XXIV Congreso Argentino de Histotecnología

"Principales Métodos y Aplicaciones de la MET en Ciencias Biológicas”

Víctor Hugo Casco

MET

Diagrama de flujo resumidomostrando el trabajo a realizarcon diferentes tipos depreparación de muestras paramicroscopía electrónicaconvencional

Para inmuno-EM, las muestrasse pueden teñir antes deembeber (tinción depreinclusión) o las seccionespueden ser teñidas después dela inclusión (tinciónposinclusión)

8/10/2019

2

Estructura de las células reveladas por MET

(A) Citoesqueleto de actina-miosinarevelado en cardiomiocitos cultivadospreparado por fijación químicaconvencional. Barra, 1 µm

(B) organelas citoplasmáticas en unmacrófago de ratón preparado por lafijación química convencional. Barra,700 nm

(C) Membranas de Golgi en una célula3T3 cultivada, preparada porcongelación–sustitución a alta presión.Barra, 200 nm.

(D) Modelo tomográfico tridimensionalde la formación del huso mitótico delevaduras gemantes. Barra, 200 nm

8/10/2019

3

Microscopia Electrónica de Transmisión

Interacción del haz de electrones con la materia

8/10/2019

4

Calor

Haz incidente

Electrones retrodispersados

(Backscattered)

Electrones

secundarios

Electrones

AugerRayos-X

Característicos

Rayos-X

Background catodoluminiscencia

Electrones

absorbidos

Electrones

transmitidos

Electrones

difractados

8/10/2019

5

Microscopia Electrónica de

Transmisión convencional

8/10/2019

6

Protocolo de procesamiento especímenes biológicos para TEM (clásico)

1. Fijación aldehídica: glutaraldehído 1-3% + formaldehído 1-3% + ácido pícrico

1% en buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4, 2-3 hs + Lavado: H2O o buffer

2. Posfijación: OsO4 1%, 2 hs + Lavado: H2O o buffer

3. Tinción en bloque: acetato de uranilo 2% (puede o no hacerse) + Lavado: H2O o buffer

4. Deshidratación: acetona (o etanol) 50%, 5’ acetona (o etanol) 75%, 5’ acetona

(o etanol) 90%, 10’ acetona (o etanol) 100%, 3 x 15’

5. Preinclusión: resina / acetona (o etanol), 1:1: 2 hs

6. Inclusión: en resina pura - 2hs. a Tº ambiente

7. Inclusión: en resina pura toda la noche a 4º C

8. Polimerización 24 hs. a 50-60º C en moldes

9. Seccionamiento y montaje en grilla

10. Tinción: acetato Ur y citrato Pb 8/10/2019

7

“Trimming”

8/10/2019

8

Un bloque epoxi

para MET. La muestrade raspado nasalhumano teñido con

OsO4 escala en mm.

Seccionamiento

Ultramicrótomo manual

Ultramicrótomo automático o semiautomático

Crioultramicrótomo automático o semiautomático

8/10/2019

9

Seccionamiento - Ultramicrotomía…

8/10/2019

10

Seccionamiento

8/10/2019

11

Seccionamiento

• Los grosores requeridos para los estudios de MET van entre 20nm y 150nm.

Existen varias técnicas para preparar muestras tan delgadas.

• Ultramicrotomía

• Grabado iónico,

• Haz iónico enfocado (FIB),

• Pulido de trípode y

• Procesamiento electroquímico

8/10/2019

12

8/10/2019

13 Seccionamiento - Crioultramicrotomía

Ultramicrotomía y crio-ultramicrotomía

8/10/2019

14

Ultramicrotomía para arreglos tomográficos8/10/2019

15

FijaciónProcesamiento

Seccionamiento

Tinción

IF

ME

La configuración para el seccionamiento seriado rápido se puede realizar empleando programas predefinidos por el

usuario.La transferencia de la serie de secciones al registro de la imagen se logra con un pequeño soporte de las secciones quese utiliza en todo el flujo de trabajo.

Ultramicrotomía para arreglos tomográficos

Ganglios linfáticos poplíteos de ratón

reconstruidos por arreglo tomográfico utilizando secciones seriales.

La tomografía de matriz permite el examen preciso de las estructuras celulares y de

proteínas de los ganglios linfáticos, que es fundamental para varios tipos de estudios de inmunología y de cáncer.

8/10/2019

16

Video que muestra el seccionamiento en serie

de los nódulos linfáticos del ratón y la

generación de imágenes en 3D mediante un

arreglo tomográfico. Cortesía: Frank Assen, Ludek

Lovicar, Vanessa Zheden, y Michael Sixt, ISTAustria, Klosterneuburg.

Inmunocitoquímica a nivel de

Microscopia electrónica

8/10/2019

17

Principales modificaciones para IEM

1. Fijación: en general sólo aldehídica y más débil

2. Deshidratación: dependiendo del medio de inclusión pero en general no es completa

3. Inclusión: en general en resinas que admiten > proporción de agua

4. Seccionamiento: más complejo debido a la resina usada.

5. Incubación con el anticuerpo 1rio

6. Incubación con la preparación Proteína – Oro

7. Tinción con Acetato de Uranilo – Citrato de Pb

8. Observación por TEM

8/10/2019

18

Protocolos de inmuno-oro

Preparación del oro coloidal

Verificación de la homogeneidad del coloide

Adsorción de oro coloidal a proteína A, proteína G, Igs u otras proteínas

Verificación del proceso de adsorción

Mantenimiento de los complejos

8/10/2019

19

Reacción de inmunocitoquímica

Localización de biomoléculas por aplicación de antisueros

específicos formando una reacción inmune y/o inmunoide que será

detectada por un segundo antisuero o molécula marcada

Es una técnica de gran especificidad, que permite la localización

real de la/s molécula/s en estudio y el conocimiento de los

mecanismos moleculares y funcionales de las células y tejidos

8/10/2019

20

Material biológico empleado

Fresco y en buenas condiciones de

preservación

Tejidos o células

Tipos de secciones:

Criosecciones (crio - ultramicrotomía):

aproximadamente 100 nm de espesor

Secciones incluidas en resina (ultramicrotomía

clásica): 60-90 nm de espesor8/10/2019

21

Técnicas de Inmunocitoquímica

(TEM)

Técnicas directas e indirectas

Técnicas de pre- y post-inclusión

Técnicas que usan reveladores enzimáticos

Técnicas que usan reveladores electrodensos (oro

coloidal, ferritina)

Técnicas que usan combinación de reveladores

enzimáticos y electrodensos (ej., avidina – biotina –

peroxidasa – oro coloidal)

Técnicas de amplificación con plata

Localización simultánea de dos o más antígenos8/10/2019

22

Hipófisis de rata

Ab. de cobayo anti – PRL

proteína A – oro 16 nm

Ab. de conejo anti ACTH

IgG – anti conejo PAP

8/10/2019

23

Localización simultánea de tres receptores de membrana en hepatocitos de rata

12 nm 26 nm

5 nm

50.000XHorisberger8/10/2019

24

12 nm

Técnicas basadas en Oro Coloidal

8/10/2019

25

Estructura del oro coloidal

La composición de las partículas determinó que consisten de un core

de oro elemental rodeado por una doble lámina de cargas iónicas

negativas.

La estabilidad del coloide se ve así comprometida por la presencia de

electrolitos:

Cloruros > Bromuros > Ioduros

Su utilización en BM&C se dio a partir del paper de Frens (1973).

8/10/2019

26

AuCl2- AuCl2

-

H+

H+

Representación diagramática de la

composición oro coloidal

H+H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+H+H+H+H+

H+H+

H+

H+

AuCl2-

AuCl2-AuCl2

-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-AuCl2

-AuCl2

-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

Au

H+H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+H+H+H+H+

H+H+

H+

H+

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-AuCl2

-AuCl2

-AuCl2

-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

Au

8/10/2019

27

Weiser, 1933

AuCl2-

AuCl2-

AuCl2-

Puede emplearse en técnicas de

Inmunohistoquímica a nivel de MET debido a:

Su alto número atómico (alta electrodensidad)

Su estabilización por proteínas y macromoléculas

(unión a Fc de anticuerpos, proteína A, proteína G,

lectinas, etc.)

Oro coloidal como sonda

microscópica

8/10/2019

28

Partículas de oro coloidal cubiertas con la proteína nuclear: nucleoplasmina que

se acumula en las fibrillas en la superficie citoplasmática de complejos nucleares

a 4° C, demostrando dos etapas de la importación nuclear8/10/2019

29

Desarrollo de la metodología

La marcación del ligando con el coloide

aparentemente no provoca cambios químicos enel ligando

Sin embargo, hay varios obstáculos que impiden suuso rutinario en biología celular

Variación del tamaño,

Limitada comprensión sobre el mecanismo deadsorción de proteínas,

Efectos sobre la actividad biológica de losligandos luego de marcación, etc.

8/10/2019

30

Síntesis del coloide

Las técnicas de reducción del ácido tetra-cloroáurico (HAuCl4) más comunes son:

Fósforo blanco (Faulk and Taylor, 1971): 5,2 nm

Ascorbato de sodio (Stathis and Fabrikanas, 1958): 13

nm

Citrato trisódico (Frens, 1973): 14-150 nm

8/10/2019

31

Diferentes tamaños de oro coloidal

Método de Tiocianato: 3,2 nm CV: 20%

Método de Citrato / ácido tánico: 3,7 nm CV: 11% - 0,01 ml AT

Método de Citrato / ácido tánico: 16 nm CV: 11% - 5 ml AT

Método de Borohidruro de Na: 5,2 nm CV: 8%.

8/10/2019

32

Complejos proteína A – oro y proteína

G - oro

Partícula de oro

Proteína A

Inmunoglobulina

Antígeno

Sección de

tejido

Proteína G

Partícula de oro

8/10/2019

33

Inmunomarcación

Tanto la proteína A–oro como la proteína G–oro son técnicas

de inmunocitoquímica indirectasde dos pasos

1ro Los antígenos presentes en la superficie del tejido sonexpuestos a un anticuerpo específico para formar uncomplejo antígeno-anticuerpo

Los anticuerpos deben ser de la clase IgG, más que de la IgMe IgA

2do las secciones de tejido son expuestas a complejosproteína A – oro (o proteína G – oro) para que estasinteraccionen con las inmunoglobulinas

8/10/2019

34

Inmunomarcación

1. Las secciones montadas sobre grillas de níquel se incuban porflotación la sección con la cara hacia abajo en una gota de PBSconteniendo ovoalbúmina 1% por 5 min a temperatura ambiente

2. Las grillas son luego transferidas (sin agitación) a una gota delanticuerpo diluido. La incubación con el anticuerpo puederealizarse a temperatura ambiente 4º C o 37º C

3. Después de la incubación con el anticuerpo, las grillas sonlavadas con PBS para remover moléculas de anticuerpo nounidas

8/10/2019

35

4. Las grillas son luego transferidas a una gota dePBS con ovoalbúmina por 5 min

5. Al final de la incubación las grillas sonprofusamente lavadas con PBS para remover loscomplejos de oro no unidos

6. Posteriormente las grillas se lavan con aguadestilada y se secan

7. Las secciones pueden ser teñidas de acuerdo aprocedimientos usuales con acetato de uranilo ycitrato de plomo

Inmunomarcación

8/10/2019

36

ANP marcado con proteína A - Oro

Coloidal

Bufo arenarum (atrium)

8/10/2019

37

ANP marcado conProteína A- Oro Coloidal

aurícula de rata

8/10/2019

38

Controles de inmunocitoquímica

8/10/2019

39

Controles de inmunocitoquímica

1. Incubación directa con los complejos proteína A (o G) – oro omitiendo el

paso del anticuerpo primario

2. incubación con la solución de anticuerpo previamente adsorbido con un

exceso de su antígeno correspondiente, seguido del complejo proteína A

(o G) – oro

3. Incubación con el anticuerpo, seguidas por proteína A (o G) no marcadas

(0,22 mg/ml) por 30 min a temperatura ambiente y luego con los complejos

proteína A (o G) – oro a temperatura ambiente

4. Incubación con anticuerpos específicos seguidos de los complejos proteína

A (o G) – oro previamente preincubados con exceso de IgGs de otra

especie8/10/2019

40

Localización de Inmunoglobulinas G en células plasmáticas de la lámina propia del duodeno

Omisión del Ab. Específico (Proteína G – oro) Omisión del Ab. Específico (Proteína A – oro)

Rabbit anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Rabbit anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)

Fuerte Débil

NR NR

8/10/2019

41

Localización de Inmunoglobulinas G encélulas plasmáticas de la lámina propia delduodeno

Goat anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Goat anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)

DébilFuerte

Mouse anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Mouse anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)

Fuerte Débil

8/10/2019

42

Localización

ultraestructural

de amilasa

pancréatica

en páncreas de

rata

8/10/2019

43

Sección tisular incubada

con el anticuerpo anti-amilasa

preadsorbido con el antígeno

seguido del complejo

Proteína A- oro

Incubación del

complejo

Proteína A- oro

directamente

omitiendo el anticuerpo 1rio

CONTROLES

8/10/2019

44

Amplificación

Partícula

de oro

Anti Proteína A

Proteína AIgG

Antígeno

Sección de tejido

8/10/2019

45

Dobles marcaciones en inmunocitoquímica

8/10/2019

46

Doble marcación fases distintas

Fase A

Fase B

8/10/2019

47

Doble marcación en la misma fase con amplificación de uno de los marcadores

8/10/2019

48

Doble marcación usando oro coloidal y técnicas enzimáticas

8/10/2019

49

Oro coloidal y Marcación Radioactiva

OroMarcador radioactivo

8/10/2019

50