ENZIMAS DE RESTRICCION / MAPAS DE RESTRICCION VECTORES DE CLONACION - TIPOS GENOTECAS - TIPOS CLONACION IDENTIF. DE SECUENCIAS CLONADAS METODOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIAS:
SOUTHERN/ NORTHEN/WESTERN PCR SECUENCIACION
BIBLIOGRAFIAGriffiths et al. (2000)
Klug y Cummings (1999)Tamarin (1999)
Strachan et al. (1996)Kaplan et al. (1993)
wwwhttp://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/genetics.html
* Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural
* Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena* Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 bp* Reconocen secuencias palindrómicas
Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae
EXTREMOS COEXIVOS
EXTREMOS ROMOS
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. MAPA DE RESTRICCION CONOCIDOUn único pto. De corte
. MARCADORES SELECTIVOSResistencia antibióticosCambios de color
. REPLICACION AUTONOMA
. RECUPERACION SENCILLA
. TIPOS:Plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs, etc.
Factor F de Bacterias: plásmido con replicación
autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana
PolilinkerResistencia antibióticos
1º Inserción del fragmento de DNA a clonar en un Vector de clonación:
MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE
2º Introducción mol. DNA recombinante en hospedador (bacterias)
3º Vectores se multiplican de forma autónoma
4º Bacteria se divide 5º Un gran nº de copias dará lugar
a un clon, con muchas copias del fragmento
. Clonación de todas las secuencias del genoma . Presente al menos una copia de cada gen. Nº de clones depende: - tamaño inserto
- tamaño genoma. Tipos : genómicas, cromosómicas, cDNAln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar
ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon
ln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar
ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon
Genoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 17 Kb - 1,7 x 104 /3 x 109
N : 8.1 x 105 fagos
Genoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 5 Kb N : varios millones
plásmidosGenoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 50 Kb N : 400.000 cósmidos
1º PASO
2º PASO
3º PASO
4º PASO
SOUTHERN BLOTTING
5º PASO
1º PASO: DESNATURALIZACION
2º PASO: ANILLAMIENTO DE PRIMERS
3º PASO: ELONGACION
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METODO DE SANGER
1º Paso: Desnaturalización2º Paso: Adición de :
dNTPsDNApolimerasacebador
3ºPaso: adición de ddNTPs
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