Vehículos

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An. R. Acad. Nac. Farm., 2008, 74: 229-256

Artculo original

Diseo y desarrollo de nuevas formulacionespara la vehiculizacin de genes teraputicoscon aplicacin al cncer de hgado y colon

Recibido el 23 de enero de 2008

NAVARRO DEZ, GEMMA y TROS DE ILARDUYA APAOLAZA *,M. CONCEPCIN

Departamento de Farmacia y Tecnologa Farmacutica.Facultad de Farmacia. Universidad de Navarra

RESUMEN

El cncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Laliberacin de genes teraputicos vehiculizados en nuevas formas farmacuticas sepresenta como una prometedora alternativa en el tratamiento de esta enfermedad.Los dendrmeros PAMAM son polmeros catinicos cuya aplicacin como vehcu-los en terapia gnica est generando un inters creciente en la comunidad cient-fica. La mezcla de los dendrmeros con DNA lleva a la formacin de complejos porinteraccin electrosttica que reducen el tamao y la carga del DNA, lo protegende la degradacin por las nucleasas del suero y aumentan su entrada en la clulapor endocitosis. Sin embargo, la influencia de los aspectos fsico-qumicos en laeficacia de estos vectores, as como el balance ptimo entre su eficacia y toxicidadno han sido totalmente elucidados. En este trabajo se han empleado dendrmerosde distintos pesos moleculares (14.000 Da y 28.000 Da) y se han asociado a DNAplasmdico en cantidades crecientes. Las formulaciones preparadas con el dendr-

* Informacin de contacto:Conchita Tros de Ilarduya.Departamento de Farmacia y Tecnologa Farmacutica. Facultad de Farmacia. Uni-

versidad de Navarra. 31080 Pamplona.Telf.: 948/425600. Ext. 6375.Fax: 948/425649e-mail: [email protected]

GEMMA NAVARRO DEZ Y C. TROS DE ILARDUYA AN. R. ACAD. NAC. FARM.

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mero de 14.000 Da presentaron tamaos de partcula de entre 150 y 170 nm,mientras que a las mismas relaciones de carga, los complejos preparados con elpolmero de mayor peso molecular presentaron valores menores, de alrededor de100 nm. El potencial de superficie fue positivo en todos los casos excepto cuandose utiliz la misma cantidad de polmero y de DNA (punto de electroneutralidad).Adems, en este estudio se ha demostrado la capacidad de estas formulacionespara proteger al DNA frente a la degradacin por DNAasas independientemente delpeso molecular y cantidades utilizadas. Los resultados in vitro en clulas HepG2(hepatocarcinoma humano) y CT26 (cncer de colon murino) sugieren que a mayorpeso molecular y a mayor cantidad de dendrmero se obtienen mayores niveles deexpresin gnica. Por ltimo, sealar que los estudios de toxicidad determinaronuna viabilidad celular superior al 80% en todos los casos.

Palabras clave: Terapia gnica.Dendrmeros.Polmeros.Galnica.PA-MAM (poliamidoamina).

SUMMARY

Design and development of new pharmaceutical dosage formsfor therapeutic gene delivery applied to liver and colon cancer

The success of gene therapy is largely dependent on the development of vectors(new pharmaceutical dosage forms) capable of effectively transfering therapeuticgenes into cells. One mayor approach in non-viral gene therapy is based on cationicpolymers, like PAMAM (polyamidoamine) dendrimers. In the latest years, thegrowing interest in the use of dendrimers as gene carries has lead into numerousin vitro and less in vivo studies. The combination of DNA with dendrimers formscomplexes that reduce the size and the charge of DNA, protects the genetic materialagainst degradation by serum nucleases and enhances the uptake into cells byendocytosis. However, the mechanisms of internalization and the influence ofbiophysical features in transfection efficacy are not fully elucidated. Moreover, thesafe limits in terms of toxicity of dendrimers when condensed with DNA are stillnot clear. More systematic studies are needed to gain a better understanding of therules that govern dendrimer-based gene delivery. In this study, we have developed,characterized and optimized nanoparticles composed of PAMAM dendrimers(14.000 Da and 28.000 Da) and plasmid DNA, which can deliver genetic materialinto tumour cells. The quantities of both components were calculated in orderto prepare complexes at charge ratio (+/) from 1/1 to 10/1 (dendrimer/DNA). Thesize of the complexes ranged from 150 nm to 170 nm for those prepared withthe 14.000 Da dendrimer at charge ratio 2/1 to 10/1. At the same charge ratios, thecomplexes prepared with the highest molecular weight polymer showed lowervalues (around 100 nm). The zeta potential was positive in all cases, except for theratio 1:1 (neutrality point). Complexes prevented nuclease digestion. The protectionwas observed in both polymer generations at all the charge ratios prepared. In vitrogene expression by complexes was performed in HepG2 cells (human hepatocellular

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carcinoma) and CT26 cells (murine colon adenocarcinoma). Transfection levelsincreased with the charge ratio and with the molecular weight with maximumlevels at charge ratio 10/1 in both generations. Finally, in vitro toxicity assaysshowed a viability higher than 80% in all the complexes prepared.

Keywords: Gene therapy.Dendrimers.Polymers.Pharmaceutical.PAMAM (polyamidoamine).

INTRODUCCIN

1. Terapia gnica. Desafos actuales

La terapia gnica se define como el tratamiento de una enferme-dad mediante la transferencia de material gentico a las clulas es-pecficas de un paciente. Se presenta como un mtodo para tratar oprevenir enfermedades mediante el uso de genes que doten al pa-ciente de informacin gentica adecuada para producir las protenasnecesarias para corregir o modular una enfermedad.

Los avances en genmica, proteinmica y la secuenciacin delgenoma humano, han permitido identificar nuevos genes implicadosen la aparicin y desarrollo de enfermedades como el cncer, la fibro-sis qustica, la hipercolesterolemia familiar o enfermedades cardiovas-culares. Al igual que en otras reas de la biomedicina, la mayorade la investigacin en terapia gnica est dirigida al tratamiento delcncer. De todos los ensayos clnicos de terapia gnica aprobados enel mundo hasta este momento, casi un 70% corresponden a ensayosdirigidos al tratamiento del cncer.

La terapia gnica del cncer tiene como finalidad la eliminacinselectiva de las clulas tumorales por medio de tres estrategias prin-cipales: la correccin gnica de las clulas tumorales, la destruccinde clulas tumorales y la terapia adyuvante. En cualquiera de ellases necesario que el gen teraputico llegue al interior de la clulatumoral, atraviese el citoplasma hasta el ncleo y exprese la protenapara la que codifica. Esta protena ser la encargada de destruir a laclula tumoral, corregir su base gnetica, etc.

El gen teraputico debe superar diversos obstculos extracelu-lares e intracelulares hasta su expresin en el interior de la clula.


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Estas barreras varan en funcin del tejido y de la va de administra-cin elegida. Uno de los problemas principales es la estabilidad y lasupervivencia del sistema administrado en el torrente circulatorio.Por un lado, las enzimas nucleasas presentes en el suero son capacesde degradar el DNA desnudo. Por otro, la interaccin con las prote-nas sricas puede dar lugar a la formacin de grandes agregados queson rpidamente eliminados por las clulas fagocticas. Adems, laentrada de material gentico extrao al organismo asociado a unsistema sinttico o viral va a dar lugar a la aparicin de respuestasde inmunidad celular y humoral generando procesos inflamatorios,sobre todo en el caso de los vectores virales que poseen elementosmuy inmunognicos en su composicin.

El DNA ha de ser capaz de alcanzar el ncleo celular. Dependien-do del mecanismo del vehculo o del procedimiento empleado, laentrada en la clula se produce por endocitosis, por fusin de mem-branas o por desestabilizacin de la membrana. Una vez que el cidonucleico llega al citoplasma es captado por el sistema endosomal-lisosomal. El material gentico es almacenado en unas vesculas lla-madas endosomas que poseen un pH cido y con un contenido ricoen enzimas capaces de degradadar molculas libres de DNA. La l-tima barrera es la entrada de DNA exgeno en el ncleo celular. Lamembrana celular permite el transporte pasivo de molculas peque-as a travs de unos poros que tienen un tamao de 80 nm aproxi-madamente. Algunos sistemas de transfeccin son ms eficaces conclulas en proliferacin. Durante la profase temprana de la mitosisse produce la disgregacin de la envoltura nuclear. Esto permite unadistribucin homognea del vector en el interior celular, quedandouna porcin intranuclear del mismo, una vez reconstituido el ncleo.

La manera ms sencilla de administrar el DNA es la inyeccindirecta del DNA desnudo a los tejidos o bien su administracin sis-tmica, pero son tcnicas muy limitadas. Como se acaba de exponer,el DNA sin proteccin presenta una biodisponibilidad celular muybaja. La bsqueda de nuevos sistemas de liberacin de genes, efica-ces y seguros, supone uno de los campos principales de investigacinen terapia gnica.


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2. Vectores en terapia gnica

Se distinguen fundamentalmente dos tipos de vectores en terapiagnica: los vectores virales y los vectores no virales o sintticos. Unvector ideal debera cumplir los siguientes requisitos:

Que proteja el DNA frente a la degradacin enzimtica.

Que sea capaz de empaquetar altas cantidades de DNA.

Que posea mecanismos que favorezcan la internalizacin celu-lar, el escape del endosoma y el transporte al ncleo.

Que sea fcil de administrar.

Que sea estable en el suero.

Que produzca una nula o baja toxicidad, inmunogenicidad ypatogenicidad.

Que sea fcil de purificar.

Que sea fcil de fabricar.

Que posea un bajo coste.

2.1. Vectores virales

Con el uso de los vectores virales se aprovecha la capacidadnatural que tienen los virus para introducir material gentico en elinterior de las clulas. La aplicacin de estos vectores en terapiagnica exige ciertas propiedades del propio virus. Por un lado, elgenoma viral debe ser capaz de acomodar el gen teraputico, y porotra debe tratarse de un virus defectivo, es decir, un virus al que sele ha privado de alguna funcin necesaria para desarrollar su cicloreplicativo, de modo que no pueda ser patgeno para el paciente.Los principales grupos de vectores virales empleados en terapiagnica son los retrovirus, los adenovirus, los virus adenoasociados ylos herpesvirus. A pesar de que son unos vectores que alcanzan unaalta eficiencia de transfeccin, presentan algunos inconvenientesentre los que destacan la limitacin del tamao de DNA que puedeser empaquetado, los bajos ttulos de vector que se obtienen durantesu produccin, el riesgo potencial de infeccin y la mutagnesis


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insercional. Si bien, la principal desventaja de estos vectores es quela respuesta del hospedador al virus parece limitar la duracin de laexpresin y la posibilidad de administrar dosis repetidas.

2.2. Vectores no virales

Las limitaciones de los vectores virales hacen que los vectoressintticos se presenten como una alternativa atractiva en la terapiagnica. Entre sus ventajas, se puede destacar que no inducen inmu-nogenicidad, que presentan una baja toxicidad y que son fciles deproducir a gran escala. Sin embargo, su principal inconveniente essu menor eficiencia de transfeccin respecto a los vectores virales.

De todos los vectores no virales, los que ms posibilidades presen-tan y mejores resultados estn alcanzando son los sistemas qumicosbasados bien en la encapsulacin, o en la condensacin del DNA conel objeto de protegerlo y de facilitar su entrada en la clula. Entre ellosencontramos los sistemas lipdicos, polimricos y peptdicos.

Dentro de los sistemas polimricos se encuentran los polmeroscatinicos. Estos sistemas se basan en la condensacin del DNA car-gado negativamente en partculas compactas mediante la interaccinelectrosttica con policationes. Las partculas resultantes protegen alDNA y facilitan su internalizacin. Existen numerosos policationesque permiten la formulacin del DNA entre los que se incluyen lapolilisina (PLL), la polietilenimina (PEI), el poli (2-dimetilaminoetilmetacrilato) (PDMAEMA), el quitosano y los dendrmeros catinicos.Estos ltimos constituyen la base de este trabajo.

3. Los dendrmeros PAMAM

Dentro del grupo de polmeros catinicos cabe destacar los den-drmeros PAMAM (poliamidoamina) por su relacin con el trabajoexperimental. Los dendrmeros (del griego dendron: rbol, y meros:parte) son macromolculas esfricas altamente ramificadas. Su des-cubrimiento y sntesis se llev a cabo a principios de los aos ochen-ta. Presentan una estructura de estrella densa caracterizada porun ncleo central del que surgen numerosas ramificaciones. Existen


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dos tipos principales de dendrmeros PAMAM, los que tienen comoncleo un grupo amonio y los que presentan una molcula de etilen-diamina, dando lugar a estructuras con tres y cuatro puntos de ra-mificacin respectivamente.

La sntesis de este polmero se realiza mediante la adicin demetacrilato al ncleo, seguida de una amidacin con etilendiaminadel grupo ster resultante. Con cada repeticin de este proceso apa-rece una nueva generacin. Si consideramos el ncleo como la ge-neracin 0, la primera adicin de metacrilato y posterior amidacindara lugar a la generacin 1, la repeticin de este proceso daralugar a la generacin 2 (G2), y as sucesivamente. Con cada genera-cin, el peso molecular del dendrmero se incrementa exponencial-mente y el nmero de grupos amino terminales de su superficie sedobla. En general, los dendrmeros PAMAM presentan un tamao yestructura bien definidos con un ndice de polidispersin bajo encomparacin con otros polmeros de similar peso molecular.

Cuando el DNA se mezcla con el polmero PAMAM, se forma uncomplejo basado exclusivamente en una interaccin de los gruposfosfato negativos del DNA y los grupos amino primarios que se en-cuentran protonados en su superficie. Una neutralizacin de las car-gas del complejo o una alteracin en su carga neta producen cambiosen las caractersticas fsico-qumicas y biolgicas del mismo. La mor-fologa de estos complejos es toroidal, muy similar a la que formael DNA con otros polmeros catinicos como la polilisina o la polieti-lenamina.

La caracterizacin de la unin PAMAM-DNA y del proceso decondensacin no han sido totalmente elucidados. Parece que unaumento en la relacin de carga (+/), favorece el proceso de forma-cin del complejo.

En general, los complejos catinicos se unen por interaccin elec-trosttica a la membrana celular cargada negativamente. El procesode internalizacin de los complejos PAMAM-DNA est mediado porendocitosis. As lo demuestran estudios realizados siguiendo la in-corporacin en las clulas de DNA desnudo marcado con radioacti-vidad o condensado con dendrmeros marcados con radioactividad.Adems, se ha demostrado que una deplecin del colesterol en lamembrana celular provoca una inhibicin total del proceso de inter-


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nalizacin. En cualquier caso, es importante sealar que un menortamao y una carga superficial positiva favorecen el proceso de in-ternalizacin mediado por endocitosis. Una vez dentro de la clula,la eficacia de los complejos depende de su habilidad para escapar delendosoma. Los dendrmeros PAMAM tienen una alta capacidad tam-pn, debido a que poseen grupos amina protonables. Esto hace queen el interior del endosoma se comporten como bases dbiles y tam-ponen el medio cido (1). Sus propiedades tampn hacen que eldendrmero acte como una esponja de protones. Al decelerar laacidificacin del endosoma, se activa una ATPasa endosomal queprovoca la entrada masiva de protones al endosoma seguido de unflujo de iones cloruro. Estos cambios en la osmolaridad conducen aun aumento del volumen del endosoma de un 140% con la conse-cuente ruptura del mismo (2).

Todas las propiedades y caractersticas anteriormente descritashacen del polmero PAMAM un candidato adecuado para la libera-cin de genes en el ncleo. En general, las generaciones ms altas,la generacin 5 y superiores, son las que muestran una mayor efi-cacia de transfeccin. Parece que la naturaleza del ncleo central,amonio o etilendiamina, no influye en las eficacias de transfecciny que los parmetros ms importantes en este sentido son el pesomolecular y el nmero de grupos amino terminales caractersticosde cada generacin (3).

Los dendrmeros pueden sufrir un proceso de activacin que dalugar a los llamados dendrmeros activados o dendrmeros fractu-rados (4). Este proceso de activacin consiste en la solubilizacin deldendrmero en un solvente adecuado (agua, butanol) y un posteriorcalentamiento que da lugar a la degradacin del dendrmero por rup-tura de algunos enlaces amida. Esto hace que la estructura del den-drmero activado sea ms flexible, lo que se relaciona con una mayoreficacia de transfeccin (5). En la actualidad el dendrmero activadode la generacin 6 del PAMAM, que se comercializa bajo el nombrede Supefect, se utiliza como un agente de transfeccin estndar.

Se han realizado numerosos estudios que demuestran la habilidadde los dendrmeros como agentes de transfeccin in vitro en numero-sas lneas celulares (1, 6-8). Los estudios in vivo desarrollados hastaahora no han sido muy prometedores. Las causas principales sonla falta de eficacia y la toxicidad asociada a estos polmeros. Desta-


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can algunos realizados por distintas vas de administracin, sistmi-ca (9, 10), intratumoral (11), pulmonar (12) y por inyeccin directa enel ojo (13) o en el corazn (14). Tambin se han realizado estudios invitro (15) e in vivo (16) para terapia antisentido.

A determinadas dosis, los dendrmeros PAMAM, como la mayorade los policationes, son capaces de desestabilizar la membrana y pro-vocar la lisis celular. Es importante advertir que prcticamente lamayora de los estudios de toxicidad realizados in vitro e in vivo (17),muestran datos de toxicidad asociados a la administracin de los den-drmeros solos. Si la toxicidad de los dendrmeros es debida a las car-gas positivas de su superficie, cabe pensar que al formar complejoscon el DNA, la toxicidad vare con respecto a los dendrmeros solos,aunque los estudios comparativos de los que se dispone son confusosy contradictorios (18). Los estudios in vitro han demostrado que losdendrmeros pueden presentar citotoxicidad y hematotoxicidad de-pendientes de la generacin siendo las generaciones altas, las mstxicas (19).

Hasta el momento, el nmero de estudios sistemticos sobre latoxicidad in vivo es muy escaso. La inyeccin en ratones de den-drmeros G5 e inferiores a una dosis de 10 mg/kg de ratn no pare-ci ser txica (20). Con respecto a la inmunogenicidad, en estudiosiniciales los dendrmeros mostraron una dbil o nula inmunogenici-dad y cierta actividad como adyuvantes (21) aunque posteriormentese ha demostrado que poseen cierta inmunogenicidad (22).

La biodistribucin tras la administracin parenteral de los den-drmeros ha sido ampliamente estudiada, sobre todo en relacin al de-sarrollo de estos dendrmeros como posibles agentes de imagen (23).Las generaciones ms pequeas son rpidamente eliminadas de la cir-culacin va hgado, para ser excretadas por el rin. Aunque es posi-ble que los perfiles de distribucin puedan verse alterados cuando semodifica la superficie del dendrmero (17).

Por todo lo anterior, la optimizacin de los dendrmeros PAMAMcomo vehculos para la liberacin de genes requiere necesariamenteun balance entre la eficacia teraputica y los efectos txicos. En estesentido, se han desarrollado nuevas sntesis a partir de los dendrme-ros PAMAM con el fin de buscar modificaciones estructurales queincrementen su eficacia y disminuyan su toxicidad (24 y 25).


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MATERIAL Y MTODOS

1. Material

1.1. Material gnico

El DNA plasmdico (pDNA) utilizado que contiene el gen de laluciferasa bajo el promotor del citomegalovirus (CMV), fue el pCMV-Luc (VR-1216), (BioServe Biotechnologies, EE.UU.). Su crecimientose llev a cabo en Escherichia coli XL-12 y su purificacin con Quia-gen Endofree Plasmid Giga Kit (Quiagen, Alemania).

1.2. Productos y reactivos

Los dendrmeros de poliamidoamina (PAMAM) con etilendiami-na (EDA) como iniciador tetravalente de la polimerizacin fueronobtenidos de Sigma-Aldrich. Para este estudio se utilizaron las gene-raciones cuarta, G4 (EDA) y quinta G5 (EDA) con un peso molecularde 14.215 Da y 28.826 Da, y un nmero de grupos amino terminalesde 64 y 128, respectivamente.

Para el crecimiento e identificacin del plsmido y para las elec-troforesis en gel de agarosa se utiliz: agar, medio LB Broth, agarosaD-1 Baja EEO (Pronidasa, Espaa), kanamicina (Sigma-Aldrich,EE.UU.), tampn Tris-brico-EDTA (TBE) formado por Tris 0.1 M,cido brico 0,09 M y EDTA 0,01 M (Invitrogen Life Technologies,Reino Unido), bromuro de etidio (50 L/mL) (Gibco BRL Life Tech-nologies, EE.UU.), desoxirribonucleasa I (Invitrogen Life Technolo-gies, Reino Unido), glicerol (Invitrogen Life Technologies, Reino Uni-do) y azul de bromofenol (Sigma, EE.UU.).

Las nanopartculas se prepararon en buffer Hepes Glucosadoa partir de HEPES (Sal sdica) y D (+) - Glucosa (Sigma-Aldrich,Alemania).

Para la disociacin de los complejos se utiliz: sal sdica deheparina (Sigma, Alemania), EDTA (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y laurilsulfato sdico (Roig Farma, Espaa).

Para los estudios de transfeccin in vitro se utilizaron los reacti-vos Luciferase Assay Sustrate (Promega, EE.UU.), Reporter Lysis


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Buffer 5X (Promega, EE.UU.) y el kit Bio-Rad Dc Protein Assay(Bio-Rad Laboratories, EE.UU.). Para evaluar la viabilidad se utilizel reactivo Alamar Blue (Trek Diagnostic System, Inglaterra).

1.3. Cultivos celulares

Las lneas celulares empleadas en este estudio fueron HepG2(clulas de hepatocarcinoma humano) y CT26 (clulas de cncerde colon de ratn) (American Type Culture Collection, MD, EE.UU.).Se mantuvieron a 37 C en atmsfera humidificada con un 5% de CO2.El medio de cultivo utilizado fue DMEM (Dulbeccos Modified EagleMedium-High Glucose con 4500 mg/L de glucosa y Glutamax-I) suple-mentado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL)y estreptomicina (100 g/mL). Todos los productos empleados enlos cultivos celulares se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies(Reino Unido).

2. Mtodos

2.1. Purificacin del plsmido

El plsmido empleado en los estudios (pCMVLuc) se obtuvo trasel crecimiento de bacterias E.coli modificadas en placas de cultivode agar-agar con kanamicina a una concentracin de 50 g/mL. Setom una unidad formadora de colonias y se creci primero en 5 mLde precultivo LB Broth (1% p/v peptona de casena, 0,5% p/v de ex-tracto de levadura y 0,5% p/v de NaCl), y kanamicina (50 g/mL)durante 4 horas a 37 C, y despus en 2 L del mismo medio durante12 horas a la misma temperatura bajo agitacin orbital en un agita-dor Shaker modelo 625 (New Brunswick Scientific, Co. Inc, Edison,EE.UU.).

Tras la centrifugacin de las bacterias a 6.000 r.p.m. y 4 C du-rante 15 minutos en una centrfuga Beckman J2-HS, la purificacinse llev a cabo con el kit Qiagen Endofree Plasmid Giga. Una vezpurificado, el plsmido fue resuspendido en 1 mL de agua estril. Laconcentracin y pureza del plsmido se determin mediante espec-


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troscopia UV midiendo la absorbancia del DNA plasmdico purifica-do a 310, 280 y 260 nm en un espectrofotmetro UV-visible HewlettPackard 8452 (EE.UU.). El cociente de las absorbancias A260/A280 detodas las muestras fue siempre mayor o igual a 1,8, indicando ungrado de pureza adecuado para el plsmido. La concentracin delplsmido se calcul mediante la ley de Lambert-Beer, segn la cualuna unidad de absorcin a 260 nm equivale a 50 g/mL de DNA dedoble cadena o a 40 g/mL de DNA de cadena sencilla.

Adems, para garantizar la pureza del pDNA, las muestras fueronsometidas a digestin con enzimas de restriccin, comparando losfragmentos obtenidos con los productos de digestin obtenidos de unpCMVLuc patrn. Para ello se tom 1 g de pDNA, 0,5 L de enzimaPst I, 0,5 L de enzima Xho I, 2 L de REact 2 (Invitrogen Life Tech-nologies, Reino Unido) y la cantidad suficiente de agua para alcanzar20 L. Tras mantener la muestra en un bao a 37 C durante 2 horas,se analizaron los productos de la digestin mediante electroforesis engel de agarosa al 0,8% usando TBE como buffer. La fuente electrofo-rtica utilizada fue un Power Pac 300 de Bio Rad (EE.UU.). Las mues-tras se sometieron a un voltaje continuo de 80 mV durante 2 horas. ElDNA se visualiz mediante luz UV en una cmara oscura de aislamien-to Gel doc 2000 (Bio Rad, EE.UU.) tras la intercalacin con bromurode etidio.

2.2. Preparacin de los sistemas PAMAM/DNA

Los complejos se prepararon mediante la mezcla de volmenesiguales de una solucin de pDNA con una solucin del dendrmero(PAMAM G4 o PAMAM G5), ambas preparadas en BHG (Buffer He-pes Glucosado) (HEPES 10 mM, glucosa al 10%, pH 7,4). La mezclase incub a temperatura ambiente durante 15 minutos. La concentra-cin final del DNA en los complejos fue de 5 g /mL.

Las cantidades de dendrmero y DNA fueron calculadas para ob-tener complejos a distintas relaciones de carga (+/) respecto alnmero de grupos amino terminales del polmero frente al nmerode grupos fosfato del DNA. Para cada generacin de dendrmero seobtuvieron complejos con relaciones de carga desde 1/1 hasta 10/1(PAMAM/DNA). Dado que las generaciones del polmero fueron su-


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ministradas por la casa comercial en forma de solucin metanlica,fue necesaria la eliminacin del disolvente mediante rotaevapora-cin (23 mbar, 143 r.p.m.) durante 20 minutos. El film de polmeroobtenido se sec a vaco durante dos horas y posteriormente se hi-drat con BHG.

2.3. Determinacin del tamao y potencial zeta

El tamao y potencial zeta se midieron por difractometra delser en un Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, ReinoUnido). Para ello, se diluyeron 200 L de complejo en 1 mL de aguabidestilada. Las medidas se realizaron por triplicado.

2.4. Microscopia de fuerza atmica (AFM)

Se prepararon complejos con PAMAM G5 a una relacin de carga10/1 en BHG. Tras depositar un pequeo volumen de los complejossobre una superficie de mica, se dejaron secar al aire. Las imgenesfueron tomadas en un Cervantes AFM System (Nanotec Electrni-ca, S. L., Espaa). Se han utilizando cantilevers Nanosensor NCH-W.Las medidas se realizaron en modo dinmico.

2.5. Estudios de condensacin

En una placa de 96 pocillos se aadieron 1,5 g de DNA y 0,17 gde bromuro de etidio por pocillo, es decir, a una relacin molar 10:1(DNA: Bromuro de etidio). A continuacin se aadieron cantidadescrecientes de dendrmero y BHG hasta 300 L de volumen total en lospocillos y se incubaron 10 minutos en la oscuridad. La concentracinde pDNA fue de 5 g/mL. La fluorescencia emitida se determin, trasdos horas de incubacin, mediante un espectrofluormetro Genios(Tecan, Austria) a una longitud de onda de excitacin de 540 nm y unalongitud de onda de emisin de 580 nm. La fluorescencia relativa decada muestra se calcul de la siguiente manera:

( ) ( )0100= r eobs e

F F FF F


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Donde Fobs es la fluorescencia en cada muestra, Fe es la fluores-cencia en ausencia del DNA, y Fo es la fluorescencia del DNA en pre-sencia de bromuro de etidio y en ausencia de polmero.

2.6. Gel de retardo

Se prepararon complejos para cada generacin de PAMAM adistintas relaciones de carga. Se incubaron durante 15 minutos y sesometieron a electroforesis. La cantidad de pDNA por pocillo fue de1 g. Las condiciones de electroforesis fueron las siguientes: agarosaal 1,2% y un voltaje constante de 80 mV durante 2 horas en TBE.

2.7. Ensayo de proteccin frente a DNAsa I

La proteccin del pDNA condensado frente a DNAsa I se evalumediante electroforesis en gel de agarosa. Para ello se incubaronlos complejos y el DNA control en presencia de desoxirribonuclea-sa I (1 U/g DNA) en un bao Grant Instrument (Reino Unido) a37 C durante 30 minutos. A continuacin se interrumpi la diges-tin aadiendo 6 L de EDTA (0,25 M). Para disociar los complejosse aadieron 11,4 L de SDS al 15% y tras 10 minutos de incubacinse adicionaron 25 L de heparina al 7%. Tras una hora de incuba-cin las muestras se sometieron a electroforesis.

Las condiciones de electroforesis fueron las siguientes: agarosa al0,8% y un voltaje constante de 80 mV durante 2 horas en TBE. Lafuente electrofortica utilizada fue un Power Pac 300 (Bio Rad,EE.UU.). El DNA se visualiz mediante luz UV en una cmara oscurade aislamiento Gel doc 2000 (Bio Rad, EE.UU.) tras la intercalacincon bromuro de etidio. El DNA extrado de los complejos se comparcon un pDNA control y con una muestra de pDNA desnudo en lasmismas condiciones de digestin con nucleasas.

2.8. Estudios de transfeccin in vitro en cultivos celulares

Para los estudios de transfeccin se utilizaron las lneas celularesHepG2 (clulas de hepatocarcinoma humano) y CT26 (clulas de cn-


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cer de colon de ratn). Se platearon 3 105 clulas por pocillo enDME-10 sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Ja-pn). Cuando el grado de confluencia fue del 80% se procedi a latransfeccin. En cada pocillo se aadieron 300 L de FBS completoactivado y 200 L complejo, de forma que la concentracin final deFBS en el pocillo fue del 60%. La cantidad de pDNA por pocillo fuede 1 g. Tras 4 horas de incubacin a 37 C y 5% CO2 en un incuba-dor (Forma Scientific, Inc, CO2 water Jacked incubator 3121, EE.UU.),se retir el medio de transfeccin y se aadi DME-10. Despus de48 horas, las clulas se lavaron con PBS y se lisaron con 100 L debuffer de lisis 1X (RLB, Reporter Lisis Buffer) (Promega, EE.UU.).Posteriormente se sometieron a dos ciclos de congelacin-desconge-lacin a 80%. El contenido de cada pocillo se centrifug a 12.000 gdurante 10 minutos. Se analizaron 20 L del sobrenadante obtenido,midiendo la expresin de luciferasa con el kit Luciferase Assay y lacantidad de protena total mediante el kit Bio-Rad Dc Protein Assay.Los resultados se expresaron en ng de luciferasa por mg de protena.

2.9. Estudios de viabilidad celular

Los estudios de viabilidad celular se llevaron a cabo mediante elensayo Alamar Blue, que permite cuantificar la proliferacin celu-lar. Para ello, se plantearon 3 105 clulas por pocillo en DME-10sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Japn). Lasclulas fueron transfectadas segn el procedimiento del epgrafeanterior. Tras 4 horas de incubacin a 37 C y 5% CO2, se retir elmedio de transfeccin y se aadi DME-10. Despus de 48 horas, seretir el medio de cultivo y se aadi 1 mL de solucin de AlamarBlue al 10% en DME-10. Tras 2 horas de incubacin, se determinla absorbancia a 570 y 600 nm de 200 L de sobrenadante, medianteun lector de placas iEMS READER (Labsystem, Finlandia). El por-centaje de viabilidad de las clulas tratadas con cada uno de loscomplejos, se calcul de acuerdo con la siguiente frmula:

( )( )570 600

570 600

100 = A A clulas tratadas

% viabilidadA A clulas sin tratar


244

RESULTADOS

1. Influencia de la generacin del polmero y de la relacin1. de carga PAMAM/DNA sobre el tamao de partcula

El tamao de partcula se analiz mediante difractometra delser. Se prepararon formulaciones con las generaciones 4 y 5 deldendrmero PAMAM a distintas relaciones de carga, como se indicen el apartado de Material y Mtodos.

En la Tabla 1 se observa cmo la generacin del polmero influyeen el tamao de los complejos, siendo los complejos preparados conla generacin 4 de mayor tamao respecto a aquellos preparadoscon la generacin 5. Esto se observa en todas las relaciones de carga,a excepcin de la relacin 1/1 (electroneutralidad), que presentatamaos de partcula no homogneos y superiores al resto.

TABLA 1. Tamao de los complejos en funcin de la generacin del dendrmeroy de la relacin de carga polmero/DNA

Tamao de partcula (nm)

Relacin de cargas(+/) Complejos G4-DNA Complejos G5-DNA

1/1 471 85 585 260

2/1 150 37 113 11

4/1 173 16 110 15

6/1 160 16 108 3

8/1 154 23 100 25

10/1 153 24 102 10

En cuanto a la influencia de la relacin de carga (cargas positivasdel polmero frente a negativas del DNA) en el tamao de partcula,no se observan diferencias significativas en los tamaos de los com-plejos preparados con la generacin 4 o con la generacin 5. LaTabla 1 muestra cmo los complejos con relacin de carga 2/1 ysuperiores poseen una alta homogeneidad en el tamao de partculacon desviaciones estndar muy pequeas.


245

2. Influencia de la generacin del polmero y la relacin2. de carga PAMAM/DNA sobre el potencial zeta

Para estudiar la influencia de la generacin del polmero y de larelacin de carga sobre la carga superficial de las partculas (poten-cial zeta), se prepararon complejos con las generaciones 4 y 5 del den-drmero PAMAM a distintas relaciones de carga.

Como indica la Tabla 2, los complejos preparados con la genera-cin 5 del polmero presentan un potencial zeta ligeramente superioral de los complejos formulados con la generacin 4.

TABLA 2. Potencial zeta de los complejos en funcin de la generacindel dendrmero y de la relacin de carga polmero/DNA

Potencial Zeta (mV)

Relacin de cargas(+/) Complejos G4-DNA Complejos G5-DNA

1/1 5 5 9 3

2/1 8 1 6 2

4/1 9 5 11 6

6/1 11 3 15 5

8/1 11 2 14 4

10/1 11 3 18 5

Respecto a la influencia de la relacin de carga, observamos quea una relacin 1/1, el potencial zeta tiene un valor negativo, aunquemuy cercano a la neutralidad. A partir de la relacin 2/1, los valoresson positivos en todos los casos. En los complejos preparados con lageneracin 4, el potencial zeta aumenta ligeramente con la relacinde carga, hasta alcanzar una meseta a partir de 6/1 donde los valoresse mantienen alrededor de 11 mV. Sin embargo, en aquellos prepa-rados con la generacin 5, el potencial zeta tiende a aumentar lige-ramente con la relacin de carga hasta alcanzar un valor de 18 mVen la relacin 10/1.


246

3. Microscopa de Fuerza Atmica (AFM)

La Figura 1 muestra la imagen obtenida por AFM de los comple-jos preparados con PAMAM G5 a una relacin de carga 10/1. Seobservan que los complejos son compactos y con una morfologaredondeada. No se detectaron moleculas libres de DNA, lo que deter-mina que la mayora del plsmido est condensado.

FIGURA 1. Imgenes AFM (4,3 m 4,3 m) de los complejos G5/DNAa una relacin de carga 10/1.

4. Ensayo de condensacin

Para estudiar el proceso de condensacin del DNA en los comple-jos, se evalu la capacidad de las generaciones G4 y G5 para despla-zar a un agente intercalante, el bromuro de etidio, en su unin conel DNA.

Como se observa en la Figura 2, la curva de condensacin deambas generaciones es similar. A medida que se aaden cantidadescrecientes de dendrmero, la fluorescencia relativa debida a la unindel DNA con el bromuro de etidio va disminuyendo, hasta alcanzarel grado mximo de condensacin a una relacin de carga de 4/1para PAMAM G4 y de 2/1 para PAMAM G5.


247

FIGURA 2. Estudio de condensacin de los complejos.

5. Caracterizacin de la unin PAMAM-DNA en los complejos

Para demostrar la unin del dendrmero PAMAM al DNA se rea-liz un gel de retardo. Los resultados obtenidos se observan en laFigura 3.

FIGURA 3. Gel de retardo para los distintos complejos preparados.

El gel de retardo es el resultado de los efectos electrostticos yestricos debidos a la formacin del complejo cargado entre el den-


248

drmero catinico y el DNA. En la primera columna del gel aparecenlas bandas del DNA control correspondientes tanto al DNA circularabierto como al superenrollado. Las siguientes columnas correspon-den al DNA acomplejado a distintas relaciones de carga con las gene-raciones 4 y 5 del dendrmero. Ambas generaciones son capaces deretener e inmovilizar el pDNA en el gel. La retencin total del plsmi-do se produce en todas las relaciones de carga, desde 1/1 hasta 10/1.

6. Proteccin del pDNA frente a la degradacin enzimtica6. por DNAsas

Para estudiar la proteccin del pDNA al ser condensado en loscomplejos, stos se incubaron a 37 C en presencia de la enzimaDNAsa I y se analiz el pDNA una vez realizada la desacomplejacin.Los resultados aparecen en la Figura 4.

FIGURA 4. Estudio de proteccin frente a DNAsas de los distintos complejospreparados.

En el gel se observa cmo el pDNA control (columna 1) apareceintacto, presentando las dos bandas correspondientes al DNA supe-renrollado y al abierto circular; por el contrario, el pDNA desnudoincubado en presencia de DNAsas (columna 2) aparece totalmentedegradado tras 30 minutos de incubacin. En el resto de las colum-


249

nas, correspondientes al pDNA obtenido tras la ruptura de los com-plejos preparados con PAMAM G4 (columnas 3-8) y PAMAM G5 (co-lumnas 9-14) incubados 30 minutos en presencia de DNAsa, el pDNAest totalmente protegido independientemente de la relacin de car-ga o de la generacin.

7. Evaluacin in vitro en cultivos celulares

Para la evaluacin in vitro de las formulaciones galnicas se rea-lizaron estudios de eficacia de transfeccin y de toxicidad en laslneas celulares HepG2 (clulas de hepatocarcinoma humano) y CT26(clulas de cncer de colon de ratn).

7.1. Eficacia de transfeccin

Los resultados de la eficacia de transfeccin in vitro aparecen re-cogidos en la Figura 5. Las clulas fueron transfectadas con los com-plejos preparados con las generaciones 4 y 5 del polmero a distintasrelaciones de carga. Tambin se transfectaron con DNA desnudo (con-trol) para poder evaluar las diferencias en la expresin gnica entre elDNA libre y el condensado. Se observ que el DNA desnudo presenta-ba una eficacia de transfeccin prcticamente nula.

Los complejos PAMAM G5/DNA presentan eficacias de transfec-cin 5 y 30 veces superiores a los formulados con PAMAM G4 enHepG2 y CT26, respectivamente. Adems, si analizamos los valores detransfeccin dentro de una misma generacin, observamos que enambos casos la expresin de luciferasa aumenta con la relacin decarga hasta alcanzar su mximo nivel a 10/1. En este punto mximo,los complejos preparados con las generaciones 4 y 5 presentan unaeficacia de transfeccin 50 y 250 veces superior respecto al DNA solo,respectivamente en la lnea celular HepG2 (Figura 5A). En las clu-las CT26, el incremento respecto al control fue 7 y 225 veces mayorpara los complejos de PAMAM G4 y G5, respectivamente (Figura 5B).En la Figura 6 se muestran las eficacias de transfeccin de los com-plejos en presencia o ausencia de suero. Los resultados indican quelos valores de expresin en presencia de suero fueron superiores entodos los casos.


250

FIGURA 5. Transfeccin in vitro de las clulas HepG2 (A) y CT26 (B)con los complejos PAMAM/DNA a distintas relaciones de carga en presencia

de un 60% de suero. La cantidad de DNA por pocillo fue de 1 g. Los datosse representan como la media d.s de tres pocillos.

7.2. Estudio de viabilidad celular

Como muestra la Figura 7, la mayora de los complejos presentanviabilidades cercanas al 90% y en ningn caso inferiores al 80%,independiente de la relacin de carga o de la generacin empleada.

ng

luci

fera

sa/m

g pr

ote

nan

g lu

cife

rasa

/mg

prot

ena


251

FIGURA 6. Transfeccin in vitro en HepG2 de los complejos PAMAM/DNAen presencia o ausencia de suero. La cantidad de DNA por pocillo fue de 1 g.

Los resultados se expresan como la media d.s. de tres pocillos.

DISCUSIN

En este trabajo se han preparado y caracterizado nuevas frmulasgalnicas en presencia del polmero PAMAM y el plsmido DNA y seha evaluado su eficacia de transfeccin y su citotoxicidad in vitro.

Muchos de los vectores desarrollados en terapia gnica no viralestn basados en molculas catinicas que se unen al DNA medianteinteraccin electrosttica. Cuando estas molculas son de naturalezapolimrica forman estructuras denominadas poliplejos. En la ac-tualidad, el proceso de unin, transferencia y expresin del materialgentico no ha sido totalmente elucidado. Se piensa que la natura-leza del complejo determina en gran parte la eficacia de transfec-cin, y que la formacin de complejos con el DNA condensado faci-lita la entrada del material gnico en las clulas.

Para caracterizar las formulaciones preparadas en este trabajo,se realizaron medidas de tamao y carga superficial, estudios de re-tardo en gel de agarosa y ensayos de condensacin.

En la determinacin del tamao y potencial zeta de los comple-jos se estudi la influencia de la generacin y de la relacin de carga.La generacin 5 dobla en su nmero de grupos amino terminales ala generacin 4, es decir, posee un mayor nmero de cargas positivas


252

en su superficie, lo que explicara que al aumentar la generacin, loscomplejos disminuyan ligeramente su tamao y aumenten su cargasuperficial (Tablas 1 y 2). Por otro lado, con el incremento en la re-lacin de carga, el exceso de cargas positivas es mayor, haciendo quelas formulaciones tiendan a aumentar su potencial zeta. La relacin1/1 supone un equilibrio de las cargas presentes en el complejo (elec-troneutralidad) que da lugar a tamaos mayores y poco homogneosen comparacin con el resto.

En los ensayos de condensacin se estudi la afinidad entre eldendrmero y el DNA, analizando su capacidad para desplazar al bro-muro de etidio en su unin al plsmido. Como muestra la Figura 2,a partir de la relacin 2/1 y 4/1, respectivamente, para PAMAM G4y G5, no se observan variaciones en la fluorescencia relativa, lo queindica que se ha alcanzado el grado mximo de condensacin del

FIGURA 7. Viabilidad celular. Efecto de los complejos PAMAM/DNA sobre laviabilidad celular en HepG2 (A) y CT26 (B). Los resultados se expresan como

la media d.s. de tres pocillos.

% v

iabi

lidad

% v

iabi

lidad


253

DNA. Podemos afirmar que la generacin G5 tiene una mayor capaci-dad de condensacin (porque la disminucin en la fluorescencia rela-tiva es mayor con respecto a la G4) y una mayor eficacia de conden-sacin (porque se alcanza el mximo grado de condensacin a menorrelacin de carga).

Las imgenes obtenidas por AFM muestran complejos compactosy de tamao similar al obtenido por difractometra de lser. Ademsconfirman los estudios de condensacin, ya que no se observan mo-lculas libres de DNA (Figura 1).

Para analizar la formacin y estabilidad de estas formulacionesPAMAM/DNA, se llev a cabo un gel de retardo (Figura 3). Se evalula capacidad del dendrmero para retener el DNA mediante electro-foresis en gel de agarosa. Los dos pesos moleculares del polmeroson capaces de provocar la retencin total del plsmido en todas lasrelaciones de carga preparadas. Este retardo en la migracin no seproduce con generaciones pequeas (G3 e inferiores), pero se haobservado con generaciones superiores (G4-G10). Todo ello sugiereque es necesario un peso molecular y una carga superficial mnimapara que el dendrmero acompleje de manera eficaz el DNA.

El DNA es altamente susceptible de ser degradado por las DNAsaspresentes en el suero. Este hecho hace que muchos de los vectoresempleados en terapia gnica no funcionen in vivo. Por esto se llev acabo un estudio in vitro para analizar si el DNA acomplejado estabaprotegido frente a las DNAsas. Se observ cmo el material gnicopermaneca ntegro independientemente de la relacin de carga pre-parada y la generacin del dendrmero utilizada, mientras que el DNAen ausencia de polmero era totalmente degradado (Figura 4). Ade-ms, los estudios in vitro posteriores (Figuras 5 y 6) confirmaron lacapacidad protectora de los complejos.

La evaluacin in vitro mostr diferencias significativas entre lasdistintas formulaciones. La generacin del polmero y la relacin decarga influyen en la eficacia de transfeccin (Figura 5). Por un lado,la actividad de transfeccin de los complejos formulados con PAMAMG5 es notablemente superior a la de PAMAM G4 en las dos lneascelulares evaluadas. Este aumento en la transfeccin puede ser debi-do a que los complejos formulados con la generacin 5 tienen menortamao y mayor potencial zeta. Un menor tamao favorece el proce-


254

so de internalizacin mediado por endocitosis y un exceso de cargaspositivas favorece la interaccin con las glicoprotenas aninicas y losfosfolpidos de la membrana celular y con ello la internalizacin delcomplejo. Por otro lado, el aumento de la relacin de carga result enun incremento progresivo de la eficacia de transfeccin tanto enHepG2 como en CT26. Un aumento en la relacin de carga supone unexceso de las cargas positivas existentes en el complejo, ya que se vanaadiendo cantidades crecientes de dendrmero catinico, con lo quese favorece la interaccin con la membrana celular, y en consecuen-cia la internalizacin del complejo.

Las dos lneas celulares evaluadas presentan niveles de expresinmuy distintos, obtenindose mejores resultados en las clulas HepG2(Figura 5A). Los bajos niveles de expresin gnica obtenidos en CT26hacen que las diferencias en la eficacia de transfeccin de los distin-tos complejos se aprecien peor en esta lnea celular. Las clulas CT26ofrecen gran dificultad a la hora de ser transfectadas. De hecho, exis-ten muy pocos estudios de transfeccin con clulas CT26, y en la revi-sin bibliogrfica que se realiz para este trabajo no se encontr nin-gn dato de transfeccin con PAMAM G4 y G5 para esta lnea celular.

Cabe asimismo sealar que todas las transfecciones celulares quese han realizado en este trabajo han sido en presencia de 60% desuero (FBS), a diferencia de la mayora de las transfecciones descri-tas en la bibliografa, que se realizan en ausencia o en presencia debajas concentraciones de suero.

La proteccin que ofrecen los complejos PAMAM-DNA frente a ladegradacin por DNAsas contribuye tambin a los valores de efica-cia de transfeccin obtenidos. Es ms, se observa que en presenciade suero la eficacia de transfeccin aumenta con respecto a los ex-perimentos realizados sin suero (Figura 6). Este efecto ya ha sidoobservado en otros vectores desarrollados por nuestro equipo y pue-de ser debido a una mayor estabilidad fsico-qumica de los comple-jos en presencia de suero.

Cabra pensar que las diferencias en la eficacia de transfeccin delos distintos complejos y lneas celulares se pudieran deber a dife-rencias en la toxicidad de los complejos. A determinadas dosis elPAMAM puede llegar a ser citotxico mediante una fuerte interac-cin con la membrana celular y la consecuente ruptura de la misma.


255

En los primeros estudios realizados con dendrmeros similares (15)se obtuvieron bajas eficacias de transfeccin a relaciones de cargasuperiores a 6/1 debido a un incremento de la citotoxicidad. Sinembargo, los estudios de viabilidad realizados en este trabajo de-mostraron una supervivencia celular superior al 80% para todas lasformulaciones y en ambas lneas celulares (Figura 7).

Por ltimo, destacar que el mtodo de preparacin de los comple-jos PAMAM-DNA mediante la simple mezcla de ambos componentes,hace que puedan ser preparados a gran escala y de manera sencilla, loque supone una gran ventaja frente a otros vectores utilizados en te-rapia gnica.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por la Fundacin Universidadde Navarra (FUN) y por el Gobierno de Navarra (Departamento deEducacin).

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