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LA BIOTECNOLOGÍA EN LA LA BIOTECNOLOGÍA EN LA PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE

ALIMENTOS FUNCIONALESALIMENTOS FUNCIONALES

Dr. Dr. Humberto Hernández SánchezHumberto Hernández SánchezDeptoDepto. Graduados e Investigación en Alimentos. Graduados e Investigación en Alimentos

Escuela Nacional de Ciencias BiológicasEscuela Nacional de Ciencias BiológicasInstituto Politécnico Nacional, México, DFInstituto Politécnico Nacional, México, DF

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ALIMENTOS FUNCIONALESALIMENTOS FUNCIONALES

• No es una categoría que esté en las Normas oficiales

• Es un término descriptivo interno de la industria

• Se podrían definir como alimentos que en general tienen algún beneficio para la salud aparte del nutricional

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PROBIÓTICOSPROBIÓTICOS• Los microorganismos

probióticos se pueden definir como cultivos vivos que tienen beneficios documentados sobre la salud

• Los géneros más importantes son Lactobacillus y Bifidobacterium

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BacteriocinasBacteriocinas

• Son compuestos de tipo proteico con efecto bactericida contra especies bacterianas muy cercanas

• Pueden existir también complejos de proteína con carbohidrato o lípidos

• Las más estudiadas son las de bacterias lácticas y la nisina (lantibiótico) es la única con el estatus de GRAS

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BacteriocinasBacteriocinas

• El objetivo de esta investigación fue estudiar la posible producción de bifidocinas por B. adolescentis, B. breve, B. animalis, B. bifidum, B. longum y B. infantis

Participantes:Rosa Ma. Navarro, Lydia Mota, Rina

González y Humberto Hernández

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BacteriocinasBacteriocinas• Se probaron 4 medios líquidos

(M17, Tioglicolato, MRS, TPY) y 5 sólidos (M17, anaeróbico de Brewer, Luria, antibiótico 2, MRS) para desarrollo de los m.o. y producción de bacteriocinas

• La incubación se hizo a 37ºC de 24 a 48 h en anaerobiosis

• Los m.o. de prueba fueron: Listeriamonocytogenes, Staphylococcusaureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus y Salmonella typhi

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BacteriocinasBacteriocinas• B. bifidum fue la cepa

que produjo mayor actividad inhibitoria

• El caldo TPY fue mejor para crecimiento pero el MRS fue el mejor para la producción de bifidocinas

• Bacillus cereus fue el m.o. más sensible y L. monocytogenes el más resistente

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Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se partió de 6 L de caldo MRS cultivados por 24 h con B. bifiduma 37ºC

• Se centrifugó a 22,100Xg por 30 min y se filtró (0.22 µm)

• Se precipitó con sulfato de amonio al 60% de saturación

• Se concentró por diálisis

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Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se ajustó el pH a 7 y se calentó a 85ºC por 15 min para después incubar a 4ºC toda la noche

• Se centrifugó a 22100Xg por 30 min y se volvió a filtrar

• Se dializó contra agua destilada• Se precipitó con sulfato de amonio al 60%

de saturación

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Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida obteniéndose 2 bandas con PM de 62,000 y 93,000

• Yildirim et al. habían reportado la presen-cia de la bifidocina B en B. bifidum con un PM de 4,433

• Se electroeluyeron las bandas• Se probó actividad inhibitoria

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Actividad de las Actividad de las BifidocinasBifidocinas

• Ambas bandas tuvieron actividad (juntas y por separado) sobre Bacillus cereus

• Las bifidocinas conservaron su actividad después de 10 min a 90ºC

• Su efecto inhibitorio se mantuvo en el intervalo de pH de 4.5 a 7.2

• Las enzimas α-amilasa, α-quimiotripsina y tripsina afectaron su actividad inhibitoria

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Prebióticos. DefiniciónPrebióticos. Definición

• Son ingredientes no digeribles para alimentos que afectan benéficamente al consumidor por medio de una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de algunos microor-ganismos probióticos (Gibson & Roberfroid, 1995). Generalmente son oligosacáridos no digeribles.

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Simbióticos. DefiniciónSimbióticos. Definición

• Es una mezcla de probióticos y prebióticos que afectan benéficamente la salud del consumidor mejorando la supervivencia e implantación de los primeros en el tracto gastrointestinal por medio de una estimulación selectiva de su actividad y/o crecimiento (Gibson & Roberfroid, 1995).

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Prebióticos en el mercadoPrebióticos en el mercado

• Fructooligosacáridos - Suntory (Japón)• Isomaltooligosacáridos - Showa

Sangyo (Japón)• Oligomate (galactooligosacáridos) -

Yakult (Japón)• Palatinosa - Südzucker (Alemania)• Polidextrosa

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Prebióticos en el mercado (2)Prebióticos en el mercado (2)

• Pirodextrina - Matsutani (Japón)• Raftiline - Orafti (Bélgica)• Oligosacáridos de frijol de soya -

Calpis (Japón)• Xilooligosacáridos - Suntory (Japón)• Lactulosa• Lactosacarosa - Hayashibara (Japón)• Panosa - Hayashibara (Japón)

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Esta segunda investigación se dedicó a la modificación del suero de quesería para su utilización como medio de cultivo económico para las bifidobacterias

Participantes:Ma. Luisa Mier, Ma. Teresa Cruz

y Humberto Hernández

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• El suero es un subproducto de la industria quesera que sólo se aprovecha en un 30% en México

• El resto se desperdicia siendo un contaminante importante

• Su modificación puede dar otra alternativa importante de uso

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La primera modificación fue la hidrólisis enzimática de sus proteínas usando extractos crudos de:

1) Mexicaína del látex del fruto del cuaguayote (Pileusmexicanus)

2) Hemisfericina del jugo del fruto del timbirichi (Bromeliahemisphaerica)

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Selección de la enzima más adecuada:1) Se probaron las 2 enzimas a 100 µg/ml2) El suero se usó a 0.4 y 1%3) Se probaron tiempos de hidrólisis de 5,

10, 60 y 240 min4) La actividad proteolítica se siguió por el

método de la ninhidrina

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La hemisfericina tuvo una actividad 5 veces superior a la mexicaína

• Con 0.4% de suero y a 35ºC se tuvieron 11,048 UL

• Con 1% de suero y a 45ºC se tuvieron 82,530 UL

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La lactulosa (galactopiranosilfructosa) resulta de la acción térmica alcalina sobre la lactosa

• Se considera como un prebiótico muy efectivo

• En la leche puede ocurrir libre y unida a la lisina

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Para inducir la formación de lactulosa en el suero se realizó lo siguiente:

a) Alcalinización a pH 11 con NaOH 1Nb) Se probaron temperaturas de 60, 70 y 80ºCc) Se probaron tiempos de 15 y 20 mind) La lactulosa se determinó por el método de la

antrona después de precipitar la lactosa con alcohol absoluto

e) Las mejores condiciones fueron 80ºC por 15 min (15.8 g/l de lactulosa)

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El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Fermentación del lactosuero a pH 6 y 37ºCCuenta viable (UFC/ml) de B. bifidum

Tiempo (h) Suero

normal

Suero

hidrolizado

Suero

hidrolizado y

calentado

0 1.4 X 104 1.5 X 104 1.4 X 104

9 3 X 108 1 X 109 1.5 X 109

18 1 X 1014 1.7 X 1014 6.4 X 1014

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Supervivencia de Supervivencia de B. B. bifidumbifidum durante la durante la elaboración de un queso funcionalelaboración de un queso funcional

• El objetivo de este estudio fue comparar la supervivencia de B. bifidum, agregados en forma libre e inmovilizada (2 soportes), durante la elaboración de un queso fresco de tipo untable

Participantes: Marisol Flores, Ma. Eugenia Jaramillo, Marina Labastida, Erika Alvarez y Humberto Hernández

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Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• La κ-carragenina es un polisacárido natural extraido de las algas cafés y rojas

• Está constituida por cadenas lineales de D-galactosa y 3,6-an-hidro-D-galactosa

• Se usa comúnmente en alimentos

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Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• El ácido algínico es un heteropolisacárido formado por ácido L-gulurónico y ácido D-manurónico

• Se extrae de las algas rojas y otros tipos

• En presencia de iones Cagelifica formando esferas cuya consistencia depende del PM

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Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• Las esferas de κ-carragenina(1% gelificadas con KCl 3M) fueron irregulares y de poca firmeza

• Las esferas de alginato (2% gelificadas con CaCl2 0.1 M) tuvieron buena firmeza y un diámetro casi constante de 2.1 mm

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Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable• Se reconstituyó leche en polvo

descremada al 10% de ST y se pasteurizó a 62ºC por 30 min

• Se agregó el cultivo de Bifidobacterias (libres o inmovilizadas)

• Se adicionó un 5% de cultivo iniciador para quesos (Lactococcus lactis) y se incubó a 32ºC por 15 h

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Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable

• Se cortó la cuajada en cubos de 8 mm cuando se alcanzó un pH de 4.6

• Se cocinó a 54ºC hasta alcanzar la textura ade-cuada (50-60 min)

• Se drenó parte del suero y se lavó la cuajada con agua a 15 y luego a 2ºC

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Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable

• Se eliminó completamente el suero

• Se adicionó crema de 17% de grasa (333 g por cada kg de cuajada) y se mezcló bien

• Se enfrió el producto a 5ºC y se dejó reposar de 4 a 6 h

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ResultadosResultados

• Los m.o. inmovilizados soportan la congelación hasta por un mes sin disminuir su viabilidad

• Sensorialmente se toleró hasta un 2% de esferas en el queso untable

• Los quesos obtenidos tuvieron en promedio un pH de 4.7, 80% de humedad, 8% de proteína y 6% de grasa

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ResultadosResultados

• Viabilidad:Queso con

Probióticos

Cuenta inicial en

la leche (UFC/ml)

Cuenta en que-

so recién elabo-

rado (UFC/ml)

Cuenta en el queso

después de 4 días

(UFC/ml)

Células

libres

2.1 X 109

5 X 106

1.8 X 105

Células

Inmovilizadas

1 X 108

1.8 X 106

1.7 X 106

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ResultadosResultadosVariación del peso inicial de esferas de alginato a

pH 2 y 100 rpm

0102030405060708090

100

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Tiempo (h)

% d

el p

eso

inic

ial

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (1)(1)

• Miles de plantas contienen fructooligo-sacáridos, ya que estos compuestos son constituyentes natural de la inulina

• La inulina se encuentra en más de 36,000 plantas y es su reserva de energía

• Comercialmente, se extrae principal-mente de la raíz de la achicoria

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (2)(2)• La inulina está formada por cadenas linea-

les de fructosa conectada por enlaces β2 1. Casi todas las cadenas tienen lon-gitudes de 60 y terminan en una glucosa

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (3)(3)• El término se ha usado para los 1-β-poli-

fructofuranosil-sacarosa, excluyendo polifructanas y oligofructósidos

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (4)(4)Fuente Inulina (%) FOS (%)

Cebolla 2 - 6 2 - 6Alcachofa de Jerusalén 16 - 20 10 - 15Achicoria 15 - 20 5 - 10Poro 3 - 10 2 - 5Agave tequilero (7 años) 22 - 30 3 - 8Ajo 9 - 16 3 - 6Alcachofa 3 - 10 < 1Diente de león 12 - 15 n. d.Salsifí 4 - 11 4 - 11Trigo 1 - 4 1 - 4

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (5)(5)

• En el alimento, los FOS proporcionan sabor y la inulina textura

• Síntesis:– Fructosiltransferasas– Presencia en m.o. y plantas– pH óptimo entre 5 y 6.5– Temperatura óptima entre 50 y 60°C

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (6)(6)

• Producción industrial– Sistema por lote: enzima soluble– Sistema contínuo: m.o. o enzima

inmovilizados en alginato de calcio en reactores de lecho empacado (1000 L) usando sacarosa concentrada (hasta 700 g/L) como sustrato

– Se obtienen mezclas de Glu, Sac, GF2, GF3 y GF4

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (7)(7)• Fuentes vegetales de fructosiltrans-

ferasas– Agave americana– Agave vera cruzae– Asparagus officinalis– Allium cepa– Cichorium intybus– Helianthus tuberosus– Lactuca sativa– Taraxacum officinale (diente de león)

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (8)(8)

• Algunos m.o. productores de FOS– Aureobasidium pullulans– Aspergillus japonicus– Aspergillus niger– Aspergillus oryzae– Claviceps purpurea– Penicillium oxysporum– Phytophthora parasitica– Saccharomyces cerevisiae

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FructooligosacáridosFructooligosacáridos (9). (9). FuncionalidadFuncionalidad

• Baja dulzura (1/3 de la de la sacarosa)• Prácticamente no aportan energía• No son cariogénicos• Son bifidogénicos• Disminuyen los niveles séricos de

colesterol, fosfolípidos y triglicéridos• En Japón se recomienda una ingesta

diaria de 0.8 g / kg de peso / día

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Obtención de una bebida funcional Obtención de una bebida funcional a partir de aguamiela partir de aguamiel

• El objetivo de esta investigación fue la de obtener un producto simbiótico a partir de un prebiótico (aguamiel) y un probiótico(bifidobacterias)

Participantes: Roberto Campos, RosalvaMora y Humberto Hernández

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AguamielAguamiel

• El aguamiel es un fluido obtenido del Agave atrovirens karb que normalmente se fermenta para la obtención del pulque

• Las muestras obtenidas prove-nientes de Contepec, Michoacán tuvieron un pH de 6.8, 86% de hume-dad y 10.7ºBx

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CarbohidratosCarbohidratos

Carbohidrato Contenido (g/L)Sacarosa 68Fructosa 9.2Glucosa 4.6FOS (incluyendo 15

inulina)El análisis de hizo por el método de

Ting y HPLC

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Uso del aguamiel como medio de Uso del aguamiel como medio de cultivocultivo

Crecimiento de 3 cepas de bifidobacterias a 37ºC y 48 hCepa As590 nm AM As590 nmTPYB. bifidum 0.77 1.03B. longum 0.74 0.96B. animalis 0.91 1.12

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Pérdida de viabilidad de diferentes Pérdida de viabilidad de diferentes cepas de cepas de BifidobacteriasBifidobacterias en aguamielen aguamiel

• Se inoculó aguamiel a 9ºBx y se incubó a 4ºC por 30 díasCepa % de pérdida de viabilidadB. infantis >25B. longum 11.3B. bifidum 13.5B. adolescentis 18.1B. animalis 9.6

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Pérdida de viabilidad de Pérdida de viabilidad de BifidobacteriumBifidobacteriumanimalisanimalis en aguamiel a diferentes en aguamiel a diferentes BrixBrix

• Las muestras se incubaron a 4ºC por 4 díasºBx % de pérdida de viabilidad6.2 1.47.5 1.28.5 1.09.6 0.6

11.8 23.1

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Efecto de la temperatura de incubaciónEfecto de la temperatura de incubación

• Cambios en diferentes constituyentes a 30 díasComponente 4ºC 25ºC 35ºC

ºBx 8.1 8.1 7.8pH 7.5 7.1 4.2Acidez(%) 0.5 0.7 3.1Sacarosa(%) 7.1 7.1 5.8B. bifidum 6.9 6.6 <6.0(log UFC/ml)

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Evaluación SensorialEvaluación Sensorial• Se evaluó la bebida inoculada con B. bifidum e

incubada a 4ºC por 30 días• El producto tenía un color amarillo paja y un

sabor dulce agradable que fue aceptada por los jueces que la evaluaron

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GRACIASGRACIAS


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