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Fig. 7.1.1.Robert Koch.
7. DIAGNOSTICO
7.1. PRUEBA DE LA TUBERCULINA.
En 1980 Robert Koch anuncio la cura contra la tuberculosis, mediante un líquido
parduzco transparente obtenido de los cultivos de Mycobacterium tuberculosis. Según Koch,
la administración diaria de tuberculina, daba como resultado la cura de la tuberculosis. Un año
después la tuberculina fue rechazada como la cura para la consunción. Sin embargo Robert
Koch no se imagino, que su descubrimiento no era la cura a la tuberculosis, si no una de las
primeras pruebas diagnosticas para la tuberculosis.
Con el paso del tiempo, se emplearon diversas pruebas cutáneas basadas en la tuberculina de
Koch: prueba cutánea Von Pirquet), Prueba percutanea (Moro), Prueba conjuntival
(Calmette), Prueba intradérmica (Mantoux).
A principios de 1930 la prueba intradérmica de la tuberculina empezó a ser ampliamente
utilizada como prueba de diagnostico.
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Fig. 7.1.2. Caja con jeringas del derivado proteico de la tuberculina (PPD)
Tuberculina Vieja (OT) . La tuberculina vieja es la tuberculina descubierta por Robert
Koch, y el método original empleado por Koch para su preparación, consiste en desarrollar a
los bacilos tuberculosos en un medio de caldo de carne glicerado, y a continuación matar a los
microorganismos con calor en un gabinete de flujo de vapor a 100 grados centígrados. El
medio de cultivo restante se concentra a la décima parte de su volumen original en baño
maría. Actualmente este tipo de tuberculina es empleada en el área de veterinaria.
Der ivado Proteico Pur ificado de la Tuberculina (PPD).
En 1932, Seibert y Munday aislaron la proteína de peso molecular bajo mediante
precipitación de filtrados de cultivo de bacilos tuberculosos con ácido tricloroacetico (TCA).
La observación principal de este producto en pruebas intradérmicas en cobayos y humanos
fue que a dosis bajas, la proteína purificada era bastante específico para la tuberculosis.
Posteriormente se logro la obtención de un producto más purificado mediante precipitación
con sulfato de amonio (AS), tratándose del derivado proteico purificado tal y como lo
conocemos hoy en día
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Fig. 7.1.3. Obsérvese los efectos producidos por antígenos de tuberculina.
7.1.1 PRINCIPIO INMUNOLÓGICO.
Como hemos revisado, la entrada o contacto con una micobacteria en el organismo de
una persona ocasiona una respuesta inmunológica de tipo retardado en su cuerpo, al mismo
tiempo que los linfocitos T son sensibilizados.
Con tal antecedente, cuando se le aplica la inyección de tuberculina en la piel de una persona,
esta estimula a los linfocitos T cercanos al sitio de la lesión, activando así la reacción de
hipersensibilidad retardada (esta reacción inmunológica es llamada retardada ya que requiere
de 24 a 48 horas para manifestarse).
En el sitio de la inyección el antígeno es infiltrado por basofilos, monocitos y neutrófilos
ocasionando una respuesta inflamatoria, vaso dilatación y edema. Proliferan linfocitos T
específicos para el antígeno y descargan linfocinas, que median la acumulación de otras
células en ese lugar.
La célula que presenta el antígeno en la sensibilización por contacto se le llama célula de
Langerhans, (una célula dendrítica presentadora de antígeno que porta antígenos MHC clase
II).
Individuos sensibilizados con antígenos de tuberculina manifiestan una reacción de
hipersensibilidad retardada, observándose visualmente a 24 horas después de haberse aplicado
la inyección intradérmica, y alcanza su máximo a 48 horas después.
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Fig. 7.1.4. Paso 1 de la inyección intercutánea de Mantoux en la superficie anterior del brazo.
7.1.2. TIPOS DE TUBERCULINAS.
Básicamente se manejan 2 tipos de tuberculinas para aplicación intradérmica:
A) Tuberculina vieja (OT). Se trata de la tuberculina descubierta por Koch.
B) Der ivado proteico pur ificado de la tuberculina (PPD). Es la tuberculina más
ampliamente utilizada hoy en día, y su contenido es una proteína purificada a partir del bacilo
tuberculoso utilizada como antígeno.
7.1.3. APLICACIÓN DE LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA PPD VÍA
INTRADÉRMICA (PRUEBA DE MANTOUX).
La prueba de la tuberculina mide la hipersensibilidad retardada a la tubérculo proteína (PPD).
• La prueba cutánea de Mantoux consiste en inyección intercutánea de tuberculina en la
superficie anterior del antebrazo.
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Fig. 7.1.5. Paso 2 de la inyección intercutánea de mantoux en la superficie anterior del brazo.
Fig. 7.1.6. Paso 3, medición de la roncha resaltada en el brazo.
• Se emplea una jeringa de tuberculina con aguja calibre 26 o 27, se introduce 0.1 mL
de antígeno justamente por debajo de la capa superior de la piel.
• Si la prueba fue aplicada de manera correcta, se producirá una elevación pálida
definida de la piel (roncha) de 6 a 10 mm de diámetro en un tiempo estimado de 48 a
72 horas.
• El PPD se estandariza desde el punto de vista biológico contra un preparado
internacional de referencia , y su actividad se expresa en unidades de tuberculina (UT)
• La dosis recomendada de PPD para la prueba cutánea es de 5 UT.
• Cuando se sospecha de un grado elevado de hipersensibilidad en una persona o bien
de una tuberculosis ocular, se emplea al principio 1 UT (primera potencia) o menos,
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Fig. 7.1.7. Medición en milímetros.
para evitar el riesgo de reacción excesiva a nivel local o en el sitio de la lesión
micobacteriana (se aplican menos de 5 UT de PPD).
7.1.4. LECTURA DE LA PRUEBA
• Los resultados de la prueba se leen a 48 a 72 horas después de la inyección
intradérmica.
• Las lecturas son efectuadas bajo una buena fuente de luz y deberá ponerse en flexión
ligera el antebrazo del paciente a nivel del codo.
• Los bordes de induración se identifican mediante deslizamiento del codo índice
ligeramente a través de la zona de reacción.
• Una vez que están marcados los bordes, con una regla flexible se mide la induración
en sentido transverso a nivel de su diámetro más amplio.
• Los resultados de las pruebas cutáneas de la tuberculina deben anotarse en milímetros
de induración; los términos "positiva" o "negativa" no brindan información sobre el
tamaño de la reacción, y vuelven un problema las decisiones subsecuentes
relacionadas con el tratamiento preventivo.
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Fig. 7.1.8. Interpretación de la prueba, resultado positivo con una induración de 1 centímetro de diámetro.
7.1.4.1. INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA.
Prueba negativa si la induración y eritema miden menos de 5 mm de diámetro.
Prueba positiva si la induración y eritema mide más de 5 mm de diámetro.
7.1.4.2. REACCIONES FALSAS POSITIVAS A LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA.
• En ocasiones las lecturas de la prueba de tuberculina, dan como resultado una lectura
falsa positiva, esto ocurre frecuentemente en pacientes con infecciones con
micobacterias no tuberculosas (MOTT) y en pacientes que por lo general son niño,
que ya se han vacunado con el bacilo de CalmetteGuerin (BCG).
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7.1.4.3. REACCIONES FALSAS NEGATIVAS A LA PRUEBA DE LA TUBERCULINA.
Tabla. 7.1. Causas potenciales de reacciones negativas falsas a la prueba cutánea de tuberculina.
Factores relacionas con la per sona sometida a la prueba Infecciones: Virales (HIV, Sarampión, parotiditis, varicela). Bacterianas (fiebre tifoidea, brucelosis, lepra, tos ferina). Micoticas (Blastomicosis sudamericana). Vacunaciones con virus vivos (sarampión, parotiditis, polio). Trastornos metabólicos (insuficiencia renal crónica). Factores nutricionales (deficiencia grave de proteínas). Enfermedades que afectan a los órganos linfoides (enfermedad e Hodkin, linfoma, leucemia linfocitica crónica). Fármacos (corticosteroides). Edad (neonatos, ancianos). Infecciones recientes con M. tuberculosis. Estrés (Intervenciones quirúrgicas, quemaduras, reacciones de injerto contra huésped).
Factores relacionados con la tuberculina empleada. Almacenamiento inapropiado (exposición a la luz y al calor). Diluciones inapropiadas. Desnaturalización química. Contaminación.
Factores relacionados con el método de administración Inyección de muy poco antígeno. Administración retrasada después de cargar la jeringa. Inyección demasiado profunda.
Factores relacionados con la lectura de la prueba y el r egistro de los resultados. Lector inexperto. Desviación consciente o inconsciente.
Error de lectura.
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ANERGIA: La anergia (ausencia de algún tipo de respuesta inmunológica, en este caso a la
hipersensibilidad retardada) hacia la tuberculina es observada muy comúnmente en pacientes
con VIH activa, e incluso en pacientes cero positivos (pacientes con VIH, que aún no
manifiestan síntomas). Es por esto que la tuberculina no es una prueba cien por ciento fiel
hacia el diagnostico de la tuberculosis.
Como conclusión se puede decir que la prueba del PPD, no es confiable, debido a la
diversidad de reacciones falsas negativas o positivas por los factores revisados. Esta prueba es
útil en el diagnostico como un apoyo a los resultados de la baciloscopia y otras pruebas
diagnosticas.
7.2. BACILOSCOPÍA.
7.2.1. FUNDAMENTO.
Como se ha revisado con anterioridad, las micobacterias poseen la característica de
poseer un alto porcentaje de lípidos en su pared celular. Estos lípidos tienen la capacidad de
ligarse o unirse al colorante de fuscina (también a la auramina fenólica, para el caso de la
tinción de fluorocromo auramina), de tal manera que estas no son decoloradas por el alcohol
ácido (ácido resistencia). Esta propiedad permite la coloración de la bacteria y su observación
en el microscopio.
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Al unirse la micobacteria al colorante de fuscina, este se colorea de color rojo brillante, y al
agregarse el colorante de contraste (colorante de azul de metileno), las micobacterias (color
rojo) quedan distinguibles de todo lo demás (color azul) véase mas adelante en este capitulo.
7.1.2.1.1. POR QUE LA BACILOSCOPIA ES UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA
ESTANDAR PARA TODOS LOS LABORATORIOS CLÍNICOS?
• La observación de bacterias ácido resistentes en una muestra de esputo, junto con
antecedentes clínicos del paciente: perdida de peso, y evidencia de un infiltrado
pulmonar en radiografía de tórax, es la clara evidencia de una tuberculosis activa.
• La baciloscopia para muestra de esputo es muy útil para el seguimiento o monitoreo
de la respuesta del organismo del paciente hacia determinado tratamiento. Una vez que
se comienza un tratamiento con drogas antituberculosas, el cultivo de la micobacteria
puede volverse negativo antes que la tinción (esto sugiere que la bacteria no es capas
de replicarse, pero si de unirse al colorante de fuscina).
7.2.2. TIPOS DE TINCIONES PARA MICOBACTERIAS.
Básicamente hasta hoy en día existen tres procedimiento distintos para la coloración
de bacterias ácido resistentes:
A) Tinción de ZiehlNeelsen
B) Tinción de Kinyoun en frío
C) Tinción con fluorocromo auramina.
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7.2.1. Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica de Ziehlneelsen para su preparación.
7.2.2.1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
La tinción de ZiehlNeelsen y Kinyoun, utilizan prácticamente los mismos reactivos y
colorantes (Carbol fuscina, alcohol ácido), así como el mismo colorante de contraste (azul de
metileno). La diferencia esta, en la preparación de estos reactivos y en el procedimiento
empleado de cada técnica. Para la tinción de Ziehl Neelsen se tiene que calentar la
preparación o portaobjeto, mientras que en la de Kinyoun (coloración en frío) no se tiene que
calentar la preparación.
El por que se debe de calentar la preparación en el método de Ziehl Neelsen, es debido a que
las micobacterias poseen una gran capa de lípidos o capa cérea, aunque sabemos que la
fuscina se liga a estos lípidos, el calentamiento logra ablandar esta capa, dejando entrar a la
carbolfuscina fácilmente.
La técnica de Kinyoun se utiliza un agente tenso activo (alta concentración de fenol en la
carbol fuscina) que aumenta la permeabilidad del colorante a través de la capa cérea. Esta alta
concentración de fenol permite disolver el material lipídico de la pared celular de la
micobacteria, lo cual ocasiona la penetración de la carbolfuscina sin la necesidad de calor.
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7.2.2.Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica en frío de Kinyoun para su preparación.
7.2.3. Microscopía observada, habiendo utilizado la técnica en frío de fluorocromoauramina para su preparación.
La coloración con fluorocromo auramina, en ves de utilizar la fuscina, utiliza auramina
fenólica, la cual al igual que la fuscina, tiene la capacidad de unirse a los lípidos de la pared
de la micobacteria. Las bacterias ácido resistentes teñidas con fluorocromos, son coloreadas
de color amarillo brillante (si se utiliza auramina) o naranjarojo (utilizando rodamina). La
coloración de contraste utilizada en esta tinción es el permanganato de potasio, el cual
produce un fondo negro de contraste.
La tinción de fluorocromo auramina posee ventajas respecto a las demás técnicas para
la coloración de micobacter ias.
Las bacterias teñidas con fluorocromos son amarillo brillante (auramina) o naranja
rojo (rodamina) contra un fondo oscuro, esto permite que la preparación pueda ser leída con
un objetivo de 25 x aumentando el campo de visión. El intenso contraste entre las
micobacterias coloreadas de forma brillante contratando con el fondo oscuro, reducen el
tiempo de observación y ofrece una clara ventaja a la hora de dar lectura ala preparación.
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La pequeña desventaja de este procedimiento, es que se requiere de una fuente de luz intensa
(lámpara de 1.200 W o una luz fuerte con filtro para isotiocianato de fluoresceína (ITCF),
ósea de in microscopio de fluorescencia.
** NOTA. El hecho de que, para la observación de la preparación mediante la técnica de
fluorocromoauramina se necesite de una luz fuerte con filtro para isotiocianato de
fluoresceína (ITCF), NO !!! Quiere decir que se trate de una reacción antígenoanticuerpo,
sino de una unión fisicoquímica del colorante con la pared celular rica en lípidos de la
micobacteria.
Tabla 7.2. Procedimiento de la coloración para BAAR . Procedimiento Ziehl
Neelsen Procedimiento Kinyoun en
fr ío Procedimiento Fluorocromo
auramina
carbolfuscina: disolver 3 g de fuscina en 10 mL de etanol al 90 95 %. Agregar 90 mL de una solución acuosa de fenol al 5 %
Carbolfuscina: disolver 4 g de fuscina básica en 20 mL de etanol al 9095 % y luego agregar 100 mL de una solución acuosa de fenol al 9 % (9 g de fenol disueltos en 100 mL de agua destilada).
Auramina fenólica: disolver 0,1 g de auramina O en 10 mL de etanol 9095 5 y luego agregarla a una solución de 3 g de fenol en 87 mL de agua destilada. Almacenar el colorante en una gaveta marrón.
Alcoholácido: agregar 3 mL de HCl concentrado lentamente a 97 mL d etanol 9095 % en este orden: la solución puede calentarse!!
Alcoholácido: agregar 3 mL de HCl concentrado lentamente a 97 mL d etanol 9095 % en este orden: la solución puede calentarse!!
Alcoholácido: agregar 0,5 mL de HCl concentrado a 100 mL de alcohol al 70 %
Colorante de contraste azul de metileno: disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada.
Colorante de contraste azul de metileno: disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada.
Permanganato de potasio: disolver 0,5 g de permanganato de potasio en 100 mL de alcohol al 70 %
Procedimiento:
1. cubrir un frotis secado y fijado con calor con un pequeño rectángulo
Procedimiento:
1. cubrir un frotis secado y fijado con calor con un pequeño rectángulo (2x3cm)
Procedimiento:
1. Cubrir un frotis fijado con calor y secado con calor con carbol auramina y permitir
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(2x3cm) en papel filtro.
2. Aplicar 57 gotas de colorante carbolfuscina para humedecer con cuidado el papel filtro.
3. Calentar el portaobjeto cubierto con el colorante hasta la emisión de vapores, sin permitir que se seque. El calentamiento se puede realizar con un mechero a gas.
4. Eliminar el papel con pinzas, lavar el portaobjetos con agua y escurrir.
5. Decolorar con alcohol ácido hasta que no aparezca más colorante en el lavado (2 min.).
6. Teñir con el azul de metileno de contraste (1 a 2 minutos).
7. Enjuagar, escurrir y secar al aire. (1 a 2 minutos).
8. Examinar con un objetivo de aceite de inmersión x 100.Las micobacterias se colorean rojo y el fondo de azul pálido.
en papel filtro.
2. Aplicar 57 gotas de colorante carbolfuscina para humedecer con cuidado el papel filtro. Dejar descansar durante (5 minutos) agregar mas colorante si el papel se seca *NOTA* !!! NO VAPORIZAR!!!
3. Eliminar el papel con pinzas, lavar el portaobjetos con agua y escurrir.
4. Decolorar con alcoholácido hasta que no aparezca más colorante en el lavado (2 min.).
5. Teñir con el azul de metileno de contraste (1 a 2 minutos).
6. Enjuagar, escurrir y secar al aire. (1 a 2 minutos).
7. Examinar con un objetivo de aceite de inmersión x 100.Las micobacterias se colorean rojo y el fondo de azul pálido
colorear durante (15 minutos).*NOTA* !!! NO CALENTAR NI CUBRIR CON PAPEL FILTRO!!! .
2. Enjuagar con agua y escurrir.
3. Decolorar con alcohol ácido (2 minutos).
4. Enjuagar con agua y escurrir.
5. Cubrir el frotis con abundante cantidad de permanganato de potasio durante (2 minutos, no mas de 4 min.).
6. Enjuagar con agua de la canilla y escurrir.
7. Examinar con objetivo x 25 utilizando lámpara de vapor de mercurio y un filtro BG12 o una luz fuerte. Las micobacterias se colorean color naranja amarillento contra fondo oscuro.
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7.2.3. PROCEDIMIENTO DE LA BACILOSCOPÍA SEGÚN EL I.N.D.R.E
(INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICA).
7.2.3.1. ÁREA DE TRABAJO.
La mesa de trabajo tendrá que ser de por lo menos 1 x 0.50 m, recubierta de material
que pueda desinfectarse fácilmente (acero inoxidable), junto a esta área deberá existir una
tarja para la coloración o tinción de preparaciones, además deberá existir otra mesa de iguales
dimensiones para la observación baciloscopica.
7.2.3.2. EQUIPO Y MATERIAL.
El material requerido para el procedimiento es el siguiente:
• Microscopio binocular con oculares 10x, 40 x y lente de 100 .
• Tarja para tinciones.
• Mechero de gas o de alcohol.
• Autoclave u olla express
• Cristalería de laboratorio para la preparación de soluciones (matraces, probetas,
pipetas etc...).
• Pizetas.
• Embudos.
• Lápiz de punta de diamante o de tungsteno.
• Frascos para soluciones colorantes y reactivos preparados.
• Gasa o papel para cubrir el área de trabajo.
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• Envases para muestras.
• Aplicadores de madera.
• Portaobjetos.
• Varillas de vidrio para soporte de la tinción (puente).
• Hisopos de algodón.
• Frasco con fenol al 5 % para desechar los aplicadores usados.
• Recipientes para eliminación de material contaminado.
• Gradillas para láminas.
• Aceite de inmersión.
• Papel de seda.
• Papel filtro.
7.2.3.3. PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO.
1. Preparar la lista de trabajo con los nombres de los pacientes a quienes se le van a procesar
sus muestra.
2. Cubrir el área de la mesa donde se van a preparar los frotis con papel absorbente
impregnado con fenol al 5%.
3. Conforme el orden de la lista colocar las muestras a procesar sobre la mesa de trabajo en
línea horizontal.
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4. Etiquetar perfectamente el envase de la muestra y el porta objetos donde se realizara la
tinción, es punto clave que el numero de identificación del paciente coincida en la hoja de
trabajo, recipiente de la muestra y porta objetos.
5. La rotulación del portaobjetos deberá realizarse con lápiz de diamante o de tungsteno. El
portaobjetos es etiquetado en la parte del extremo izquierdo con el número de identificación
correspondiente y nombre del paciente.
6. Evitar confusiones también es punto clave, para esto; el laboratorista puede colocar frente a
el, la muestra y el portaobjetos a procesar, tanto el recipiente de la muestra como el
portaobjetos deberán coincidir en su numero de identificación. Es preferible realizar la tinción
una a una.
7. El extendido debe realizarse con un palillo de madera (el asa de nicromio, no es
recomendable para la tinción de Ziehlneelsen u otra para micobacterias, ya que esta puede ser
peligrosa para el trabajador al liberarse partículas infecciosas y aerosoles si esta interactúa con
el mechero). Para el caso de baciloscopia de esputo, es recomendable la toma de 3 muestras o
más para el extendido.
8. En el porta objetos se realiza un frotis o extendido de tamaño de 2 cm de largo por 1 cm de
ancho. El frotis se realiza haciendo movimientos circulares para la obtención de una película
uniforme. En este paso debe de cuidarse que el frotis no sea demasiado grueso ni tampoco
demasiado delgado, para evitar dificultades mas adelante para la lectura de la prueba.
9. El palillo o aplicador de madera tendrá que desecharse en un recipiente que contenga fenol
al 5%, para cada muestra se deberá usar un aplicador de madera distinto, aun y se trate de la
muestra del mismo paciente.
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7.2.4. Fijación del frotis
7.2.5. Limpieza con fenol al 5 %
10. El frotis se deja secar a temperatura ambiente. La laminilla no deberá calentarse mientras
el frotis este húmedo, ya que de lo contrario, se producen aerosoles infecciosos peligrosos
para el laboratorista.
11. Una vez secado el frotis a temperatura ambiente, se fija el frotis pasándolo sobre la flama
del mechero 2 o 3 veces. Debe evitarse el sobrecalentamiento de la laminilla, ya que esta
puede romperse o alterar la estructura de la bacteria.
12. Una vez terminada la tinción, se procede con la desinfección del área de trabajo con fenol
al 5% y se esteriliza el recipiente con los aplicadores de madera y el papel utilizado como
cubremesas.
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7.2.6. Colocación del frotis a teñir.
13. Los recipientes de las muestras no son desechados hasta que no se reporten los resultados
de su baciloscopia, cuando esto se cumpla, estos se esterilizan y se desechan.
7.2.3.4. TINCIÓN DEL EXTENDIDO (ZIEHLNEELSEN).
En México el I.N.D.R.E. (Instituto de diagnóstico y referencia epidemiológica) utiliza
el método de ZiehlNeelsen como método base para la coloración de micobacterias. Ellos
recomiendan teñir como máximo 12 preparaciones simultaneas para lograr una coloración
uniforme..
1. Colocar el frotis sobre las varillas del puente, con el extendido y numeración hacia arriba,
de modo que el laboratorista pueda visualizarlo. Si existen más preparaciones a teñir, estas
deben estar separadas por lo menos 5 mm separadas una de la otra evitando la contaminación
por arrastre de soluciones.
2. Como control de calidad. Diariamente se incluyen preparaciones control, tanto negativas
como positivas, estas deberán ser leídas al microcopio antes de revisarse las demás muestras
problema.
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7.2.7. Se cubre el frotis con colorante de fuscina.
7.2.8. Decoloración de la preparación con alcohol ácido
3. Se cubre completamente la preparación con el colorante de Carbol fuscina.
4. Se calienta la preparación usando un hisopo de algodón impregnado con alcohol hasta la
producción de vapores visibles. El punto clave en este paso, es evitar que el colorantes hierva
o este se seque sobre la laminilla, de lo contrario, se formaran diversos cristales que
confundirán al laboratorista cuando este frente al microscopio revisando la preparación,
ocasionando falsos positivos como resultado final de la prueba.
5. Después de la emisión de vapores, el portaobjetos es lavado con agua destilada y se deja
escurrir colocando el portaobjetos en forma inclinada.
6. Se decolora la preparación con alcohol ácido hasta la desaparición del colorante visible ( 2
minutos aproximadamente).
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7.2.9. Coloración de contraste: azul de metileno.
7.2.10. Escurrimiento de la preparación.
7. Se cubre completamente la preparación con el colorante de contraste: azul de metileno y se
esperan no mas de 1 minuto.
8. Se enjuaga la preparación con agua destilada y se escurre.
9. Con un algodón impregnado con alcohol ácido, se limpia la parte inferior (cara opuesta de
la preparación), para la eliminación de restos de colorante que pudieran interferir con la
lectura.
10. Se deja secar la preparación a temperatura ambiente.
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7.2.11. Ejemplo, del método empleado para la lectura de bacilos en campos ópticos en un microscopio.
7.2.3.5. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA. (LECTURA DE LA PRUEBA).
Este es el último paso de la baciloscopía antes de registrar los resultados. La lectura es
realiza en un microscopio óptico a con objetivo de 100 x.
1. Se colocan unas gotas de aceite de inmersión sobre el extremo más cercano a la
identificación del extendido.
2. Se enfoca el microscopio acercando el objetivo de inmersión (100 x) hasta tocar la
superficie de la gota de aceite, se observa en el ocular y se ajusta con el tornillo micrométrico.
3. Cada campo microscópico se divide mentalmente en cuatro cuadrantes. La lectura se inicia
en el cuadrante de la parte superior derecha y se continúa con los otros cuadrantes en sentido
de las manecillas del reloj. Debe observarse en superficie y en profundidad, utilizando
constantemente el tornillo micrométrico.
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7.2.12. Observación microscópica de los bacilos acidoalcohol resistentes teñidos con tinción de Ziehlneelsen.
7.2.13. Ejemplo a seguir, durante una lectura baciloscopica.
4. La observación de los bacilos ácido alcohol resistentes al microscopio aparecen como
bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo y generalmente con gránulos más
coloreados en su interior, aislados en parejas o en grupos sobre el azul de la tinción de
contraste.
5. Tendiendo en cuenta como se observan los bacilos ácido alcohol resistentes en la
coloración de Ziehlneelsen, se procede a la identificación de estos al microscopio. Una vez
identificado el bacilo en el campo observado, la observación microscópica debe seguir un
procedimiento para la lectura de los demás campos, la preparación se lee de izquierda a
derecha del extendido realizando lecturas de 100 campos como mínimo.
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Se considera como campo microscópico útil en aquellos que además de la observación de
bacilos ácido alcohol resistentes, son observados elementos celulares de origen bronquial
como: leucocitos, células ciliadas, broncolitos. Los campos en los que no son observados tales
elementos bronquiales, no son considerados para la contabilización de la prueba.
6. Cuando el promedio de los bacilos observados es elevado, para su contabilización final es
aconsejable utilizar un cuadriculado con 100 cuadros y apuntar en cada cuadrante el número
de bacilos por campo observado.
7. Como regla general la observación microscópica del extendido es de 100 campos. Sin
embargo el número de campos varía si en su observación aparecen bacilos ácido alcohol
resistentes
a) Si no se observan BAAR o están presentes menos de 1 bacilo por campo en
promedio, solo se examinarán 100 campos microscópicos útiles.
b) Si son observados de 1 a 10 bacilos en promedio por campo, solo se observan 50
campos microscópicos útiles.
c) Si son encontrados más de 10 bacilos en promedio por campo, solo se observan 20
campos microscópicos útiles.
8. Una vez terminada la lectura, el aceite de inmersión es limpiado del objetivo utilizando una
gasa o papel suave.
9. El frotis observado es sumergido en xilol, se deja escurrir y este es archivado.
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7.2.3.5. INFORME DE RESULTADOS (INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA).
Los resultados de la observación microscópica, son reportados por número de cruces.
Este dato puede indicarle al médico el tamaño de la lesión, la capacidad infectiva del paciente;
además proporciona una importante información epidemiológica y la evolución del
tratamiento.
Tabla 7.3. Informe de resultados baciloscópicos. Resultado. Característica
Negativo No se observan bacilos ácidoalcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscópicos observados.
De 1 a 9 BAAR Reportar el número de bacilos en 100 campos.
Positivo (+) Menos de un bacilo por campo en promedio (de 10 a 99 bacilos), en 100 campos observados.
Positivo (++) De uno a diez bacilos por campo en promedio en 50 campos observados. Positivo (+++) Más de 10 bacilos por campo en 20 campos microscópicos observados. * BAAR = Bacilos ácido resistentes
Para baciloscopía en esputo, si el paciente es diagnosticado como positivo, este deberá
iniciar algún tratamiento y ser controlado mediante exámenes baciloscopicos mensuales. Este
deberá presentar negativa la prueba durante el segundo y tercer mes de tratamiento. Si la
baciloscopia continua siendo positiva después del tercer mes, es recomendable realizar un
cultivo microbiológico para confirmar el fracaso al tratamiento.
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En la siguiente tabla, se descr ibe el método utilizado por la CDC (Centers of Diseases Control) para el informe de la cantidad de bacilos acidorresistentes.
Tabla 7.4. Método para el informe de la cantidad de bacilos acidorresistentes observados en frotis teñidos. Fuente bibliográfica: Diagnóstico microbiológico, Elmer W. Koneman, Ed.
panamericana. Cantidad de bacilos observados Método de Informe del CDC
0 Negativo. ( ) 1 2 / 300 campos observados Cantidad observada. (+ o ) 1 9 / 100 campos observados Numero promedio / 100 campos. (1 + ) 1 9 / 10 campos observados Numero promedio / 10 campos (2 + ) 1 9 / campos observados Número promedio / campo (3 + ) Más de 9 / campo observado Más de 9 /campo (4 + )
7.2.3.6. REGISTRO DE RESULTADOS.
El laboratorio deberá llevar un control o registro interno de los resultados de las
baciloscopías revisadas. Este registro puede llevarse acabo en una libreta destinada a llevar
dicho control.
La libreta o bitácora deberá incluir:
* Número de paciente.
* Domicilio.
* Sexo.
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* Edad.
* Nombre del centro de salud.
* Señalar si la baciloscopía se realizó a partir de una preparación o de una muestra.
* Señalar la calidad y condiciones de la muestra.
* Resultado de la baciloscopia
* Observaciones.
* Resultados Positivos deberán ser registrados con tinta roja.
7.2.3.7. CONSERVACIÓN Y ELIMINACIÓN DE LAS PREPARACIONES.
1. Al término de la lectura de la baciloscopía, el portaobjetos deberá ser lavado suavemente
con xilol, se deja secar y se almacena.
2. No deberá desecharse ninguna laminilla, ya sea positiva o negativo, las laminilla deberán
almacenarse durante un año en una caja que impida la exposición de la luz y el polvo.
3. Luego de cumplirse el año, las preparaciones o portaobjetos deberán ser colocados en un
envase para vidrio (contenedor para materiales punzo cortantes), para su posterior
esterilización y desecho.
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7.2.3.8. CAUSAS DE ERROR EN LA BACILOSCOPÍA.
1. Causas relacionadas con la muestra.
a). Mala calidad de la muestra o volumen insuficiente.
b). Rotulación inadecuada en la muestra.
2. Causas relacionadas con la preparación del frotis.
a). No tomar la porción adecuada de la muestra para su tinción.
b). La preparación de demasiados frotis simultáneos.
c). Muestras contaminadas por el uso inadecuado de los aplicadores de madera.
d). Un área de trabajo insuficiente.
c) Mezclar laminillas.
3. Causa r elacionadas con la tinción.
a). Uso de laminillas rayadas.
b). Calentamiento excesivo de la carbol fuscina durante su preparación (el secado y la
ebullición forman cristales en el frotis).
c). Inadecuada decoloración de la preparación, el lavado insuficiente puede ocasionar
la confusión de micobacterias con otros bacilos no ácido resistentes
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4. Causas relacionadas durante la lectura de la prueba.
a). Lectura de un número de campos menor de lo indicado.
b). Falta de habilidad para distinguir a los bacilo de los artefactos de la tinción.
c). No verificar el número de identificación del paciente con la del porta objetos.
d). Rotulado del portaobjetos ilegible.
e). Presencia de micobacterias en el aceite de inmersión, la punta del gotero del aceite
de inmersión no debe topar con la preparación.
f). Registro equivocado del resultado observado.
Antes de proseguir con el desarrollo de los siguientes temas, debo aclarar que solo
laboratorios con un nivel II de servicios o superior pueden realizar cultivos microbiológicos,
identificación de género y especie y pruebas de susceptibilidad. Aquellos laboratorios que
posean un nivel I de servicio, solo se ocupan de recoger la muestra, realizar la baciloscopia y
en todo caso subrogarla a un laboratorio de referencia que posea un nivel II o superior de
servicio.
Para el diagnostico de tuberculosis, los laboratorios se han clasificado de acuerdo a los
servicios que estos pueden brindar. En la siguiente tabla se describen dichos niveles de
servicios.
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Tabla.7.5. Niveles en los laborator ios para el procesamiento de muestras.
NIVELES PROCESOS
NIVEL 1
1. Recolección de muestras clínicas adecuadas, incluidos esputos inducidos por aerosol.
2. Transporte de muestras a laboratorios de un nivel superior para posterior aislamiento e identificación.
3. Pueden prepararse y examinarse frotis para el diagnóstico presuntivo o como una forma de seguimiento de la evolución de pacientes ya diagnosticados en tratamiento quimioterapéutico.
NIVEL 2
1. Pueden realizarse todas las funciones de los laboratorios de "nivel I" y procesarse muestras según sea necesario para cultivos en medios sólidos y líquidos
2. Pueden llevar acabo la identificación de Mycobacterium tuberculosis.
3. Pueden realizarse estudios de susceptibilidad a las drogas contra M. tuberculosis con drogas antituberculosas de primera línea.
4. Pueden conservar los cultivos de micobacterias durante un tiempo razonable.
NIVEL 3
1. Pueden realizarse todas las funciones de los laboratorios de "nivel I" y "nivel II", y también pueden identificar todas las especies de Mycobacterium a partir de muestras clínicas.
2. Pueden realizar estudios de susceptibilidad a drogas contra micobacterias.
3. Pueden conservar cultivos de micobacterias durante un tiempo razonable.
4. Pueden realizar trabajos de investigación y proporcionar capacitaciones.
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7.3. CULTIVO MICROBIOLÓGICO.
El primer medio de cultivo para micobacterias fue el preparado con huevos enteros y
mezcla de féculas de papas, glicerol y sales, solidificado por calentamiento a 85 º C a 95 º C
durante 30 a 45 minutos. El proceso de solidificación por calor del medio que contiene
proteínas es conocido como "CONDENSACIÓN". Un medio de cultivo condensado es más
susceptible a la licuefacción proveniente de los efectos de las enzimas proteolíticas
producidas por bacterias contaminantes que en un medio solidificado por el agregado de agar
7.3.1. MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS.
Existen diversos medios de cultivo, para el desarrollo de las micobacterias, de la
variedad de cultivos existentes, los podemos dividir en dos: MEDIOS DE BASE SÓLIDA
(Medios selectivos y no selectivos). Y MEDIOS LÍQUIDOS o CALDOS.
Fig. 7.3.1. Medio de cultivo para micobacterias en frasco.
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7.3.1.1.1. MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS.
Para antes del siglo XIX, aún no existían medios de cultivo para aislamiento de
micobacterias. Fue hasta finales del siglo XIX mediante experimentación, se encontró que en
un medio de cultivo con huevos enteros y mezcla de féculas de papas, glicerol y sales,
solidificado por calentamiento a 85 º C A 95 º C durante 30 a 45 minutos daba como resultado
un medio de cultivo efectivo para las micobacterias. Poco después a este medio se le
agregaron colorantes de anilina como el verde de malaquita y cristal violeta, se observo que
estos colorantes servían como agentes inhibidores de bacterias contaminantes. Actualmente
los fabricantes de medios de cultivo tienen bien establecidas las concentraciones de estos
colorantes como el verde de malaquita (más utilizado), ya que un exceso de estos puede
inhibir el crecimiento de las micobacterias.
En la tabla 7.6. Se describen los medios de cultivo sobre base de huevo para la recuperación
de micobacterias.
Tabla. 7.6. Medios no selectivos para el aislamiento de micobacterias. Medio Componente Agente inhibidor
LowensteinJensen Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa
Verde de malaquita, 0,035 g/100 mL
Petragnani Huevos enteros coagulados, yemas de huevo, leche entera, papa, fécula de papa, glicerol
Verde de malaquita, 0,052 g/100 mL
Medio de la American Thoracic Society
Yemas de huevo frescos coagulados, fécula de papa, glicerol
Verde de malaquita, 0,02 g/100 mL
Middlebrook 7H10 Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, dextrosa.
Verde de malaquita, 0,0025 g/100 mL
Middlebrook 7H11 Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, 0,1 % de hidrolizado de caseína
Verde de malaquita, 0,0025 g/100 mL
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7.3.2. Medio de LowensteinJensen en pico de flauta.
1. El medio de LowensteinJensen, es el más utilizado en los laboratorios clínicos, este es
menos inhibitorio a bacterias contaminantes que el medio de petragnani. Sin embargo a pesar
de que este medio de cultivo es el más antiguo y reconocido, hoy en día se esta dejando de
utilizar, ya que en comparación con el medio de cultivo Middlebrook el medio de
LowensteinJensen es mas más lento para el crecimiento de micobacterias. Sin embargo el
medio de LowensteinJensen posee gran ventaja, ya que los estudios cromogénicos y pruebas
bioquímicas son más exactas cuando son realizados a partir de subcultivos provenientes del
medio de LowensteinJensen.
2. El medio de Petragnani posee gran cantidad de agente inhibidor (0,052 g/100 mL), es muy
utilizado en cultivos a partir de muestras muy contaminadas.
3. El medio de la Amer ican Thoracic Society (ATS), posee tan solo 0,02 g/100 mL de verde
de malaquita, por lo que no es recomendable para muestras de esputo, este medio es muy
utilizado para muestras de LCR, líquido pleural y biopsias de tejidos (muestras regularmente
estériles).
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7.3.3. Crecimiento de M. tuberculosis en medio sólido Middlebrook 7H11.
4. El medio de cultivo Middlebrook7H10 y Middlebrook 7H11, a diferencia del de
LowensteinJensen (tubo en pico de flauta), están preparados en placas transparentes,
permitiendo la observación precoz de micro colonias de micobacterias (microbiólogos con
experiencia pueden observar características morfológicas bien definidas a partir de las
microcolonias) en un tiempo de 10 a 12 días de incubación en lugar de los 18 a 24 días en
promedio requeridos por otros medios. La rapidez de estos medios de cultivo, es la adición de
biotina y catalasa. Además estos medios de cultivo son los mayormente utilizados para las
pruebas de susceptibilidad. La diferencia entre el medio Middlebrook 7H10 y 7H11, es la
adición 0,1 % dehidrolisado de caseína en el Middlebrook 7H11, un aditivo que mejora la
velocidad y el rendimiento de las micobacterias resistentes a Isoniazida (INH). las desventajas
de estos medios, es la poca inhibición hacia la flora contaminante, ya que poseen
concentraciones muy bajas de verde de malaquita, además estos medios de cultivo, a
diferencia del LowensteinJensen (el cual requiere la incubación al 5 o 10% de oxígeno), los
medios de Middlebrook requieren de una incubación en condición absoluta de anaerobiosis.
requieren de una incubación en condición absoluta de anaerobiosis.
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7.3.1.1.2. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS.
Este tipo de medios de cultivo van acompañados de diversos agentes antibacterianos y
antifungicos, los cuales evitan el crecimiento de bacterias contaminantes. Estos medios de
cultivo dan como resultado un aumento enorme en la recuperación de micobacterias. Sin
embargo, para quienes preparan medios de cultivo selectivos para el aislamiento de
micobacterias, debe utilizarse con precaución la inclusión de agentes inhibidores, ya que
estoas pueden ocasionar inhibición de las propias micobacterias.
A continuación, en la siguiente tabla se describen algunos de los medios de cultivo selectivos
más utilizados en el mercado.
Tabla 7.7. Medios Selectivos para el aislamiento de micobacterias. Medio Componentes Agente inhibidor
Modificación de Gruft del Lowenstein jensen
Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa, RNA5mg/100 mL
Verde de malaquita, 0,025 g/100 mL, penicilina, 50 U/mL, Ácido nalidíxico, 35 ug/mL
LowensteinJensen Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, fécula de papa
Verde de malaquita, 0,025 g/100 mL Cicloheximida, 400 ug/mL, Lincomicina, 2u /mL, Ácido nalidíxico, 35 ug/mL
Middlebrook 7H10
Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa.
Verde de malaquita, 0,0025 g/100 mL, Cicloheximida, 360 ug/mL, Lincomicina, 2u/mL, Ácido nalidíxico, 20 ug/mL.
Selectivo 7H11 (Medio de Mitchison)
Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa, hidrolizado de caseína.
Carbenicilina, 50 u/mL, Anfotericina B 10 u/mL , Polimixina B 200 U/mL, Lactato de trimetoprima, 20 ug/mL
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7.3.1.2. PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA.
Dependiendo si la muestra requiere ser procesada previamente por medio de una
descontaminación y desinfección, en general el procedimiento es el siguiente:
1.La muestra es transferida a un tubo cónico de 50 ml.
2.Si la muestra requiere descontaminación previa al cultivo, el tubo cónico con la muestra es
agitada en el agitador vortéx durante 15 a 20 segundos,
3. La muestra es tratada con igual cantidad del agente descontaminante a utilizar.
generalmente se deja actuar el descontaminante (puede ser NacetilLcisteína + NaOH)
durante 15 minutos.
4. Se agrega el buffer de fosfatos. (generalmente hasta la marca de 45 ml del tubo cónico).
5. Antes de centrifugar las muestras en el gabinete de bioseguridad, se limpian las superficies
del recipiente con fenol al 5%.
6. La muestra es centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos, utilizando una centrífuga con
refrigeración abordo.
7. Se decanta el sobrenadante en un recipiente a prueba de salpicaduras, se limpian las
superficies del recipiente con fenol al 5%.
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8. Si el cultivo sólido, es en tubo y en pico de flauta como el de Lowenstein Jensen, el medio
se inocula utilizando una pipeta estéril (se cubre toda la superficie del pico de flauta). se
etiquetan los datos completos del paciente, y se incuba a 37 grados centígrados durante 9
semanas. Durante estas 9 semanas el medio de cultivo se monitorea cada semana.
NOTA **. Es importante realizar la siembra o inoculación en dos tubos de LowensteinJensen
en presencia de 5 o 10% de oxígeno.
10. Si es utilizado un medio de cultivo en placa como el Middlebrook, el procedimiento de la
inoculación es realizada de igual manera que para cualquier cultivo en placa, utilizando un asa
microbiológica.
11. Obviamente el último paso, es la desinfección del área de trabajo y del gabinete de
bioseguridad tipo II, utilizando fenol al 5%.
7.3.2. IDENTIFICACIÓN / PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
La identificación de Mycobacterium tuberculosis mediante pruebas bioquímicas es
hasta ahora la prueba diagnostica más confiable y utilizada, sin embargo, la desventaja de las
pruebas bioquímicas es el tiempo que tarda en obtener los resultados finales. Esta situación ha
dado lugar al perfeccionamiento de técnicas moleculares o cromatográficas.
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7.3.4. Prueba de niacina. Mycobacterium tuberculosis (+).
7.3.2.1. ACUMULACIÓN DE NIACINA.
PRINCIPIO.
Todas las micobacterias no tienen la capacidad de acumular la niacna, sin embargo M.
tuberculosis, M. simiae y ocasionalmente cepas de M. africanum, M. bovis, M. marinum y M.
chelonae si tienen las enzimas para convertir la niacina a ribonucleótido de niacina.
PROCEDIMIENTO.
Como es mostrado en la fotografía, los tubos de ensaye contienen una tira de papel filtro
impregnado con bromuro de cianógeno. Se extraen las colonias provenientes del medio
sólido, mezcladas con un poco de solución salina, se colocan en el fondo del tubo de vidrio.
LECTURA DE LA PRUEBA.
La aparición de un color amarillo en el medio incubado con la tira de niacina abordo, indica la
acumulación de niacina, dando positiva la prueba.
Actualmente se han desarrollado tiras de papel de filtro impregnadas con niacina, eliminando
la necesidad de la utilización de bromuro de cianógeno (sustancia altamente tóxica). Para
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7.3.5. Reducción de nitratos a nitritos. Mycobacterium tuberculosis (+).
evitar un falso negativo, es vital el aislamiento de suficientes colonias de Mycobacterium
tuberculosis en el medio de cultivo.
7.3.2.2. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS.
PRINCIPIO.
Mycobacterium tuberculosis es un gran productor de nitrorreductasa, enzima que cataliza la
conversión de nitratos a nitritos.
LECTURA DE LA PRUEBA.
Como es mostrado en la imagen, la coloración rosarojo en el agregado de ácido sulfanílico y
Nnaftiletilendiamina a un extracto de colonias aisladas de un medio de cultivo, indica la
existencia de nitritos y por tanto afirmando la positividad de la prueba.
Además de Mycobacterium tuberculosis, esta prueba de reducción de nitratos a nitritos es
utilizada para la identificación de M. kansasii y M. szulgai.
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7.3.6. Hidrólisis del Tween 80. Mycobacterium tuberculosis (variablemente positivo)
7.3.2.3. HIDRÓLISIS DEL TWEEN 80.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA.
Tween 80 es el nombre comercial del detergente (derivado polietilenado del monooleato de
sorbitano) que se utiliza para la identificación de micobacterias que son capaces de producir
una enzima lipasa que cliva o hidroliza el Tween 80 en ácido oleico y sorbitol polioxietilado.
Para Mycobacterium kansasii el Tween 80 es una característica positiva para su
identificación.
LECTURA DE LA PRUEBA.
El desarrollo de color rojo es el resultado positivo, ya que indica la capacidad de la bacteria
para hidrolizar el Tween 80.
El cambio de color amarillo a rojo en esta prueba, no es debido a un cambio en el pH, sino al
resultado del cambio en la densidad óptica a medida que se va produciendo ácido oleico y
sorbitol polioxietilado, como productos de degradación del Tween 80.
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7.3.7. Prueba de catalasa Mycobacterium tuberculosis ()
7.3.2.4. PRUEBA DE LA CATALASA A 68 GRADOS CENTÍGRADOS.
PRINCIPIO.
La mayoría de las micobacrterias son capaces de producir la enzima catalasa, sin embargo no
todas las especies son capaces de producirla en condiciones de temperatura elevada a 68
grados centígrados durante 20 minutos (catalasa termoestable). Normalmente esta prueba
bioquímica es negativa para las micobacterias tuberculosas, con excepción de las cepas de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a la isoniazida, por lo que esta prueba es de gran
ayuda en tales casos.
LECTURA DE LA PRUEBA.
La lectura de la prueba es realizada en tubos de LowensteinJensen ubicados en posición
vertical y no en pico de flauta, esto para que la superficie plana del medio sea inoculada e
incubada durante 14 días antes de agregarle el peroxido de hidrógeno. Si en el tubo se levanta
una columna de efervescente o de burbujas de unos 4 mm de diámetro, la prueba es
considerada como positiva.
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7.3.8. Prueba de catalasa en medio de Middlebrook 7H11. Mycobacterium tuberculosis ()
Si se quiere evitar el tiempo de 14 días de incubación a 68 grados centígrados para revisar la
prueba de la catalasa después del cultivo primario, se puede utilizar un medio de Middlebrook
7H10 o 7H11 (como cultivo primario), agregando unas gotas de peróxido en la superficie de
las colonias y observar rápidamente el resultado de la prueba.
7.3.2.5. PRUEBA DE LA ENZIMA ARILSULFATASA.
PRINCIPIO.
Normalmente ciertas especies pertenecientes a las micobacterias de crecimiento rápido, son
positivas a esta prueba. La aril sulfatas es una enzima que cliva fenolftaleína libre a partir de
la sal tripótasica del disulfito de fenolftaleína.
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7.3.9. Prueba de la enzima arilsulfatasa. Mycobacterium tuberculosis ()
PROCEDIMIENTO Y LECTURA DE LA PRUEBA.
La prueba es realizada, agregando bisulfato de fenolftaleína tripotásica a un tubo que contiene
sustrato de fenolftaleína en agar ácido oleico (Wayne).
En 3 o 14 días de incubación, la lectura de la prueba puede realizarse al observar una
coloración rojo a rosa después de la adición de carbonato de sodio, lo cual indica que la
prueba es positiva.
La prueba es negativa cuando no hay cambio de color después de la adición de carbonato de
sodio.
7.3.2.6. PRUEBA DE LA UREASA.
PRINCIPIO.
Esta prueba trata de verificar si la micobacteria es capas o no de producir la enzima ureasa.
Esta enzima hidroliza la urea, y por consiguiente se forma amoníaco y dióxido de carbono. El
amoniaco reacciona en solución, formando carbonato de amonio, ocasionando así una
alcalinización del medio como resultado del aumento del pH de la solución. (es la causa del
vire de la solución).
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7.3.10. Prueba de la ureasa. Mycobacterium tuberculosis (+)
PROCEDIMIENTO.
Esta prueba puede ser realizada, inoculando al microorganismo en agua destilada, la cual
contenga un concentrado sobre la base de urea, o bien se pueden utilizar discos de papel
impregnados con urea y estos se agregan al agua destilada.
LECTURA DE LA PRUEBA.
Si ocurre un cambio de color a rosa en la solución, la prueba es ureasa (+), si no ocurre
cambio de color, la prueba es ureasa ().
7.3.2.7. PIRAZINAMIDASA.
PRINCIPIO.
La pirazinamidasa es una enzima producida por ciertas micobacterias, la cual deamina la
pirazinamida para formar ácido pirazinoico, tal compuesto produce una banda o anillo en el
medio.
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7.3.11. Prueba de la pirazinamida. Mycobacterium tuberculosis (+)
LECTURA.
Utilizando un caldo con base de Dubos, previamente sembrados con un subcultivo de la
muestra problema, este se coloca a incubar durante 4 días aproximadamente. Después de la
incubación, al agregar sulfato de amonio ferroso, en el medio sobresale un anillo de color
rojorosado es la indicación de que la micobacteria es capas de desaminar la pirazinamida.
7.3.2.8. INCORPORACIÓN DE HIERRO.
Algunas micobacterias como M. fortuitum, tienen la capacidad de incorporar sales de
hierro solubles desde el medio de cultivo, al agregarle una solución acuosa al 20 % de citrato
de amonio férrico, se produce un aspecto marrón en la colonia, lo cual indica que la prueba es
positiva.
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7.3.12. Prueba de crecimiento en T2H. Mycobacterium tuberculosis (+).
7.3.2.9. INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO POR LA HIDRAZIDA DEL ÁCIDO
TIOFENO2CARBOCÍLICO (T2H).
La hidrázida del ácido tiofeno2carboxílico (T2H) inhibe selectivamente el desarrollo
de Mycobacterium bovis, mientras que otras micobacterias pueden crecer en un medio que
contenga este compuesto.
Si se siembran tres cepas de micobacterias en un medio de cultivo Middlebrook 7H11 de
cuatro cuadrantes, y además se siembra Mycobacterium bovis en el cuarto cuadrante, se tiene
como resultado la inhibición del crecimiento de Mycobacterium bovis, y el crecimiento de las
demás micobacterias. Esta prueba es fundamental para la diferenciación de Mycobacterium
bovis (con crecimiento) de Mycobacterium tuberculosis (sin crecimiento).
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7.3.2.10. CRECIMIENTO EN CLORURO DE SODIO AL 5% .
Ciertas micobacterias tienen la capacidad de crecer en un medio de cultivo de base de
huevo con NaCl al 5%, cuando se incuban a 28 grados centígrados. Estas micobacterias son:
M. flavescens, M. triviale y las micobacterias de crecimiento rápido (excepto M. chelonei).
Las demás no pueden resistir a una gran concentración de sales.
La prueba se realiza en un medio de LowensteinJensen en pico de flauta, el cual contiene
NaCl al 5%, esta prueba no se realiza en un medio de cultivo en placa como el Middlebrook.
7.3.2.11. CRECIMIENTO EN AGAR MACCONKEY
Algunas micobacterias son capaces de crecer en este medio de cultivo (se debe
eliminar el cristal violeta), Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium chelonei son capaces
de crecer en este medio.
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TABLA 7.8. Características bioquímicas diferenciales para el diagnóstico de Micobacterias
PATÓGENAS.
(+) Positivo, () Negativo, V Variable, Espacios blancos Pocos datos
TABLA 7.7. Características bioquímicas diferenciales para el diagnóstico de Micobacterias PATÓGENAS.
MICROORGANISMO
Temper atura de
aislamiento y tiempo pa ra
el crecimiento óptimos en medio de
cult ivo sólido Middlebrook
Pigmenta ción /luz
P igmentación / oscuridad
Pr ueba de la niacina
Reducción de nitra to
Hidr ólisis del
Tween 8010 días
Catalasa
pH 7.0 Aa 68ºC
Ar ilsulfatasa 3 día s Ur easa Pir azina midasa Incor por ación
de hier ro
Crecimiento sobre la hidr az ida de l ácido t iofeno2 car boxílico (T2H)
Cr ecimiento e n 5% de NaCl
Crecimiento e n Aga r
MacConkey
M. tuberculosis 37 ºC 12 a 25 días Gamuza Gamuza (+) (+) V (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)
M. africanum 37 ºC 31 a 42 días Gamuza Gamuza V V (—) (—) (—) V (—) (—) (+) (—) (—)
M. bovis 37 ºC 24 a 40 días Gamuza Gamuza V (—) (—) (—) (—) (+) (—) (—) (—) (—) (—)
M. ulcerans 32 ºC 28 a 60 días Gamuza Gamuza (—) (—) (—) (+) (—) V (—) (—) (+) (—) (—)
M. kansasii 37 ºC 10 a 20 días Amarillo Gamuza (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)
M. marinum 30 º C 5 a 14 días Amarillo Gamuza V (—) (+) (—) V (+) (+) (—) (+) (—) (—)
M. simiae 37 ºC 7 a 14 días Amarillo Gamuza (+) (—) +/ (+) (—) (+) (—) (—) (+) (—)
M. asiaticum 37 ºC 10 a 21 días Amarillo Gamuza (—) (—) (+) (+) (—) (—) (—) (—) (+) (—)
M. szulgai 37 ºC 12 a 25 días
Amarillo a naranja
Amarillo a 37 ºC
Gamuza a 25 ºC
(—) (+) V (+) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—)
M. scrofulaceum 37 ºC 10 días Amarillo Amarillo (—) (—) (—) (+) (—) (+) V (—) (+) (—) (—)
M. gordonae 37 ºC 10 días Amarillo a naranja Amarillo (—) (—) (+) (+) (—) (—) V (—) (+) (—) (—)
M. thermoresistible 45 ºC 7 días Amarillo Amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—)
M. flavescens 37 ºC 7 a 10 días Amarillo Amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) V (—)
M. xenopi 42 ºC 14 a 28 días Amarillo Amarillo (—) (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—) (—)
Complejo M. avium 37 ºC 10 a 21 días
Gamuza a amarillo pálido
Gamuza a amarillo pálido
(—) (—) (—) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—) V
M. haemophilum 30 ºC 14 a 21 días Gris Gris (—) (—) (—) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—)
M. malmoense 37 ºC 21 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) V (—) V V (—) (+) (—)
M. shimoidei 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (—) (—) (—) (+) (—) (+) (—) (—)
M. genavense 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (+) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (—)
M. celatum 37 ºC 14 a 28 días Gamuza Gamuza (—) (—) (—) (+) (+) (—) (+) (—) (+) (—) (—)
M. gastri 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—) (+) (—) (—)
Complejo M. terrae 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) V (+) (+) (+) (—) V (—) (+) (—) V
M. triviale 37 ºC 10 a 21 días Gamuza Gamuza (—) (+) (+) (+) V (—) V (—) (+) (+)
M. fortuitum 37 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza (—) (+) V (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
M. chelonae spp chelonei
28 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza V (—) V (+) (+) (+) (+) (—) (+) (—) (—)
M. chelonae spp abscessus
35 ºC 3 a 5 días Gamuza Gamuza (—) (—) V (+) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (+)
M. smegmatis 37 ºC 3 a 5 días
Gamuza a amarillo
Gamuza a amarillo (—) (+) (+) (+) (—) (+) (+) (—)
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 133
7.4. MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS * CALDOS Y SISTEMAS DE DETECCIÓN
AUTOMATIZADOS.
Se ha demostrado que las personas que utilizan botellas de caldo de cultivos líquidos
BACTEC 12B® han experimentado un índice mayor de recuperación de M. tuberculosis y
otras especies de Mycobacterium de 1 a 2 semanas antes que quienes utilizan sólo medios de
cultivo sólidos. Por esto, el empleo de medios de cultivo líquidos para la recuperación
temprana de micobacterias es muy recomendado en la actualidad.
Hasta hoy en día se disponen de tres sistemas automatizados para la detección de
micobacterias:
• El sistema radiométrico BACTEC aceptado y probado por el tiempo,
• El recientemente introducido sistema no radiométrico MB/BacT (Organon Teknika
Durham, NC)
• El sistema ESP Myco (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Dos alternativas posibles para los laborator ios sin sistemas automatizados son:
• El método manual SeptiChek System (BBL)
• El sistema MGIT (Becton Dickinson, Cockeysville, MD).
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 134
7.4.1. SISTEMAS DE DETECCIÓN AUTOMATIZADOS
7.4.1.1. SISTEMA RADIOMETRICO BACTEC AFB
CONSTRUCCIÓN.
Los componentes del instrumento automatizado BACTEC 460 (Becton Dickinson
Diagnostic Instruments, Sparks, MD) incluyen un contador de centelleo, un conjunto de
agujas de aspiración y un riel móvil en el que pueden colocarse hasta 60 botellas de cultivos.
El riel es alineado de modo que cada botella de cultivo pasa por turno bajo el conjunto de
agujas de aspiración a una velocidad de aproximadamente una cada 80 segundos. El
instrumento está equipado con una campana que proporciona aire filtrado por filtros HEPA
bajo presión negativa en el área de prueba y una fuente de luz UV como características de
seguridad adicionales. La aguja es esterilizada por calor electrotécnico durante el intervalo
previo a que se tome la muestra de la próxima botella.
Fig. 7.4.1. Sistema radiométrico BACTAEC AFB
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El principio de operación del BACTEC AFB incluye la aspiración de la columna de gas
existente por encima del medio de cultivo de un frasco ampolla sembrado, y la detección
cuantitativa de la radiactividad en el aspirado (C14), la que a su vez refleja el grado de
desarrollo en el frasco ampolla. Los conteos radiactivos del gas se comparan con un valor
basal predeterminado, y de esta forma puede establecerse un índice de desarrollo
BOTELLAS.
Cuando la botella problema está justo debajo del conjunto de agujas, la aguja es
introducida a través del tapón de goma en el espacio de la cabeza. Se aspira una muestra
del gas de la cabeza y se libera a la cámara del contador de centelleo. El gas de la cabeza es
reemplazado con un bolo fresco de CO2 al 10% inmediatamente después de que la muestra es
aspirada.
La botella del caldo de cultivo BACTEC 12B es la clave para la operación. Consiste en un
frasco ampolla de vidrio de 20 mL con un cuello corto, la boca del cual se sella con un fino
tapón de goma. Contiene 4 mL de medio de cultivo líquido que consiste en una base de caldo
de Middlebrook 7H9, BSA, hidrolizado de caseína, catalasa y estearato de polixileno como
enriquecedores del crecimiento, pequeñas cantidades de una mezcla antimicrobiana de
polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima y azlocilina para evitar el
crecimiento de contaminantes y ácido palmítico marcado con 14C como detector del
crecimiento.
7.4.2. Botella para cultivo de micobacterias y detección en el sistema radiométrico BACTEC
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 136
El frasco ampolla se inocula con 0,5 mL de la muestra procesada y se coloca en una estufa a
35°C. Si hay micobacterias en el inóculo, se libera 14CO2 en el espacio de la cabeza y la
cantidad de éste refleja directo la cantidad de crecimiento en el frasco
ampolla. Se utiliza un sistema detector de radiactividad muy sensible debido a que el
metabolismo muy lento de las micobacterias produce sólo cantidades mínimas de CO2.
LECTURA DE LA PRUEBA
Cuando ha pasado un período designado de tiempo de incubación, los frascos ampolla se
colocan sobre el riel del instrumento BACTEC 460 preparado para las lecturas. La cantidad
de radiactividad se mide en el gas aspirado de la cabeza, el cual es traducido a un valor
numérico denominado índice de crecimiento (IC). Un IC mayor de 10 se considera positivo;
no obstante, deben realizarse coloraciones para acidorresistentes de una pequeña alícuota del
caldo, ya que otras bacterias pueden vencer la inhibición antibiótica.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS.
Con el empleo del sistema BACTEC en comparación con los medios sólidos convencionales,
se ha comunicado tanto un aumento de la cantidad de cultivos positivos provenientes de
muestras clínicas como una disminución del tiempo de detección, El tiempo de detección para
M. tuberculosis promedia los 9 a 14 días; puede ser de menos de 7 días para algunas cepas de
micobacterias diferentes de M. tuberculosis.
Las desventajas del sistema incluyen el costo de los instrumentos, la imposibilidad de
observar la morfología de las colonias y detectar cultivos mixtos, el sobrecrecimiento por
contaminantes, la necesidad de desechar materiales radiactivos y el uso de muchas agujas.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 137
Las muestras procesadas con otros reactivos distintos del NALCNaOH (como el cloruro de
benzalconio o el Zephiranfosfato trisódico) no se pueden emplear con el sistema BACTEC
debido a que las cantidades residuales en el caldo inhibe potencialmente el desarrollo de las
micobacterias.
Una ventaja adicional del sistema BACTEC es la capacidad de realizar estudios rápidos de
susceptibilidad a las drogas antimicobacterianas. El instrumento BACTEC, también se puede
utilizar para diferenciar M. tuberculosis y M. bovis de las micobacterias no tuberculosas
mediante el empleo de frascos ampolla de cultivos de sangre con pnitroacetilamino
hidroxipropiofenona , (NAP). M. tuberculosis y M. bovis no pueden desarrollarse en medios
de cultivo con NAP y, por lo tanto, no pueden producir un IC positivo después de varios días
de incubación.
7.4.1.2. SISTEMA DE DETECCIÓN DE MICOBACTERIAS MB/BACT
CONSTRUCCIÓN
Las micobacterias son bacterias aeróbicas, por lo tanto estas consumen oxígeno (O2) y
generan bióxido de carbono (CO2) como parte de su metabolismo. El sistema automatizado
MB/BACT, posee una lámpara luz, el equipo hace reflejar el haz de luz visible hacia el sensor
del fondo de la botella Bactec . El fondo de la botella cambia de color conforme el grado de
bióxido de carbono (CO2) producido.
7.4.3. Construcción de la lámpara de luz, del equipo MB/BACT
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 138
Finalmente el software del equipo registra el cambio de color determinando el grado de
positividad de la muestra.
BOTELLAS
El MB/BacT es un sistema automatizado para detectar micobacterias. Las botellas para
procesamiento MB/BacT contienen 10 mL de caldo de Middlebrook 7H9 enriquecido
en una atmósfera de bióxido de carbono (CO2), nitrógeno y oxígeno bajo vacío. Por esta
razón, esta botella proporciona las condiciones nutritivas y ambientales adecuadas para
recuperar las especies de Mycobacterium encontradas con más frecuencia en las muestras
clínicas de sangre.
7.4.5. Sistema MB/BACT 950, muy utilizado para el procesamiento de hemocultivos.
7.4.4. Fondo de botella, comparación de resultados: positivo y negativo.
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Se agrega medio mililitro del suplemento antibiótico reconstituido para micobacterias que
contiene anfotericina B, azlocilina, ácido nalidíxico, polimixina B, trimetoprima y factores de
crecimiento patentados a cada botella justo antes de usarlas para aumentar el desarrollo de
especies de Mycobacterium y reducir el de las bacterias contaminantes que puedan sobrevivir
al procedimiento de descontaminación y concentración, El fondo de cada botella de caldo está
cubierto con un sensor permeable al gas que cambia de verde oscuro a amarillo brillante
cuando se produce bióxido de carbono (CO2) en el caldo por el metabolismo de las
micobacterias.
Las botellas se colocan paradas dentro de los orificios individuales en la cámara incubadora, y
se utiliza luz reflejada para monitorear continuamente la producción de CO2 generada por las
bacterias.
Conforme la micobacteria crece en el medio, esta consume oxígeno, y el compuesto
fluorescente embebido en el fondo del tubo al no estar unido con el oxígeno es capaz de emitir
luz fluorescente.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
7.4.6. Botellas de cultivo líquido, para uso en el sistema MB/BACT 950, obsérvese la fluorescencia en el fondo de las botellas.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 140
A pesar de que los ensayos de campo multicéntricos patrocinados por los fabricantes indican
que el sistema radiométrico BACTEC tiene ventaja sobre el sistema MB/BacT. Este último
recupera un porcentaje más alto de micobacterías con menos tiempo en comparación con los
métodos convencionales y la detección colorimétrica del crecimiento micobacteriano elimina
la necesidad del manejo y descarte de reactivos con radioisótopos, esta es una ventaja clara.
7.4.1.3. SISTEMA ESP MYCO
CONSTRUCCIÓN
Cada botella de cultivo, cuando se coloca en una gaveta especial en el módulo de la
estufa, es unida a un sensor, que consiste en una caja plástica, una aguja suspendida y una
membrana hidrofóbica. Así, cada botella es continuamente monitoreada para evaluar
cualquier cambio en la presión de gas debido a la actividad metabólica de los
microorganismos en la botella de cultivo. Los cambios de presión significativos pueden ser
indicados tempranamente a partir del consumo de oxígeno; o, más tarde, con la producción de
gases del metabolismo de los microorganismos.
Fig. 7.4.7. Sistema ESP MYCO, Un sistema moderno, el cual se auto revisa diariamente y lleva un control automático del índice de crecimiento.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 141
BOTELLAS
Cada botella contiene medio modificado de Middlebrook 7H9, Casitone, glicerol y esponjas
de celulosa. Las esponjas proporcionan una plataforma de crecimiento para las micobacterias,
ya que simulan los alvéolos de los pulmones. Inmediatamente antes de la inoculación de la
muestra, cada botella es suplementada con una mezcla antibiótica (PVNA) que contiene
polimixina B, vancomicina, ácido nalidíxico y anfotericina B.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Este sistema esta basado en la señal temprana durante la fase del consumo de oxígeno en el
ciclo de crecimiento, ya que las botellas están unidas a un sensor durante su incubación y son
monitoreadas continuamente.
El método de detección no radiométrico utilizado también excluye la necesidad de manipular
y descartar materiales radiactivos.
7.4.1.4. SISTEMA MGIT 960
CONSTRUCCIÓN
El Bactec MGIT960 es un sistema automatizado no radiométrico de alto rendimiento
para al detección de micobacterias, diferenciación y pruebas de susceptibilidad. Este sistema
utiliza tubos MGIT para hacer crecer a la micobacteria, así como probar su susceptibilidad a
diversos compuestos antituberculosos.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 142
Un compuesto fluorescente es embebido en siliconas en el fondo del tubo. Este compuesto es
sensible al oxígeno disuelto en el medio (no emite fluorescencia en contacto con un alto grado
de oxígeno).
Conforme la micobacteria crece en el medio, esta consume oxígeno, y el compuesto
fluorescente embebido en el fondo del tubo al no estar unido con el oxígeno es capaz de emitir
luz fluorescente.
La lectura de estos tubos, se pueden realizar ya sea utilizando el equipo automatizado: MGIT
960, o bien realizando la lectura manual de los tubos frente a una luz UV. Más adelante se
explica esta forma de lectura manual
Fig. 7.4.8. Fundamento químico de los tubos MGIT.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 143
La micobacterias que identifica el equipo son:
• M. tuberculosis
• M. aviumintracellulare
• M. kansasii
• M. xenopi
• M. simiae
• M. flavescens
• M. chelonae
• M. fortuitum
• M. gordonae
Fig. 7.4.9. Sistema automatizado MGIT 960, posee una amplia base de datos, para la detección definitiva de diversas micobacterias patógenas.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 144
BOTELLAS
El sistema Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) (BBL, Becton Dickinson,
Microbiology Systems, Hunt Valley, MD) consiste en un tubo de vidrio con fondo redondo de
16 x 100 mm que contiene 4 mL de base de caldo Middlebrook 7H11 modificado, al cual se le
ha agrega 0,5 mL de OADC como enriquecimiento (ácido oleico, albúmina bovina, dextrosa y
catalasa) y 0,1 mL de la mezcla antibiótica PANTA (polimixina B, anfotericina B, ácido
nalidíxico, trimetoprima, azlocilina).
La mezcla antibiótica inhibe el desarrollo de bacterias contaminantes; el suplemento OADC
proporciona ácido oleico, un importante estimulante metabólico para las micobacterias;
albúmina, para unirse a los ácidos grasos libres tóxicos; dextrosa, como fuente de energía; y
catalasa, para destruir los peróxidos tóxicos que pueden estar presentes en el medio. Un
compuesto fluorescente es embebido en siliconas en el fondo del tubo. Este compuesto es
sensible al oxígeno disuelto en el medio; es decir, la presencia de oxígeno en el medio no
inoculado sirve para extinguir la emisión de luz fluorescente.
.
Fig. 7.4.10. Tubo indicador MGIT, si el sistema automatizado falla, con una simple lámpara de luz ultravioleta, visualmente se puede revisar la identificación.
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Q.B.P. Eliel Mendoza Wong 145
LECTURA
Para realizar la prueba, los 0,1 mL de PANTA y los 0,5 mL de la mezcla OADC se
agregan asépticamente al tubo, y se reconstituye el medio liofilizado. Esto es seguido por 0,5
mL de muestra o un concentrado de ella; si se agrega más de 0,5 mL de muestra puede afectar
adversamente el rendimiento del tubo. Se coloca la tapa, se mezclan los ingredientes por
inversión del tubo varias veces y se coloca el tubo en la estufa del equipo MGIT 960 a 37°C
Como el crecimiento bacteriano activo consume el oxígeno disuelto, la fluorescencia es
desenmascarada y es detectada automáticamente por el equipo MGIT 960. Además estos
tubos pueden leerse manualmente mediante el uso de una lámpara de luz ultravioleta (véase
más adelante).
7.4.2. SISTEMAS DE DETECCIÓN MANUALES (SEMIAUTOMATIZADOS).
7.4.2.1. SISTEMA SEPTICHEK AFB
CONSTRUCCIÓN
Este sistema consiste en una botella tapada que contiene 20 mL de caldo Middlebrook 7H9
modificado bajo bióxido de carbono (CO2) al 20%. Un segundo componente es un tubo
plástico, tapado en un extremo con una tapa a rosca removible, dentro del cual está incluida
una paleta de dos caras, en cuyas dos superficies está embebido el medio sólido.
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Una superficie de la paleta está cubierta con agar Middlebrook 7H11 no selectivo; el lado
opuesto está dividido en dos secciones, una contiene medio LJ modificado y la otra agar
chocolate para detectar el crecimiento de bacterias contaminantes.
LECTURA
El sistema se procesa mediante extracción de la tapa de la botella que contiene el medio de
cultivo, al cual se le agrega 1 mL de un suplemento reconstituido, también provisto por el
fabricante, compuesto de glucosa, glicerina, ácido oleico, piridoxina, HCl, catalasa, albúmina,
azlocilina, ácido nalidíxico, trimetoprima, polimixina B Y.Afifotericina B. El caldo
suplementado se inocula luego con 0,5 mL de una muestra tratada con NALCNaOH. Se
retira la tapa a rosca de la parte superior de la paleta y se asegura el conjunto a la botella de
caldo de cultivo.
Fig.7.4.11. Sistema no automatizado SEPTICHEK, estos sistemas poseen la gran ventaja de poseer 2 medios bifásicos: sólidolíquido, que permite la recuperación de M. tuberculosis más rápidamente, que cuando se utilizan medios de cultivo sólidos.
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Los medios de cultivo sólidos sobre la paleta son inoculados invirtiendo el conjunto, para
permitir que la mezcla del caldo de cultivo bañe toda la superficie del agar. El sistema es
colocado luego en una estufa a 35°C en posición vertical. Las superficies del agar y los
medios de cultivo se examinan cada tres días para ver la aparición del desarrollo, después de
lo cual, si es negativo, el conjunto se invierte de nuevo para reinocular el medio con agar.
Si se observa crecimiento, deben realizarse frotis para acidorresistentes a partir de las colonias
aisladas que desarrollan sobre la superficie del agar y pueden realizarse subcultivos del caldo
a los medios selectivos apropiados o pueden prepararse para el
análisis de sondas de DNA.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS.
Mejor índice de recuperación que los medios sólidos, atribuido a la naturaleza bifásica
del sistema y la ventaja se obtenía por la repetida exposición temprana del medio con agar a
los microorganismos que proliferaron en la fase líquida.
Comparado con el LJ y el Middlebrook 7H11, el promedio de días para la recuperación de
micobacterias es menor para el sistema SeptiChek AFB; 3 días menos para la detección de
M. tuberculosis y 9 días menos para el M. aviumintracellulare.
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7.4.2.2. TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO DE MICOBACTERIAS (MGIT).
BOTELLAS
Los tubos MGIT son iguales a los utilizados en el sistema MGIT 960, para aquellos usuarios
que no dispongan del equipo automatizado, solo tienen que comprar los tubos MGIT, realizar
el procedimiento descrito anteriormente, y leer la fluorescencia del tubo visualmente mediante
el uso de una lámpara ultravioleta.
LECTURA
Los tubos se leen por medio, de una lámpara de Wood, colocando el tubo con la mezcla que
se va a probar entre un control positivo (solución de sulfito de sodio) y uno negativo (tubo
MGIT sin inocular).
* NOTA. No leer en la oscuridad.
Fig. 7.4.12. Tubo indicador MGIT
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Colocar los tubos en forma vertical directamente en la lámpara de Wood o un
transiluminador.
* Si observa una fluorescencia naranja o resplandor naranja, la prueba es positiva.
* Si no se observa la fluorescencia naranja, la prueba es negativa.
Se deben utilizar anteojos protectores de luz UV para observar el color naranja brillante en el
fondo de los tubos positivos, con una reflexión naranja observada también en el menisco.
Los tubos positivos se tiñen para acidorresistentes. Los tubos negativos se colocan
nuevamente en la estufa y se observan a intervalos regulares hasta las 6 semanas.
7.4.2.2.1. LECTOR BACTEC MICROMGIT ™
El lector MGIT ™, es utilizado en laboratorios de pequeño volumen o laboratorios con
poco espacio de trabajo para cultivo de micobacterias.
Este lector MicroMGIT ayuda de una manera sencilla a interpretar el nivel de fluorescencia
en el tubo MGIT, eliminando así la subjetividad de la lectura visual.
.
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El lector es fácil de usar, es operado con una batería intercambiable, no requiere energía
eléctrica, utiliza un botón sencillo de operación y uso de iconos en pantalla.
Solamente se coloca el tubo en la parte superior del lector, y la lectura es automática
eliminando así la subjetividad visual
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Todas las reacciones positivas deben ser confirmadas por una coloración para
acidorresistentes debido a que en ocasiones pueden desarrollar otras bacterias que consumen
oxígeno a pesar de la mezcla antibiótica PANTA. Una desventaja importante es el alto costo
de cada tubo (unos 8 dólares por unidad); sin embargo, esto es compensado en algún grado,
ya que la fluorescencia se observa visualmente y no requiere equipos elaborados o costosos.
Fig. 7.4.13. Lector manual de tubos MGIT
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Tabla 7.9. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE SISTEMAS AUTOMATIZADOS Y SEMI AUTOMATIZADOS PARA LA DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosis.
SISTEMA LECTURA VENTAJAS DESVENTAJAS
BACTEC AFB
AUTOMATIZADA
Detección radiométrica mediante radioisótopos (Detección de CO2 marcado con el isótopo radioactivo C14 )
Aislamiento en 9 a 14 días.
Es el equipo más específico para la detección de micobacterias, ya que utiliza C14 como un marcador de crecimiento.
En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el BACTEC AFB es más rápido y tiene mayor capacidad de aislamiento
Las pruebas de susceptibilidad para este sistema son altamente confiables y se logran resultados al mismo tiempo del aislamiento o más tardar en 18 días
Costo excesivamente elevado del sistema.
Necesidad de desechar residuos radioactivos
Solo muestras descontaminadas con NALC NaOH podrán ser procesadas en este sistema.
Solo laboratorios con un nivel de bioseguridad III podrá tener este sistema (debido a la utilización de residuos radioactivos).
Requiere un alto nivel de consumibles
MB /BACT
AUTOMATIZADA
Detección calorimétrica (Detección de cambio de color mediante un haz de luz visible)
Aislamiento en 14 días o más
No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos
En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el MB/BACT es más rápido y confiable
Las pruebas de susceptibilidad son rápidas
Se requieren consumibles:
PANTA Y OADC Costo elevado del sistema
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ESP/MYCO
AUTOMATIZADA
Detección de cambios de presión dentro de la botella y la producción de gases (O2, CO2, NH2, H2) por parte de la micobacteria.
Aislamiento hasta en 7 días (es el más rápido) debido al constante monitoreo de las botellas durante su incubación
No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos.
Una gran ventaja de este equipo es el constante monitoreo por agitación automática de las botellas
En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el sistema ESP / MYCO es más rápido y confiable
Cuenta con botellas para uso pediátrico, las cuales requieren poco volumen de hasta 0.1 mL de muestra.
Costo elevado del sistema
Requiere un alto nivel de consumibles
MGIT 960
AUTOMATIZADA
Compuestos fluorescentes embebidos en el tubo; estos indican el consumo de oxígeno de la bacteria que es detectado mediante una lámpara de luz ultravioleta y traducida la señal por el equipo automatizado..
Aislamiento en 14 días o más
No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos
En comparación con los medios de cultivo sólidos y sistemas convencionales, el MGIT es más rápido y confiable
Las pruebas de susceptibilidad son
Costo elevado del sistema.
Se requieren consumibles: PANTA Y OADC
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rápidas, de hasta 7 días.
SEPTICHEK AFB
SEMIAUTOMATIZADA / MANUAL
Detección de colonias aisladas en el medió sólido, su crecimiento es favorecido por la fase líquida de la botella
Aislamiento hasta en 16 y 18 días de incubación.
Es más rápido y confiable que cualquier medio sólido existente, gracias a su naturalidad bifásica de la botella
Costo relativamente accesible
No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos
Si hay crecimiento la identificación del género y especie se realiza mediante 2 pasos: Tinción de acidorresistente y subcultivo en medios sólidos selectivos para posterior identificación mediante pruebas bioquímicas y especialmente sondas de DNA (Biología molecular).
Las pruebas de susceptibilidad se realizan por separado por otros métodos.
TUBO INDICADOR MGIT Y LECTOR MICRO MGIT™
SEMIAUTOMATIZADA / MANUAL
Compuestos fluorescentes embebidos en el tubo; estos indican el consumo de oxígeno de la bacteria. La fluorescencia es detectada visualmente utilizando una lámpara de luz ultravioleta.
Aislamiento hasta en 14 días de incubación.
Ahorra espacio
Costo accesible
Es más rápido y confiable que cualquier medio sólido existente.
No tiene la necesidad de utilizar reactivos radioactivos, y por lo tanto no necesita de un control de bioseguridad para este tipo de residuos
La Identificación solo puede ser a nivel de genero
Las pruebas de susceptibilidad se realizan en tubos separados. (Se tiene que comprar 1 tubo para cada uno de los antituberculosos manejados).
Se requieren consumibles: PANTA Y OADC
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7.5. APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.
Las aplicaciones de la biología molecular en nuestro país están limitadas a laboratorios
muy especializados o laboratorios de investigación. Por su costo estas pruebas diagnosticas no
están disponibles en la mayoría de los laboratorios clínicos de rutina y a menudo son
subrogadas a otros laboratorios. Esta es la desventaja principal de estas pruebas, que a pesar
de ser el futuro de la microbiología diagnostica, aun no se han logrado estandarizar y facilitar
para uso de rutina.
7.5.1. DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE LA
AMPLIFICACIÓN DE SU DNA (PCR).
La amplificación del material genético de M. tuberculosis mediante una reacción enzimática
da lugar a millones de copias del DNA blanco. Teóricamente este hecho convierte a la PCR
en la técnica de diagnóstico más rápida y especifica de todas las técnicas de diagnóstico
actualmente utilizadas, ya que, en teoría esta puede ser utilizada sin la necesidad de aislar
previamente a la micobacteria en un medio de cultivo.
En 1983 a 1985, Kary Mullis desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de
grandes cantidades de un fragmento de DNA sin clonarlo.
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El primer paso consiste en sintetizar fragmentos con secuencias idénticas a las que flanquean
la secuencia blanco. Esto se consigue por medio de una maquina sintetizadora de DNA
.Estos oligonucleótidos sintéticos suelen tener unos 20 nucleótidos de longitud y actúan como
iniciadores de la síntesis de DNA
La mezcla de reacción contiene el DNA blanco (material genético de la micobacteria en este
caso), un gran exceso de los iniciadores deseados, una DNA polimerasa termoestable y cuatro
desoxirribonucleósidos trifosfato.
El ciclo en sí de la P C R tiene lugar en 3 fases:
Fase 1: El DNA blanco que contiene la secuencia que va a amplificarse se desnaturaliza por
calentamiento, separando sus cadenas complementarias.
Fig. 7.5.1. Fase 1, desnaturalización del material genético por calentamiento.
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Fase 2: La temperatura desciende de forma que los iniciadores pueden formar puentes de
hidrógeno con el DNA blanco, uniéndose a ambos lados de la secuencia previamente
separada. Como existe un exceso de iniciadores, las cadenas de DNA blanco normalmente se
asociarán o unirán al iniciador en vez de volverse a unir entre sí.
Fase 3: Se añaden nucleósidos trifosfato y la DNA polimerasa. La DNA polimerasa extiende
a los iniciadores y sintetiza copias de la secuencia del DNA blanco.
Fig. 7.5.2. Fase 2, Al bajar la temperatura, los iniciadores vuelven a formar puentes de hidrógeno y se unen a la secuencia del DNA blanco.
Fig. 7.5.3. Fase 3, Se añade la DNA polimeraza y los nucleósidos trifosfato.
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Al final de cada ciclo, las secuencias del DNA blanco de ambas cadenas han sido copiadas.
Cuando se repite el ciclo, las cuatro cadenas producidas en el primer ciclo se copian para
producir 8 fragmentos nuevos, el tercer ciclo generará 16 productos. En teoría 20 ciclos
producirián 1 millón de copias de la secuencia blanco.
La desventaja de esta maravillosa técnica es el difícil manejo durante su procedimiento y que
esta debe de estar sujeta a estrictos controles de calidad, sin mencionar su precio. Actualmente
en laboratorios especializados o de referencia, primeramente se obtiene el aislamiento por
cultivo, luego utilizan la amplificación del material genético de las colonias aisladas mediante
un termociclador, y finalmente identifican el agente mediante la hibridación con sondas de
DNA marcadas (véase más adelante). En países ya desarrollados, la PCR ha sustituido a la
identificación de micobacterias por medio del uso de pruebas bioquímicas.
Fig 7.5.5. Termociclador de PCR moderno para la amplificación del DNA .
Fig. 7.5.4. Finalmente, se completa el ciclo, y de una cadena de DNA se forman 4.
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Existen también diversas variantes de la PCR, cono la PCR inversa, PCR anidada, PCR
múltiple; todas ellas desarrolladas con fines diagnósticos, que sin duda fijan el futuro próximo
de la microbiología clínica.
7.5.2. USO DE SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA LA CONFIRMACIÓN DE
CULTIVOS POSITIVOS DE Mycobacterium tuberculosis.
Una sonda es una secuencia de cadena simple de ácido nucleico que puede hibridar
específicamente con su cadena complementaria mediante el apareamiento de bases. Una
sonda puede ser tanto de DNA o RNA. El principio de esta tecnología, es la desnaturalización
del DNA blanco, y la posterior hibridación con una sonda de DNA o RNA marcada con un
compuesto radioactivo.
Actualmente en el mercado, existen diferentes reactivos de sondas de DNA da cadena simple
marcadas con I 125 (radioisótopo radioactivo de yodo 125) complementarias del rRNA de
diversas especies de micobacterias, entre ellas: M. tuberculosis.
PRINCIPIO
El rRNA liberado de la bacteria que se va a probar (M. tuberculosis por ejemplo) a través de
la acción de un agente lítico, calor y sonicación, se hibridiza con la sonda de DNA de cadena
simple marcada con I 125 para formar un complejo DNARNA estable.
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Después de la separación del complejo marcado del DNA, se cuentan los complejos DNA
RNA radiactivos. Los resultados de la prueba se calculan como porcentaje de hibridación de
la sonda inicial.
Los altos niveles de exactitud, especificidad y sensibilidad de estas sondas para la
confirmación de especies clínicas de Mycobacterium han sido certificadas en varios estudios
científicos alrededor del mundo. También existen sondas de ácidos nucleicos no isotópicas
para la identificación de varias especies de micobacterias. Estas sondas, son sondas de DNA
Fig. 7.5.6. Esquematización del procedimiento empleado para la identificación de M. tuberculosis por medio del uso de sondas de DNA marcadas con radioisótopos fluorescentes.
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de cadena simple, marcadas con éster de acridina complementarias al rRNA del
microorganismo blanco.
Para poder realizar la prueba de identificación mediante sondas de DNA, es necesario tener el
cultivo o aislamiento primario de M. tuberculosis (y de preferencia amplificar su material
genético mediante PCR). Como hemos revisado anteriormente existen medios para el
aislamiento primario: medios líquidos y medios sólidos, el uso de cualquiera de estos medios
de cultivo son necesarios para el posterior diagnostico mediante sondas de DNA.
La ventaja de utilizar medios líquidos como aislamiento es su rapidez, ya que el aislamiento
primario en medios sólidos es de 4 semanas y de 3 semanas utilizando Middlebrook 7H11.
Los medios líquidos tardan hasta 7 días después de la inoculación en indicar una
fluorescencia, radiactividad, presión o actividad metabólica, estableciendo la positividad de la
prueba. El sistema SEPTICHEK ofrece una clara ventaja, ya que es un medio de cultivo
bifásico (medio líquido + medio sólido al mismo tiempo).
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7.6. OTRAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS.
7.6.1. CROMATOGRAFÍA GASLÍQUIDO Y CROMATOGRAFÍA DE ALTA
RESOLUCIÓN.
La cromatografía se basa en que los compuestos poseen diferentes solubilidades
cuando son expuestos a distintos materiales o fases no miscibles. El principio de la
cromatografía es lograr un equilibrio de absorción entre dos fases, una móvil y la otra
estacionaria. Las fases móvil y estacionaria existen virtualmente en todos los tipos de
cromatografía.
En la cromatografía Gas líquida, un gas inerte que actúa como transportador (nirógeno, helio,
argón) es la fase móvil y en ella se inyecta la muestra para el análisis. La fase estacionaria
consiste en una matriz sólida (sílica o celita) cubierta por un líquido inerte y fácilmente
volatilizable. Estos materiales cubren la superficie interna de un tubo capilar (columna)
enrollado de vidrio que está encerrada en la unidad de calentamiento.
La muestra en análisis es volatilizada por calor en la zona de inyección de la columna, donde
se mezcla inmediatamente con el flujo del gas transportador. Los compuestos presentes en la
muestra se distribuyen entre la fase inerte y móvil de la columna en función de sus afinidades
relativas por la fase cubierta de la columna.
Los compuestos con baja afinidad son los que pasan más rápido a través de la columna y se
detectan primero; aquellos con mayor afinidad se mueven a través de la columna más
lentamente y emergen últimos.
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El tiempo que transcurre entre la inyección de un material dado en la columna y su aparición
en el sistema de detección se denomina "tiempo de retención". Este tiempo de retención, en
condiciones definidas de temperatura, tipo de gas transportador y empaquetamiento de la
columna, es constante; por lo tanto, compuestos desconocidos pueden ser identificados por
comparación con muestras conocidas, preparadas de un modo similar y corridas a través de la
misma columna.
La composición de los ácidos micólicos y constituyentes de los ácidos grasos de la pared
celular de las micobacterias, son componentes que pueden ser determinados por técnicas
cromatográficas como: cromatografía gaslíquido (GLC), cromatografía líquida de alta
presión (HPLC).
El ácido tuberculoestéarico (TBE) es un compuesto de ácidos grasos largos de cadena larga de
la pared celular de M. tuberculosis, que puede descubrirse desde concentraciones en
femtomoles con cromatografía de gaslíquido.
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede analizar ácidos grasos de cadena
larga, varios componentes de la membrana celular de diferentes bacterias. Los
microorganismos crecidos en condiciones estandarizadas son cosechados y saponificados con
hidróxido para liberar los ácidos grasos de cadena larga de las células intactas. Estos ácidos
grasos son metilados para volverlos volátiles, extraídos con un solvente orgánico (hexano:
metil tertbutil éter) e inyectados en una columna que contiene una fase líquida de fénil métil
silicona entrecruzada adsorbida sobre silicua fundida y con hidrógeno como gas
transportador. La detección de los derivados metilesterificados de los ácidos grasos se realiza
con ionizador de llama. El detector emplea una mezcla de oxígeno ardiente e hidrógeno para
encender a los compuestos orgánicos; las partículas ionizadas de la muestra pasan luego entre
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los alambres con carga opuesta, que genera una fluctuación en la corriente que es medida y
trasladada a un registro permanente.
De tal manera que el HPLC es capaz de detectar cantidades infinitesimales de determinadas
sustancias químicas en líquidos orgánicos (en este caso los ácidos micólicos de M.
tuberculosis), y aumenta la señal de determinada sustancia hasta un millón de veces, para que
estas puedan ser interpretadas por un software específico, mostrando en pantalla una señal en
forma de gráfica, en la que cada pico demuestra la concentración del analito o compuesto que
se busca en una muestra clínica determinada.
Fig. 7.5.7. Equipo automatizado de cromatografía de alta resolución (HPLC).
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En la siguiente imagen se muestra un cromatograma, el cual muestra la identificación de picos
(señal), que separan o identifican varios componentes de benceno en una muestra problema
(mezcla).
El uso práctico de HPLC para el diagnostico de tuberculosis, tan solo consta en
descontaminación previo a la muestra (en caso de que se requiera como las muestras de
esputo) antes de someterla al aparato. En caso de muestras como líquido cefalorraquídeo, no
tendría caso un pretratamiento de la muestra. Este sistema ha sido empleado con gran éxito
en países ya desarrollados para la detección de tuberculosis meníngea en niños. Entonces el
cromatograma de ácidos micólicos sería específico para ciertas especies de micobacterias,
como habíamos mencionado anteriormente, para Mycobacterium tuberculosis la señal leída
seria el pico perteneciente al ácido tuberculoesteárico cuya concentración aseguraría su
presencia en la muestra analizada.
Fig. 7.5.8. Ejemplo de lectura de un cromatográma detectado en un equipo de HPLC.
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7.3.5.2. ANTICUERPOS ANTI Mycobacter ium tuberculosis.
En la sección de patogenía e inmunidad, revisamos como el organismo humano se
defiende ante una infección por M. tuberculosis. A grandes rasgos, se entiende claramente la
forma en que nuestro sistema inmunitario se defiende, esta es mediante una respuesta de
hipersensibilidad retarda por parte de los macrófagos, junto con las diversas linfocinas y
citocinas secretadas por los linfocitos que ocasionan una zona de necrosis en el tejido o zona
de lesión provocando la detención de la tuberculosis mediante la posterior calcificación de la
zona lesionada (lo anterior descrito se aplica solo en caso de que el cuerpo del paciente fuera
inmune a la micobacteria). Se puede destacar, que en la tuberculosis, la respuesta
inmunológica humoral o respuesta específica mediada por anticuerpos de memoria no es útil
para aniquilar al bacilo tuberculoso.
Entonces de que ayudan los anticuerpos en esta enfermedad ?
A pesar de que los anticuerpos en la tuberculosis no tienen una función defensora, estos son
secretados de forma sistemática, y nos sirven para determinar un posible diagnostico de la
enfermedad. La técnica más confiable en la medición de anticuerpos es la técnica EIA
(Enzimoinmunoensayo) y ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima).
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Aunque en la práctica diaria estas técnicas son altamente específicas para la detección de
anticuerpos o antígenos de muchas enfermedades, en el diagnóstico de la tuberculosis solo se
obtiene una sensibilidad de 80 %. Esto se debe a que las paredes celulares de las
micobacterias son similares entre si y con otros hongos (comparten epitopes o determinantes
antigénicos) y no se puede proporcionar un diagnóstico 100 % especifico y sensible, como lo
es cuando ELISA es aplicado en el diagnóstico de otras enfermedades. Otra gran desventaja
de las pruebas diagnósticas por serología son; la imposibilidad de detectar anticuerpos anti
M.tuberculosis en una etapas tempranas de la tuberculosis.
Sin embargo, la medición serológica de anticuerpos IgG e IgM en suero, tiene una clara
ventaja sobre las demás técnicas cuando esta es acompañada del diagnóstico radiológico y
baciloscopico del paciente.
Cuando esta técnica se logre perfeccionar al grado de que no existan reacciones cruzadas, será
sin duda la mejor técnica diagnostica. Ya que es una técnica muy rápida, es automatizable, se
necesitan unos pocos mililitros de sangre, está al alcance de la mayoría de los laboratorios del
país y si se utilizan anticuerpos monoclonales para su empleo podría llegar a ser tan específica
como las técnicas de PCR.