades, el sorgo se

presenta como una alternativa muy propicia para aquellos sistemas en que se desee

mantener las buenas condiciones de fertilidad, como así también es un cultivo ideal para

sistemas de producción bajo siembra directa (Carrasco et al., 2011).

20

Tabla 2: Taxonomía del sorgo

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Subdivisión Pteropsidae

Clase Liliopsida

Subclase Liliidae

Orden Poales

Familia Poaceae

Subfamilia Panicoideae

Tribu Androgoneae

Género Sorghum

Especie S. bicolor L.

Fuente: (Trinidad, 2003)

2.1.7.5. Albahaca blanca (Ocimum basilicum)

El género Ocimum está representado por más de 150 especies y tiene una amplia

distribución geográfica por todas las regiones de clima tropical y subtropical. Perteneciente

a la familia de las Labiadas es uno de los representantes del género que se obtiene de

extensiones cultivadas para su comercialización en diferentes partes del mundo (Govín et

al., 2000).

De acuerdo a Govín et al. (2000), la albahaca blanca (O. basilicum L.) es una especie que

presenta variabilidad en la tolerancia a distintos tipos de estrés abiótico y se considera una

planta sensible a la salinidad en las etapas iniciales de su crecimiento. Es una planta

herbácea, anual, de tallos erectos y ramificados, frondosa, que alcanza de 30 a 50 cm de

altura. Suelos drenados con textura franca – arenosa o franca arcillosa presentando mejor

crecimiento y desarrollo de las raíces. Las hojas tienen de 2 a 5 cm, hojas suaves, oblongas,

opuestas, pecioladas, aovadas, lanceoladas y ligeramente dentadas.

Las flores son blancas dispuestas en espigas alargadas, en la parte superior del tallo o en

los extremos de las ramas, lampiñas de color verde intenso con pequeñas flores blanco

21

azuladas dispuestas en forma de largos ramilletes terminales. Para la cosecha el corte es a

la altura de 10 a 15 cm sobre la superficie del suelo (Marrero et al., 2004).

Tabla 3: Taxonomía de la albahaca

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Subreino Tracheobiona

Clase Magnoliopsida

Subclase Asteridae

Orden Lamiales

Familia Lamiaceae

Subfamilia Nepetoideae

Tribu Ocimum

Género Ocimeae

Especie O. basilicum

Fuente: (Reyes, 2010)

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

23

3.1. Localización

La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Innovación Agrícola de la

Fundación Maquita, ubicada en el Km. 3 vía a Santo Domingo, situada en el Cantón de

Buena Fe de la Provincia de Los Ríos, sector Los Limones, cuyas coordenadas geográficas

son las siguientes: 00°50'53.9" de latitud Sur y 79°29'23.1" de longitud Oeste. Se encuentra

a una altura promedio de 162 msnm, con una textura de suelo franco-arcilloso, y de clima

Tropical Megatérmico semi-húmedo, con temperatura media anual es de 24.9 °C. La

precipitación promedio anual es de 2265 mm, su humedad relativa media de 84%

promedio anual.

3.2. Tipo de investigación

Se llevó a cabo una investigación de tipo experimental, implementando un ensayo en el

laboratorio y en el invernadero para determinar el efecto de la multiplicación de micorrizas

por medio de plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L) y albahaca blanca (Ocimum

basilicum) en diferentes sustratos.

3.3. Método de investigación

La metodología que se utilizó es el método deductivo partiendo de los objetivos planteados

y de la información obtenida sobre la colonización y la multiplicación de micorrizas para

identificar el sustrato eficaz para la reproducción de micorrizas nativas y LMSSK 60% en

condiciones de invernadero.

3.4. Fuente de recopilación de información

La presente investigación recopiló información de varias fuentes primarias a través de

observaciones directas, mediante la medición variable dependiente, así también como

fuentes secundarias de libros, publicaciones, revistas e internet.

3.5. Material y equipos

Equipos y materiales que se utilizaron en el desarrollo de la investigación.

24

3.5.1. Material del laboratorio

Porta objeto

Cubre objeto

Ependor

Erlenmeyer

Pipetas

Probetas

Pinzas

Micropipetas

Puntas para micropipetas de 1ml

Vasos de precipitación 200-500 ml

Luna de reloj

Platos de pesar

Bisturí

Mango de bisturí

Cajas petri de vidrio

Guante quirúrgico talla M

Tubos falcón de 15-50 ml

Tamices 250-125-53 micras

3.5.2. Equipos de laboratorio

Baño María

Cocina eléctrica

Autoclave 12 °C

Balanza de precisión

Agitador magnético

Centrifuga

Nevera 20 °C

Microscopio compuesto

Microscopio óptico

Cámara

Computador

25

3.5.3. Material Biológico

Cepas micorrizadas nativa.

Cepas micorrizadas LMSSK 60%.

Semillas de sorgo (S. bicolor L.).

Semillas de albahaca blanca (O. basilicum).

Tierra.

Turba de coco.

Piedra “Picón”.

3.5.4. Material de campo

Macetas de 2Kg

Pala

Carretilla

Marcadores

Machete

Regadora

Tijeras

Fundas de papel

Metro

Tamices de 5-3-2 mm

Bandejas

Tarrina

3.5.5. Reactivos e insumos

Agua destilada

Agua de la llave

Etanol

Glicerol acidificado

Trypan Blue

Hipoclorito sódico

Hidróxido de potasio

26

Ácido clorhídrico

Hexametafosfato

Sacarosa al 60%

Alcohol

3.6. Diseño de la investigación

Se empleó el Diseño Completamente al Azar (DCA) con arreglo factorial 2x3 + 1 en 4

repeticiones, usando cuatro unidades experimentales por tratamiento. La unidad

experimental consistió en una maceta de 25 cm de diámetro, de plástico con un contenido

de 2kg aproximadamente del sustrato; lo que significa que el Factor A está compuesto por

2 niveles (micorriza nativa y LMSSK 60%) y el factor B compuesto de 3 niveles

(sustratos) en evaluación, con la cual se evaluó 6 tratamientos más el testigo (control) a

nivel de condiciones controladas (invernadero).

Todas las variables fueron sometidas al análisis de varianza y se empleó la prueba de

Tukey al 95% de probabilidad. Para establecer las diferencias entre las medias de los

tratamientos. Para el análisis estadístico se utilizó Infostat.

3.7. Factor de estudio

Se estudió dos factores:

Factor A (Micorrizas) Factor B (Sustratos)

Micorriza nativa

Micorriza LMSSK al 60%.

Tierra + picón

Turba de coco + picón

Tierra + picón + Turba de coco

3.8. Tratamientos Estudiados

Para identificar a las cepas micorrizadas (nativa y LMSSK al 60%) y los sustratos

considerados en la presente investigación, se detallan en la siguiente tabla.

27

Tabla 4: Identificación de los tratamientos a estudio

Tratamientos Factor A Factor B

T1 Micorriza LMSSK 60%. Sustrato 1

T2 Micorriza Nativa Sustrato 1


14 Micorriza Nativa Sustrato 2


T6 Micorriza Nativa Sustrato 3

T0 Testigo (control) Suelo natural

Elaborado por el autor: Mayra Bustamante.

3.9. Esquema del Análisis de Varianza

En la tabla se presenta el esquema del ADEVA

Tabla 5: Esquema del ADEVA (Análisis de varianza)

Fuentes de variación Grados de libertad

A: Micorriza 1

B: Sustratos 2

Interacción AxB 2

Error experimental 19

Total 23


3.10. Manejo del Experimento

Se realizaron las prácticas y las aplicaciones de las soluciones nutritivas para el adecuado

desarrollo del cultivo (sorgo - albahaca) y para así efectuar de forma correcta la toma de

los datos y la evaluación correspondiente a cada uno de los tratamientos.

28

3.10.1. Obtención de cepas micorrizadas y sustratos.

La cepa en estudio de LMSSK al 60%, del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias

ICIA. Islas Canarias – España se la obtuvo como donación a la Fundación Maquita –

Buena Fe con fines de investigación. La cepa nativa se la obtuvo de la huerta de la

Fundación Maquita – Buena Fe, de cacao nacional nativo. En este caso, se realizaron

muestreos de plantas sanas, recolectando muestras a los 30 cm de profundidad de la planta.

Para el sustrato, se recolecto tierra en barbecho del Cantón Palenque que se conoce como

pobre en fósforo, lo que se verificó posteriormente mediante un análisis de suelo (Anexo

11). El picón se lo obtuvo de la orilla del río San Pablo, del Cantón La Maná, utilizando

tamices de numeraciones 3 y 2 mm. La turba de coco se adquirió en el Cantón El Empalme

en el Agroquímico AGROMASA.

3.10.2. Preparación de los sustratos.

Tanto la cepa nativa obtenida de la huerta antigua de cacao y la cepa LMSSK al 60%, se

las dejo secar en una maceta cubierta por un papel toalla bajo sombra (invernadero) por 4

días. El picón de 3 mm y 2 mm obtenidos del río, se lavaron bien, cada uno por separado,

luego se esterilizaron en autoclave dos veces en días sucesivos; la fracción de tierra tenía

bajo contenido de humedad y solamente, se la esterilizó de forma similar al picón; la turba

que se utilizó es de fibra de coco, pulverizada, se usó sin esterilización. Después de tener

cada uno de los sustratos listos, se prepararon los tratamientos usando igual volumen de

cada uno de los componentes.

Tabla 6: Pesos de los componentes de la mezcla de los tratamientos

Mezcla de sustratos

(Tratamientos)

Peso por componente de la mezcla de

materiales

Cantidad

Vol : Vol

1 Tierra 250 g + picón fino 450 g. 2:2

2 Turba de coco 60g + picón fino 450g. 3:3

3 Tierra 250 g + picón fino 450 g + Turba

de coco 60 g.

2:2


29

3.10.3. Distribución de la mezcla de sustratos en las macetas

Después de realizar las mezclas de cada uno de los sustratos, se colocaron en capas en las

maceta de 2 kg: primero una capa de picón grueso (3mm) para asegurar buen drenaje,

seguidamente una capa de la mezcla del sustrato 1 (Tierra + picón de 2mm), sobre ésta se

realizaron cuatro pequeños hoyos aproximadamente de 2 – 3 cm de profundidad, donde se

colocaron las semillas y por último se cubrieron con los inóculos correspondientes. Previa

a la siembra, las semillas de las plantas trampa se desinfectaron con hipoclorito de sodio al

1%, y se depositaron las semillas, en los hoyo y finalmente se cubrieron con

aproximadamente 20 g de inoculo en cada hoyo. La siembra se realizó el 21 de septiembre

del 2018. El raleo se realizó 7 días después de la siembra para las plántulas de sorgo (S.

bicolor L.) y 15 días en plántulas de albahaca (O. basilicum), dejando las plántula con

mayor vigor, dos de cada especie. El control de maleza se realizó manualmente cortando

los tallos de las malezas (especialmente en el testigo) con una tijera y estuvo sujeta solo al

tratamiento control. Las micorrizas son muy exigentes en cuanto a su nutrición es por eso

que se procedió a aplicaciones semanales de soluciones nutritivas, cuidando que estas

fueran bajas en fósforo. A continuación la tabla 7 muestra la cantidad de cada sustancia

usada para elaborar la solución madre y la cantidad de cada solución que integran la

solución nutritiva-madre. En cada maceta se aplicó la solución nutritiva en las siguientes

proporciones: 5 ml a los 15 días de la siembra, 15 ml, diez días después; 30 ml, a los 35

días de la siembra y de ahí en adelante, cada 10 días, hasta los 90 días de edad, se aplicó 50

ml/maceta.

Tabla 7: Composición de la soluciones madre de Hewitt (1969).

Tipo Composición Cantidad g/l Cantidad (ml) de solución/1litro

de Sol. Madre

I NO3K 40.44 10

II NO3Ca. 4 H2O 47.23 20

III SO4Mg. 7 H2O 36.97 10

IV SO4Mn. 4 H2O

BO3H3

SO4Zn. 2 H2O

2.23

3.09

0.288

1


30

El control fitosanitario se realizó de forma manual o utilizando una tijera, cortando las

hojas que se encontraron enfermas. La cosecha de las raíces se realizó después de tres

meses a partir de la siembra.,

3.11. Datos Registrados y Formas de Evaluación.

Para estimar el efecto de los tratamientos y a su vez estudiar el comportamiento de los

sustratos para la multiplicación de micorriza nativa y LMSSK 60%.

3.11.1. Protocolo de tinción de raíces.

A los 90 días después de la siembra, las plantas se sometieron a un stress hídrico de 4 a 6

días, cuando la planta muestre estrés, se recolecto 4 g de raíces de cada unidad

experimental, cortando con una tijera y se conservó las raíces en un tubo falcón de 50 ml,

previamente lavadas con agua de llave y después sumergiéndolas en etanol al 50% para

luego proceder a determinar la colonización. Las observaciones se realizaron siguiendo el

protocolo de tinción de raíces descrito por Phillips y Hayman (1970); Gemma y Koske

(1989), (Anexo 10). En los casos en que no se pudieron observar los tejidos

adecuadamente, se realizaron pruebas con el proceso de teñido para conseguir los

resultados esperados.

3.11.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60%

en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.

A los 90 días después de la siembra, las plantas se sometieron a un stress hídrico de 4 a 6

días y seguidamente, de cada maceta se recogió una muestra de 4 g de raíces para realizar

la tinción de raíces con Trypan blue. De cada muestra se prepararon dos placas y en cada

una se colocaron 10 trozos de 1 cm de raíces teñidas. Las raíces se observaron utilizando

un microscopio de luz con objetivo 10X para determinar las raíces colonizadas, a la vez se

detectaron el tipo de estructuras de micorrizas dentro del tejido de las raíces (hifas,

arbúsculos y vesículas), se requirió utilizar objetivo 40X observar las diferentes estructuras

presentes. El porcentaje de colonización se determinó dividiendo el número de raíces

colonizados por el total de raíces observadas y multiplicando el resultado por 100 (Aguilar

31

et al., 2016). Fórmula para la obtención del porcentaje de colonización en raíces de S.

bicolor L. y O. basilicum.

% 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑟𝑎í𝑧 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎𝑠

𝑟𝑎𝑖𝑧 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 ∗ 100

3.11.3. Determinación del volumen y peso del sistema radicular de S.

bicolor L) y O. basilicum, bajo el efecto de las micorrizas.

Para determinar el volumen y peso del sistema radicular de las raíces de S. bicolor L y O.

basilicum, se realizó el corte en la base del tallo (Planta trampa) de las cuatro macetas que

conforman cada unidad experimental por tratamiento. Se separó el sustrato de las raíces,

tratando de no dañarlas. Seguidamente, se las colocó en un vaso de precipitación aforado

250 ml o 500 ml y se estableció el volumen del sistema radicular/planta, luego, de cada

uno se midió el peso, usando una balanza analítica. El volumen y peso final resulta de la

media de cada unidad experimental por tratamiento y de las cuatro repeticiones.

3.11.4. Determinación del número de esporas en los tratamientos con

micorriza nativa y LMSSK, en plantas de S. bicolor L. y O.

basilicum.

Para cosechar las esporas, los sustratos se dejaron sin regar 3 semanas, cuando estuvieron

totalmente secos (entre 10% y el 15% de humedad), se eliminó todo residuo aéreo y se

homogenizó el contenido de las cuatro macetas que componían la unidad experimental,

pasándolas a través de una zaranda, finalmente se colocaron en fundas plásticas para

conservación. Una alícuota de 100 g, de esta mezcla se usó luego para extraer las esporas

mediante la técnica de decantación en gradiente de sacarosa al 60% y se realizó el contaje

de esporas como se indica a continuación:

3.11.4.1. Aislamiento de esporas.

Se extrajeron esporas de hongos micorrízicos de los tratamientos (suelo) de 100 g seco de

la muestra de cada una y con 100 g de muestra ya tratada del suelo de cada maceta

32

utilizando centrifugado de tamizado húmedo y gradiente de sacarosa (Daniels, 1982). Para

el aislamiento de esporas los 100 g de suelo previamente secado a temperatura ambiente,

se pasó por un tamiz de 2 mm, se pulverizó con un mortero y se volvió a pasar por el

tamiz. Se pesaron 20 g y se mezcló con 5 g de hexametafosfato sódico y se suspendió en

100 ml de agua destilada, agitándose con un agitador magnético, durante 2 min y luego se

dejó por 15 min en reposo.

Posteriormente la mezcla se decantó a una serie de tamices de 250 µm, 125 µm y 53 µm,

finalmente el residuo de los tamices se lavó con abundante agua ayudada con una piseta. El

sedimento sobrante se resuspendió en 100 ml de agua y repetir los 2 min de agitación

seguido de los 15 min de reposo inclinado y pase por el nido de tamices (Aguilar et al.,

2016).

Las fracciones obtenidas en los tamices de 125 µm y 53 µm se recogieron 2ml (con la

menor cantidad de agua posible), se colocaron en el tubo falcón, seguidamente, usando una

pipeta de 10 ml, se agrega, al fondo del tubo, 4 ml de agua y se lleva a centrifugación a

4000 rpm por 1 min. Eliminamos el sobrenadante.

Al precipitado se añadió 4 ml de sacarosa al 60 %. Se agita bien y se vuelve a centrifugar a

4000 rpm por 2 min, las esporas están ahora en suspensión. El sobrenadante obtenido se

conservó en refrigeración hasta el contaje de esporas. (Aguilar et al., 2016). Las esporas

extraídas se observaron bajo un microscopio de luz y la identificación de especies

utilizando criterios taxonómicos actuales

3.11.4.2. Calculo de la cantidad de esporas observadas por tratamiento

De acuerdo a Rodríguez y Rodríguez (2017), el contaje de esporas se realizaron

depositando 0,5 ml de la suspensión en un porta objeto, donde se contabilizaron el total de

las esporas con la ayuda de un el microscopio estereoscopio (LEITZ, MODELO XY)

(Objetivo de 10X). Aquellas que se observaban saludables, intactas y con colores vivos

se contaron y separaron por grupos teniendo en cuenta tamaño, color y forma. El contaje

se efectuó por triplicado, con ese promedio se aplicó la siguiente fórmula para determinar

el número de esporas presentes en los 100 g de suelo. La siguiente fórmula se utilizó para

la obtención de esporas en 100g/suelo (Rodríguez y Rodríguez, 2017).

33

#𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 =𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗𝑝𝑖

𝑝𝑓∗ 100

Dónde:

pi = peso inicial de la muestra.

pf = peso final usado

3.11.5. Efecto de la micorriza en el desarrollo vegetativo de sorgo (S.

bicolor L) y (O. basilicum).

El efecto de la micorrización en el desarrollo vegetativo de las plantas trampa en cada

tratamiento se efectuó por medio de evaluación de las variables altura de plantas y

diámetro del tallo. Estos resultados se los obtuvo realizado mediciones de la altura de cada

planta tomada desde la base del tallo hasta el ápice de la hoja y el diámetro del tallo a la

altura del primer nudo con una regla.

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

35

4.1. Resultados

4.1.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las

plantas trampa S. bicolor L. y O. basilicum.

Del muestreo de suelos nativos no intervenidos con el empleo de agroquímicos se verifico,

la presencia de micorrizas nativas de raíces de cacao (Figura 6), por el proceso de tinción

en raíces descrito por Phillips y Hayman, (1970); Gemma y Koske, (1989) con ajustes para

las condiciones locales, principalmente en periodos de tiempo o secuencia de pasos, que se

ajustaron por ensayo y error hasta conseguir una visión clara de las estructuras (Anexo 10).

A partir de estas muestras de micorrizas nativas de suelo con raíces fue posible rescatarlas

realizando la inoculación en plantas trampa. Se observaron un buen proceso de

colonización en las plantas de sorgo y albahaca asegurando el futuro de estas micorrizas

para uso posterior en suelos de cacao mediante inoculación.

En las figuras siguientes se presenta los resultados de las imágenes observadas bajo el

microscopio del tejido colonizado en raíces de las plantas trampa y las observaciones de las

diferentes estructuras provenientes tanto de micorriza nativa como de la LMSSK 60%

Figura: 6: Obtención de micorriza nativa del cultivo de cacao.

36

Figura: 7: Aspecto del tejido colonizado en raíces de Sorgo (s) y Albahaca (a) con

aumento de objetivo 10X.

Figura: 8: Observación de las diferentes estructuras de micorrizas: hifas en “pelotón” (a =

objetivo 40X), vesículas (b = objetivo 10X), arbúsculos (c = objetivo 10X) y esporas (d =

objetivo 40X).

4.1.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60%

en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.

El mejor sustrato y el que permitió la mayor colonización y multiplicación de las

micorrizas fue tierra + turba de coco + picón. En esta mezcla obtuvo entre 80 y 99 % de

colonización micorrízica, independientemente del tipo de micorriza originalmente usado

como inoculo. El incremento de micorrización se observó en todos los tratamientos,

inclusive se observaron que el control que no fue inoculado. Considerando que este último

sustrato no fue previamente esterilizado, se deduce que contenía sufriente presencia de

hongos micorrízicos como para presentar un 42% de colonización, demostrando que

existen micorrizas nativas en los suelos aunque con bajos niveles de colonización (Figura

9). La presencia de micorriza en el control nos indica que las plantas se desenvuelvan con

37

algún nivel de eficiencia en los suelos bajo estudio, sin embargo requieren, para mayor

efectividad, de la inoculación de los sustratos pobres, para conseguir un incremento de la

absorción y translocación de nutrientes.

Figura: 9: Porcentaje de colonización de los tratamientos. Las barras de error indican ±ES;

letras diferentes indican diferencias significativas entre los promedios a p<0.05 (Prueba de

Tukey).

4.1.3. Efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular de

S. bicolor L. y O. basilicum.

El efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular, para el factor micorriza no

se encontraron diferencias significativas, es decir tanto la micorriza nativa como la

LMSSK al 60% generaron igual volumen radicular, con valores de 129,27 y 128,96 cm3

respectivamente (Tabla 8). En el factor sustrato, si se presentaron diferencias significativas,

con el sustrato formado por tierra + turba de coco + picón presentando el valor más alto,

168,44 cm3. Aparentemente, a mayor cantidad de nutrientes, mayor aumento del sistema

radicular y consecuentemente mayor capacidad de colonización de la micorriza, que se

refleja en las distintas combinaciones micorriza sustrato. Entre las interacciones se

observaron también diferencias significativas, destacando que la micorriza nativa de la

huerta de cacao tuvo un efecto semejante al de LMSSK al 60% en relación al aumento de

volumen del sistema radicular, cuando interactúa con la mezcla completa, variando

comportamiento cuando faltaba uno de los componentes.

38

Tabla 8: Efecto del volumen de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes

sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum)

en condiciones de invernadero, 2019.

TRATAMIENTOS Volumen de

raíces (cm3) N° Detalles

Micorrizas

M1 Micorriza LMSSK 60% 128,96 a

M2 Micorriza nativa 129,27 a

Sustratos

S1 Tierra + Picón 97,19 c

S2 Turba de coco + Picón 121,72 b

S3 Tierra + Turba de coco + Picón 168,44 a

Tratamientos

M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 90,00 abcd

M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 127,19 ab

M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 169,69 a

M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 104,38 abc

M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 116,25 abc

M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 167,19 a

Testigo Tierra 54,06 d

Promedios 13,30

CV % 34,92

4.1.4. Determinación del peso del sistema radicular de S. bicolor L. y

O. basilicum, bajo el efecto de las micorrizas.

Al analizar el peso del sistema radicular, los resultados son consistentes con lo encontrado

en volumen. No hubo diferencias en cuanto al tipo de micorriza tanto la nativa como la

LMSSK 60% presentaron pesos similares. El factor sustrato si se dio lugar a diferencias

significativas, el mayor peso del sistema radicular estuvo dado por el sustrato más

completo tierra + turba de coco + picón, con un valor de 11,57 g. En las interacciones

igualmente se observaron diferencias significativas, entre los tratamientos con las dos

39

combinaciones de micorriza y el sustrato más completo dando el valor más alto (11,96 y

11,19 g para la micorriza LMSSK al 60% y nativa respectivamente) del peso radicular

(Tabla 9).

Tabla 9: Peso de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en

simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en


TRATAMIENTOS Peso de

raíces (g) N° Detalles

Micorrizas

M1 Micorriza LMSSK 60% 8,88 a

M2 Micorriza nativa 8,98 a

Sustratos

S1 Tierra + Picón 6,67 abc

S2 Turba de coco + Picón 8,55 ab

S3 Tierra + Turba de coco + Picón 11,57 a

Tratamientos

M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 6,09 abcd

M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 8,61 abc

M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 11,96 a

M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 7,25 abc

M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 8,50 abc

M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 11,19 ab

Testigo Tierra 3,38 abcd

Promedios 8,14

CV % 16,40

4.1.5. Multiplicación de esporas proveniente de dos tipos de

micorrizas nativa y LMSSK 60% en plantas trampa.

La producción de esporas estuvo a favor de la micorriza nativa que generó la mayor

cantidad de esporas con un valor de 1960 esporas en 100g/suelo, siendo significativamente

diferente a la LMSSK 60% (Tabla 10). En el factor sustrato, se observó que mientras más

enriquecido hubo mejor producción de esporas, con diferencias significativas entre ellos

(Tabla 10), la mezcla de tierra + turba de coco + picón produjo 2370 esporas en

100g/suelo, seguida por las otras dos mezclas con 1500 esporas y 1510 respectivamente; es

decir, a mayor cantidad de nutrientes, mayor generación del sistema radicular y capacidad

40

de colonización la micorriza y producción de esporas. Entre las interacciones se

observaron diferencias significativas, la producción de esporas en los sustratos de tierra +

picón y turba de coco más picón fue a favor de la micorriza nativa produciendo 420 y 620

más esporas que cuando se mezcló con la LMSSK al 60 %. El sustrato más rico, tierra +

turba de coco + picón en cambio, aparentemente disminuyo esa diferencia presentando

valores casi similares, con apenas 40 esporas de diferencia, a favor de la LMSSK al 60%

(Tabla 10). La producción de esporas de hongos es un mecanismo que tienen para asegurar

su supervivencia, lo que explica que la producción de esporas sea menor en el sustrato más

rico, como se aprecia en la tabla.

Tabla 10: Número de esporas de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con

plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en condiciones de

invernadero, 2019.

TRATAMIENTOS Número de

esporas N° Detalles

Micorrizas

M1 Micorriza LMSSK 60% 1626 ab

M2 Micorriza nativa 1960 a

Sustratos

S1 Tierra + Picón 1510 ab

S2 Turba de coco + Picón 1500 ab

S3 Tierra + Turba de coco + Picón 2370 a

Tratamientos

M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 1300 abcd

M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 1190 abcde

M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 2390 a

M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 1720 abc

M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 1810 ab

M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 2350 a

Testigo Tierra 800 abcde

Promedios 1651,43

CV % 13,14

41

4.1.6. Efecto de la micorrizas en los caracteres morfológicos de S.


4.1.6.1. Altura y diámetro del sorgo (S. bicolor L.).

Los parámetros de altura y diámetro que corresponden al aspecto morfológico de las

plantas trampa presentaron efecto variable, con algunos tratamientos alcanzando valores

incluso menores al del testigo. Sobre el sorgo, el efecto de las micorrizas fue visible tanto

en la altura como en el diámetro, que alcanzaron las plantas.

Para el factor micorriza se pudo determinar que no existieron diferencias significativas

para ninguno de estos dos parámetros (Tabla 11), es decir, que la micorriza nativa tiene

igual capacidad que la LMSSK al 60%, para que las plantas trampa alcancen su mejor

desarrollo.

Si se observaron diferencias significativas con los sustratos y las combinaciones,

observándose que la turba + tierra + picón y la mezcla de los tres elementos da mejores

resultados que si solo se usa tierra + picón solamente.

Dentro las interacciones se si se encontraron diferencias significativas, con alturas de entre

133 -123 cm (Tabla 11). Bajo las condiciones de invernadero en sitio con baja nubosidad

en que se realizó este experimento, los resultados obtenidos en los caracteres morfológicos

de las plantas son consistentes con los resultados obtenidos en el proceso de micorrización.

Tabla 11: Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de micorrizas en tres

diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O.


42

TRATAMIENTOS

N° Detalles

Diámetro

/tallo

(mm)

Altura

/planta

(cm)

Micorrizas

M1 Micorriza LMSSK 60% 6,83 ab 112 a

M2 Micorriza nativa 7,64 a 112 a

Sustratos

S1 Tierra + Picón 5,38 ab 88 ab

S2 Turba de coco + Picón 7,77 a 126 a

S3 Tierra + Turba de coco + Picón 8,55 a 122 a

Tratamientos

M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 5,26 abcd 81 abc

M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 7,16 abc 133 a

M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco +

Picón 8,06 ab 122 ab

M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 5,5 abcd 95 abc

M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 8,38 ab 95 abc

M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 9,03 a 123 ab

Testigo Tierra 6,75 abcd 101 abc

Promedios 7,16 110

CV % 10,56 11,96

4.1.6.2. Altura y diámetro de la albahaca (O. basilicum).

Los parámetros de altura y diámetro que corresponden al aspecto morfológico de las

plantas trampa presentaron efecto variable, con algunos tratamientos alcanzando valores

incluso menores al del testigo. Al igual que el sorgo, sobre la albahaca, el efecto de las

micorrizas fue visible tanto en la altura como en el diámetro, que alcanzaron las plantas.

Para el factor micorriza se pudo determinar que no existieron diferencias significativas

para ninguno de estos dos parámetros (Tabla 12), es decir, que la micorriza nativa tiene

igual capacidad que la LMSSK al 60% para que las plantas trampa alcancen su mejor

desarrollo. Si se observaron diferencias significativas con los sustratos y las

combinaciones, observándose que la turba de coco con picón y la mezcla de los tres

43

elementos da mejores resultados que si solo se usa tierra y picón solamente. Dentro las

interacciones se si se encontraron diferencias significativas, con alturas de 0,21 cm (Tabla

12).

Tabla 12: Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de micorrizas en tres

diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O.


TRATAMIENTOS

Diámetro

/tallo

(mm)

Altura

/planta

(cm)

N° Detalles

Micorrizas

M1 Micorriza LMSSK 60% 3,75 a 14 a

M2 Micorriza nativa 3,75 a 12 b

Sustratos S1 Tierra + Picón 1,67 Ac 5 c

S2 Turba de coco + Picón 4,13 ab 18 a

S3 Tierra + Turba de coco + Picón 5,44 a 14 ab

Tratamientos M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 1,47 Ac 4 A c

M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 4,13 ab 21 a

M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 5,66 a 16 abb

M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 1,88 Ac 6 c

M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 4,13 ab 16 ab

M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 5,22 ab 13 ab

Testigo Tierra 1,57 Ac 7 c

Promedios 3,44 29

CV % 19,28 18,46

4.2. Discusión

4.2.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las

plantas trampa S. bicolor L. y O. basilicum.

La simbiosis mutualista existente entre un hongo y la raíz de un hospedero (Planta trampa),

logran resultados eficientes en la rizósfera, entre las interacciones de hongo-planta se

requirieron estudios de suelos donde no hayan sido intervenidos con el empleo de

maquinarias, productos agroquímicos o sobre fertilizaciones y para la obtención de

micorrizas nativas se verifico la presencia de aspectos de tejidos colonizados y las

diferentes estructuras (hifas , vesículas, arbúsculos y esporas) por medio del proceso de

44

tinción en raíces descrito por Phillips y Hayman (1970); Gemma y Koske (1989), de

acuerdo a este tipo de organismos, el uso de fuentes nativas tiene la ventaja de estar

adaptado a las condiciones edafoclimáticas y por lo tanto su eficiencia puede ser de

intereses locales. Se demostraron que los suelos nativos mantiene un buen proceso de

colonización, los cuales permitieron rescatar realizando la inoculación en plantas trampa.

Según González y Ferrera (1996); Álvarez y Ferrera (2006), como ejemplo, se ha

demostrado que la inoculación con hongos micorrízicos arbusculares aislados de fincas

cafetaleras favorece significativamente el crecimiento de plantas de café en comparación

con cepas de hongos micorrízicos de diferente origen. No obstante, estos trabajos no

consideraron la identidad taxonómica ni aspectos ecológicos de donde fueron recolectados

los hongos micorrízicos.

4.2.2. Porcentaje de colonización de la micorriza nativa y LMSSK

60% en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.

La micorriza arbuscular nativa y LMSSK 60% para obtener el mayor porcentaje de

colonización y multiplicación se requiere de la inoculación con raíz-suelo, la eficiencia de

sustratos pobres y esterilizados, donde se observaron un incremento de todos los

tratamientos. Según Monroy (2004), la colonización se produce rápidamente a partir de

raíces previamente micorrizadas que a partir de esporas, ya que en la raíz tienen mayor

viabilidad y desarrollo de estructuras. Independientemente del tipo de micorriza que

consignan entre 80 y 99% de colonización micorrízica, inclusive se observaron que el

control que no fue inoculado y debido a que el sustrato no fue previamente esterilizado y

presentaron un 42% de colonización.

Según Roveda et al. (2007), la colonización de HMA en los tratamientos testigo es causada

por la presencia de cepas nativas de micorrizas, debido a que los sustratos utilizados no

fueron previamente desinfectados. Sin embargo, los niveles de colonización en los

tratamientos testigos son bajos, menores que aquellos inoculados, lo que demuestra la

importancia de la práctica de selección de suelos con mayor riqueza de hongos

micorrizógenos para inoculación y la mayor eficiencia de las cepas inoculadas con relación

a las cepas presentes en el sustrato. Igualmente es de destacar el comportamiento de la cepa

nativa, cuya eficiencia fue comparativamente igual que la cepa LMSSK al 60% utilizada.

45

Una de las razones para ello, además de lo ya expuesto es la diversidad encontrada en la

nativa, frente a la LMSSK 60 % en la que solamente había dos géneros de hongos.

4.2.3. Efecto de las micorrizas en el volumen y peso del radicular de S.


Al analizar el sistema radicular respecto al peso y volumen, los resultados son consistentes,

es decir tanto la micorriza nativa como la LMSSK al 60% generaron igual peso y volumen

del sistema radicular. Donde se encontraron diferencias en los sustratos, el mayor peso y

volumen del sistema radicular estuvo dado por tierra + turba de coco + picón, con un valor

de 11,57 g y 129,27 cm3 respectivamente. Igualmente se observaron diferencias en las

interacciones, entre la micorriza y el sustrato completo dando el valor más alto del peso y

volumen del sistema radicular. Según Galindo (2008), en un estudio en frejol determinó

que la edad de la planta afecta la masa radical obtenida y que varía con el estado de

desarrollo del cultivo, con lo cual se obtuvieron valores mayores en las plantas cosechadas

a los 60 días que en plantas evaluadas a los 30 días, en donde los tratamientos no

influenciaron la masa radical de las plantas de frejol. Consecuentemente, las observaciones

en este estudio realizadas a los 90 días de edad de las plantas trampa, se hicieron en un

tiempo suficiente como para obtener un desarrollo micorrízico adecuado a las necesidades

de este estudio.

4.2.4. Producción de esporas proveniente de dos tipos de micorriza:

nativa y LMSSK 60% en plantas trampa.

La multiplicación o producción de esporas estuvieron a favor de la micorriza nativa

arbuscular de la huerta nativa de cacao generó la mayor cantidad de esporas con un valor

de 1960 esporas en 100g/suelo. Se observaron que mientras más enriquecido el sustrato

hubo mejor producción de esporas con la mezcla de tierra + turba de coco + picón

produjeron 2370 esporas en 100g/suelo, seguida por las otras dos mezclas con 1500 - 1510

esporas respectivamente, es decir, a mayor cantidad de nutrientes, mayor generación del

sistema radicular y capacidad de colonización la micorriza y producción de esporas. Según

Habte y Osorio (2001), en el proceso de multiplicación el carácter de simbionte obligado

por parte del hongo implica el uso de plantas hospedadoras con las cuales pueda completar

46

su ciclo de vida y finalmente producir abundantes esporas y/u otros propágulos. La planta

hospedadora debe sembrarse en un sustrato adecuado, buscando obtener alta versatilidad,

buena capacidad de intercambio catiónico, aireación y retención de humedad. Los

elementos están realmente disponibles en el país a costos relativamente bajos. Según

Duchicela (2001), quien sugiere que para ver el efecto benéfico de la simbiosis se requiere

de la esterilización del sustrato y/o desinfección (solarización, fumigación, vaporización)

con el fin de evitar daños posibles por la presencia de microorganismos fitopatógenos que,

además de ser una fuente de diseminación de enfermedades también pueden influir en la

capacidad de los hongos micorrízicos de colonizar el sistema radical.

4.2.5. Efecto de la micorrizas en los caracteres morfológicos de S.


Los efectos micorrízicos en los caracteres morfológicos sobre sorgo y albahaca presentaron

efecto variable con algunos tratamientos. Siendo visibles en diámetro y altura que

alcanzaron las plantas. El efecto micorrízico se pudo determinar que no existieron

diferencias para ninguno de estos dos parámetros, es decir, que la micorriza nativa tiene

igual capacidad que la LMSSK al 60%, para que las plantas trampa alcancen su mejor

desarrollo.

Según Aravena y Marcelo (2007), en plantas de aguacate y cítricos se observó que ninguna

de las variables (altura, diámetro, materia seca radicular y aérea) afectó el crecimiento final

de las plantas, conociendo que las respuestas a la micorrización tienden a ser menores en

suelos ricos en fósforo, también otro factor que se debe tener en consideración, y que

eventualmente podría explicar la falta de diferenciación en el crecimiento de las plantas, es

el tiempo transcurrido entre la inoculación y las mediciones realizadas. Plantas que se

encuentran en condiciones de invernadero, con fertilización y riego controlados, y pese a

porcentajes de colonización adecuados, pueden no expresar respuestas en el crecimiento

debido al tiempo de exposición a la acción de las micorrizas. Según Van der Heijden et al.

(1998); Klironomos et al. (2000), lo que el efecto benéfico de hongos micorrízico

arbuscular (definida como efectividad) en la promoción del crecimiento y/o nutrición de

las plantas parece estar definido por la riqueza de especies y por la procedencia de su

aislamiento, hecho que también fue posible apreciar en este estudio.

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

48

5.1. Conclusiones

La validación del protocolo de la técnica de tinción de las raíces, requirió ajustes en

las temperaturas a baño María y las secuencias de tiempos, para conseguir una

absorción de las soluciones, permitiendo que las raíces micorrizadas se aclaren y se

adhiera el tinte, facilitando la observación de las diferentes estructuras

colonizadoras.

La determinación del tipo de cepa que presenta mayor capacidad micorrízica tanto

la micorriza nativa, como la LMSSK al 60%, alcanzaron valores 99% de

colonización, es decir, ambas tienen capacidad de colonización. Existieron

diferencias entre las interacciones en la producción de esporas de la micorriza

nativa con 1960 esporas/100 g de suelo y la micorriza LMSSK al 60% con 1626

esporas/100 g de suelo y combinación con el sustrato tierra + turba de coco + picón

con 2370 esporas/100 g de suelo.

El mejor sustrato con el 99% de colonización y 1960 esporas/100 g de suelo

independientemente del tipo e inoculo, fue el que contiene la mezcla tierra + turba

de coco + picón.

El mejor con 8.55 mm – 122 cm del sorgo y 5.44 mm – 14 cm de la albahaca en el

efecto de la micorrización en las plantas trampa se obtuvieron con la mezcla de

turba de coco + picón y la de tierra + turba de coco + picón. Las observaciones de

colonización fueron más claras y extensivas en la albahaca.

49

5.2. Recomendaciones

Es recomendable para multiplicar micorrizas nativas de manera artesanal utilizar el

sustrato tierra + turba de coco + picón, previamente esterilizado e inoculado con

suelo y raíces, que brinda las condiciones favorables para que la masa radicular se

desarrolle adecuadamente obteniendo mayor cepas micorrizadas.

Realizar estudio de suelos de huertas antiguas de cacao y otros cultivos similares

para determinar fuentes de micorrizas nativas para multiplicación.

Realizar pruebas en vivero o campo con inoculo proveniente de micorrizas nativas

para establecer su eficiencia y efecto en condiciones de cultivos de interés local

(cacao, maíz, plátano).

Para una siguiente investigación es recomendable evaluar otras especies de plantas

locales (ejemplo: maíz, frejol, albahaca de monte) como planta trampa para

multiplicación o producción de inóculos nativos, teniendo en cuenta de estudiarlas

independientemente medir su capacidad micorrízica de colonización y

multiplicación.

CAPÍTULO VI

BIBLIOGRAFÍA

51

6.1. Literatura Citada

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CAPÍTULO VII

ANEXOS

57

Anexo 1: Croquis de cada unidad experimental.

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

* * * * * * * * * * * * * * * *

Distancia entre macetas: 30cm

Anexo 2: Croquis del área de estudio.

0,40m IV 0,40m I 0,40m II 0,40m III 0,40m

0,80m 0,80m 0,80m 0,80m

1.20m

T3 T0 T5 T1

1,20m

T2 T4 T3 T0

T5 T1 T2 T5

T1 T3 T4 T4

T6 T5 T6 T6

T4 T6 T1 T2

T0 T2 T0 T3

4,40m

58

Anexo 3: Obtención de las cepa micorrízica nativa.

Anexo 4: Recolección y esterilización de los sustratos.

Anexo 5: Protocolo de la técnica de tinción de raíces.

59

Anexo 6: Observación de las estructura de micorrizas.

Anexo 7: Toma de datos de los tratamientos.

Anexo 8: Peso y volumen de raíces.

60

Anexo 9: Obtención y observación de esporas.

Anexo 10: Protocolo de tinción de raíces descrita por (Phillips y Hayman, 1970); (Gemma

y Koske, 1989), con modificaciones de Mayra Bustamante 2019.

Se recolectó 4 gramos de raíces de cada unidad experimental que conformó el

tratamiento (Anexo 5), se conservó hasta su procesamiento en un tubo falco de 15 ml,

con Etanol al 50%, previamente lavado con agua de llave (Anexo 7).

Seguido se eliminó el Etanol, se enjuagó con agua de llave, se añade una solución de

Hidróxido de potasio (KOH) al 2.5%, hasta cubrir las raíces, se dejó 1 hora a 70 ºC en

baño maría y 24 horas a temperatura ambiente.

Se eliminó el Hidróxido de potasio (KOH), se enjuagó con agua de llave y se dejó por

10 minutos con Hipoclorito sódico (NaClO) cubriendo las raíces.

Se eliminó el Hipoclorito sódico, se enjuagó con agua de llave, se añadió el Ácido

clorhídrico (HCl) al 1% hasta cubrir las raíces, aquí permanecen 1 hora a 70 ºC en

baño maría y 24 horas más temperatura ambiente (Anexo 7).

Se eliminó el Ácido clorhídrico (HCl) y se tiñen con Trypan Blue al 0.05% en glicerol

acidificado (500 ml de glicerol + 450 ml de H2O + 50 ml de Ácido clorhídrico (HCl)

al 1%), cubriendo las raíces, igualmente permanecen por 1 hora a 70 ºC en baño maría

y 24 horas a temperatura ambiente (Anexo 7).

Se eliminó el Trypan Blue, se enjuagó con glicerol acidificado 3 veces y se las deja en

el último enjuague, donde pueden permanecer en refrigeración hasta su observación.

61

Anexo 11: Análisis de suelo.

62

63

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