ESI-MS
MALDI-MS
Espectrometría de masasInstrumentación y aplicaciones
Clase 01
Espectrometría de Masa (MS: Mass spectrometry)
la relación masa(m):carga (z); m/z
Espectroscopía o Espectrometría??
Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra
Analogía entre un
espectrómetro de
masa y un prisma
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry)
la relación masa(m):carga (z); m/z
Espectroscopia o Espectrometria??
Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra
M M+
Energía
muestra ionizaciónfragmentación
separación m/z
Espectro de
Masa
f1+
f2+
f3+
f4+
M+
f4+
f3+
f2+
f1+
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
• Espectro de MASA de una molécula,
% de abundancia relativa vs. relación MASA/CARGA
Espectro de Masa de metanol
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
• Identificación de compuestos desconocidos (masa del compuesto o de
sus fragementos)
biomoléculas grandes, presición de 0.01% (40.000 Da error de
4Da)
moléculas pequeñas, presición de 5 ppm o menores (suficiente
para confirmar la masa molecular de un compuesto)
• determinar la composición isotopica de un elemento en una muestra
• determinar la estructura de un compuesto (patrón de fragmentación)
• “cuantificación” de un compuesto en una mezcla (diseño de método, MS
no e stécnica cuantitativa)
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Información
• Industrial o Académica (para procesos de rutina o de investigación)
• Campos de aplicación:
Bioquímica-Biotecnología: análisis de proteínas, peptidos, oligonucléotidos
Química farmacéutica: descubrimiento de drogas, química combinatoria,
farmacocinética, metabolismo de drogas
Bioquímica clínica: test de drogas
Analisis Ambientales: calidad de agua, contaminación de alimentos
Geología: composición de hidrocarburos
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Aplicaciones
1897 J.J. Thomson, primer medida m/q de partículas elementales “corpúsculos”
1918-1919 A. Dempster & F. Aston, primer espectrógrafo de masa
1951 W. Pauli & H. Steinwedel, espectrómetro de masa de cuadrupolo
1959 K. Biemann, MS electroionización aplicada a péptidos
1968-1970 M. Dole, polimeros naturales y sintéticos en fase gaseosa a presión atmosférica
1974 D. Torgerson, plasma desorption MS (fisión de 252Cf)
1974 B. Mamyrin, contribución al desarrollo de TOF MS
1978 N. Commisarow & A. Marshall, adaptación de métodos de transformadas de Fourier a
ICRS, ion cyclotron resonance spectrometry
1981 M. Barber, FAB; fast atom bombardment, masa de Met-Lys-bradykinin M=1318
1984 R. Willoughby & M. Aleksandrov (trabajos independientes) proponen acoplar LC a MS
1988 J. Fenn & M. Yamashita (trabajos independientes) macromoléculas biológicas en fase
gaseosa a presión atmosférica, ESI, electrospray ionization. M. Karas & F. Hillencamp y K.
Tanaka (trabajos independientes) desrrollan MALDI, matrix –assisted laser desorption-
ionization. 2002, K. Tanaka recibe premio Nobel.
1992-1999 Especificidad y Sensibilidad MALDI-MS
2000-presente Desarrollo de MS como técnica analítica en ciencias biológicas
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Revisión histórica
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Revisión histórica
What is Mass Spectrometry?
John B. Fenn, the originator of electrospray ionization for biomolecules and the 2002
Nobel Laureate in Chemistry, probably gave the most apt answer to this question:
Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine
their molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient,
frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species. To
practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte, then
measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to various
combinations of electric and magnetic fields.
Clearly, the sine qua non of such a method is the conversion of neutral analyte
molecules into ions. For small and simple species the ionization is readily carried
by gas-phase encounters between the neutral molecules and electrons, photons, or
other ions. In recent years, the efforts of many investigators have led to new
techniques for producing ions of species too large and complex to be vaporized
without substantial, even catastrophic, decomposition.
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
• Desde 1930, MS técnica analítica importante para Biología Estructural
• Producción de iones de alto peso molecular en fase gaseosa (macromoléculas
biológicas)
• Desarrollo de técnicas de ionización como FAB, MALDI, ESI
• Desarrollo de métodos ultrasensibles para caracterización de proteínas basados en
Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTIR-MS), límite de
detección de 30 zmol (30x10-21mol) para proteínas de masa molecular 8 – 20 kDa.
Utilización de MS:
• Determinación precisa de masa molecular de proteínas y ac. nucleícos, amplio rango de masas
• Secuenciación de péptidos y oligonucleótidos
• Identificación de modificaciones post-traduccionales
• Cambios estructurales en proteínas, plegamiento y dinámica
• Identificación de proteínas (cantidades subpicomolares) de 2D-electroforesis
• Identificación de marcado isotópico
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Aplicaciones Biológicas
ión acelerado por una fuente externa, adquiere E. cinética (Ekin)
Ekin= z * Vacc =mv2
2
Z: carga del ion
Vacc: diferencia de potencial en
región de aceleración
m: masa del ion
v: velocidad del ion
Relación m/zmZ =
B2r2
2Vacc=
F = zvB =mv2
r
partícula cargada, en campo magnético
homogéneo (B), perpendicular a trayectoria,
fuerza de Lorentz F, trayectoria, círculo de
radio r.
Partícula cargada en campo
Eléctrico y Magnético
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa - Iones en campos eléctricos
y magnéticos
Ejemplo:
R=1000 (sector magnético), permite separar masas de 1000 y 1001 Da.
R=100000, permite distinguir masas de 100000 y 100001 Da, 10 ppm.
Resolución, R: medida de la
habilidad de un instrumento para
separar iones de masas
similares, m y m+Dm, de igual
intensidad, con superposición de
señal de 10%10%
Dm
m+Dmm
R=m/Dm
Definir la extensión de la superposición de picos adyacentes
• 10% valley definition (2 picos adyacentes contribuyen con 5%)
• Full width, half maximun (FWHM),masa del pico (Da) dividido
el ancho del pico a la mitad de la altura
R (FWHM) aprox. 2 veces R (10%)
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Resolución de masa
y presición de masa
Figure 2.2. The resolution is determined by the measurement of peak’s
m/z and FWHM , in this case m/z = 500 and the FWHM = 1.Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Resolución de
masa y presición de masa
Presición de la medida de masa molecular es la diferencia entre la
masa medida y la calculada para cierto ión
Expresada como:
% de la masa medida: masa molecular = 10000 ± 0.01%
o
ppm de la masa medida: masa molecular = 10000 ± 100ppm
-Presición en las determinaciones de masa molecular, no requieren alta
resolución
- Factor limitante en la presición de la determinación de masa molecular para
macromoléculas de alta masa es la superposición de picos
Espectrometria de Masa - Resolución de masa
y presición de masa
Análisis Espectroscópico
Error y Precisión según la masa molecular
• Para moléculas pequeñas
Error menores de 5 ppm permiten identificar la formula molecularinequivocamente
Ej: C23H37NO3 Masa esperada 375.27734 uma
C23H37NO3 Masa encontrada 375.27652 uma
Error = [(375.27734- 375.27652)/ 375.27734] * 1E6 = 2.2 ppm =
Diferencia = 0.00082 uma
• Para biomoleculas de alto MW se pueden determinar conalrededor de 0.5 Da
Ej.: PM 50 kDa con 2.2 ppm de error masa encontrada 50000.11 Da
Diferencia = 0.11 uma
Espectrometría de Masa
1 Da = 1 uma
Análisis Espectroscópico
Resolución de masa y presición de masa, masa promedioEspectrometría de Masa
Análisis Espectroscópico
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición
de masa, masa promedio.
Espectrómetro de Masa – Tratamiento de la muestra
• INYECCIÓN de la muestra, directa o con tratamiento previo (sample injector)
•IONIZACIÓN de la muestra (ion source)
• SEPARACIÓN de los iones con diferentes m/z (mass analyzer)
• DETECCIÓN del número de iones producidos (detector)
• COLECCIÓN de datos, generación del espectro de masa
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
Muestra
Fuente de
ionización
Analizador
de masas
DETECTOR
Análisis
de Datos
Primer espectrómetro de masa: 1913, J.J. Thomson
Campos eléctricos y magnéticos fijos para separar isótopos de Ne, por
diferencia de comportamiento de partículas cargadas (diferentes momentos y
energías) en un campo electromagnético.
Análisis Espectroscópico
Espectrometria de Masa – Electrón
SAMPLE
ION
SOURCE
MASS
ANALYZERDETECTOR
DATA
ANALYSIS
3 partes básicas,
alto vacio (no
siempre)
Muestra – ionización- analizador de masa, separación de acuerdo a su relación
m/z – detección – señal enviada a sistema de análisis de datos (abundacia en
función de m/z)
Generación del Espectro de masa, % abundancia relativa vs. m/z
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
Figure 1.2. Components of a mass spectrometer. Note that the ion source does not
have to be within the vacuum of the mass spectrometer. For instance, ESI and APCI
are at atmospheric pressure and are known as atmospheric pressure ionization (API)
sources. http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php#Basics
Análisis Espectroscópico
Espectrometría de Masa
Fuente de
ionizacion
Muestra
+
_
Analizador
de masas
Detector
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa
Métodos deionizacion
- Impactoelectrónico
- IonizacionQuímica
- MALDI
- Electrospray
- APCI
Análizadores
de masas
– Cuadrupolo
– Tiempo de vuelo
– Trampa de iones
– Orbitrap
– Ciclotrón
– En tandem
Generación
iones
Separacion
de ionesDetección
de iones
• Espectro de masas
• Análisis en bases de datos
QqQ / QTof /
Tof-Tof / IT-Tof
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa – Instrumentación
• Impacto electrónico (EI - Hard method)– Moleculas pequeñas, 1-1000 Daltons
• Fast Atom Bombardment (FAB – Semi-hard)– peptidos, azucares, hasta 6000 Daltons
• Electrospray Ionization (ESI - Soft)– peptidos, proteinas, hasta 200,000 Daltons
• Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI-Soft)– peptidos, proteinas, DNA, hasta 500 kD
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización
Impacto Electrónico
• Renombrado como ionización electrónica
• Calentamiento electrodo, produce e-
• Energía electrón: l = h/mn
• Dualidad onda-párticula
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Análisis Espectroscópico
• Aproximadamente UN ión por cada 1000 moléculas ( 70eV)
• 10 eV – energía necesaria para ionizar una molécula. Exceso de energía ??
I = NpiV
I = número de iónes producidos
N= constante, p= presión, i=corriente
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Análisis Espectroscópico
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
• En lugar de “bombardear” las moléculas con electrones se usan moléculas cargadas.
• Fuente de ionización mixtas, pueden usar ionización química y electrónica.
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
Reacciones en ionización química
Dependiente de las características de la molécula a ionizar, (heteroátomos, aceptores protón)
GH+ transfiere un protón a la muestra
GH+ + M G + MH+
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
1) Formación de aductos
2) Reacciones de transferencia de carga
Se usan gases utilizados
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
Metano – Reacciones
CH4 + e -----> CH4+. + 2e ------> CH3
+ + H.
CH4+. + CH4 -----> CH5
+ +CH3.
CH4+. + CH4 -----> C2H5
+ + H2 + H.
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
• Isobutano
Reacciones
i-C4H10 + e -----> i-C4H10+. + 2e
i-C4H10+. + i-C4H10 ------> i-C4H9+ + C4H9 +H2
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
• Amoníaco
• Reacciones
NH3 + e -----> NH3+. + 2e
NH3 +. + NH3 ------> NH4+ + NH2
.
NH4+ + NH3 --------->N2H7
+
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa – Comparación gases de ionización
Análisis Espectroscópico
Espectrómetro de Masa - Ionización química