Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
ALDOLASAS RECOMBINANTES:ALDOLASAS RECOMBINANTES:DESARROLLO DE BIOCATALIZADORESDESARROLLO DE BIOCATALIZADORES
ESTEREOESPECÍFICOSESTEREOESPECÍFICOS
Josep López SantínDepartament d’Enginyeria Química
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LIASASCATÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE ENLACES C-C
ALDOLASASCATÁLISIS ESTEREOESPECÍFICA DE LA ADICIÓN
DE FRAGMENTOS DE 1,2 o 3 CARBONOSA UN ALDEHIDO VIA ADICIÓN ALDÓLICA
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REACCIONES CATALIZADAS POR ALDOLASAS
OHR5 C* C
OR4
R3
H
R1 CO
R2
+ R2 C* C
OR4
R3
R1
C*
R5
OH
* Ataque del C en α desprotonado de un aldehido o cetona alC carbonílico de otro aldehido o cetona
Especificidad por el substrato. Estereoquímica definida.*
* Degradación o transformación de azúcares, amino ácidos ycompuestos aromáticos
* Producción de azúcares no usuales para la industria farmacéuticao alimentaria y ciertos amino ácidos
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ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
HO OPO32 -
O
HR
O
- R
O
OPO32 -
OH
OH
+Aldolasa
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ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
PO OH
O
PO
O
R1
OH
H R1
O
OH
PO
O
R1
OH
OH
PO
O
R1
OH
OH
PO
O
R1
OH
OH
+
FruA
L-treo
D-eritroD-treo
L-eritro
RhuA
FucA3
4
3
3
34
4
4
TagA
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2-Desoxirribosa-5-fosfato aldolasa (DERA).
Cataliza la condensación aldólica reversible entre el acetaldehído y el D-gliceraldehído 3-fosfato para dar la 2-desoxirribosa-5-fosfato (Figura 2). Es la única aldolasa conocida que condensa dos aldehídos para dar β-hidroxialdehídos de configuración eritro.
H R1
O
H
O
H R1
OR2
OH
R2
+DERA
2 3
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ALDOLASAS DEPENDIENTES DE GLICINA.
Son aldolasas dependientes de piridoxal-5-fosfato y catalizan la condensación aldólica de la glicina con diferentes aldehídos aceptores para generar los correspondientes β-hidroxi-α-aminoácidos con dos nuevos centros estereogénicos (carbonos α y β).
-O2C H
H2N H
H CH3
O
+-O2C
CH3
NH2
OH
TA
-O2C H
H2N H
H H
O
+-O2C
OH
NH2
SHMT
αβ
αβ
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ALDOLASAS DEPENDIENTES DE PIRUVATO O FOSFOENOL PIRUVATO.
Catalizan la condensación aldólica entre el piruvato o fosfoenolpiruvato y diferentes aldehídos para dar lugar a los correspondientes productos con un nuevo centro estereogénico.
-O2C CH3 +
O
H R1
O-O2C R1
O OH
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Proyecto PPQ2002-04625
Dep. Ingeniería Química
Obtención y utilización de un conjunto de biocatalizadores para la síntesis asimétrica de intermedios quirales de
cara a la preparación de productos de alto valor añadido
Institut d’Investigacions Químiquesi Ambientals de Barcelona
Dep. Química y Bioquímicade péptidos y proteínas
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
Proyecto PPQ2002-04625
Desarrollo de procesos
Aldolasas recombinantes no comerciales
- Aldolasas dependientes de DHAP- DERA - Treonina aldolasas
Expresiónen E.coli
Operaciónbioreactor
Purificación
Inmovilización
Síntesisselectivas
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Proyecto PPQ2002-04625
Desarrollo de procesos
Intermedios quirales tipo polioles y aminopolioles
Medios dereacción
- Síntesis específicas catalizadaspor aldolasas recombinantes
Síntesis de iminoazúcaresa partir de aminoaldehidos
Obtención productosalto valor añadido
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ASPECTOS GENERALES EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN E. coli
g biomasa/LMáxima concentración UA/LMáxima productividad UA/L h UA / g biomasa
* SISTEMA DE EXPRESIÓNEfecto sobre el crecimientoExpresión solubleEstabilidad plasmídica
* PROCESOMedio de cultivo Bioreactor / Modo de operaciónEstrategia de inducción
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PRODUCCIÓN DE FucA
Fuculosa-1-fosfato aldolasa (FucA)Especificidad: dioles 3R,4R. Tipo II (Zn2+)
CLONAJE Y SOBREEXPRESIÓN
Microorganismo: E. Coli XL1 Blue
Vector de expresión: pTrcHis
Expresión: proteína de fusión con una cola de hexahistidina en el extremo N-terminal.
Inducción: IPTG
Dr. Eduardo García-Junceda. Instituto de Química Orgánica CSIC
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Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
OD
600
nm
0,1
1
10
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Spec
ific
activ
ity A
U/g
DC
W induction
µmax= 0.55 h-1
MSC
Time (h)
0 5 10 15 20 25 30 350
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
OD
600
nm
0,1
1
10
induction
MD
µmax= 0.36 h-1
Spec
ific
activ
ity A
U/g
DC
W
Spec
ific
activ
ity A
U/g
DC
W
Time (h)
0 5 10 15 20 25 30 35
OD
600
nm
0,1
1
10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
induction
MD+EDTA
µmax= 0.37 h-1
Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
OD
600
nm
0,1
1
10
Spec
ific
activ
ity A
U/g
DC
W
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
induction
µmax= 0.6 h-1
LB
Efecto del medio de cultivo
PRODUCCIÓN DE FucA
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PRODUCCIÓN DE FucA
IPTG concentration (µΜ)
0 100 200 300 400 500
Spe
cific
act
ivity
(AU
/g D
CW
)
050
100150200250300350400450500550600650700750800
MD medium + EDTA
MD mediumLB medium
MSC medium
Medio definidoInductor: 40 µ mol IPTG / g DCWActividad FucA: 700 UA/ g DCW
Efecto de la concentración de inductor
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CRECIMIENTO DISCONTINUO ALIMENTADO (FED BATCH)
SIN CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN:Adición constanteAdición creciente (gradual, por escalones o lineal)Adición exponencial ( µ constante)
CON CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN:METODOS INDIRECTOS:
DO-statpH- statVelocidad de producción de dióxido de carbono (CER)Concentración biomasa
METODOS DIRECTOS:Concentración de substrato
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PRODUCCIÓN DE FucACRECIMIENTOS EN FED BATCH
FERMENTADOR : Braun Biostat B 1.5 L de volumen O2 disuelto 50% conc. saturación
MEDIO DE CULTIVO : Medio definido MD
OPERACIÓN : Fed-batch a µ constante = 0.1 h-1
Limitación por la fuente de C
ALIMENTO : Fuente de C (Glucosa) + microelementos
EXPRESIÓN : Inducción química. Adición de IPTG
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PERFIL EXPONENCIAL DE ADICIÓN
( )apSXf
setset
YStVX
F/
00 exp⋅
⋅⋅⋅⋅=
µµBalances de materiaSistema discontinuo alimentado
YX/Sap Rendimiento aparente biomasa substrato (g biomasa/g substrato)
( )( )1exp/
000 −⋅⋅
⋅⋅
=−=∆ tYS
VXVVV set
apSXf
µAdiciones discretas
Programa en Visual BasicControl adición alimento
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Alim.
Perfil exponencialde adición
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Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
0 10 20 30
O.D
. 600
nm
0
50
100
150
200
250
Glu
cose
(g.d
m-3
)
0
5
10
15
20
25
Tota
l bio
mas
s (g
DC
W)
0,1
1
10
100
Batch Fed-batch
(a)
phosphateaddition
(b)
Time (h)
0 10 20 30
Acet
ate
(g.d
m-3
)
0
2
4
6
8
10
Amm
oniu
m (g
.dm
-3)
0
1
2
3
4
5
(b)
45 g peso seco/LBiomasa total 53 g PS
µ = 0.1 h-1
Crecimiento fed batch. YX/S ap= 0.3µset =0.1 h-1
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0 10 20 30 40
D.O
. 600
nm
0
50
100
150
200
250
Biom
asa
tota
l (X*
V; g
PS)
0,1
1
10
100G
luco
sa (g
/l)
0
5
10
15
20
25
30
35
Etapa Discontínua Etapa Semicontínua
Indu
cció
n
addición fosfatos
Inducción inicio
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
0 10 20 30 40 50 60
D.O
. 600
nm
0
50
100
150
200
250
Biom
asa
tota
l (X*
V; g
PS)
0,1
1
10
100G
luco
sa (g
/ l )
0
5
10
15
20
25
30
35
Etapa Discontínua Etapa Semicontínua
Indu
cció
n
addición fosfatos
Inducción final
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
20 30 40 50
Tota
l Bio
mas
s (X
*V) (
g D
CW
)
0
10
20
30
40
50
60
70
Tota
l act
ivity
(AU
)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Fed-
batc
h
Indu
ctio
n
(a)
Time (h)
20 30 40 50Fu
c-1-
PA S
peci
fic A
ctiv
ity (
AU
· g
DC
W-1
)0
200
400
600
800
Fuc-
1-PA
con
cent
ratio
n (A
U.d
m-3
)
0
10000
20000
30000
40000
50000
(b)
Indu
ctio
n
Fed-
batc
h
15 20 25 30 35 40
Tota
l Bio
mas
s (X
*V) (
g D
CW
)
0
10
20
30
40
Tota
l act
ivity
(AU
)
0
10000
20000
30000
40000
50000
Fed-
batc
h
Indu
ctio
n
(a)
Time (h)
15 20 25 30 35 400
200
400
600
800
1000
1200
Fuc-
1-PA
con
cent
ratio
n (A
U.d
m-3
)
0
10000
20000
30000
40000
50000
Fed-
batc
h
Indu
ctio
n
(b)
Inducción finalInducción inicio
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
(a)
0 10 20 30 40
Tota
l bio
mas
s (g
DC
W)
0,1
1
10
100G
luco
se (g
.dm
-3)
0
5
10
15
20
25
D.O
. 600
nm
0
50
100
150
200
250
Fed-batch
Indu
ctio
n
phosphate addition
Batch
Inducción óptima
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
Time (h)
10 15 20 25 30 35 40 45
Fuc-
1-PA
spe
cific
act
ivity
(AU
· g
DC
W-1
)
0
200
400
600
800
1000
1200
Fuc-
1-PA
con
cent
ratio
n (A
U.d
m-3
)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Fed-
batc
h
Indu
ctio
n
(b)
10 15 20 25 30 35 40 45
Tota
l Bio
mas
s (X
*V) (
g D
CW
)
0
10
20
30
40
50
60
Tota
l act
ivity
(AU
)
0
20x103
40x103
60x103
80x103
Fed-
batc
h
Indu
ctio
n(a)
Fuc-1-PA
1100 UA g-1
Discontinuo 700 UA g-1
Productividad 1200 UA L-1 h-1
47000 UA L-1
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PRODUCCIÓN DE RhuA
Ramnulosa-1-fosfato aldolasa (Rham-1PA)Especificidad: dioles 3S,4R. Tipo II (Zn2+)
CLONAJE Y SOBREEXPRESIÓN
Microorganismo: E.. Coli M15
Vector de expresión: pQE-40 promotor T5
Expresión: proteína de fusión con una cola de hexahistidina en el extremo N-terminal.
Inducción: IPTG
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Bam HI Hind III
Ptrc
lacIq ampr
Col E1
pTrcrham
6xHis DHFR MCS
Bam HI Hind III
PT5
ampr
Col E1
pQE-404.0 Kb
0.82 Kb rhaDDNA fragment
PT5
ampr
Col E1
pQErham
6xHis rhaD
Bam HI Hind III
Ptrc
lacIq ampr
Col E1
pTrcrham
Bam HI Hind III
Ptrc
lacIq ampr
Col E1
pTrcrham
6xHis DHFR MCS
Bam HI Hind III
PT5
ampr
Col E1
pQE-404.0 Kb
6xHis DHFR MCS6xHis DHFR MCS
Bam HI Hind III
PT5
ampr
Col E1
pQE-404.0 Kb
0.82 Kb rhaDDNA fragment
PT5
ampr
Col E1
pQErham
6xHis rhaDPT5
ampr
Col E1
pQErham
6xHis rhaD
TransformaciónE.coli M15 [pREP-4]
Gen rhaD del vector pTrcrham subclonado en el plásmido pQE-40bajo el control transcripcional del promotor T5
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PRODUCCIÓN DE RhuA
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Biom
ass
(DO
600n
m l)
0
50
100
150
200
250
300
350
Amm
oniu
m, A
ceta
te (
g l-1
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Glu
cose
(g l-1
); Ph
osph
ate
(g l-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40Batch Fed-batch
Phosphate addition
µ= 0.36 h-1
95 g PS/L
Crecimiento fed batch. YX/S ap= 0.3µset =0.3 h-1
. ( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1).
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µγS
SX
SX mY
+=
/
/ 11
γx/s - Rendimiento intrínseco biomasa-substratomS - Coeficiente de mantenimiento
(Yx/s)set µset (h-1) µexp (h-1) (Yx/s)expX
(g DCW l-1) Time (h)
0.3 0.1 0.09 0.31 30.9 23.5
0.3 0.1 0.09 0.30 43.44 25.0
0.3 0.1 0.09 0.30 95.4 33.3
0.3 0.2 0.23 0.39 91.6 19.7
0.3 0.3 0.36 0.41 95.1 15.4
γx/s = 0.48 g g-1
mS = 0.10 g g-1h-1
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Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Bio
mas
s (D
O60
0nm
l)
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
Amm
oniu
m, A
ceta
te (g
l-1)
0,5
1,5
2,5
3,5
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
Glu
cose
(g l-1
); Ph
osph
ate
(g l-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40Batch Fed-batch(µ = 0.3 h-1)
Phosphateaddition
Zn2+addition(10 mg)
Phosphateaddition
+ IPTG
µset =0.3 h-1
. ( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1).
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4 1 6 1 8
Amm
oniu
m, A
ceta
te (g
l-1)
0 ,5
1 ,5
2 ,5
3 ,5
0 ,0
1 ,0
2 ,0
3 ,0
4 ,0
Glu
cose
(g l-1
); P
hosp
hate
(g l-1
)
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
d d i t io nm g )
P h o s p h a t ea d d i t io n
+ IP T G
Time after induction (h)
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Spe
cific
Act
ivity
(AU
g-1
DC
W)
0
100
200
300
400
500
600
700
( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1); ( ) RhuA actividad específica (AU g-1)
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IPTG (µmol l-1)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Spe
cific
Rhu
A a
ctiv
ity (A
U g
-1 D
CW
)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
C. discontinuos en Erlenmeyer ( ) y bioreactor ( )
C. discontinuos alimentados (▲)
Efecto de la concentración de IPTG
Specific activity(AU g-1 DCW)
Concentration (AU l-1)
Productivity(AU l-1h-1)Operation mode
Batch 1250 2292 255
Fed-batch 850 61436 3413
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FermentadorV = 2 L
Centrifugación Biomasa
Sobrenadante
Pellets
Cromatografíade afinidad
PURIFICACIÓN DE ALDOLASAS
Disrupción celular
Centrifugación
Incubación
Zn2+
Precipitación
(NH4)2 SO4
Aldolasa
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Volum eluït (ml)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Abs
orbà
ncia
280
nm
0
1
2
3
4f 1 f 3f 2
a bc d
FucA
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
PURIFICACIÓN DE FucA
1 2 3 4 5
KDa
31.0
21.5
14.4
40.0
55.0
66.2
FucA
4.- Fracciones no retenidas en columna de afinidad 5.- Elución de las proteínas retenidas
1.- Marcadores 2.- Biomasa lisada3.- Sobrenadante lisado
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
FermentadorV = 2 L
Centrifugación Biomasa
Sobrenadante
Pellets
Cromatografíade afinidad
PURIFICACIÓN DE ALDOLASAS
Disrupción celular
Centrifugación
Incubación
Zn2+
Precipitación
(NH4)2 SO4
AldolasaRendimiento global FucA/RhuA: 65-70%Rendimiento global DERA: 80-85%
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SÍNTESIS DE IMINOAZÚCARES A PARTIR DE AMINOALDEHIDOSCATALIZADAS POR ALDOLASAS
HN
H
R1n
O
Cbz
HN
n
HO OH
OHa) DHAP, Aldolase
b) H+, PaseH2, Pd/Cc)
Metodologías quimoenzimáticas a partir de α,β-aminoácidos y aminoalcoholes
Variedad de estructuras, funcionalidades y configuraciones
Poco solubles en aguaReactividad bajaMalos aceptores en agua o mezclas H2O/ DMF
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
EMULSIONES AGUA EN ACEITE ALTAMENTE CONCENTRADAS(EMULSIONES GEL)
Dispersiones líquido-líquido. Fracción volumétrica fase interna > 0.74
Hidrocarburo alifático6 % peso
Agua90 % peso
Surfactante4 % peso -Solubilización de compuestos
hidrofóbicos y hidrofílicos
- Gran área interfacial
- Alto contenido en agua (90-98%)Baja concentración de tensioactivo(máximo 4% en peso)
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EMULSIONES AGUA EN ACEITE ALTAMENTE CONCENTRADAS(EMULSIONES GEL)
Cinética, Rendimiento
Tensión interfacial γo/wCoeficiente de reparto
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3
8 10 12 14 16
Part
ition
coe
ffici
ent O
/W
Aliphatic hydroc. chain length
H
O
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3
8 10 12 14 16
Part
ition
coe
ffici
ent O
/W
Aliphatic hydroc. chain length
H
O
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
Inte
rfac
ial t
ensi
on
(mN
/m)
C8 C10 C12 C14 C16
Aliphatic hydrocar. Chain length
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CbzHN O
CbzHN
O
CbzHN
O
CbzHN
O
Emul / DMF 20% Emul / DMF 20% Emul / DMF 20%FruArab (RAMA) RhuA FucA
60 / 20
80 / 25
20 / 9
45 / 5
AldehydeConver%
HN
H
R1n
O
Cbz
HN
R1n
OH
Cbz
O
OH
OPO3-2DHAP
Aldolase
100-120 mM DHAP:180-216 mM aldehyde
50 / 58
87 / 80
64 / 60
69 / 61
35 / 18
60 / 15
37 / 17
55 / 17
42 / 40
58 / 58
62 / 50
45 mM DHAP:72 mM Aldehyde
S
R
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ESTEREOSELECTIVIDAD
RhuA
Expected 3R,4S(S)
(R) OP
O
OH
OH
(R)(R) OP
O
OH
OH
80%60% de
80% de90%
20%
10%
NH
H
O
Cbz
Cbz
HN
H
O
33%34% de
67%
100% de100%Cbz
HN
H
O
Cbz
HN
H
O
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INMOVILIZACIÓN
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+NH3NH3
NH3NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3
NH3+
NH2 NH2NH2
NH2+NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+C H
O
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
C HO
NH3NH3
NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+NH3NH3
NH3NH3+NH3NH3+
NH2NH2 NH2NH2NH2NH2
NH2NH2+
VARIABLES QUE CONTROLAN EL PROCESO DE INMOVILIZACIÓN:- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10
- TEMPERATURA: 20ºC- TIEMPO: 15 min
VARIABLES QUE CONTROLAN EL PROCESO DE INMOVILIZACIÓN:- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10
- TEMPERATURA: 20ºC- TIEMPO: 15 min
- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10
- TEMPERATURA: 20ºC- TIEMPO: 15 min
DERIVADO INMOVILIZADO DE FUCULOSA 1 FOSFATO ALDOLASA 65 Unidades de Actividad/mL agarosa
43%actividad respecto al total inmovilizado
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REACCIONES DE SÍNTESIS CON FucA INMOVILIZADA
t (h)
0 5 10 15 20 25
Con
vers
ión
(%)
0
10
20
30
40
50
60
Propanal S-Alaninal R-Alaninal
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
Dr. Gregorio Álvaro
Dra. Dolors Benaiges Dra. Olga DuranyDra. Glòria Caminal Jaume Pinsach
Dr. Carles de Mas Trinitat Suau
Luis VidalDr. Pau Ferrer
Lorena FerrerDra. Glòria González
Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio
Dr. Jordi BujonsDr. Pere Clapés
Dra. Conxita SolansDr. Antonio Delgado
Jordi CalverasDr. Jesús Joglar
Dra. Laia Espelt