UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
ROL DE LA INSULINA EN LA VÍA NEURAL HIPOTÁLAMO-OVARIO EN UN MODELO DE OVARIO POLIQUÍSTICO INDUCIDO POR ESTRÉS CRÓNICO.
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología
Por
MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ
Directores de Tesis
Profesor Dr. Hernán Enrique Lara Peñaloza
Profesor Dr. Víctor Domingo Ramírez
Santiago – Chile 2008
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
INFORME DE APROBACION
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato
MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para el Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis rendido el …………………………………………………………………. Directores de Tesis: - Dr. Hernán Lara P. ________________ - Dr. Víctor D. Ramírez ________________ Comisión Informante de Tesis: - Dr. Javier Puente (Presidente) ________________ - Dr. Luis Núñez ________________ - Dra. Margarita Vega ________________ - Dra. Teresa Sir-Petermann ________________ - Dr. Luis Michea ________________
Dedicada a Isaac Pessó (Z.L.), cuyos consejos y ejemplos fueron
siempre de gran valor para las decisiones que he tomado a lo largo de este
camino.
AGRADECIMIENTOS:
Al Dr. Hernán Lara por la oportunidad que me dio de realizar la tesis de
doctorado en su laboratorio y por toda la ayuda, consejos y enseñanzas que
me ha entregado durante todos estos años.
Al Dr. Víctor Domingo Ramírez por darme el honor de tenerlo como director
de tesis, por toda la entrega y dedicación en la gestación y desarrollo de este
trabajo de tesis y por la motivación que me dio en los momentos difíciles.
A mis compañeros de laboratorio: Pablo Jara, Ramón Sotomayor, Alfonso
Paredes, Mónika Greiner, Eric Acuña, Gonzalo Cruz, Claudio Araya, Sergio
Hernández, Ariel Díaz, Guillermo Elorza, Gabriel Aravena, Nicolás Crisosto y
Leticia Luna por su amistad, colaboración y excelente disposición.
Al grupo de investigación comandado por las Doctoras Margarita Vega y
Carmen Romero por permitirme realizar los análisis de Western Blot en su
laboratorio y enriquecer este trabajo mediante sus comentarios en los
seminarios de grupo.
Al Dr. Luis Michea por facilitarme la infraestructura de su laboratorio para las
determinaciones de mRNA por PCR en tiempo real.
A la Dra. Elisabet Stener-Victorin por acogerme durante un mes en su
laboratorio de la Universidad de Gotemburgo, Suecia, en donde aprendí la
técnica del clamp hiperinsulinémico-euglicémico.
A Alejandra De Calisto, Fernanda Schäufler (veterinarias encargadas del
bioterio), Fredy y Juan Carlos (funcionarios del bioterio), por su ayuda en los
procedimientos realizados con los animales.
A Don Francisco Cortés por su ayuda con los cortes y tinciones de los
tejidos.
A los miembros de la Comisión Evaluadora, Dra. Teresa Sir-Petermann, Dra.
Margarita Vega, Dr. Luis Michea, Dr. Javier Puente y Dr. Luis Núñez por
aceptar participar de esta comisión y por sus comentarios y correcciones que
enriquecieron este trabajo.
Un agradecimiento muy especial a mi familia: Araceli, mi novia, por su amor,
cariño, paciencia y gran sostén durante los últimos 10 años de mi vida. A mis
padres, abuelita, hermano y cuñada. A mis suegros y cuñados, gracias a
todos ustedes por su constante apoyo y preocupación.
FINANCIAMIENTO: La realización de esta tesis fue financiada por proyectos de investigación,
becas de mantenimiento, apoyo de tesis y de estadía en el extranjero de las
siguientes instituciones:
Proyecto del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT)
• Proyecto FONDECYT Nº 1050765 “Cambios en la actividad nerviosa
simpática durante el desarrollo neonatal predispone al ovario poliquístico
en la vida adulta”
Investigador Responsable: Dr. Hernán Lara P.
Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT):
• Beca de Mantención Estudiante de Doctorado(2004-2007)
• Beca de Apoyo a la Realización de Tesis Doctoral Nº 24060026 (2006-
2007)
• Beca de Termino de Tesis Doctoral (2008)
Becario: Mauricio Dorfman Pessó
Programa de Mejoramiento de la Calidad y Equidad de la Educación Superior (MECESUP):
• Beca para estadía corta en el extranjero. Proyecto MECESUP UCH 0208
(2006)
Becario: Mauricio Dorfman Pessó
PUBLICACION: Los resultados de esta tesis han dado origen a un artículo científico,
aceptado para publicación en la revista internacional “Biology of
Reproduction”.
Dorfman M, Ramirez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. “Chronic-Intermittent
cold stress in rats induce selective ovarian insulin resistance”. Biology of
Reproduction (In Press).
PRESENTACIONES A CONGRESOS: Los resultados de esta tesis han sido presentados en los siguientes
congresos científicos:
1. Dorfman M, Ramirez VD, Sotomayor R, Jara P, Lara HE. Rol de la
insulina en la inervación simpática ovárica en un modelo de ovario
poliquístico inducido por estrés crónico.
XVII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo. Exposición de póster, Reñaca, Chile, 2006.
2. Dorfman M, Ramírez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. Determinación de la
resistencia a la insulina in vivo por el método del clamp hiperinsulinémico
euglicémico en ratas.
XXVIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Exposición de póster Olmué, Chile, 2006.
3. Dorfman M, Ramírez VD, Lara HE. El estrés induce resistencia tejido
específico a la insulina.
XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Exposición oral. Trabajo incorporación a la sociedad de Farmacología de
Chile. Iquique, Chile, 2007.
ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL ..........................................................................................................1
ÍNDICE FIGURAS ...........................................................................................................4
RESUMEN ......................................................................................................................7
ABSTRACT .....................................................................................................................9
INTRODUCCIÓN...........................................................................................................10
1) Fisiología ovárica ......................................................................................................10 2) Regulación de las funciones ováricas.......................................................................11
2.1) Regulación endocrina: .....................................................................................11
2.2) Regulación nerviosa: .......................................................................................12
3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico ............................................13 4) Estrés ........................................................................................................................15
4.1) Definición de estrés: ........................................................................................15
4.2) Clasificación de los estímulos estresores:.......................................................15
4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística ................................16
4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico..............................................17
5) Resistencia a la insulina............................................................................................17 5.1) Definición: ........................................................................................................17
5.2) Acciones de la insulina: ...................................................................................19
5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP: .........19
HIPÓTESIS ...................................................................................................................21
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................21
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .........................................................................................21
� Objetivo específico Nº1: ..................................................................................21
� Objetivo específico Nº2: ..................................................................................21
� Objetivo específico Nº3: ..................................................................................21
MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................................22
1) Animales y grupo experimentales .............................................................................22 2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente.......................................................22 3) Seguimiento de los animales ....................................................................................23
3.1) Ciclicidad estral:...............................................................................................23
3.2) Peso corporal: .................................................................................................23
3.3) Ingesta de alimento: ........................................................................................23
4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés.............................24
1
4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa: ..................................................................24
4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico:.............................................................24
4.3) Liberación de noradrenalina ovárica:...............................................................26
4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico: ..................................................26
4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K+ 80 mM:...........................................27
4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas ................................................27
4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical.....................................28
4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real........................................................................................................................28
4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot.........................................30
5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés ...31 6) Procedimientos experimentales finalizada la administración ICV de insulina...........32
6.1) Morfología ovárica ...........................................................................................32
6.2) Determinación de los niveles séricos de estradiol, androstenediona, progesterona, insulina y glucosa.....................................................................32
6.3) Determinación de catecolaminas en la médula adrenal ..................................33
6.4) Determinación del contenido de noradrenalina en ovario y ganglio celíaco mediante HPLC ...............................................................................................33
7) Análisis estadístico....................................................................................................34 RESULTADOS ..............................................................................................................35
1) Caracterización del modelo de estrés por frío crónico intermitente ..........................35 1.1) Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral.......................................................35
1.2) Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento..........................36
1.3) Efecto del estrés sobre el grado de sensibilidad a la insulina .........................38
1.4) Efecto del estrés sobre la tolerancia a la glucosa ...........................................39
1.5) Efecto del estrés sobre la actividad nerviosa simpática ..................................40
2) Efecto local de la insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica .................41 2.1) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo
eléctrico ...........................................................................................................41
2.2) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante con K+ 80 mM ...........................................................................43
2.4) Efecto de la insulina sobre la secreción de esteroides ováricos .....................46
3) Determinación de la expresión de IRS-1, IRS-2, GLUT-1 y GLUT-4 ........................48 3.1) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis .48
3.2) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario y músculo tibialis.......................50
3.3) Nivel de mRNA para Irs-1 y Glut-4 en células de granulosa y teca-intersticial52
2
3.4) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa y teca-intersticial 54
4) Administración de insulina intracerebroventricular....................................................56 4.1) Control del implante de la cánula ....................................................................56
4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre aspectos metabólicos ..............57
4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la concentración plasmática de P, ∆4 y E2 .............................................................................................................59
4.3) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la actividad nerviosa simpática ovárica.............................................................................................................60
4.3.1) Contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco:.......................................60
4.3.2) Contenido de noradrenalina en el ovario:.....................................................61
4.4) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica................62
DISCUSIÓN ..................................................................................................................65
1) Cambios metabólicos en el modelo de estrés crónico por frío..................................65 2) Efectos de la insulina aplicada localmente sobre la actividad nerviosa ovárica en el
modelo de estrés por frío..........................................................................................67 3) Efectos de la insulina aplicada ICV sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo
de estrés por frío.......................................................................................................71 ESQUEMA FINAL .........................................................................................................75
CONCLUSIONES..........................................................................................................76
REFERENCIAS.............................................................................................................77
3
ÍNDICE FIGURAS Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario.......................... 13 Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en
células de músculo esquelético.................................................................... 18 Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la
hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes. Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárica.................................... 20
Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina y glucosa durante el clamp............................................................................................................ 25
Figura 5: Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral.................................................... 35 Figura 6: Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento....................... 37 Figura 7: Efecto del estrés sobre la velocidad de infusión de glucosa, determinada
mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico........................................ 38 Figura 8: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratas control y estresadas.................. 39 Figura 9: Efecto del estés por frío crónico sobre la actividad nerviosa simpática........ 40 Figura 10: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo
depolarizante eléctrico, de [3H]NA ovárica en ratas control y ratas sometidas a estrés por frío......................................................................... 42
Figura 11: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante eléctrico................................................................. 42
Figura 12: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante de alta concentración de potasio, de [3H]NA ovárica en ratas control y ratas sometidas a estrés por frío................................................. 44
Figura 13: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante K+ 80 mM.............................................................. 44
Figura 14: Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica.................... 45 Figura 15: Efecto de la insulina sobre la secreción de hormonas esteroidales
ováricas...................................................................................................... 47 Figura 16: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis de
ratas control y estresadas.......................................................................... 48 Figura 17: Cambios en el mRNA para Irs-2 y Glut-1 en ovario y músculo tibialis de
ratas control y estresadas.......................................................................... 49 Figura 18: Efecto del estrés frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario
y músculo.................................................................................................... 51 Figura 19: Concentración relativa del mRNA de Fshr en células de granulosa y teca-
intersticial.................................................................................................... 52 Figura 20: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en fracción de células de
granulosa y teca-intersticial de ratas control y estresadas......................... 53 Figura 21: Cambios en el nivel de para IRS-1 y GLUT-4 en fracción de células teca-
intersticial y granulosas de ratas control y estresadas............................... 55
4
Figura 22: Control del implante de la cánula colocada en el tercer ventrículo............ 56 Figura 23: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la ganancia de peso y
consumo de alimento en animales control y sometidos a estrés por frío.. 58 Figura 24: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la insulina y glucosa
plasmática en animales control y sometidos a estrés por frío................... 58 Figura 25: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el
ganglio celíaco de ratas control y sometidos............................................. 60 Figura 26: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el
ovario de ratas control y sometidos a estrés por frío................................. 61 Figura 27: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfometría ovárica........ 63 Figura 28: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica........... 64 Figura 29: Esquema del efecto propuesto para la insulina sobre la actividad nerviosa
ovárica…………………………………………………………………………….70 Figura 30: Esquema de los resultados obtenidos………………………………............. 75
5
ABREVIATURAS A : Adrenalina ANOVA : Análisis de varianza DTT : Ditiotreitol E2 : Estradiol ELISA : Inmunoensayo unido a enzima EV : Estradiol valerato FAA : Folículo antral atrésico FAN : Folículo antral normal FPAA : Folículo preantral atrésico FPAN : Folículo preantral normal FSH : Hormona folículo estimulante FSHR : Receptor de FSH FTIII : Folículo tipo III GLUT : Transportador de glucosa GnRH : Factor liberador de gonadotropinas hCG : Gonadotropina coriónica humana HHO : Hipotálamo-hipófisis-ovario HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución ICV : Intracerebroventricular Ins : Insulina IRS : Sustrato del receptor de insulina LH : Hormona luteinizante NA : Noradrenalina NPV : Núcleo paraventricular P : Progesterona PI3K : Fosfoinositol-3 quinasa PKB : Proteína quinasa B PMSF : Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PQ : Prequiste PTG : Prueba de tolerancia a la glucosa Q : Quiste RT-PCR : Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a transcripción reversa SNA : Sistema nervioso autonómico SON : Nervio ovárico superior SOP : Síndrome de ovario poliquístico Vehic : Vehículo ∆4 : Androstenediona
6
RESUMEN
El estrés crónico, en combinación con la sobrealimentación y la falta de
ejercicio, contribuye al desarrollo del síndrome metabólico, aumentando el riesgo de
enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Se ha demostrado que el estrés
afecta a cada componente del síndrome metabólico y entre ellos, al síndrome de ovario
poliquístico (SOP), principal causa de infertilidad en mujeres en edad fértil.
Hemos descrito que el estrés por frío crónico en ratas provoca cambios
morfológicos en los folículos ováricos similares a los encontrados en el SOP. Para
conocer si este modelo de estrés está asociado a cambios metabólicos, determinamos
la sensibilidad a insulina y el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa
ovárica (factor involucrado en la génesis y mantención del SOP) y por ende, si el estrés
es un factor potencial en el desarrollo del SOP.
A nivel metabólico, los animales sometido a estrés por frío crónico aumentaron
la sensibilidad a la insulina, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico
euglicémico. Al mismo tiempo, estos animales aumentaron su ingesta alimenticia,
manteniendo la misma ganancia de peso que sus respectivos controles. La actividad
nerviosa simpática ovárica aumentó cuando los ovarios de animales control fueron
incubados con insulina, sin embargo, no hubo cambio en los ovarios de ratas
estresadas. Estos resultados sugirieron una resistencia a la insulina tejido específico, la
cual fue apoyada al determinar el nivel de mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4. Ambas
moléculas de la ruta de señalización intracelular de insulina, disminuyeron en los
ovarios de las ratas sometidas a estrés, siendo las células de la teca-intersticial en las
que se observó preferencialmente esta disminución. Al administrar insulina
intracerebroventricular (ICV), la actividad nerviosa ovárica no fue modificada, ni
ocurrieron cambios en el desarrollo folicular, sin embargo, las ratas estresadas
infundidas con insulina ICV no disminuyeron la ganancia de peso, la glicemia ni la
insulinemia, como lo hicieron sus respectivos controles, apoyando una pérdida de
sensibilidad a insulina hipotalámica inducida por el estrés.
7
Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por frío
crónico intermitente provoca una resistencia a la insulina que es tejido específica, y que
la insulina tiene un efecto estimulador de la actividad nerviosa simpática ovárica.
Probablemente, la resistencia insulínica en ovario e hipotálamo son en parte
responsables de los cambios en la función reproductiva y metabólica de la condición
poliquística inducida por estrés crónico.
8
ABSTRACT
The chronic stress in combination with overfeeding and lack of exercise
contributes to health problems known as metabolic syndrome, increasing the risk of
cardiovascular disease and type 2 diabetes. It has been shown that stress affects each
component of metabolic syndrome, including the polycystic ovary syndrome (PCOS),
the major cause of infertility in women of reproductive age.
We have previously described that rats exposed to chronic cold stress show
follicular changes similar to those found in PCOS patients. To find out if this model of
stress is associated with metabolic changes, we determined insulin sensitivity and the
effect of this hormone on the ovarian nervous activity (a factor involved in the genesis
and maintenance of PCOS).
The animals exposed to chronic cold stress increased the insulin sensitivity,
measured by hyperinsulinemic euglycemic clamp. These animals increased their food
intake and they maintained the same gain weight than their respective controls. The
ovarian sympathetic nerve activity was increased when the ovaries from control rats
were incubated with insulin, however it was not change in the ovaries of stressed rats.
These results suggested the presence of specific tissue insulin resistance, which was
supported by determining the IRS-1 and GLUT-4 level of mRNA and protein. Both
molecules, involved in the intracellular insulin signaling, were decreased in the stress
rats ovaries, preferentially in theca-interstitial cells. When we administrated insulin
intracerebroventricular (ICV), the ovarian nerve activity and the follicular development
were not changed. However, stressed rats infused with insulin ICV did not decrease the
gain weight, glycaemia and plasmatic insulin, as did their respective controls. These
results supporting a loss of hypothalamic insulin sensitivity induced by stress.
The results of this study show that chronic intermittent cold stress produce
specific-tissue insulin resistance. Indeed, the insulin has a stimulating effect of the
ovarian sympathetic nervous activity. Probably the ovarian and hypothalamus insulin
resistance are in part responsible for the changes in metabolic and reproductive
function of the polycystic condition induced by chronic stress.
9
INTRODUCCIÓN
1) Fisiología ovárica El ovario es la gónada femenina, cuyas principales funciones son la
esteroidogénesis y la ovulación. Los folículos son la unidad funcional del ovario de
mamíferos y la función de cada uno de ellos es proveer todo el apoyo necesario a la
célula germinal femenina (ovocito), para alcanzar su máximo potencial, ser liberados
del ovario y tener el potencial de ser fecundados por un espermatozoide para producir
un embrión. El ovario está formado, además de los folículos en diferentes etapas de
maduración, por tejido conectivo laxo, vasos sanguíneos y nervios, cuyos terminales
nerviosos se proyectan hacia la corteza ovárica (región en la cual se encuentran
ubicados los folículos) (1).
Las células foliculares somáticas (granulosa y teca) contribuyen de diversas
formas al cumplimiento de la ovulación, esencial para la reproducción y sobrevida de
las especies. Ellas proveen los requerimientos nutritivos para el crecimiento y
maduración de los ovocitos contenidos en los folículos seleccionados para la ovulación.
Al mismo tiempo que contribuyen a la atresia y destrucción de los ovocitos de folículos
no seleccionados (1).
Las células de la granulosa rodean e interaccionan directamente con el ovocito,
mientras que las células de la teca se encuentran en la periferia de los folículos,
separadas de las células de la granulosa por la lámina basal. A medida que los
folículos son reclutados, desde folículos primordiales hasta su máximo desarrollo
(folículos preovulatorios), estos aumentan en número de células de granulosa y teca y
se incrementa el tamaño del ovocito. Una vez que el o los ovocitos (dependiendo de la
especie) son liberados desde los folículos preovulatorios, estos últimos forman cuerpos
lúteos, fundamentales para que ocurra la implantación del embrión en el caso que
hubiese ocurrido la fecundación (1).
Además de la ovulación, la secreción de hormonas esteroidales por parte de las
células que forman parte del ovario, es otra función principal de la gónada femenina.
Las células de la teca sintetizan y secretan principalmente andrógenos, las células de
la granulosa estrógenos y las células lúteas progesterona. Estas hormonas actúan
sobre una amplia variedad de tejidos blanco y órganos que no sólo comprenden el
10
sistema reproductivo, sino que incluyen variados otros órganos y sistemas, como el
sistema nervioso central, músculo esquelético, sistema cardiovascular, hígado, tejido
adiposo, etc. Complementario al efecto hormonal sobre estructuras lejanas al ovario,
los esteroides producidos por las células foliculares actúan localmente sobre los
propios folículos, de forma autocrina (sobre las mismas células que los secretan) y/o
paracrina (sobre células vecinas). Estos efectos hormonales contribuyen al correcto
funcionamiento del sistema reproductivo femenino (1).
2) Regulación de las funciones ováricas Las funciones ováricas, principalmente la ovulación y la secreción de hormonas
esteroidales, son finamente reguladas tanto por señales sistémicas como locales. En
este contexto el eje endocrino hipotálamo-hipófisis-ovario (HHO) y el eje neural
hipotálamo-ovario participan de forma coordinada para mantener la homeostasis del
ovario (fig. 1).
2.1) Regulación endocrina: El eje endocrino HHO es comandado por neuronas GnRHérgicas, ubicadas en
el hipotálamo, las cuales liberan en forma de pulsos el Factor Liberador de
Gonadotropinas (GnRH) a la circulación portal hipofisiaria. Este factor estimula la
liberación de las gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante
(FSH) desde la hipófisis anterior. Estas últimas actúan sobre receptores específicos
localizados en las células ováricas, controlando de esta forma la ovulación y la
secreción de hormonas esteroidales (1). Los receptores de LH se ubican en las células
de la teca, de la granulosa y de células intersticiales, mientras que los receptores de
FSH se ubican en las células de la granulosa. La hormona FSH es responsable del
reclutamiento y crecimiento folicular y de la síntesis de estrógenos durante la fase
folicular del ciclo ovárico. Por su parte, la hormona LH es responsable de la ovulación y
la formación de los cuerpos lúteos. Finalmente, los esteroides ováricos, producidos
como consecuencia de la acción de las gonadotropinas sobre sus respectivos
receptores, tienen la capacidad de actuar sobre el hipotálamo e hipófisis, produciendo
un control del eje endocrino a través de retroalimentación negativa y positiva (1).
11
2.2) Regulación nerviosa: Muchas evidencias han permitido postular que las funciones ováricas, además
de la regulación hormonal clásica, está controlada a través de mecanismos neuronales
de origen cerebral (2, 3). Kawakami y col. fueron, sin embargo, los primeros que
presentaron evidencias sobre la existencia de una vía de control neural directa desde
el hipotálamo al ovario (4). Aunque estos autores no entregaron evidencias
neuroanatómicas directas sobre esta vía, este hallazgo permitió el desarrollo de
estudios neuroquímicos sobre la relación funcional entre el sistema nervioso
autonómico (SNA) y el ovario. El uso de la técnica de trazado viral transneuronal,
permitió a Gerendai y col., definir al núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo como
la región del cerebro desde donde se proyectan las neuronas, que hacen su último
relevo sináptico en el ganglio celíaco y finalmente inervan al ovario (5).
El ovario recibe principalmente inervación simpática y sensorial, con una
pequeña contingencia de fibras parasimpáticas (6). Los nervios simpáticos liberan
desde sus terminales nerviosos principalmente el neurotransmisor noradrenalina (NA).
La inervación llega al ovario por dos rutas: a) el plexo nervioso, que viaja junto a los
vasos sanguíneos y b) el nervio ovárico superior (SON), el cual está asociado al
ligamento suspensorio y lleva la mayoría de las fibras noradrenérgicas que inervan los
folículos (7). Los nervios simpáticos ováricos participan en el desarrollo folicular,
secreción de esteroides y ovulación (8, 9). Por lo tanto, cambios en la actividad
nerviosa del ovario pueden alterar la correcta fisiología ovárica y desencadenar
eventos que lleven a patologías ováricas.
12
Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario. GnRH: hormona liberadora de gonadotroipinas; LH: hormona luteinizante; FSH: hormona folículo estimulante; P: progesterona; A: androgenos; E: estrógenos; SON: nervio ovárico superior; NA: noradrenalina. 3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es ampliamente reconocido como la
causa más común de infertilidad en mujeres y afecta entre el 5-10% de las mujeres en
edad reproductiva (10). Los criterios de diagnóstico de este síndrome fueron
redefinidos en el Congreso de Rotterdam (Holanda, 2003), en el cual se acordó que
para diagnosticar SOP debe coexistir a lo menos dos de los tres criterios siguientes: 1)
irregularidades menstruales, 2) signos bioquímicos o clínicos de exceso de andrógenos
y 3) morfología de ovario poliquístico. Además, este síndrome está fuertemente
asociado a desordenes metabólicos, en los que destacan defectos en la acción y
secreción de insulina, lo cual le sitúa como un importante factor de riesgo de diabetes
mellitus tipo 2 (11).
Si bien la etiología del SOP aún es desconocida, esta parece ser multifactorial,
en la cual estarían involucrados componentes genéticos y ambientales. Este síndrome
HHiippoottáállaammoo
OOVVAARRIIOO
HHiippóóffiissiiss
LLHH ,, FFSSHH
GGnnRRHH
GG.. CCeelliiaaccoo
SSOONN
NNAA
PP,, AA,, EE
+/-
RReegguullaacciióónn HHoorrmmoonnaall RReegguullaacciióónn NNeerrvviioossaa
13
fue considerado por mucho tiempo un desorden principalmente reproductivo, sin
embargo, en la actualidad variados descubrimientos le han otorgado implicaciones
metabólicas.
Existen diversas investigaciones que apuntan a que cambios locales que
alteren la esteroidogénesis podrían ser los eventos iniciales del síndrome. El grupo de
investigación de nuestro laboratorio ha obtenido importantes evidencias de que
cambios en la actividad nerviosa simpática del ovario participan en el desarrollo y
mantención del ovario poliquístico en la rata (12-14). En el modelo animal de ovario
poliquístico inducido mediante la administración de una dosis única de valerato de
estradiol (EV), estrógeno de vida media larga, se producen cambios profundos en la
homeostasis de las catecolaminas ováricas. Estos cambios se iniciaron antes del
desarrollo de quistes ováricos y se mantuvieron incluso después de que los quistes se
formaran. Las alteraciones involucraron un aumento en el contenido de NA ovárica,
aumento en la liberación de NA desde los terminales nerviosos que llegan al ovario y
un “down-regulation” de los receptores β-adrenérgicos en las células de la teca y el
intersticio del ovario (12). Otro modelo animal de ovario poliquístico, que evita el
estradiol como evento primario, es el inducido con estrés por frío crónico intermitente,
en el cual se ha demostrado la activación de los nervios simpáticos ováricos y la
aparición de estructuras quísticas (15-17). Finalmente, la administración del agonista β-
adrenérgico isoproterenol durante 10 días, como forma de remedar una activación
simpática, provocó la aparición de quistes ováricos después de 30 días de finalizado el
tratamiento (13). Estas alteraciones encontradas en la inervación simpática del ovario
de rata, parecen tener relevancia clínica, ya que un estudio realizado recientemente en
Suecia, demostró por primera vez, con un registro intraneural de la actividad nerviosa
simpática, un aumento del tono nervioso simpático en mujeres con SOP (18),
concordante con el mayor nivel de estrés demostrado en estas pacientes (19).
La variedad de evidencias presentadas claramente apoyan la participación de la
actividad nerviosa simpática ovárica en el desarrollo y/o mantención de la condición
poliquística.
14
4) Estrés
4.1) Definición de estrés: El término estrés fue introducido por Selye, quien lo definió como una
respuesta no específica del cuerpo frente a cualquier demanda que éste tuviera (20).
Años más tarde Weiner, Chrousos, Gold, Goldstein y McEwen hicieron importantes
contribuciones al concepto de estrés. Específicamente, Weiner introdujo el concepto de
especificidad de la respuesta al estrés, mediante la descripción del estrés como
presiones selectivas físicas y sociales del medio ambiente que rodea al organismo
(agentes estresores). Estos estímulos amenazan o presentan un desafío al organismo,
el cual reacciona con un patrón de respuestas compensatorias (21). En esta misma
línea, Chrousos y Gold definieron el estrés como un estado de falta de armonía o
amenaza de la homeostasis, que evocan respuestas tanto específicas como
inespecíficas (22). Por último, McEwen agregó el término “alostasis” a lo que a estrés
se refiere. Este concepto se refiere a los procesos de adaptación del organismo,
mediante la producción de diversos mediadores como esteroides adrenales,
catecolaminas, citoquinas, mediadores tisulares y genes de respuesta temprana (23).
Sin duda que las adaptaciones fisiológicas son un elemento fundamental para
mantener la homeostasis de un organismo cuando éste es sometido a condiciones
ambientales adversas.
4.2) Clasificación de los estímulos estresores: Un estímulo estresor puede considerarse como un agente que interrumpe la
homeostasis. En general, los estresores pueden dividirse en cuatro categorías: a)
estresores físicos, b) estresores psicológicos, c) estresores sociales y d) estresores
que alteran la homeostasis cardiovascular y metabólica. Entre los estresores físicos se
incluyen el frío, el calor, la radiación intensa, el ruido, la vibración, entre otros. Por otra
parte, los estresores psicológicos afectan profundamente los procesos emocionales y
pueden resultar en cambios de comportamiento, como ansiedad, miedo, o frustración.
El estrés de tipo social para un animal corresponde a la colocación de éste en el
territorio de un animal dominante, y en los seres humanos, al desempleo y la
separación matrimonial, entre otros. Los estresores que perturban la homeostasis
cardiovascular o metabólica incluyen el ejercicio, la inclinación vertical, la exposición de
15
calor, la hipoglucemia, y la hemorragia (24). Muchos de los factores estresantes que se
han descrito, se utilizan en animales investigación, como modelos de activación de
diferentes vías neuroendocrinas.
En términos de duración, el estrés puede dividirse en dos categorías
principales: agudo y crónico. El estrés agudo corresponde a un estímulo único con
tiempo de duración limitado, en cambio el crónico puede ser una exposición única pero
prolongada o varias exposiciones al agente estresor (estrés crónico intermitente) (24).
4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística El estrés es una característica que prevalece en las mujeres con SOP (19), lo
cual sugiere que podría jugar un rol importante en la etiología de este desorden
endocrino-metabólico. En nuestro grupo de trabajo, hemos demostrado la capacidad
del estrés de activar la inervación simpática ovárica e inducir cambios en el desarrollo
folicular y la formación de quistes en ratas (16, 17). Los tipos de estrés que se han
utilizado han sido crónicos, con un mínimo de 3 semanas de duración. Ésto debido
principalmente a la cinética de crecimiento folicular en los roedores, la cual ha
mostrado que desde que entran al pool de folículos en crecimiento hasta que alcanzan
el estado preovulatorio transcurren aproximadamente 20 días (25). Uno de los modelos
de estrés usados fue el estrés combinado de restricción de movimiento y frío, sin
embargo, después de 11 semanas de tratamiento los cambios ováricos encontrados a
las 3 semanas fueron revertidos (17). El estrés por restricción de movimiento induce
una fuerte respuesta del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, aumentando los corticoides
plasmáticos. Estos últimos inhiben la actividad nerviosa simpática (26, 27), lo cual
podría explicar la reversión de los cambios ováricos en el modelo de estrés combinado.
Por otra parte, el estrés por frío crónico de 4 semanas no afecta el nivel de corticoides
plasmáticos (28), lo cual fue corroborado por nuestro grupo de trabajo (16), e hizo de
éste un buen modelo de estrés para inducir cambios en la actividad nerviosa simpática
ovárica. Los cambios ováricos observados en el modelo de estrés por frío crónico dan
cuenta de un retardo en el desarrollo folicular y muestran la aparición de folículos con
hipertrofia tecal, similar a lo observado en ovarios de mujeres con SOP (29).
Las alteraciones metabólicas, como la resistencia a la insulina y la intolerancia a
la glucosa, que acompañan al ovario poliquístico en un gran número de pacientes, han
16
sido relacionadas con un alto grado de estrés. Sin embargo, en nuestro modelo
experimental aún se desconoce si existen cambios a nivel metabólico.
4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico El síndrome metabólico es un conjunto de factores de riesgo que aumentan el
riesgo de enfermedad cardiaca y diabetes tipo 2. Las características del síndrome
metabólico son obesidad abdominal, dislipidemia (triglicéridos aumentados, alta
concentración de lipoproteínas de baja densidad y baja concentración de lipoproteínas
de alta densidad), presión sanguínea elevada y resistencia a la insulina (con o sin
intolerancia a la glucosa) (30). Varios autores han discutido el posible efecto del estrés
sobre los componentes del síndrome metabólico, por ejemplo, Taran Chandola y cols.,
mostraron evidencias clínicas de una relación entre estresores psicológicos y
enfermedad cardiaca (31); Rosmond R., demostró que alteraciones psicológicas y
socioeconómicas pueden relacionarse con resistencia a la insulina y obesidad visceral
(32). Por otra parte, investigaciones en animales han demostrado que diferentes tipos
de estresores, tales como estrés acústico y restricción de movimiento, alteran el control
de la glicemia, pudiendo desencadenar resistencia a la insulina, intolerancia a la
glucosa y/o diabetes tipo 2 (33, 34).
5) Resistencia a la insulina
5.1) Definición: La resistencia a la insulina, uno de los aspectos del síndrome metabólico, se
caracteriza por una respuesta defectuosa o anómala de la insulina en tejidos
periféricos: músculo esquelético, hígado y tejido adiposo, donde no ejerce de forma
adecuada sus acciones biológicas, condicionando como mecanismo de compensación
un incremento en la secreción de insulina (35). Los defectos moleculares de la
actividad insulínica varían dependiendo del tejido estudiado. La cascada de
transducción normal de la insulina se inicia con la unión a su receptor de membrana, el
cual corresponde a un heterotetrámero compuesto de dos subunidades α y dos β
unidos por puentes disúlfuro. Este receptor del tipo tirosina quinasa autofosforila
residuos de tirosina en su subunidad intracelular β, cuando las moléculas de insulina se
unen al receptor. Posteriormente, se fosforila el sustrato del receptor de insulina (IRS),
17
el cual se une transitoriamente al receptor de insulina activado y sirve como molécula
de anclaje para otras proteínas que poseen dominios de unión, tal como la
fosfoinositol-3 quinasa (PI3K). La PI3K a su vez fosforila a la proteína quinasa B (PKB
o AKT), la cual fosforila a la glicógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3). Esta última inhibe la
síntesis de glicógeno al inhibir la glicógeno sintasa. La activación de la PI3-K conduce
también a la traslocación del transportador de glucosa dependiente de insulina (GLUT-
4) a la superficie celular, lo cual induce la captación de glucosa por parte de las células
(figura 2) (36). Algunos de los cambios que ocurren en los tejidos cuando se está en
presencia de resistencia a la insulina son la disminución de la activación de la PI3K y la
expresión de IRS-1 y GLUT-4 (37)
PI3-K
IRS p85 p110
PKB
PKC
Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en células de músculo esquelético.
18
5.2) Acciones de la insulina: La acción clásica de la insulina es el control del metabolismo de la glucosa a
través de una retroalimentación dual que une a la insulina plasmática con la glicemia.
Es decir, cuando aumenta la concentración de glucosa plasmática se induce la
secreción de insulina desde las células beta pancreáticas, lo cual inhibe la
gluconeogénesis hepática. Sin embargo, un gran número de acciones nuevas de la
insulina se han propuesto a partir de estudios in vivo e in vitro (38). A nivel de sistema
nervioso autonómico y central se ha demostrado que la insulina sistémica tiene un
efecto excitatorio de las ramas simpáticas del sistema nervioso autonómico, aún
cuando se prevenga la hipoglicemia (39). En estudios de liberación de noradrenalina
desde tejido aórtico in vitro se ha demostrado un aumento de la liberación del
neurotransmisor cuando éste se incuba en presencia de insulina (40), lo que hace
posible un efecto de la insulina sobre neuronas simpáticas ováricas.
Por otra parte, existe variada evidencia que indica que la insulina actúa en el
cerebro. La insulina atraviesa la barrera hematoencefálica y alcanza diferentes zonas
del cerebro. En algunas regiones, especialmente en áreas periventriculares, la barrera
hematoencefálica está incompleta, y precisamente en esas brechas la insulina puede
difundir hacia el núcleo arcuato y paraventricular, en donde se une a receptores
específicos que están expresados abundantemente en sus neuronas (41). Las
funciones de la insulina sobre estos núcleos no son del todo claras, sin embargo,
existen estudios que demuestran un efecto sobre el control de la ingesta de alimento,
el crecimiento neuronal, el gasto energético y la reproducción (42, 43).
Cabe mencionar que la transducción de señal de la insulina en diferentes
tejidos puede sufrir modificaciones distintas. En esta línea, se han descrito en la
literatura, tanto en humanos como en modelos animales, cambios en la sensibilidad a
la insulina tejido y/o función específica (44, 45).
5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP: La hiperinsulinemia y la resistencia a la insulina juegan un importante papel en
la patogénesis del SOP y el síndrome metabólico. Estos últimos son considerados
factores de riesgo para diabetes mellitus tipo 2. Las mujeres con SOP presentan
19
resistencia a la insulina en un porcentaje mayor al 50 %, la cual es independiente del
grado de obesidad de las pacientes (46).
La relación propuesta entre la hiperinsulinemia compensatoria a la resistencia a
la insulina y el SOP, corresponde al efecto de la insulina sobre el eje endocrino
hipotálamo-hipófisis-ovario. Específicamente, la insulina actuaría a nivel hipotalámico e
hipofisiario cambiando el patrón de secreción de las gonadotropinas y a nivel ovárico
aumentaría la secreción de andrógenos (47, 48). Estas alteraciones en el eje de
regulación endocrino de la función ovárica, podrían ser en parte responsables de la
patología poliquística. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el efecto que
pudiera tener la insulina sobre el eje de regulación neural de la función ovárica, ya sea
actuando directamente sobre terminales nerviosos simpáticos ováricos o centralmente
en donde está el origen de la vía nerviosa que inerva el ovario (ver figura 3). Tampoco
se sabe si el estrés por frío crónico intermitente, descrito previamente como un modelo
de ovario poliquístico (16), pudiera tener cambios en la sensibilidad a la insulina en
diferentes órganos blanco.
Estrés Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes (derecha). Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárico (izquierda) con probables cambios en la sensibilidad a la insulina en un modelo de estrés crónico.
GnRH
LH
A
E2
∆4
Ovario
∆4
E2 y ∆4
Resistencia a insulina
Hiperinsulinemia GG.. CCeelliiaaccoo
SSOONN NNAA
HHiippoottáállaammoo ?
?
A ∆4E2
Ovario
20
Los antecedentes mencionados anteriormente apoyan la hipótesis de que la
insulina puede regular la homeostasis de la función reproductiva, alterando la actividad
nerviosa simpática ovárica, ya sea a nivel de sistema nervioso central y/o a nivel local,
directamente sobre los terminales nerviosos ováricos.
HIPÓTESIS
“En el ovario poliquístico inducido mediante estrés crónico por frío, la insulina
activa la inervación simpática ovárica y modifica la esteroidogénesis mediante un
efecto central y/o periférico, alterando el desarrollo folicular”
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto de la insulina, aplicada central y localmente, sobre la
actividad simpática del ovario de rata, en un modelo de ovario poliquístico inducido por
estrés crónico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Objetivo específico Nº1:
“Determinar los cambios en la acción y secreción de insulina en el modelo de
ovario poliquístico inducido por estrés frío crónico”
• Objetivo específico Nº2:
“Estudiar el efecto in vitro de la insulina sobre la actividad simpática ovárica y la
secreción de hormonas esteroidales del ovario en el modelo de ovario
poliquístico inducido por estrés crónico”
• Objetivo específico Nº3:
“Estudiar el efecto de la insulina aplicada centralmente sobre la actividad
simpática del ovario en el modelo de ovario poliquístico inducido por estrés
crónico”
21
MATERIALES Y MÉTODOS
1) Animales y grupo experimentales Se usaron ratas hembras, adultas, de aproximadamente 200 gramos, de la
cepa Sprague-Dawley, provenientes del bioterio de animales de la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Los animales se
mantuvieron en cajas individuales a 23º C en un régimen de 12 horas de luz y 12 horas
de oscuridad (luz apagada de 7 p.m. a 7 a.m.), con alimento y agua ad libitum. Un total
de 81 ratas fueron utilizadas en esta tesis, de las cuales 15 se usaron en el
experimento del clamp hiperinsulinémico euglicémico, 10 en la prueba de tolerancia a
la glucosa, 18 en los experimentos de liberación de NA, 10 en la cuantificación del nivel
de mRNA, 10 en los análisis del nivel de proteína, 8 en la secreción in vitro de
hormonas esteroidales y 20 en los experimentos de administración de insulina
intracerebroventricular. Todos los procedimientos con animales fueron previamente
aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas y Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.
Para el desarrollo de los objetivos 1 y 2 los animales fueron divididos al azar en
2 grupos experimentales: 1) grupo control (mantenidos a 23º C) y 2) grupo estrés por
frío (4º C por 3 horas/día, de lunes a viernes, por 4 semanas). En el caso del objetivo
número 3 los animales fueron separados en 4 grupos experimentales: 1) grupo control
infundido con vehículo (Control Vehic), 2) grupo control infundido con insulina (Control
Ins), 3) grupo estresado infundido con vehículo (Estrés Vehíc) y 4) grupo estresado
infundido con insulina (Estrés Ins).
2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente Para los experimentos de esta tesis, solamente se utilizaron las ratas que
tuvieron ciclos estrales regulares de 4 días. El procedimiento de estrés utilizado ha sido
previamente descrito por nuestro grupo de trabajo (16). Este consiste en colocar las
ratas a 4 ºC por 3 horas cada día, de lunes a viernes, durante 4 semanas. Tanto los
animales control como los estresados fueron manipulados diariamente por el mismo
operador y mantenidos en la misma habitación. Una vez terminado el procedimiento de
22
estrés, los animales fueron eutanasiados 24 horas después. Durante el protocolo de
estrés, se siguió la ciclicidad estral, peso corporal e ingesta de alimento.
3) Seguimiento de los animales
3.1) Ciclicidad estral: Las etapas del ciclo se determinaron mediante el análisis microscópico del tipo
de células predominantes en un frotis vaginal obtenido diariamente (lunes a viernes),
tanto en el grupo de ratas control, como en el de ratas estresadas. Las etapas son:
Proestro: se caracteriza citológicamente por la presencia de células epiteliales
nucleadas, bien redondeadas. La duración de esta etapa es de 12 a 24 horas
Estro: citológicamente se caracteriza por la presencia de células escamosas agrupadas
y con formas irregulares. Esta etapa tiene una duración entre 24 y 48 horas y
corresponde al periodo de receptividad sexual de la hembra.
Metaestro o Diestro 1: el frotis vaginal se caracteriza por la presencia de leucocitos y
células escamosas. La duración es entre 12 y 24 horas.
Diestro 2: se caracteriza por una gran presencia de leucocitos en el frotis vaginal. La
duración de esta etapa es de aproximadamente 48 horas.
3.2) Peso corporal: Los animales fueron pesados en una balanza granataria diariamente, de lunes a
viernes, durante las cuatro semanas de duración del protocolo de estrés.
3.3) Ingesta de alimento: Para determinar el consumo de alimento, se determinó la diferencia de peso
entre el alimento colocado a cada animal y el alimento sobrante después de dos días.
Este procedimiento se repitió durante todo el tratamiento, tanto para los animales
control, como para los estresados.
23
Una vez finalizado el último evento de estrés, se esperó 24 horas para hacer los
experimentos correspondientes.
4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés
4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa: Mediante esta prueba se determinó la capacidad de los animales de secretar
insulina en respuesta a un secretagogo (glucosa) y de regular la glicemia. Los animales
de ambos grupos experimentales (control y estrés) se mantuvieron en ayuna por 12
horas antes de comenzar la prueba. Las ratas fueron anestesiadas con 120 mg/kg de
tiopental sódico vía i.p. Posteriormente a los animales se les insertó una cánula en la
arteria carótida y se administró 2 g/kg de glucosa vía i.p. La colección de sangre, desde
la cánula implantada en la arteria, se realizó a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos
después de la carga de glucosa. Los tiempos de colección nos permitieron observar en
la curva de glucosa plasmática versus tiempo, la capacidad del animal de regular la
glicemia. La determinación de insulina sérica se realizó en los mismos sueros, lo cual
nos permitió conocer la capacidad del páncreas de responder frente a un secretagogo
como la glucosa. La insulina se midió con un kit de ELISA específico para rata (Alpco
Diagnostics, Windham,NH). Por su parte, la glucosa se determinó mediante un ensayo
enzimático colorimétrico (Human, Weisbaden, Germany).
4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico: Existen diversos métodos para determinar el grado de resistencia a la insulina,
sin embargo el procedimiento más válido para este fin corresponde al clamp
hiperinsulinémico euglicémico (49). Después de 24 horas de finalizado el
procedimiento de estrés crónico, se procedió a realizar el siguiente protocolo
experimental, similar a lo descrito anteriormente (50): las ratas se mantuvieron
anestesiadas durante todo el experimento, aproximadamente 90 minutos desde la
administración del anestésico (tiopental sódico 120 mg/kg i.p.). Los animales se
colocaron sobre una manta temperada con el fin de mantener la temperatura corporal.
Se insertaron dos catéteres, uno en la arteria carótida izquierda y el otro en la vena
yugular derecha, utilizados para la colección de sangre e infusiones de glucosa e
insulina respectivamente. Además se colocó un catéter en la tráquea para permitir al
24
animal una mejor respiración. Posteriormente, se tomó una muestra de sangre basal
en la cual se midió inmediatamente la glicemia con un Accucheck Comfort
Glucometer™. Una mezcla de insulina (100 U/ml; Humalog, Eli Lilly, West Ryde,
Australia) con 0.2 ml de albúmina y 0.9 % de NaCl se infundió a un flujo de 24, 16 y 12
mU/kg/min al minuto 1, 2 y 3 respectivamente. Inmediatamente después se cambió el
flujo a 8 mU/kg/min y se administró a esta velocidad por todo el experimento. La
euglicemia se mantuvo mediante la infusión de una solución de glucosa al 30 % p/v en
0.9 % de NaCl. Cada 5 minutos se midió la glicemia del animal en una gota de sangre
obtenida desde la arteria carótida y se varió el flujo de glucosa con la finalidad de
mantener una glicemia cercana a 6 mmol/l (ver figura 4). Al terminar el experimento se
colectó una muestra de sangre para medir la concentración de insulina. La velocidad
de infusión de glucosa se calculó con el promedio de al menos los últimos 3 valores en
el estado estacionario (cuando la glucosa en la sangre es estable a 6.0 mmol/l,
aproximadamente a los 60 minutos) y fue corregida por el peso corporal del animal.
Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina (gráfico izquierda) y glucosa (gráfico derecha) durante el clamp. El minuto cero corresponde al momento en que comienza la infusión de insulina y glucosa. En el gráfico de concentración de glucosa plasmática se muestra la curva de velocidad de infusión de glucosa, la cual es la variable que se utiliza finalmente para determinar el grado de sensibilidad a la insulina.
Glu
cosa
(mm
ol/L
)
Min
01
2
34
5
6
7
89
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
25
20
15
10
5
0 Velo
cida
d de
infu
sión
de
Glu
cosa
(mg/
kg/m
in)
Glu
cosa
(mm
ol/L
)
Min
01
2
34
5
6
7
89
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
25
20
15
10
5
0 Velo
cida
d de
infu
sión
de
Glu
cosa
(mg/
kg/m
in)
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
150
250
50
100
200
0
Min
liU
)
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
150
250
/ml
Insu
na(µ
50
100
200
0
Min-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
150
250
50
100
200
0
Min
liU
)/m
lna
(µIn
su
25
4.3) Liberación de noradrenalina ovárica: La liberación de neurotransmisores es una prueba funcional de la actividad
nerviosa. En el caso particular de la liberación de NA ovárica, esta representa la
actividad de los nervios simpáticos que inervan el ovario. Después de 24 horas de
finalizado el procedimiento de estrés los animales se eutanasiaron y los ovarios
rápidamente se disectaron e incubaron en buffer Krebs (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM,
KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2mM, NaHCO3 250 mM, CaCl2 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml,
ácido ascórbico 0.1 mg/ml) pH 7.4, en presencia de mezcla O2/CO2 (95:5) por 20
minutos y luego se incubaron con 2 µCi [3H]-NA (specific activity 74.9 Ci/mmol, Perkin
Elmer, Boston, MA) por 30 minutos a 37º C. La radioactividad no retenida por el tejido
fue lavada mediante la incubación de los ovarios con buffer Krebs sin [3H]-NA durante
60 minutos (6 lavados continuos de 10 minutos cada uno). Dependiendo del tipo de
estímulo aplicado, para simular un potencial de acción e inducir liberación de NA, es
como se procedió a continuación.
4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico:
Los ovarios se transfirieron a una cámara de superfusión termoregulada y se
perfundieron con buffer Krebs a un flujo de 2.5 ml/min. Simultáneamente se utilizaron
dos cámaras de superfusión, colocándose un ovario en cada una de ellas. Se tomaron
3 fracciones de 1 minuto como secreción basal (B), luego ambos ovarios se
sometieron a un estímulo eléctrico (80V, 10Hz, 2ms, 1 minuto) en ausencia de insulina
(estímulo control) y se tomó una fracción de 1 minuto correspondiente al estímulo (E).
Finalmente, se tomaron 4 fracciones de 1 minutos correspondientes a los post-
estímulos (PE). Posteriormente, en una de las cámaras de superfusión se cambió el
buffer por Krebs con insulina (10 UI/l). Luego de 10 minutos de lavado del tejido, es
decir, con flujo de buffer en ambas cámaras de superfusión, se repitió el protocolo de
estimulación. La finalidad de realizar dos estímulos en cada ovario es expresar los
resultados como razón entre ambos estímulos (E2/E1), de tal forma de independizarse
de variables del tejido o de la cámara de superfusión, que hicieran obtener errores en
las comparaciones de ambos ovarios.
26
Una vez terminado ambos estímulos, los ovarios se homogeneizaron en ácido
perclórico 0.4 M, se centrifugó a 15.000 g por 10 minutos y se determinó el remanente
de [3H]-NA en el tejido y la [3H]-NA de las fracciones con un contador de centelleo
(Packard Liquid Scintillation Analyzer 1600TR con un 72.5 % de eficiencia para tritio).
El eflujo de NA se calculó y expresó como el porcentaje de liberación fraccional
(porcentaje del total de radioactividad presente en el ovario en cualquier momento). La
cantidad total de NA liberada se calculó como el área bajo la curva después de la
estimulación menos el eflujo basal.
4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K+ 80 mM: Cada par de ovarios, proveniente de cada rata, se separaron al azar e
incubaron en pocillos (placas de 24 pocillos), que contienen 1.5 ml de buffer Krebs. Los
ovarios se cambiaron al siguiente pocillo cada 2 minutos. Después de 3 incubaciones
de 2 minutos cada una (basales), los ovarios se estimularon por despolarización con un
medio isotónico que contenía KCl 80 mM y NaCl 43.3 mM (buffer Krebs K+). Los
ovarios posteriormente fueron lavados por 30 minutos antes de ser sometidos a un
segundo periodo de estimulación. Esta vez uno de los ovarios se incubó con buffer
Krebs suplementado con insulina (10 UI/l) y el otro se mantuvo en las mismas
condiciones utilizadas en el primer periodo de estimulación. El motivo de la realización
de dos estímulos consecutivos en cada ovario y la forma de expresar los resultados es
la misma descrita anteriormente para la estimulación inducida con estímulo eléctrico.
4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas Una vez finalizada las 4 semanas de estrés, se esperó 24 horas para eutanasiar
a los animales y se disecó los ovarios. Estos se dividieron en dos partes y se incubaron
en 2 ml de buffer Krebs-Ringer (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4
1.2mM, NaHCO3 250 mM, CaCl2 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml, ácido ascórbico 0.1
mg/ml, EDTA 0.11 mg/ml, albúmina 0.1 mg/ml) pH 7.4, a 37 ºC en presencia de mezcla
O2/CO2 (95:5) durante 3 horas. Cada mitad de ovario (en total 4 por cada rata) fue
incubada en un pocillo distinto que contenía: 1) buffer Krebs-Ringer; 2) Krebs-Ringer
más hCG (2.5 UI/ml); 3) Krebs-Ringer más insulina (10 UI/l); 4) Krebs-Ringer más hCG
(2.5 UI/ml) e insulina (10 UI/l). El diseño experimental fue tal que permitió utilizar las 4
27
mitades simultaneamente. Una vez cumplida las 3 horas de incubación se recuperó el
sobrenadante y se determinó en este último la progesterona (P), androstenediona (∆4)
y estradiol (E2) secretado al medio por el ovario mediante un inmunoensayo (EIA, Alpco
Diagnostics, Windham, NH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las
variaciones intra e inter ensayo fueron menos de 11 %, 7 % y 10 % para P, ∆4 y E2
respectivamente. El valor mímino detectable para P fue de 2.5 pg; para ∆4 1.25 pg; y
para E2 0.5 pg.
4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical La obtención de una fracción enriquecida de células de la granulosa a partir de
ovarios completo ha sido descrita previamente en la literatura (51). Una vez disectados
e incubados los ovarios en 50 µl de buffer Krebs, estos se pincharon con una aguja y
se colectó la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Este
procedimiento se repitió tres veces, colectando finalmente un volumen de 150 µl de
suspensión de células de granulosa. La suspensión fue centrifugada a 250 g y lavada
tres veces con buffer Krebs. Tanto de la suspensión de células de granulosa como del
resto del ovario (principalmente células tecales-intersticiales) se extrajo el RNA total y
las proteínas para los análisis de PCR en tiempo real y western blot respectivamente.
Para comprobar la pureza de la preparación, se midió el nivel de mRNA para el
receptor de FSH en ambas fracciones, ya que este sólo se expresa en células de la
granulosa (52).
4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real
El RNA total se extrajo del músculo tibialis, ovario completo, células de
granulosa y teca-intersticial, mediante el método descrito por Chomczynski and Sacchi
(53). Se tomó 5 µg del total de RNA extraído de cada una de las muestras y se
sometieron a la reacción de transcripción reversa para obtener cDNA. La reacción se
llevó a cabo en presencia de dNTPs 1.6 mM, DTT 10 mM, partidores randomizados
176 nM (Invitrogen, Carlsbad, CA), RNasaOUT 25 U (Invitrogen, Carlsbad, CA) y
transcriptasa reversa SuperScript II 125 U (Invitrogen, Carlsbad, CA). El volumen final
de reacción fue de 30 µl y la reacción se llevó a cabo a 42 ºC por 60 minutos,
deteniéndose por calentamiento de las muestras a 75 ºC durante 10 minutos.
28
Posteriormente, los cDNA obtenidos se amplificaron mediante la reacción de PCR en
tiempo real, en presencia de partidores específicos para cada uno de los genes de
interés. El volumen final de esta reacción fue de 25 µl, de los cuales 12.5 µl
correspondieron a 2X Brilliant® Platinum SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene®,
1834 State Hwy. 71 West), 9.5 µl a agua estéril nanopura, 0.5 µl a cada uno de los
partidores y 2 µl a cDNA.
El perfil de temperatura utilizado en el termociclador para la reacción de PCR en
tiempo real fue el siguiente:
1) 10 minutos a 95 ºC (ciclo único)
2) 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 60 ºC, 30 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 78
ºC (40 ciclos)
3) 1 minuto a 95 ºC, 7 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 95 ºC (ciclo único)
La intensidad de fluorescencia de la doble hebra formada unida al reactivo
SYBR-Green I, medida al final de cada ciclo de elongación (etapa 2), refleja la cantidad
de producto PCR formado. Para determinar la especificidad del producto formado se
realizó una “curva de melting” entre 72-95 ºC, bajo continua medición de fluorescencia
(etapa 3). Cada amplicón o producto PCR formado tiene una temperatura de
desapareamiento específica (melting point). La cantidad de mRNA inicial de cada gen
de interés se calculó, determinando el ciclo en el cual comenzó el aumento lineal del
producto PCR. El valor de ciclo se interpoló en una curva estándar obtenida por
diluciones seriadas de una muestra de concentración conocida.
Los partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 se diseñaron a partir de las
secuencias del Genebank y los partidores para Fshr se obtuvieron de la literatura (54)
(ver tabla 1). Para normalizar la cuantificación de los mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1,
Glut-4 y Fshr, se midió en cada uno de los tejidos el gen de expresión constitutiva
subunidad ribosomal 18s y los resultados se expresaron como la razón entre el gen de
interés y el constitutivo. La medición del mRNA 18s se realizó utilizando partidores
disponibles comercialmente (Ambion, Austin, TX, USA) y se llevó a cabo en tubos de
PCR independientes para evitar interferencia con la amplificación de los genes de
interés.
29
Tabla 1: Partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4, Fshr y 18s de rata. Nombre Secuencia (5'-3') Código de acceso al
GenBank Irs-1 Sentido GGA AGC CAT GGA CAA ACG GAG TAG Antisentido TCT GGG CCA TAG TAG CAT TCT CAG
NM_012969
Irs-2 Sentido CCC TGT ACT TGC GGT GGT GGA G Antisentido CTG AGT GAT GAG GCT GGG TAT GAC
XM_001076309
Glut-1 Sentido CCT ACC GCC AGC CCA TCC TCA T Antisentido CCA CGA CGA ACA GCG ACA CCA C
NM_138827
Glut-4 Sentido CGT CCT CCT GCT TGG CTT CTT CAT Antisentido CCA CCA TTT TGC CCC TCA GTC ATT
NM_012751
Fshr Sentido CAT CAC TGT GTC CAA GGC CA Antisentido TGC GGA AGT TCT TGG TGA AAA
BC 137991
18s Sentido TCA AGA ACG AAA GTC GGA GG Antisentido GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA
NM_X01117
4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot La proteínas se extrajeron de ovarios, músculo tibialis, fracción de células de
granulosa y de teca-intersticial, mediante la homogeneización de los tejidos en un
homogenizador vidrio-vidrio con 200 µl de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM,
EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, Triton 1 %; pH 7.4) suplementado con un cocktail inhibidor
de proteasas (SIGMA, St. Louis, Missouri, USA), PMSF y DTT. El homogenizado se
centrifugó a 16500 g por 10 minutos a 4 ºC y se procedió a recuperar el sobrenadante
en el cual se encuentran las proteínas. La determinación de proteínas totales se realizó
mediante el método de Lowry (55), el cual se basa en la formación de un complejo
entre las proteínas y el cobre en medio alcalino, el cual reacciona con el reactivo de
Folin (mezcla entre ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico) y finalmente la
reducción de este compuesto es detectado colorimétricamente a una absorbancia de
660 nm. La separación de las proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida con SDS
al 8 %, en el cual se cargaron 50 µg de proteína de cada muestra. La electroforesis se
realizó con una diferencia de potencial constante de 100 V y una duración de
aproximadamente 1 hora. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa en una cámara electroforética de transferencia, con
intensidad de corriente constante a 300 mA durante 3 horas. Finalizada la
30
transferencia, la nitrocelulosa fue bloqueada con leche en polvo al 5 % en TBST (20
mM Tris, 137 mM NaCl, 0. % Tween-20, pH 7.6) por 1 hora a temperatura ambiente
con agitación. La membrana fue incubada toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo
primario correspondiente diluido en TBST: anti-IRS-1 (C-20, Santa Cruz,
Biotechnology, Inc., USA; dilución 1:100), anti-GLUT-4 (H-61, Santa Cruz,
Biotechnology; dilución 1:100) o anti-β-tubulin (3F3-G2, Santa Cruz, Biotechnology;
dilución 1:1000). Al día siguiente las membranas fueron lavadas tres veces (7 minutos
cada vez) con TBST e incubadas con el anticuerpo secundario anti-rabbit (IRS-1 y
GLUT-4) o anti-mouse (β-tubulin), por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La
detección se realizó mediante quimioluminiscencia con el sistema de detección de
western blot ECL plus (Amersham Biosciences). Las películas fotográficas se
escanearon y la intensidad de las bandas se midió con el programa UN-SCAN-IT (Silk
Scientific, Orem, Utah). Los resultados se expresaron como la razón entre la intensidad
de banda de la proteína de interés y la proteína de expresión constitutiva β-tubulina
(utilizada también como control de carga).
5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés Una semana antes de comenzar el procedimiento de estrés los animales fueron
canulados en el tercer ventrículo. Para ello, las ratas se anestesiaron con una mezcla
de ketamina (60mg/Kg) y xilacina (10mg/Kg) administrada vía i.p. Posteriormente, se
implantaron cánulas de acero inoxidable de 24 G con diámetro externo de 0.5 mm en el
tercer ventrículo (3V) de acuerdo a las siguientes coordenadas respecto a Bregma: (-)
0.28 mm antero-posterior, 0,0 mm medio-lateral y (-) 0,81 mm dorso-ventral desde el
cráneo del animal, según el Atlas de coordenadas estereotáxicas de cerebro de rata de
Paxinos & Watson (56) y de acuerdo a lo publicado anteriormente (3). Luego de la
cirugía los animales permanecieron en recuperación y antes de comenzar el protocolo
de estrés se dividieron en 4 grupos: 1) control vehículo, 2) control insulina, 3) estrés
vehículo y 4) estrés insulina. La administración de vehículo (solución fisiológica, NaCl
0.9 %) o insulina (1 UI/kg) se realizó durante 7 días (última semana de estrés). La
forma de administración fue mediante infusión continua con bomba de perfusión a un
flujo de 1 µl/minuto. Posteriormente, se procedió a eutanasiar los animales y disecar
31
los órganos (ovario, ganglio celiaco, medula adrenal, músculo tibialis, cerebro
completo) que fueron inmediatamente congelados a -80 ºC hasta el momento de hacer
los análisis. Uno de los ovarios se fijó para el análisis morfológico.
6) Procedimientos experimentales finalizada la administración ICV de insulina 6.1) Morfología ovárica Los ovarios se fijaron con Zamboni (p-formaldehído 4 %, ácido pícrico saturado
y buffer fosfato salino 0.1 M) durante 16 horas, luego se traspasó a buffer salino por 24
horas y finalmente se deshidrató con sacarosa 20 % en buffer fosfato salino. Finalizado
el proceso de fijación los ovarios fueron incluidos en parafina, cortados a un grosor de
8 µm y teñidos con hematoxilina-eosina. El conteo de estructuras en el ovario se
realizó en el corte central, correspondiente al corte de mayor diámetro. Se analizó la
presencia de folículos preantrales normales (FPAN), folículos preantrales atrésicos
(FPAA), folículos antrales normales (FAN), folículos antrales atrésicos (FAA), cuerpos
lúteos (CL) y folículos anómalos, entre los cuales se considera a los folículos con
hipertrofia tecal (FHT), folículos tipo III (FTIII), prequistes (PQ) y quistes (Q) (57). Los
folículos preantrales, principalmente secundarios, fueron definidos como folículos que
carecen de cavidad antral y que poseen dos o más capas de células de granulosa. Los
folículos atrésicos por su parte fueron definidos como aquellos folículos con más del 5
% de células con núcleo picnótico y que muestran a veces degradación de la célula
germinal. Los folículos antrales corresponden a aquellos que poseen una cavidad
antral. Para normalizar los resultados obtenidos de la morfometría, se determinó el
área del corte central mediante el programa computacional Rhino Cero y se expresaron
los resultados como el número de folículos/mm2.
6.2) Determinación de los niveles séricos de estradiol, androstenediona, progesterona, insulina y glucosa
Al momento de eutanasiar los animales se colectó muestras de sangre, las
cuales se mantuvieron a 4 ºC durante aproximadamente 18 horas, luego se
centrifugaron a 3000 g y finalmente se colectó y congeló el suero a -20 ºC para su
posterior análisis. Las hormonas esteroidales se midieron mediante un inmunoensayo
(EIA, Alpco Diagnostics, Windham, NH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
32
Las variaciones intra e inter ensayo fueron menos de 11 %, 7 % y 10 % para P, ∆4 y E2
respectivamente. El valor mímino detectable para P fue de 0.1 ng/ml; para ∆4 de 0.05
ng/ml; y para E2 de 10 ng/ml. La insulina por su parte se determinó con un ELISA
específico para rata (Alpco Diagnostics, Windham,NH) y la glucosa con un Accucheck
Comfort Glucometer™.
6.3) Determinación de catecolaminas en la médula adrenal Al momento de la medición las adrenales se descongelaron, pesaron y
homogenizaron con 1 ml de ácido perclórico (PCA) en un homogenizador vidrio-vidrio,
posteriormente el homogenizado se centrifugó a 13000 rpm por 10 minutos a 4 ºC y el
sobrenadante rescatado se utilizó directamente para la cuantificación de catecolaminas
por el método de Von Euler y Hamberg (58). Este método se basa en la oxidación de
adrenalina y noradrenalina a adrenocromo y noradrenocromo, moléculas que
presentan una absorción a una longitud de onda de 540 nm. La oxidación se realizó en
presencia de una solución de I2/I- a pH 6.0 y la medición se realizó con un
espectrofotómetro Jenway 6405 UV/Vis.
6.4) Determinación del contenido de noradrenalina en ovario y ganglio celíaco mediante HPLC Los ovarios y ganglios congelados previamente, se homogenizaron el día de la
determinación de NA, en 300 µl y 1 ml de PCA 0.2 N respectivamente, en un
homogenizador vidrio-vidrio. El homogenizado se centrifugó a 13000 rpm por 10
minutos y el sobrenadante rescatado se filtró con membranas de 0.22 µm de diámetro
de poro (MillexTM, Millipore Sao Paulo, Brazil). Posteriormente 20 µl de las muestras
filtradas se inyectaron en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución
acoplado a un detector electroquímico (HPLC-EC) con la siguiente configuración:
Inyector Rheodyne, bomba Waters multisolvente (Modelo 600-E, waters, millipore
Corporation, Milford, MA), columna BAS (Modelo MF-6213, fase II ODS-3, Bioanalitycal
System, West Alfayate, IN) y detector electroquímico de pulso (Modelo 464, Waters,
Millipore Corporation, Milford, MA).
La fase móvil utilizada en la cromatografía fue la siguiente: NaH2PO4 0.1 M,
Octal-Sulfato 0.86 mM, EDTA 1 mM y acetonitrilo 0.5 % v/v, ajustado a pH 2.6). Las
33
condiciones de detección fueron las siguientes: potencial amperométrico de oxidación
de 0.650 V, sensibilidad de detección 1 nA y flujo de fase móvil de 1 ml/min. El tiempo
de retención aproximado fue de 4.1 minuto para NA y las áreas de los picos calculadas
para cada muestra se interpolaron en una curva estándar, que se construyó con la
medición de diferentes concentraciones de noradrenalina bitartrato (Sigma, St. Louis,
MO).
7) Análisis estadístico Las diferencias entre los grupos control y experimental se analizaron con la
prueba de t de Student y las comparaciones entre varios grupos se realizó mediante un
análisis de varianza (ANOVA), seguido por una prueba de comparación múltiple para
desigual número de replicas (Newman-Keuls). El nivel de significancia fue definido
como p<0,05.
34
RESULTADOS 1) Caracterización del modelo de estrés por frío crónico intermitente
1.1) Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral Durante el procedimiento de estrés no hubo cambios en la ciclicidad estral en
ninguno de los grupos experimentales, control (fig. 5 A) y estrés (fig. 5 B), lo cual
concuerda con los resultados previamente descritos por nuestro grupo de trabajo (16).
La figura 5 C muestra el número de días promedio en cada una de las etapas del ciclo
que permaneció cada grupo experimental.
Figura 5: Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral. El panel A muestra la ciclicidad de las ratas control (n = 6) y el panel B la ciclicidad de las ratas sometidas a estrés crónico por frío durante 4 semanas (n = 6). El panel C muestra los mismos datos de A y B, pero expresados como el porcentaje de días en cada etapa (diestro y metaestro han sido considerados en diestro) P: proestro; E: estro; M: metaestro; D: Diestro.
0
15
30
45
60D EP
Control EstrésC
% D
ías
4 semanas de estrés por frío B
A
35
1.2) Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento La curva de crecimiento fue similar entre el grupo control y el de ratas
estresadas (fig. 6 A), al mismo tiempo que no hubo cambios en la ganancia de peso
entre el primero y último día de tratamiento (fig. 6 B). Sin embargo, el consumo de
alimento tendió a ser mayor en los animales estresados durante todo el tratamiento,
alcanzando significancia estadística sólo durante la cuarta semana de estrés (fig. 6 C).
Para investigar si las ratas sometidas a estrés crónico tuvieron algún grado de
resistencia a la insulina y/o fueron intolerantes a la glucosa, determinamos la
sensibilidad a la insulina in vivo mediante el método del clamp hiperinsulinémico
euglicémico y realizamos una prueba de tolerancia a la glucosa.
36
0 5 10 15 20 25 30 35 40150
200
250
300ControlEstrés
Primer día de estrés
A
Días
Peso
pro
med
io (g
)
Antes del
estré
sSem
-1Sem
-2Sem
-3Sem
-410
15
20
25
30ControlEstrés
**
C
Inge
sta
de a
limen
to (g
/día
)
0
10
20
30
40
50ControlEstrés
B
Gan
anci
a de
pes
o (g
)
Figura 6: Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento. En A se muestra el crecimiento de las ratas, expresado como el peso corporal promedio diario. En B se refleja el crecimiento como la ganancia de peso desde el primero hasta el último día de estrés. En el panel C se observa la ingesta de alimento diaria durante cada semana de tratamiento (Sem: semana). Cada punto o barra corresponde al promedio del peso corporal, diferencia de peso o ingesta diaria de alimento de al menos 6 animales ± el error estándar. **p‹0.01 vs. control Sem-4.
37
1.3) Efecto del estrés sobre el grado de sensibilidad a la insulina La técnica del clamp hiperinsulinémico euglicémico es la más válida para
determinar el grado de sensibilidad a la insulina. En esta técnica la glucosa plasmática
se mantiene en estado estacionario dentro de un rango euglicémico (~6 mmol/l),
mientras que la insulina plasmática se eleva hasta alcanzar un plateau deseado
(estado hiperinsulinémico). A mayor velocidad de flujo de glucosa, requerido para
alcanzar el estado euglicémico, mayor es la sensibilidad a la insulina y viceversa. Tal
como se muestra en la figura 7, la velocidad de infusión de glucosa fue
significativamente mayor en los animales estresados por cuatro semanas, lo cual
sugiere que estos animales tienen mayor incorporación y utilización de la glucosa que
sus respectivos controles. El valor de insulina plasmática en el estado estacionario fue
de 95.1 ± 7.3 mU/l, lo cual corrobora el estado hiperinsulinémico.
Control Estrés0
20
40
60
*
Velo
cida
d de
infu
sión
de
gluc
osa
(mg/
kg/m
in)
Figura 7: Efecto del estrés sobre la velocidad de infusión de glucosa, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico. Cada barra corresponde al promedio ± el error estándar de 9 ratas control y 6 ratas estresadas. *p‹0.05 vs. control.
38
1.4) Efecto del estrés sobre la tolerancia a la glucosa En el modelo de estrés crónico los animales fueron capaces de tolerar la
glicemia elevada, inducida con la PTG (fig. 8 A). En las mismas muestras de sangre
obtenidas durante la prueba de tolerancia a la glucosa se midió la insulina, con la
finalidad de relacionar la respuesta del páncreas de secretar insulina y la capacidad del
animal de regular la glicemia. Las insulinemias se muestran en la figura 8 B, en donde
se puede observar que ambos grupos experimentales respondieron de la misma forma
al secretagogo glucosa, secretando insulina de forma muy similar. La glicemia e
insulinemia basal de los animales control y estresados fue de 6.20±0.21 y 2.36±0.6;
5.82±0.42 y 1.54±0.34 respectivamente, sin alcanzar diferencias significativas en
ninguno de los parámetros.
0 15 30 45 60 75 90 105 1200
6
12
18
24ControlEstrés
A
Tiempo (min)
Glu
cosa
pla
smát
ica
(mm
ol/L
)
Figura 8: PTG en ratas control y estresadas (A). Insulina plasmática medida durante la PTG (B). Cada punto corresponde al promedio ± el error estándar de 5 animales para cada grupo experimental.
0 30 60 90 1200
4
8
12
16
20
24
28
32 ControlEstrés
B
Tiempo (min)
Insu
lina
plas
mát
ica
(µg/
L)
39
1.5) Efecto del estrés sobre la actividad nerviosa simpática Aunque el modelo de estrés crónico por frío ya había sido caracterizado
anteriormente en cuanto a su actividad nerviosa simpática generalizada y ovárica en
particular (16, 28), en este trabajo corroboramos los datos anteriormente publicados
respecto a este modelo animal. La concentración de A y NA plasmática no experimentó
modificaciones después de 4 semanas de estrés (figura 9 A), sin embargo en la
glándula adrenal hubo un aumento en el contenido de catecolaminas producto del
estrés crónico (figura 9 B). El contenido de NA en el ganglio celiaco se mantuvo sin
cambios, mientras que la NA ovárica aumentó, una vez finalizado el estrés, sin
alcanzar significancia estadística (figura 9 C y D).
0
10
20
30
40
50Adrenalina Noradrenalina
EstrésControlA
Cat
ecol
amin
as (n
g/m
l de
plas
ma)
0
20
40
60 Control Estrés
*
B
Cat
ecol
amin
as (µ
g/ad
rena
l)
Figura 9: Efecto del estés por frío crónico sobre la actividad nerviosa simpática. En A se muestra la concentración de adrenalina y noradrenalina en el plasma, en B el contenido de catecolaminas en la médula adrenal, en C el contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco y en D la concentración de noradrenalina en el ovario en ratas control y estresadas. Los valores están expresados como el promedio ± el error estándar de 5 experimentos individuales. *p‹0.05 vs. control
0
20
40
60
Control Estrés
Nor
adre
nalin
a (n
g/ga
o)
C
0.0
0.2
0.4
0.6
Control Estrés
Nor
adre
nalin
a (n
g/m
g O
vario
)
D
ngli
40
2) Efecto local de la insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica 2.1) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo eléctrico La determinación de la liberación de [3H]-NA ovárica, como forma de medir la
actividad nerviosa simpática ovárica ha sido utilizada ampliamente por nuestro grupo
de trabajo (12, 59). Los ovarios de los animales control y sometidos a estrés crónico
fueron incubados en cámaras de superfusión, en donde se sometieron a
despolarización por medio de un estímulo eléctrico que simula un potencial de acción.
En este experimento el flujo de solución Krebs o Krebs complementado con insulina es
continuo y la colección de fracciones es cada 1 minuto, por lo tanto, no hay
acumulación de moléculas secretadas por el tejido ovárico en el medio de incubación.
La liberación inducida del neurotransmisor en estas condiciones experimentales no
mostró diferencias cuando el ovario estuvo o no incubado en presencia de insulina en
ambos grupos experimentales, control (fig. 10 A-B) y estrés (fig. 10 C-D). Los valores
presentados bajo cada gráfico corresponden a la cantidad total de NA liberada bajo
estimulación (señalada por el área blanca o achurada según corresponda, A1-2). Cada
ovario se estimuló dos veces de forma consecutiva y la razón de las áreas obtenidas
en cada experimento se presenta en la figura 11, la cual confirma que no hubo
diferencias significativas cuando se agregó insulina al medio de superfusión.
41
Figura 10: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante eléctrico, de [3H]NA ovárica en ratas control (panel A y B) y ratas sometidas a estrés por frío (panel C y D). Los ovarios fueron preincubados con [3H]NA y luego sometidos a 2 estímulos (600 pulsos a 80 V, 2 mseg de longitud y 10 Hz por 1 min). La insulina fue agregada al medio de perfusión 14 minutos antes del segundo estímulo. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación fraccional y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
- -+Ins +Ins
Control Estrés
A 2/A
1
Figura 11: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante eléctrico. El gráfico muestra las razones entre el estímulo 2 (A2) y el estímulo 1 (A1) realizados para cada ovario. Las barras blancas corresponden a dos estimulaciones consecutivas en presencia de solución krebs, mientras que para las barras grises el primer estímulo fue con krebs y el segundo con krebs + insulina. Cada valor representa el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.
42
2.2) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante con K+ 80 mM En este caso la incubación de los ovarios se hizo en estanco, es decir, la
solución Krebs o Krebs suplementada con insulina, se mantuvo en los pocillos con los
ovarios sumergidos. De tal forma que, cualquier molécula secretada al medio de
incubación podría acumularse durante el tiempo en que se mantenga el ovario en este
medio (2 minutos en cada pocillo). Sin embargo, la insulina en estas condiciones
tampoco fue capaz de modificar la liberación de NA basal ni inducida con el estímulo
despolarizante en los animales control (fig. 12 A-B) y estresados (fig. 12 C-D). Al igual
que en el caso anterior, los valores presentados sobre cada gráfico corresponden a la
cantidad total de NA liberada bajo estimulación (señalada por el área blanca o
achurada según corresponda, A1-2). Cada ovario se estimuló dos veces de forma
consecutiva y la razón de las áreas obtenidas en cada experimento se presenta en la
figura 13, la cual confirma que no hubo diferencias significativas cuando se agregó
insulina al pocillo de incubación.
43
Figura 12: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante de alta concentración de potasio, de [3H]NA ovárica en ratas control (panel A y B) y ratas sometidas a estrés por frío (panel C y D). Los ovarios fueron preincubados con [3H]NA y luego sometidos a 2 estímulos con K+ 80 mM. La insulina fue agregada al medio de incubación 30 minutos antes del segundo estímulo. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación fraccional y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
- -+ Ins + Ins
Control Estrés
A2/
A1
Figura 13: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante K+ 80 mM. El gráfico muestra las razones entre el estímulo 2 (A2) y el estímulo 1 (A1) realizados para cada ovario. Las barras blancas corresponden a dos estimulaciones consecutivas en presencia de solución krebs, mientras que para las barras grises el primer estímulo fue con krebs y el segundo con krebs + insulina. Cada valor representa el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.
44
2.3) Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica En la literatura Chi y cols. habían descrito que la insulina aumentaba la
liberación basal de NA en tejido aórtico, cuando este era incubado por 30 minutos (40).
Al realizar ese procedimiento experimental con los ovarios, observamos un aumento en
la liberación de NA inducido por la insulina en los ovarios de ratas control, sin embargo,
no fue capaz de inducir el mismo efecto sobre los ovarios de ratas estresadas (fig. 14).
Este resultado sugirió que los animales sometidos a estrés crónico tenían un grado de
resistencia a la insulina, que probablemente estaba dado por cambios en la expresión
de moléculas de la transducción de señal de la insulina
- + Ins - + Ins0
1
2
3
4
5
6
7Control Estrés
*
Libe
raci
ón d
e NA
(%)
Figura 14: Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica. Las barras blancas corresponden a la liberación basal de NA en ausencia de insulina y las barras grises en presencia de insulina. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales. *p‹0.05 vs. control -
45
2.4) Efecto de la insulina sobre la secreción de esteroides ováricos La misma dosis de insulina (10 UI/l) usadas en el experimento de liberación de
NA, fue utilizada para determinar si la insulina modifica la secreción de esteroides
ováricos. En el experimento se incluyó la gonadotropina coriónica humana (hCG) como
control positivo de estimulación de esteroides ováricos y se probó también el efecto de
la insulina en presencia de hCG, ya que en la literatura se ha descrito un efecto
sinérgico entre la insulina y las gonadotropinas sobre la liberación de hormonas
esteroidales (48). La insulina no modificó la secreción de progesterona (fig. 15 A),
androstenediona (fig. 15 B) ni estradiol (fig. 15 C) en ninguno de los grupos
experimentales. La hCG tendió a aumentar la secreción de progesterona y
androstenediona, sin modificar la secreción de estradiol. El efecto sinérgico de la
insulina junto con hCG sólo pudo observarse en la secreción de progesterona.
46
Krebs hCG Ins hCG + Ins0
1
2
3ControlEstrés
*
**
APr
oges
tero
na (n
g/m
l/mg
ovar
io)
Krebs hCG Ins hCG + Ins0
10
20
30ControlEstrés
B
And
rost
ened
iona
(pg/
ml/
mg
ovar
io)
Krebs hCG Ins hCG + Ins0
10
20
30ControlEstrés
C
Estr
adio
l (pg
/ml/m
g ov
ario
)
Figura 15: Efecto de la insulina sobre la secreción de hormonas esteroidales ováricas. A: secreción de P; B: secreción de ∆4; C: secreción de E2. Las barras blancas corresponden a la secreción ovárica de animales control y las barras grises de animales sometidos a estrés crónico. Los valores están expresados como el promedio ± el error estándar de 5 experimentos individuales. *p‹0.05 y **p‹0.01 vs. secreción basal (Krebs).
47
3) Determinación de la expresión de IRS-1, IRS-2, GLUT-1 y GLUT-4 3.1) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis Con el fin de corroborar si los cambios en la sensibilidad a la insulina,
encontrada en la periferia y en el ovario de las ratas sometidas a estrés crónico fueron
tejido específicos, se midió la expresión de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en
músculo y ovario. La expresión de Irs-1 y Glut-4 en los ovarios de ratas expuestas al
frío, fue significativamente menor que en los animales control (fig. 16 A-B), mientras
que en el músculo no se encontró cambios en la expresión de Irs-1 ni Glut-4 (fig. 16 C-
D). La expresión de Irs-2 y Glut-1 no mostró cambios en ovario ni músculo (fig. 17 A-
D).
Control Estrés0.00
0.04
0.08
0.12
*
B
Raz
ónG
lut-4
/18s
0
6
12
18
*
AOvario
Raz
ónIrs
-1/1
8s
0
10
20
30
40
50
60C
Músculo
Raz
ónIrs
-1/1
8s
Control Estrés0
2
4
6
8
D
Raz
ónG
lut-4
/18s
Figura 16: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en ovario (A-B) y músculo tibialis (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.
48
0
3
6
9
12
15Ovario
A
Raz
ónIrs
-2/1
8s
0
10
20
30
40
50
60Músculo
C
Raz
ónIrs
-2/1
8s
Control Estrés0.0
2.5
5.0
7.5
10.0B
Raz
ón G
lut-1
/18s
Control Estrés0.0
0.1
0.2
0.3
0.4D
Raz
ón G
lut-1
/18s
Figura 17: Cambios en el mRNA para Irs-2 y Glut-1 en ovario (A-B) y músculo tibialis (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental.
49
3.2) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario y músculo tibialis Los cambios en el nivel de mRNA se complementaron con la determinación del
nivel de proteína de IRS-1 y GLUT-4, mediante western blot. La determinación
demostró un patrón similar al observado al medir el mRNA. En los gráficos B y C de la
figura 18 está cuantificada la intensidad de los pixeles de las bandas obtenidas en el
wester blot (panel A) para las muestras de ovario. El resultado muestra una
disminución significativa del nivel de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios de los animales
estresados. En el tejido muscular tibialis no se observó cambios en el nivel de proteína
IRS-1 ni GLUT-4 (figura 18 E-F). Estos resultados confirman la disminución de la
expresión de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios de los animales estresados y apoyan la
resistencia a la insulina encontrada en cuanto a la actividad nerviosa simpática ovárica.
50
A Ovario Estrés Control IRS-1 GLUT-4 β-TUB
Control Estrés0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
*
IRS-
1 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
Control Estrés0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
*
GL
UT
-4 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
C B
D Músculo Estrés Control
IRS-1 GLUT-4
β-TUB
Control Estrés0.00
0.05
0.10
0.15
IRS-
1 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
E F
Control Estrés0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
GL
UT
-4 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
Figura 18: Efecto del estrés frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario (A, B, C) y músculo (D, E, F). En A se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en el ovario. B y C representan la cuantificación de las respectivas bandas. En D se muestra el the western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en músculo. E y F representan la cuantificación de las respectivas bandas. La intensidad de las bandas fue medida con el programa UN-SCAN-IT y los resultados fueron normalizados con su correspondiente banda de ß-TUBULINA. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.
51
3.3) Nivel de mRNA para Irs-1 y Glut-4 en células de granulosa y teca-intersticial La disminución de la expresión de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios, aumenta la
posibilidad de que diferentes tipos celulares estén involucrados en la resistencia a la
insulina ovárica. Para elucidar esta incógnita, estudiamos la expresión de IRS-1 y
GLUT-4 en una fracción enriquecida de células de granulosa y en otra de células
tecales e intersticiales. Para comprobar la pureza de la preparación, se midió el nivel
de mRNA para el receptor de FSH en ambas fracciones, ya que este sólo se expresa
en células de la granulosa (52). Más del 99 % del mRNA para Fshr se encontró
presente en la fracción de células de granulosa (fig. 19)
Las células de la teca-intersticial mostraron la misma magnitud de disminución
del mRNA de Irs-1 y Glut-4 que en el ovario completo (fig. 20 A-B), mientras que en la
fracción de granulosas no hubo cambios en el nivel de estos mRNAs (fig. 20 C-D).
0.00
0.02
0.04
0.063
4
5
6 GranulosaTeca-intersticial
Raz
ónFs
hr/1
8s
Figura 19: Concentración relativa del mRNA de Fshr en células de granulosa y teca-intersticial. La diferencia alcanza los dos órdenes de magnitud entre una fracción y la otra. Cada barra representa el promedio ± el error estándar de 5 ovarios individuales.
52
0
5
10
15
20
25C
Granulosa
Raz
ónIrs
-1/1
8s
Control Stress0
4
8
12D
Raz
ónG
lut-4
/18s
Control Estrés0.0
0.5
1.0
1.5
*
B
Raz
ónG
lut-4
/18s
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Teca-IntersticialA
Raz
ónIrs
-1/1
8s
Figura 20: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en fracción de células de granulosa (A-B) y teca-intersticial (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.
53
3.4) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa y teca-intersticial La determinación del nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en las fracciones
celulares de granulosa y teca-intersticial se realizó mediante ensayo de western blot.
En la fracción de células de granulosa disminuyó sólo el nivel de IRS-1 en los animales
estresados, manteniéndose sin cambios el nivel de GLUT-4 (figura 21 B-C). En la
fracción de células teca-intersticial la disminución fue tanto en el nivel de IRS-1 como
de GLUT-4 en los animales sometidos a estrés (figura 21 E-F). Estos resultados
sugieren que las células de la teca-intersticial son las preferentemente involucradas en
la carencia de respuesta de liberación de NA desde el ovario después de la
estimulación con insulina.
54
A Granulosa
Estrés Control Figura 21: Efecto del estrés por frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa (A, B, C) y teca-intersticial (D, E, F). En A se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en la fracción de células de la granulosa. B y C representan la cuantificación de las respectivas bandas. En D se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en la fracción de células teca-intersticial. E y F representan la cuantificación de las respectivas bandas. La intensidad de las bandas fue medida con el programa UN-SCAN-IT y los resultados fueron normalizados con su correspondiente banda de ß-TUBULINA. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 4 ovarios de ratas control y 5 ovarios de ratas estresadas. *p‹0.05 vs. control.
IRS-1
GLUT-4
β-TUB
Teca-intersticial
IRS-1
GLUT-4
Control Estrés
D
β-TUB
Control Stress0.00
0.05
0.10
0.15
*
IRS-
1 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)B
Control Stress0.0
0.1
0.2
0.3
GL
UT
-4 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
C
Control Stress0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
*
IRS-
1 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
E F
Control Stress0.0
0.1
0.2
0.3
*
GL
UT
-4 (U
nida
des a
rbitr
aria
s)
55
4) Administración de insulina intracerebroventricular 4.1) Control del implante de la cánula Para verificar la ubicación de la cánula implantada en los animales, los cerebros
fueron cortados y fotografiados bajo microscopía de luz. La foto, representativa de 18
cerebros canulados, muestra la ubicación de la cánula en el tercer ventrículo (figura
22).
HipocampoHipocampo
Ventrículolateral
Ventrículolateral 3er Ventrículo3er Ventrículo
Cánula
HipocampoHipocampo
Ventrículolateral
Ventrículolateral 3er Ventrículo3er Ventrículo
Cánula
Figura 22: Control del implante de la cánula colocada en el tercer ventrículo. En el panel de la izquierda se muestra un esquema de un corte coronal en -2.80 mm según Bregma, en el que se indica el hipocampo, los ventrículos laterales y el tercer ventrículo. Las mismas estructuras se indican en el panel de la derecha, que corresponde a un corte coronal de un cerebro de rata, canulado según las coordenadas del Atlas Paxinos en el tercer ventrículo (-2.80 mm antero-posterior, 0,00 mm medio-lateral y -8.1 mm dorso-ventral).
56
4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre aspectos metabólicos La administración ICV de insulina (1U/kg/día) durante 7 días (última semana de
tratamiento de estrés) provocó una disminución significativa (p<0.001) de la ganancia
de peso en los animales controles comparado con aquellos que sólo recibieron una
infusión de suero fisiológico (vehículo), figura 23 A. Los animales estresados
disminuyeron la ganancia de peso corporal independiente del tratamiento ICV que
recibieron (vehículo o insulina), cuando se compararon con el grupo control vehículo.
Sin embargo, la disminución del peso corporal de los animales infundidos con insulina
ICV comparados con sus respectivos controles (control vehículo o estrés vehículo)
mostró que el efecto de la insulina en los animales estresados fue mucho menor, lo
cual sugiere una posible resistencia al efecto de insulina en el sistema nervioso central
en los animales sometidos a estrés crónico. El consumo de alimento fue
significativamente menor en los animales sometidos a estrés crónico independiente del
tratamiento ICV que recibieron (vehículo o insulina), cuando estos se compararon con
los animales control vehículo (fig. 23 B). El papel anorexígeno que juega la insulina a
nivel del sistema nervioso central (28), fue confirmado sólo parcialmente en nuestros
resultados, ya que la administración de insulina ICV en los animales control sólo tendió
a disminuir la ingesta de alimento.
La insulina administrada en el tercer ventrículo provoca una disminución de la
gluconeogénesis hepática y como consecuencia disminuye también el nivel basal de
insulina plasmática (60). Al igual que lo descrito en la literatura, la administración de
insulina ICV provocó una disminución significativa de la insulinemia y glicemia en
animales control, mientras que en los animales estresados, la insulina administrada
ICV no produjo cambios (figura 24 A-B). Estos resultados apoyan nuevamente un
estado de resistencia a la insulina a nivel de sistema nervioso central en los animales
sometidos a estrés crónico.
57
-10
-5
0
5
10
*********
A
#
- -+ +Control Estrés
Insulina
Gan
anci
a de
Pes
o (%
)
0
10
20
30
* *
B
Control Estrés- -+ +Insulina
Con
sum
o de
alim
ento
(g/d
ía)
Figura 23: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la ganancia de peso (A) y consumo de alimento (B) en animales control y sometidos a estrés por frío. La ganancia de peso fue expresada como el porcentaje de peso ganado o perdido después de terminado el protocolo de infusión ICV, tomando como 100 % el valor de peso corporal que tenían los animales antes de comenzar el tratamiento de infusión. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. Control -; ***p‹0.001 vs. Control -; #p<0.05 vs. diferencia entre Control + y Control -.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
Insulina - -+ +Control Estrés
A
Insu
lina
plas
mát
ica
(µg/
l)
0
2
4
6
8
Control EstrésInsulina - -+ +
*
B
Glu
cosa
pla
mát
ica
(mm
ol/L
)
Figura 24: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la insulina (A) y glucosa (B) plasmática en animales control y sometidos a estrés por frío. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. Control -
58
4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la concentración plasmática de P, ∆4 y E2
La relación descrita entre la señalización de insulina a nivel de sistema nervioso
central y la función reproductiva ha sido centrada en el efecto de insulina sobre el eje
neuroendocrino, hipotálamo-hipófisis-ovario (47, 48). Los receptores de insulina
expresados en neuronas GnRH o en algunos centros superiores pueden mediar la
síntesis o secreción de GnRH (43). En nuestro interés de determinar si la insulina, en
nuestro modelo experimental, altera el eje endocrino, determinamos la concentración
de hormonas ováricas en los distintos grupos experimentales. Como se muestra en la
tabla 2, no hubo cambios en la concentración plasmática de progesterona,
androstenediona y estradiol. Esto sugiere que el efecto de insulina administrado ICV in
vivo durante 7 días no altera la secreción de hormonas esteroidales ováricas ni altera
la ciclicidad de los animales (datos no mostrados).
Tabla 2: Efecto de la insulina ICV sobre la concentración plasmática de progesterona (P), androstenediona (∆4) y estradiol (E2)
Control Estrés Vehículo Insulina Vehículo Insulina
P (ng/ml) 6.51±1.70 5.00±1.08 4.68±1.43 3.83±2.21 ∆4 (ng/ml) 0.24±0.06 0.18±0.03 0.18±0.03 0.16±0.02
E2 (pg/ml) BLD 2.75±0.88 1.93±0.65 BLD
BLD: Bajo límite de detección
59
4.3) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la actividad nerviosa simpática ovárica 4.3.1) Contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco: El ganglio celíaco es el último relevo sináptico de las proyecciones nerviosas,
que se originan en el hipotálamo e inervan al ovario. La figura 25 muestra que la
administración de insulina ICV no modifica el contenido de NA en el ganglio celíaco en
los animales control ni estresados. Lo que sugiere que la vía nerviosa que controla la
función ovárica no parece alterarse por la acción de la insulina ICV.
0
20
40
60
80
100
Nor
adre
nalin
a (n
g/ga
nglio
)
Control EstrésInsulina - -+ +
Figura 25: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el ganglio celíaco de ratas control y sometidos a estrés por frío. Vehic: vehículo; Ins: insulina. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental.
60
4.3.2) Contenido de noradrenalina en el ovario: Al igual que lo ocurrido en el ganglio celíaco el contenido de NA en el ovario no
se modificó con la administración de insulina ICV en ambos grupos experimentales (fig.
26). Lo que apoya la ausencia de efecto de la insulina ICV sobre la actividad nerviosa
simpática del ovario. Los animales estresados mostraron una clara tendencia al
aumento del contenido de NA al compararlos con sus respectivos controles (p=0.053),
independiente del efecto de la insulina administrada ICV, lo cual concuerda con lo
observado anteriormente en que los animales sometidos a este protocolo de estrés
aumentan la actividad nerviosa simpática del ovario (16).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Nor
adre
nalin
a (n
g/m
g O
vario
)
Control EstrésInsulina - -+ +
Figura 26: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el ovario de ratas control y sometidos a estrés por frío. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental.
61
4.4) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica La insulina aplicada ICV no parece ejercer efecto alguno en la morfología
ovárica. El número de folículos saludables y atrésicos por mm2 no se ven modificados
por efecto de la insulina administrada durante 7 días en el tercer ventrículo en los
animales control y estresados. Sin embargo, el estrés por frío, independiente del efecto
de insulina ICV, disminuye el número total de folículos por mm2 (2.61 ± 0.34 control
vehículo vs. 0.43 ± 0.08 estrés vehículo, p<0.05). Al investigar qué tipo de folículos son
los que dan cuenta de una disminución en el número total de folículos, encontramos
que los folículos preantrales y antrales normales disminuyeron significativamente en los
ovarios de los animales expuestos al estrés por frío (fig. 27 A), de forma similar a lo
descrito anteriormente por nuestro grupo de trabajo (16). El número de cuerpos lúteos
por mm2 se redujo alrededor de un 50 % en los animales estresados (fig. 27 B). Los
folículos anómalos, entre los cuales se encuentran los folículos con hipertrofia tecal,
tipo III, prequistes y quistes, tendieron a incrementarse en los ovarios de animales
estresados (fig. 27 C), apoyando los resultados publicados anteriormente en este
modelo animal (16).
62
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Control Vehíc Control Ins Estrés Vehíc Estrés Ins
Normal Atrésico Normal Atrésico
Preantral Antral
**
*** **
***
Den
sida
d de
Fol
ícul
os (n
º/mm
2 )
A
0
1
2
3
4Control VehícControl InsEstrés VehícEstrés Ins
**
Cue
rpos
Lút
eos/
mm
2
B
0
1
2
3
4Control VehícControl InsEstrés VehícEstrés Ins
Núm
ero
de fó
licul
os a
nóm
alos
/co
rte
cent
ralC
Figura 27: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfometría ovárica de ratas control y estresadas infundidas con insulina ICV. En A se observa la densidad de folículos preantrales normales, preantrales atrésicos, antrales normales y antrales atrésicos. El el gráfico B se muestra la densidad de cuerpos lúteos y en C se contabilizaron los folículos anómalos (hipertecosis, tipo III, prequistes y quistes) en cada uno de los grupos experimentales. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05, **p‹0.01, ***p‹0.001
63
A Control
CL
CL
CL CL
FAN
CL
CL
CL
FAA
FTIII
CL
CL
EstrésD
CL
FTIII
C
CL PQ
CL
CL
CL Estrés
CL
Control B
Figura 28: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica de ratas control y estresadas infundidas con insulina ICV. Las fotos corresponden al corte central de un ovario de rata control infundida con vehículo (A), rata control infundida con insulina (B), rata estresada infundida con vehículo (C) y rata estresada infundida con insulina (D). Las fotos son representativas de cada grupo experimental. CL: cuerpo lúteo; FAN: folículo antral normal; FAA: folículo antral atrésico; FTIII: folículo tipo III; PQ: prequiste.
64
DISCUSIÓN
En esta tesis se estudió el efecto de la insulina sobre la actividad nerviosa
simpática ovárica y cómo el estrés crónico intermitente por frío es capaz de modificar la
respuesta de esta hormona. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente que el
estrés crónico por frío desarrolla una resistencia a la insulina, ovario e hipotálamo
específica. Estos resultados abren la posibilidad de que alteraciones en la cascada de
transducción de señal de la insulina en el ovario, inducida por estrés crónico, pueda ser
un evento inicial responsable de provocar cambios en la fisiología ovárica.
Previamente, se ha descrito en la literatura que este modelo animal de estrés crónico
por frío provoca cambios en el desarrollo folicular ovárico, entre los que destacan la
hipertrofia de las células de la teca y una luteinización prematura de la teca. Además,
estos cambios fueron asociados con la activación de la inervación simpática del ovario
(16). Algunas de las características encontradas en este modelo animal han sido
observadas en el SOP humano (29). Una característica común asociada con la
patología poliquística es la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia compensatoria.
Un gran número de evidencias relacionan al SOP con la hiperinsulinemia, mediante un
efecto de la insulina sobre el eje de regulación endocrina del ovario. Específicamente,
la insulina aumenta la esteroidogénesis ovárica al actuar directamente sobre
receptores ubicados en las células de la teca y de la granulosa (61, 62). Además, la
insulina es capaz de modificar la secreción de gonadotropinas hipofisiarias, cambiando
la relación entre LH y FSH, lo cual ocurre en algunas pacientes con SOP. Si bien estos
cambios hormonales provocados por la insulina parecen ser importantes en el
desarrollo o mantención del SOP, hasta ahora no existían evidencias sobre el rol que
podría jugar la insulina sobre el eje de regulación nerviosa que, en forma
complementaria a la endocrina, participa en el control de la fisiología ovárica.
1) Cambios metabólicos en el modelo de estrés crónico por frío Ante cualquier tipo de agente estresor, los organismos sufren adaptaciones
fisiológicas con el fin de mantener la homeostasis corporal. La exposición de ratas al
65
estrés por frío crónico no provocó cambios en la secreción de insulina por parte del
páncreas cuando fue estimulado con un secretagogo como la glucosa (prueba de
tolerancia a la glucosa). Sin embargo, la acción de la insulina sufrió modificaciones, ya
que al analizar la sensibilidad de la insulina, mediante el clamp hiperinsulinémico
euglicémico, se observó un aumento de ésta, sugiriendo una mayor eficiencia en la
incorporación de glucosa por parte de los tejidos blanco de esta hormona,
principalmente la musculatura esquelética y el tejido adiposo. La exposición de
animales homeotérmicos al frío produce como respuesta inicial, una disminución en la
pérdida y un aumento de la generación de calor. Para lograr esto último debe ocurrir un
aumento en la demanda energética, que se traduce en una pérdida de peso o aumento
en la ingesta de alimento. En resultados similares a los encontrados en esta tesis,
Gasparetti y cols., mostró que ratas expuestas durante 8 días continuos a estrés por
frío sufrieron una caída temprana en el peso corporal, un aumento en la ingesta diaria
de alimento y una mayor captación de glucosa (44). El procedimiento de estrés
utilizado en nuestro trabajo, si bien no afectó el peso corporal, provocó un aumento
significativo en la ingesta de alimento durante la última semana de estrés. El aumento
en la ingesta de alimento, sin un aumento concomitante en la curva de crecimiento ni
ganancia neta de peso, sugiere que los animales mantuvieron el balance ente el
consumo de alimento y el gasto energético. La termogénesis, que involucra
inicialmente lipólisis, inducida mediante un aumento en la activación del sistema
nervioso simpático (63), puede ser uno de los mecanismos utilizados para mantener la
homeostasis del animal. En la literatura se ha descrito que la activación nerviosa
simpática producida mediante un agente estresor produce a nivel pancreático una
disminución en la secreción de insulina, esto mediado principalmente por el efecto de
la NA sobre los receptores α2-adrenérgicos postsinápticos ubicados en las células β-
pancreáticas (64). Sin embargo, en el modelo de estrés por frío crónico intermitente, la
insulina basal de los animales fue igual a la de sus respectivos controles, indicando
probablemente que hubo mecanismos de adaptación a nivel pancreático, quizás
atribuibles a un “down-regulation” de los receptores α2-adrenérgicos. Por otra parte, la
administración de insulina en el tercer ventrículo mostró una respuesta disminuida a
esta hormona en cuanto a cambios periféricos se refiere, comparada con los animales
control (revisar más adelante en la discusión). Al ser la insulina una señal de saciedad
66
alimenticia en el hipotálamo, podemos sugerir que en este modelo de estrés la insulina
pierde su capacidad de generar saciedad a nivel central, pudiendo también participar
como agente causal de la mayor ingesta de alimento.
2) Efectos de la insulina aplicada localmente sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío Existen diversos efectos atribuidos a la insulina, distintos a su acción clásica de
regulación de la glicemia, entre los cuales se encuentra la modulación de la actividad
nerviosa autonómica (39, 40). A nivel ovárico a la insulina se le ha atribuido la función
de potenciar el efecto esteroidogénico de las gonadotropinas (48, 62), sin embargo,
hasta ahora se desconocía el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa
simpática del ovario.
El aumento en la sensibilidad a la insulina encontrada en los animales
estresados, abrió la posibilidad de que los ovarios de estos animales respondieran más
que sus respectivos controles al ser incubados en presencia de insulina. La insulina no
modificó la liberación de NA inducida por estímulo despolarizante eléctrico o con alta
concentración de K+, apuntando a que esta hormona no participa en los mecanismos
que involucran la liberación de NA producidos en el terminal nervioso después de
generado un potencial de acción. La liberación basal de NA de 1 minuto en el protocolo
de estimulación eléctrica y de 2 minutos en el protocolo de estimulación con alta
concentración de K+, no fue afectada por la presencia de insulina en ninguno de los
grupos experimentales. La actividad nerviosa simpática de los ovarios de animales
control fue modificada por la insulina de forma similar a la demostrada anteriormente
en tejido aórtico (40). Es decir, aumentando la liberación basal de NA luego de 30
minutos de incubación. Sin embargo, la insulina fue incapaz de modificar la actividad
nerviosa simpática en los ovarios de los animales estresados. Este resultado sugirió
que como consecuencia del estrés crónico, el ovario experimentó cambios que llevaron
a la resistencia a la insulina en los nervios simpáticos ováricos o, posiblemente, en otro
tipo de células ováricas, si suponemos que el efecto de la insulina sobre la liberación
de NA desde los terminales nervioso que llegan al ovario fue indirecto. El hecho que la
liberación haya sido aumentada sólo después de 30 minutos en el protocolo de
incubación en estanco, sugiere que los cambios inducidos por la insulina sobre los
67
terminales nerviosos son indirectos. Es decir, probablemente esta hormona actúa
sobre células ováricas, las cuales en respuesta a esta estimulación secretan al medio
de cultivo algún factor estimulador de la liberación basal de NA.
En este trabajo se ha descrito por primera vez un efecto estimulador de la
insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica. Esto podría tener una gran
relevancia en la patología del SOP, si suponemos que las pacientes con SOP
hiperinsulinémicas (más del 50 % de las pacientes con SOP), podrían tener
alteraciones en la regulación nerviosa de la gónada, la cual se sabe que participa en la
génesis y mantención del SOP (12-14).
La concentración de insulina que provocó el aumento en la liberación de NA, no
afectó la secreción de hormonas esteroidales ováricas, progesterona, androstenediona
y estradiol, indicando quizás una selectividad en el efecto de esta hormona. Estudios
previos en los que se utilizaron células de la granulosa provenientes de pacientes
PCOS con resistencia a la insulina mostraron que la insulina mantiene su efecto
estimulatorio sobre la esteroidogénesis ovárica, contrastado con su daño en la acción
metabólica (65). En nuestro modelo, utilizando cultivos con ovario completo, no
encontramos cambios de la esteroidogénesis al incubarlos sólo en presencia de
insulina. La posible explicación es que el tiempo de incubación (3 horas) no fue
suficiente para producir el efecto sobre la esteroidogénesis o que es necesaria la co-
incubación con una gonadotropina para potenciar el efecto esteroidogénico, tal como
ha sido descrito anteriormente (62). Cuando incubamos los ovarios en presencia de
hCG, estos respondieron a la secreción de progesterona y en menor grado a la de
androstenediona, cuando se comparó con su secreción basal, lo cual está de acuerdo
con el efecto esperado para esta hormona. Cuando co-incubamos los ovarios con
insulina y hCG, sólo observamos en la secreción de progesterona un aumento al
comparar con la secreción obtenida con hCG solamente. No hubo diferencias entre la
secreción de esteroides en ovarios de ratas control y estresadas, por lo que el efecto
de resistencia a la insulina parece ser función específica, tal como se ha demostrado
en células de granulosa de pacientes SOP insulina resistentes (45).
El aumento en la sensibilidad a la insulina en el animal completo encontrada en
este modelo de estrés y la presencia de resistencia a esta hormona en la función
nerviosa ovárica, supone cambios en la señalización de la insulina que serían tejido
68
específico. Para corroborar esto último, determinamos la expresión de moléculas
involucradas en la transducción de señal de la insulina, tanto en tejido muscular como
ovárico. Los resultados apoyaron la hipótesis de una regulación en la señalización de
insulina tejido específico, ya que en los animales estresados hubo una disminución de
IRS-1 y GLUT-4, tanto en lo que respecta al mRNA como a la proteína, mientras que
en el músculo tibialis no hubo cambios significativos de estas moléculas. Los cambios
encontrados en el mRNA apoyan lo sugerido anteriormente sobre que el efecto de la
insulina sobre la liberación de NA sería indirecto, ya que el mRNA no se encuentra en
los terminales nerviosos, sino que estaría en el cuerpo neuronal, parte ausente en los
ovarios disecados. Por lo tanto, las células ováricas en donde se han descrito
receptores para insulina (granulosa y teca) serían los responsables de la resistencia a
la insulina y por ende de la incapacidad de la insulina de activar la inervación simpática
en los animales estresados.
Para comprobar el tipo de célula ovárica involucrada, separamos las células de
la granulosa de la fracción teca-intersticial y determinamos la expresión de IRS-1 y
GLUT-4. Tanto el mRNA como la proteína IRS-1 y GLUT-4 disminuyó
significativamente en la fracción de células teca-intersticial y no en las células de la
granulosa en los animales sometidos a estrés por frío. Sólo la proteína IRS-1
disminuyó en las células de la granulosa después de las 4 semanas de estrés.
Estudios realizados en células de granulosa humanan de pacientes PCOS con
resistencia a la insulina, han demostrado que existe resistencia a la insulina en estas
células en cuanto a su capacidad de incorporar glucosa y almacenar glicógeno (45),
manteniendo intacto el efecto esteroidogénico descrito para la insulina (65). En nuestro
modelo animal, los principales cambios aparecen en las células de la teca-intersticial,
precisamente las únicas células intraováricas directamente inervadas por los
terminales nerviosos simpáticos. Jones y cols. encontraron que la infusión de
adrenalina a animales previamente adrenalectomizados, disminuyó la transcripción de
GLUT-4, sugiriendo que las catecolaminas disminuyen la expresión de este
transportador (66). Este antecedente apoya nuestra teoría de que la disminución de la
expresión de IRS-1 y GLUT-4 en las células teca-intersticial se debe al aumento en el
flujo de NA ovárico durante el tratamiento de estrés (descrito previamente por nuestro
grupo de trabajo en este modelo experimental (16)).
69
Nosotros proponemos que la insulina podría ser un modulador local de la
actividad nerviosa simpática ovárica. En los animales control la insulina aumenta el
tono nervioso simpático del ovario, probablemente mediante un mecanismo indirecto,
tal como se mencionó anteriormente. Cuando la actividad nerviosa ovárica aumenta,
como consecuencia del estrés crónico, la NA liberada induciría un mecanismo
compensatorio sobre las células de la teca-intersticial, las cuales disminuyen la
expresión de moléculas que participan en la señalización de la insulina, inhibiendo de
esta forma el efecto de la insulina sobre la liberación de la NA desde los terminales
nerviosos (figura 29).
Figura 29: Esquema del efecto propuesto para la insulina sobre la liberación de NA ovárica (1) y de la pérdida de sensibilidad a la insulina producto de la activación nerviosa simpática ovárica inducida por el estrés crónico (2).
La regulación del tono nervioso simpático ovárico, que realiza la insulina, podría
ser mediada por la secreción del factor de crecimiento nervioso (NGF) desde las
células de la teca. Esta neurotrofina es sintetizada en el ovario, preferentemente en las
células de la teca y cumple la función de crecimiento, diferenciación y sobrevida de las
Estrés
NA
Terminal nervioso simpático
Células de la teca
Células de la granulosa
GLUT-4
IRS-1
Noradrenalina
β2
IRI
?
I
? NA
β2-adrenérgico
I
GLUT-4 IRS-1
Insulina Receptor insulina
2
?
1
70
neuronas que inervan directamente a esta capa de células tecales (67). Además, el
NGF modula la transmisión sináptica entre neuronas y órganos blanco (68), por lo
tanto, pudiese ser un candidato a intermediario entre la insulina y la activación del tono
nervioso simpático ovárico. Otras moléculas que pudieran ser secretadas desde la teca
y estimular la liberación de NA, podrían ser las hormonas esteroidales secretadas por
la teca, androstenediona y progesterona. Estas hormonas son secretadas como
respuesta a la estimulación de insulina y tienen efectos rápidos sobre la
neurotransmisión, actuando sobre receptores de membrana (69).
La respuesta disminuida a la insulina de las células ováricas podría afectar
además otras funciones del ovario, como por ejemplo el desarrollo folicular. El receptor
de insulina tiene una expresión diferencial en diferentes etapas del desarrollo folicular
(70), por lo que la resistencia a la insulina ovárica podría ser partícipe de los daños en
el desarrollo folicular observados en ratas expuestas al estrés por frío (15, 16).
3) Efectos de la insulina aplicada ICV sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío
En el sistema nervioso central los receptores de insulina están expresados en
diferentes zonas entre las cuales se encuentra el hipotálamo y la hipófisis (41, 71). La
función de la insulina a nivel central ha sido asociada a la regulación de la ingesta de
alimento, gasto energético y más recientemente al control de la función reproductiva
(43, 47, 60). Como se ha descrito en la introducción de esta tesis, el hipotálamo es la
región del cerebro desde donde se proyectan las neuronas, que hacen su último relevo
sináptico en el ganglio celíaco y finalmente inervan al ovario (5). Por lo que la insulina,
que atraviesa la barrera hematoencefálica, tal vez modula el control nervioso ovárico,
tal como se demostró localmente en el ovario.
Los cambios diferenciales en la sensibilidad a la insulina, encontrados a nivel
sistémico y en el ovario en el modelo de estrés crónico, abren la posibilidad que a nivel
del sistema nervioso central también existan cambios en la sensibilidad a la insulina,
que pudiera en parte ser responsable de los cambios reproductivos descritos para el
modelo de estrés crónico (16).
La administración de insulina en el tercer ventrículo a animales control redujo
fuertemente la ganancia de peso, sin reducir de forma significativa el consumo de
71
alimento. Por el contrario en los animales estresados la disminución de la ganancia de
peso fue significativamente menor y la ingesta de alimento no sufrió cambios cuando
comparamos la administración de vehículo vs. insulina. Estos resultados concuerdan
con lo descrito en la literatura en que la insulina a nivel hipotalámico disminuye
drásticamente la ganancia de peso (72), sin embargo, al mismo tiempo su principal
efecto es anorexígeno y por lo tanto el consumo de alimento también ha sido
observado disminuir en animales de experimentación (72). Lamentablemente no
tenemos los datos de cómo era el consumo de alimento de las ratas antes de iniciar la
infusión ICV y, por lo tanto, no pudimos comparar el cambio en la conducta alimenticia
entre antes y después de la infusión. Probablemente, hubiéramos encontrado cambios
a lo menos en los animales control, ya que la disminución en la ganancia de masa
corporal es mucho mayor en estos animales. Esto último sugiere que en el sistema
nervioso central la señalización celular de la insulina ha sufrido algún tipo de alteración
en los animales sometidos a estrés por frío, tal como lo observamos a nivel ovárico. Es
interesante destacar que los animales estresados y canulados, infundidos con
vehículo, sufrieron cambios en la ingesta de alimento y ganancia de peso, que no
fueron observadas en el animal control infundido con vehículo ni en los animales
estresados sin canulación. Esto supone que el estrés por frío adicionado al estrés
producido por la canulación y la infusión diaria, se potenciaron y causaron un efecto
que no es observado cuando se utiliza sólo uno de los agentes estresores. En la
literatura está descrito que la aplicación de un segundo estímulo estresor diferente, a
un animal previamente estresado, produce una alteración exagerada, comparada al
efecto producido en un animal que no se ha estresado previamente (28).
Obici y cols. ha mostrado que la administración central de insulina aumenta la
sensibilidad a la insulina en tejidos periféricos, disminuyendo la glicemia, debido
principalmente a un efecto inhibitorio de la gluconeogénesis hepática (60). En nuestro
trabajo confirmamos la disminución de la glicemia al administrar insulina ICV, sin
embargo, los animales sometidos a estrés crónico por frío volvieron a mostrar un grado
de resistencia a nivel central, ya que la glicemia no disminuyó en ellos. Un efecto
similar ocurrió con la insulina plasmática en los animales control y estresados después
de administrar insulina ICV. La insulinemia disminuyó significativamente en los
controles y no en los estresados, apoyando la resistencia central a la insulina. El efecto
72
sobre la disminución de la insulinemia puede explicarse como consecuencia del menor
nivel de glicemia o como un efecto estimulador de la insulina sobre la actividad
nerviosa simpática que se origina en el hipotálamo y llega al páncreas, la cual
finalmente a través de receptores postsinápticos α2-adrenérgicos inhibe la secreción
de insulina (73). Para corroborar la resistencia a la insulina hipotalámica en este
modelo de estrés, será necesario medir la expresión de moléculas de la transducción
de señal de la insulina en el hipotálamo, como por ejemplo PI3K. La inactivación
farmacológica de esta quinasa, revierte la reducción de la producción de glucosa
inducida por la insulina administrada ICV (60).
La actividad nerviosa simpática ovárica no fue alterada por la administración de
insulina ICV. El contenido de NA tanto en el ganglio celíaco, como en el ovario se
mantuvo sin cambios después de la administración de 7 dosis de insulina en el tercer
ventrículo. Es posible que la insulina, al igual como ocurrió cuando se incubó
directamente en el ovario, aumente el tono nervioso simpático, reflejándose a nivel
periférico en un leve aumento en el eflujo del neurotransmisor desde los terminales
nerviosos a su órgano blanco, sin alcanzar a producirse cambios en el contenido de NA
en los terminales nerviosos. El hecho que la administración de insulina ICV no
produjera cambios en la actividad nerviosa simpática ovárica puede explicar el por qué
no encontramos cambios en el desarrollo folicular en estos animales. El estrés por frío,
tal como habíamos demostrado anteriormente (16), disminuye la población total de
folículos e incrementa los folículos anómalos. La drástica disminución en la densidad
de cuerpos lúteos observada en los animales estresados no había sido percibida
anteriormente, debido a que habíamos contado las estructuras de todo el ovario y no
sólo del corte central, por lo que no había sido necesario normalizar por el área
analizada. En es trabajo observamos que si bien el número de cuerpos lúteos no es
significativamente menor en los animales estresados, al dividir el número de cuerpos
lúteos por el área analizada, el valor se reduce significativamente al compararlo con
sus respectivos controles. Probablemente, los cuerpos lúteos son de mayor tamaño, lo
cual hace que el mismo número de estos ocupe una mayor área. Cuando las ratas son
estresadas mediante este mismo protocolo, pero extendiendo de 4 a 8 semanas la
duración del estrés, las ratas desarrollan quistes en los ovarios (15), lo cual apoya
nuestra teoría de que a las 4 semanas de estrés crónico por frío nos encontramos en
73
una etapa previa de ovario poliquístico y los cambios en la actividad nerviosa y en la
sensibilidad a la insulina pueden ser en parte responsables de la aparición de
estructuras quísticas posteriormente.
En esta tesis nosotros proponemos que el estrés por frío crónico intermitente,
como forma de estrés físico, activa los terminales nerviosos noradrenérgicos ováricos,
conduciendo a cambios en la sensibilidad a la insulina en las células teca-intersticial, lo
cual provoca alteraciones en la función y morfología ovárica, que podrían en parte ser
responsables de la etiología del ovario poliquístico inducido por estrés. Estos datos
podrían adquirir relevancia, ya que recientemente se ha demostrado que el PCOS
humano está asociado con un aumento en el tono nervioso simpático (18),
independiente de los cambios metabólicos generales del organismo.
74
ESQUEMA FINAL
Figura 30: Esquema de los cambios producidos en el modelo de estrés por frío crónico intermitente y de los efectos provocados por la insulina aplicada localmente sobre el ovario y centralmente en el tercer ventrículo.
CONTROL ESTRÉS
NIVEL METABÓLICO Aumento de la sensibilidad a la insulina periférica. Aumento del consumo de alimento.
A
E2
∆4
Ovario
Insulina
GG.. CCeelliiaaccoo
SSOONN NNAA
HHiippoottáállaammoo
A
E2
∆4
Ovario
GG.. CCeelliiaaccoo
SSOONN NNAA
HHiippoottáállaammoo
Liberación basal de NA Progesterona +hCG
Liberación basal de NA Progesterona +hCG
Peso corporal
Glicemia
Insulinemia
Peso corporal
Glicemia
Insulinemia
NIVEL OVÁRICO Disminución mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4 en células tecales. Disminución de la densidad total de folículos y cuerpos lúteos.
Act. Nerviosa simpática ovárica
Act. Nerviosa simpática ovárica
ICV
Ovario
75
CONCLUSIONES En el modelo de estrés por frío en rata, en el cual se han identificado cambios
ováricos similares a los encontrados en las mujeres con SOP, existe una resistencia a
la insulina ovárica e hipotalámica tejido-específica.
A nivel ovárico la insulina, además de su acción sobre la esteroidogénesis, tiene
un efecto activador del sistema nervioso simpático.
La insulina aplicada intracerebroventricular no es capaz de modificar la
actividad nerviosa simpática ovárica. Sin embargo, induce cambios metabólicos
conocidos para esta hormona en los animales control y no en los animales sometidos a
estrés.
Por lo tanto, el estrés crónico, además de activar la vía nerviosa ovárica y
producir cambios en la morfología del ovario, similares a los encontrados en pacientes
con SOP, reduce la respuesta a la insulina en el ovario e hipotálamo, los cuales
podrían ser eventos tempranos que desencadenen en alteraciones endocrinas y/o
metabólicas como el SOP, obesidad o diabetes tipo 2.
76
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