Valorización de la fracción proteica del agua de cola del

proceso productivo de la harina de pescado mediante

hidrólisis enzimática y filtración cerámica

Laura Pérez Megíasa*; Sandra Balsellsa; Sílvia Juncàb; Camilo Avedañoc; Edxon

Licon-Bernala, F. Xavier Simón Fonta; Montse Jorbaa; Julia García-Montañoa aCentro Tecnológico LEITAT, c/Innovació, 2, 08225 Terrassa (Barcelona) bLEF ingenieros, c/Francesc Macià, 25, 08755 Castellbisbal (Barcelona) cAZ Ingeniería y Ma´quinas Ltda., Av. Tobalaba 4033-B, Providencia Santiago (Chile)

* Persona de contacto (lperez@leitat.org)

RESUMEN

Durante la producción de varios alimentos y productos alimenticios del sector pesquero

ocurre una pérdida inevitable de proteína debido a la producción de harina de pescado.

La mayoría de estas pérdidas de productos valiosos se encuentran en el agua, por

ejemplo, cuando se lleva a cabo la deshidratación por centrifugación. El subproducto

acuoso en esas instalaciones se conoce como agua de cola o stickwater y puede

contener 8-10% de sólidos con un importante contenido proteico. Debido a ese

contenido de proteína, el agua de cola es una corriente de particular importancia desde

el punto de vista técnico, ambiental y económico. Además, las aguas residuales

producidas por la industria pesquera son la principal fuente de contaminación en el lecho

marino y el agua de mar cuando se derraman en el océano donde se establecen esos

tipos de plantas industriales. Por lo tanto, es importante crear una ruta viable para tratar

el agua de cola correctamente y, a su vez, recuperar sustancias valiosas presentes en

él. El presente estudio describe un método confiable que extrae, purifica y recupera la

proteína presente en el agua de cola mediante un proceso híbrido basado en hidrólisis

enzimática y tecnología de membrana.

Palabras clave: valorización de corrientes de proceso, economía circular, hidrólisis

enzimática, membranas cerámicas, filtración cerámica, agua de cola, harina de

pescado; recuperación de proteína

Inevitable loss of protein due to industrial fishmeal producing is occurring during the

production of several food and feed products. Most of these valuable product losses are

found in water, for example when dewatering by centrifugation is carried out. The

aqueous byproduct in those facilities is known as stickwater and it can contain 8-10%

solids with important protein content. Due to that protein content, stickwater is a stream

of particular importance from the technical, environmental and economic point of view.

Moreover, wastewater produced by fishery industry is the main source of pollution on the

sea sediments and seawater when it is spilled to the ocean where those kinds of

industrial plants are established. Therefore, it is important to create a viable route for

treating stickwater properly and in turn recovering valuable substances contained in it.

The present study describes a reliable method which extracts, purifies and recovers the

protein present in stickwater by a hybrid process based in enzymatic hydrolysis and

membrane technology.

Key Words: process streams valorization; circular economy; enzymatic hydrolysis;

ceramic membranes; stickwater; ceramic filtration; fishmeal; protein recovery

1. INTRODUCCIÓN

El agua de cola es una corriente de proceso muy importante en volumen que se genera

durante el proceso productivo de la harina de pescado (Figura 1). Esta corriente llega a

representar el 60% en volumen del pescado procesado y suele contener del orden de

un 10% de sólidos (mayoritariamente proteína1). Este sector de la industria pesquera,

comprometido con proyectos de mejora continua, ha dedicado esfuerzos a la

recuperación de la proteína contenida en el agua de cola por poseer un gran valor. De

hecho, su recuperación y posterior valorización como harina de pescado permite

aumentar la calidad del producto final –destinado a alimentación animal– y mejorar su

precio en el mercado.

Figura 1. Harina de pescado

Aunque el concentrado de proteína obtenido de estas corrientes puede enriquecer la

harina de pescado u otros productos en contenido proteico, es necesario que tenga una

baja concentración de sales y aminas biogénicas, como la histamina, para que sea

adecuado para incorporarse a la harina de pescado u otras matrices y aumentar así el

valor nutricional y de mercado del producto (Tabla 1). Por lo tanto, es importante diseñar

un tratamiento viable para tratar adecuadamente el agua de cola (Tabla 2), de manera

que se pueda incrementar su contenido proteico y a la vez eliminar las sustancias no

deseadas (ej. histamina, sales).

Tabla 1. Estándares de calidad de la harina de pescado2

Harina de pescado Clasificación

Parámetros Unidades PREMIUM SUPER PRIME PRIME STANDARD

Proteína % min 70 68 67 65/64

Grasa % max 10 10 10 10

1 García, S.C.O. (2007). Generación de efluentes con baja carga contaminante y caracterización de sólidos derivados del agua de cola tratada por centrifugación y ajuste de pH. Tesis doctoral, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (Méjico) 2 http://www.hayduk.com.pe/harina_calidades.htm

Harina de pescado Clasificación

Parámetros Unidades PREMIUM SUPER PRIME PRIME STANDARD

Humedad % max 10 10 10 10

Ácidos grasos % max 7 7.5 10 -

Cenizas (sin sal) % max 14 14 15 -

Arena y sal % max 4 4 4,5 5

TVN 100mg/100g 86 100 120 -

Histamina ppm max 100 500 1000 -

Tabla 2. Caracterización del agua de cola

Determinación Resultado

pH 6,0

Conductividad (mS/cm) 37,9

MES- Materias en suspensión (filtro de microfibra de vidrio borosilicato de 1,2µm) 20-22ºC (%)

1,17 ± 0,05

MES-Materias en suspensión (filtro de nitrato de celulosa de 0,45µm) 75ºC (%)

1,25

Residuo seco (%) 14,33 ± 0,02

Mat. orgánica (%) 11,52 ± 0,03

Cenizas (%) 2,80 ± 0,02

Nitrógeno Kjeldahl (%) 1,93 ± 0,08

Nitrógeno Soluble membrana 1,2µm (20-22ºC) (%) 1,99 ± 0,08

Nitrógeno Soluble membrana 0,45µm (75ºC) (%) 1,75 ± 0,00

Nitrógeno volátil total (TVN) (%) 0,23 ± 0,01

Proteína Kjeldahl (%) 9,51 ± 0,44

Proteína total según método Biuret (%) 14,26 ± 2,18

Aminoácidos libres (%) 0,9 ± 0,03

Perfil proteico SDS-PAGE 5 - 150 kDa

Histamina (%) 0,31 ± 0,01

Grasa (%) 0,36 ± 0,02

2. OBJETIVOS

El presente estudio investiga un tratamiento que permita extraer y purificar la proteína

contenida en el agua de cola mediante dos etapas: un proceso basado en hidrólisis

enzimática seguido de un proceso de filtración mediante tecnología de membrana

(Figura 2). Por una parte, el estudio de hidrólisis enzimática investiga y selecciona:

enzimas, dosis, grado de hidrólisis y tiempo de aplicación. Por otra parte, el estudio del

proceso de filtración determina las condiciones de operación (presión, flujo y

temperatura de filtración) que maximicen el porcentaje de recuperación de proteína y la

eliminación de histamina y sales.

Figura 2. Proceso basado en hidrólisis enzimática y filtración cerámica

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Hidrólisis enzimática

3.1.1. Enzimas

La hidrólisis enzimática tiene como objetivos solubilizar la mayor parte de los sólidos

contenidos en el agua de cola (mayoritariamente proteína) e hidrolizar parcialmente los

péptidos de alto peso molecular. Por un lado, se reduce la viscosidad de la corriente

residual y, consecuentemente, se mejora la operación posterior de filtración con

membranas. Por otro lado, se obtiene un perfil proteico mucho más homogéneo en

comparación con el agua de cola original que contiene una gran variedad de pesos

moleculares, comprendidos entre 5 y 150 kDa. En la Figura 3 se muestra la distribución

de pesos moleculares por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) realizado

en un equipo Mini-PROTEAN Tetra cell de Bio-Rad.

Figura 3. Perfil proteico del agua de cola a diferentes diluciones (1: Patrón Precision Plus Protein Dual Xtra Standard 2-250 kDa; 2: dilución 1/100; 3: dilución 1/50;

4: dilución 1/20; 5: dilución 1/10)

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Sales y aminas biogénicas

Biorreactor agitado/calorifugado

Bomba

T

Recirculación de proteínas

A evaporador

Stickwater

Sales y aminas biogénicas

Proteínas hidrolizadas purificadas MF-UF-NF

cerámica

T

Se debe tener en cuenta que un grado de hidrólisis demasiado alto originará péptidos

de pequeño tamaño que permearán fácilmente a través de la etapa posterior de filtración

por membrana y se perderán, mientras que un grado de hidrólisis demasiado bajo el

beneficio operacional tendrá poco impacto y no compensará el coste de las enzimas.

Por estos motivos se plantea una hidrólisis parcial de la proteína.

La selección de enzimas viene dada por la necesidad de emplear aquellas que sean de

grado alimentario con el fin de asegurar la calidad de la harina de pescado para el sector

alimentario, y también, por el tipo de proteasa. Se seleccionan enzimas de grado

alimentario tipo endoproteasas, que actúan cortando internamente la proteína, en lugar

de exoenzimas. Las exoenzimas cortan preferentemente las proteínas en los extremos

terminales, liberando aminoácidos y péptidos de pequeño peso molecular, los cuales

podrían causar sabores amargos, sobre todo aquellos péptidos pequeños compuestos

de aminoácidos hidrofóbicos3,4,5. Además, estos péptidos pequeños podrían permear

fácilmente durante el proceso de filtración y perderse hacia el permeado durante el

proceso de filtración por membranas.

Las endoproteasas se seleccionan considerando el rango de pH y temperatura de

procesado industrial del agua de cola, para asegurar que sean activas en el nuevo

proceso. De entre una variedad de enzimas que cumplen estos criterios, se seleccionan

y se ensayan dos enzimas por presentar actividad en una mayor amplitud térmica.

3.1.2. Ensayos de hidrólisis enzimática

La Tabla 3 muestra un resumen de los diferentes ensayos realizados para determinar el

grado de hidrólisis óptimo del agua de cola, es decir, la dosis de enzima y el tiempo

necesarios para obtener una hidrólisis parcial adecuada.

Tabla 3. Protocolo experimental de los ensayos de hidrólisis enzimática

Condiciones fijas pH 5.9 (pH muestra)

Temperatura: 70ºC

Condiciones variables % Enzima respecto agua de cola

Enzima A y enzima B

Tiempo de aplicación: 10, 20 y 30 minutos

Ensayos enzimáticos: dosis de enzimas

respecto agua de cola

Dosis (en ppm): 0, 10, 25, 40, 50*, 500*, 1000* * dosis altas en 30 min

Inactivación Se inactiva la muestra por efecto en frío, para

poder parar la reacción y observar el perfil proteico en aquel tiempo concreto.

Determinación Perfil peptídico SDS-PAGE

3 Peter Amala Sujith and T.V. Hymavathi. Recent developments with debittering of protein hydrolysates.. As. J. Food Ag-

Ind. 2011, 4(06), 365-381 4 Badal C. Sahaa, Kiyoshi Hayashi. Debittering of protein hydrolyzates. Biotechnology Advances 19 (2001) 355–370 5 Heidi Geisenhoff. Bitterness of soy protein hydrolysates according to molecular weight of peptides. Thesis submitted to

the graduate faculty in partial fulfillment of the requirements for the degree of MASTER OF SCIENCE Iowa State University

3.2. Filtración con membranas cerámicas

3.2.1. Membranas cerámicas

Las membranas cerámicas (Figura 4) son adecuadas para esta aplicación ya que son

capaces de soportar condiciones de operación extremas6, como las altas temperaturas

(70-90 ºC) del proceso productivo de la harina de pescado.

Figura 4. Membranas cerámicas con distintas configuraciones para micro-, ultra- y nanofiltración.7

El correcto dimensionado involucra el diseño de un tren de filtrado que permita recuperar

el máximo % de proteína presente en el agua de cola. Usar membranas de tamaño de

poro grande conlleva a la pérdida de proteína por el permeado, mientras que usar

membranas de tamaño de poro pequeño implica una obturación de la membrana y,

consecuentemente, bajos flujos y altas presiones que hacen inviable el proceso.

La Tabla 4 muestra las características de las tres membranas cerámicas de Rauschert

/Inopor8 utilizadas en este estudio.

Tabla 4. Características de las membranas utilizadas

Tipo

Microfiltración (MF)

Ultrafiltración (UF)

Nanofiltración (NF)

Geo

metr

ía

Tamaño de poro [nm] 100 5 0.9

Diámetro exterior / interior - largo [mm]

10 / 7 - 500 10 / 7 - 500 10 / 7 - 500

Membrane Cut-off [Da] - 8500 450

Valo

res

esp

ecíf

ico

s

Área de membrana [m2] 0,011 0,011 0,011

Velocidad crossflow [m/s]

0,14 0,14 0,14

Mate

rial Soporte α-Al2O3 α-Al2O3 α-Al2O3

Membrana α-Al2O3 TiO2 TiO2

Porosidad 40-55% 30-55% 30-40%

6 Gitis, V., & Rothenberg, G. (2016). Ceramic membranes: new opportunities and practical applications. John Wiley & Sons. 7 https://rauschert.com/

8 http://www.inopor.com

3.2.2. Proceso de filtración

Después de unos ensayos preliminares (los datos no se muestran) se diseñan tres

trenes de filtrado diferentes con la finalidad de comparar los resultados y determinar qué

opción tiene un balance más equilibrado entre recuperación de proteína, eliminación de

histamina y gasto energético (mayoritariamente marcado por la presión de operación).

Las opciones que se han planteado contienen un proceso de pre-filtrado mediante

filtración a 1 micra para eliminar sólidos más gruesos, seguido de la hidrólisis enzimática

con una dosis determinada y finalmente el proceso de filtración múltiple que contiene

etapas de MF, UF y NF como se muestra en la Figura 5.

Opción 1: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + UF

Opción 2: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + UF + NF

Opción 3: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + NF

Figura 5. Tren de filtrado que incorpora: pre-filtración + hidrólisis enzimática + MF + UF + NF

Cada una de las etapas de filtración se lleva a cabo en el equipo de filtración MMS SW18

de MMS Membrane Systems (Figura 6).

Figura 6. Equipo de filtración MMS SW18 de MMS Membrane Systems

3.2.3. Análisis de proteína e histamina

Para determinar el porcentaje de recuperación de proteína y eliminación de histamina,

se realizan analíticas de las muestras rechazadas por las membranas de MF, UF y/o NF

que finalmente se reincorporarán al proceso de producción de la harina de pescado.

El cálculo de proteína se realiza mediante la determinación de nitrógeno Kjeldahl basado

en la norma UNE-EN 25663:1994, y multiplicando el valor de nitrógeno por el factor de

colágeno (5,6).

La determinación de histamina se realiza mediante cromatografía de líquidos (HPLC-

DAD Agilent 1200) según norma ME-711.04-070.

4. RESULTADOS

4.1. Determinación de la dosis de enzima y grado de hidrólisis

Los diferentes ensayos de hidrólisis parcial del agua de cola, determinaron que la

enzima B hidroliza más que la enzima A y, por tanto, es posible usar menos cantidad de

enzima. Además, se determinó que para ambas enzimas se empieza a observar una

ligera hidrólisis en el minuto 10, siendo la hidrólisis parcial completamente visible en el

minuto 30. Como se observa en la Figura 7, una dosis de tan solo 10 ppm de enzima ya

es suficiente para que se produzca una hidrólisis parcial, rompiendo las proteínas de

alto peso molecular superiores a 75 kDa.

1 2 3 4

Figura 7. Perfil proteico del agua de cola (1: Patrón Precision Plus Protein Dual Xtra Standard 2-250 kDa; 2: agua de cola original; 3: 10 enzima A, 30 min; 4: 10 ppm enzima B, 30 min)

4.2. Condiciones de operación durante el proceso de filtración

La temperatura de trabajo se mantuvo a 70-85ºC para todos los casos. La MF operó a

3 bares y 60 lmh9, la UF operó a 5 bares y 60 lmh y la NF operó a 10 bares y 5-10 lmh.

Se debe tener en cuenta el ensuciamiento o fouling de las membranas, la cual cosa

conlleva a la necesidad de limpiezas periódicas para asegurar el mantenimiento del flujo

de permeado.

4.3. Recuperación de proteína y eliminación de histamina

El tren de filtrado formado por MF + UF (Opción 1) es capaz de recuperar el 89,3% de

proteína y eliminar el 25,4% de histamina. Al añadir NF (Opción 2) incrementa la de

recuperación de proteína hasta un 95,7% pero baja la eliminación de histamina hasta el

13,5% de histamina. Finalmente, el tren de filtración formado por MF + NF (Opción 3)

recupera el 91,1% de proteína y elimina el 21,3% de histamina.

Como se puede observar el la Figura 8, la opción que es capaz de recuperar más

proteína es también la que elimina menos histamina. Es por ello que es necesario buscar

un balance entre estos dos porcentajes y el gasto energético que supone la filtración.

9 Se refiere al flujo de permeado a través de la membrana en L/(m2·h).

1 2 3 4 5

Figura 8. Recuperación de proteína y eliminación de histamina para cada unos de los trenes de filtrado

5. CONCLUSIONES

A temperatura ambiente, el agua de cola tiene un aspecto líquido de color marrón

oscuro, con un ligero olor a pescado. A temperaturas frías de 6ºC, el agua de cola

presenta un aspecto de gelatina sólida, pero este aspecto de gelatina se pierde si la

muestra se somete previamente a tratamiento enzimático. El estudio de hidrólisis

enzimática ha permitido correlacionar la observación de la pérdida de la capacidad de

gelificación a temperaturas frías con el perfil peptídico obtenido, establecer las

condiciones óptimas para obtener una hidrólisis significativa de los péptidos de alto peso

molecular y a la vez, obtener una muestra homogénea para obtener una harina de

pescado de mayor calidad, aplicando finalmente 10 ppm de la enzima B durante 30

minutos.

El estudio del proceso de filtración ha permitido determinar la necesidad de un pre-

tratamiento para la filtración de agua de cola y determinar las condiciones de operación

para cada una de las diferentes etapas de filtración. Las opciones estudiadas han

permitido recuperar más del 90% de proteína y eliminar del orden del 20% de histamina.

La Figura 9 muestra que para alcanzar una harina PRIME, es necesario añadir 1,7 litros

de agua por cada litro de stickwater. Mientras que para alcanzar una harina

SUPERPRIME, serían necesario añadir 2,2 litros de agua por cada litro de stickwater.

89,395,7

91,1

25,4

13,520,3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Opción 1 Opción 2 Opción 3

[%]

Recuperación proteína Eliminación histamina

Figura 9. Diafiltraciones necesarias para pasar de harina PRIME a SUPERPRIME

6. AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el soporte de las tareas realizadas en este estudio al proyecto

REFISHEIN (RDXI-1-0002), con el soporte de ACCIÓ en el marco del Programa

Operativo FEDER Catalunya 2014-2020.