VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbióloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.
Noviembre de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA
APROBADO
_________________________________ Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga
Directora
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA
APROBADO
_________________________________ Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga
Directora
_____________________________ _______________________________ Rosario del Pilar Ortiz, Bacterióloga Lorena Valencia, Microbióloga Jurado Jurado
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA
APROBADO
_____________________________ _______________________________ Ingrid Schuler , Ph. D Janeth Arias Palacios M.Sc, M.Ed. Decana Académica Directora de carrera
Le doy gracias a Dios por permitirme lograr este triunfo, a mis padres por el
esfuerzo y apoyo que me han brindado, ya que sin su ayuda no lo hubiera podido
lograr, a mis hermanos que de una u otra forma me han brindado su confianza y
apoyo para seguir adelante, al Gordo por brindarme su amor y apoyo
incondicional, a toda mi familia y en especial a mi mamá, que ha sido la persona
que ha estado conmigo en todo este proceso brindándome lo mejor de sí y con
muchas ganas de que yo comience una nueva etapa en mi vida como es la de ser
Profesional.
vii
AGRADECIMIENTOS
Al Laboratorio de salud Publica del Huila, por permitirme llevar a cabo este trabajo
en sus instalaciones, A la Doctora Gloria María Rivera Díaz, por brindarme su apoyo
y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo, al Dr. Gerardo Navas del
Instituto Nacional de Salud, por su valiosa colaboración y al personal del área
ambientes del Laboratorio por su colaboración.
viii
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................................. xiii
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 14
2. MARCO TEORICO ........................................................................................................ 16
2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN ......................................................... 16
2.1.1. Validación ....................................................................................................... 17
2.1.2. Validación primaria......................................................................................... 17
2.1.3. Validación secundaria ..................................................................................... 18
2.1.4. Tipos de validación ......................................................................................... 19
2.1.4.1. Validación prospectiva ............................................................................ 19
2.1.4.2. Validación retrospectiva ......................................................................... 19
2.1.4.3. Validación concurrente ........................................................................... 20
2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación ............................................. 20
2.1.5.1. Limite de detección ................................................................................. 20
2.1.5.2. Limite de cuantificación .......................................................................... 21
2.1.5.3. Exactitud ................................................................................................. 21
2.1.5.4. Especificidad ........................................................................................... 21
2.1.5.5. Selectividad ............................................................................................. 22
2.1.5.6. Precisión .................................................................................................. 22
2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO .............................................................. 23
2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme ................................................................ 23
2.2.1.1. Coliformes Totales .................................................................................. 23
2.2.1.2. Coliformes fecales ................................................................................... 24
2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS ..................................................... 25
2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras) .............................. 25
2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves ...................................................... 27
2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba ...................................... 27
2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas ............................ 28
ix
2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras ........................................ 28
2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA ............................................... 29
2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana ..................................... 29
2.4.2. Características del filtro de membrana ............................................................ 29
2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana ..................... 30
2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana ................................................... 30
3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 33
4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 35
4.1. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 35
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 35
5. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 36
5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................................... 36
5.2. MATERIALES ....................................................................................................... 36
5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS ................................. 38
5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND ........................................... 39
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 39
5.5.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 39
5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 40
5.6. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 41
5.7. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 41
5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO .................................................................................... 42
5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland ..................................................... 42
5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 44
5.8.3. Validación del método de filtración por membrana ........................................ 47
5.8.3.1. Descripción de soluciones y muestras ..................................................... 48
5.8.4. Elaboración de cartas R/ para el control de calidad analítica interna del laboratorio ....................................................................................................................... 49
5.8.5. Evaluación de la validación ............................................................................ 49
5.9. INFORME DE RESULTADOS ............................................................................. 50
x
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................... 51
6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA . 51
6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 53
6.2.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 53
6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 54
6.3. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 55
6.4. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 56
6.5. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA ............................... 57
6.5.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland .................................................... 58
6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 61
6.5.3. Validación del método de filtración por membrana ....................................... 63
6.5.3.1. Determinación de la precisión ................................................................ 67
6.5.3.2. Determinación de la exactitud ................................................................ 69
6.5.4. Cartas de control “R” ...................................................................................... 74
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 76
8. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 77
9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 78
9.1. RECURSOS ELECTRONICOS ...................................................................................... 80
10. ANEXOS ....................................................................................................................... 81
xi
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras ............................. 57
TABLA 2 Comparación de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensión de E. coli
................................................................................................................................................ 59
TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensión de E. coli ............................................. 60
Tabla 4 Calculo de la media, desviación estándar y coeficiente de variación de las
concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL ........................................................................... 62
TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo. .................................................... 64
TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC. ....................................................... 65
TABLA 7 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para
coliformes totales .................................................................................................................... 68
Tabla 8 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para
coliformes fecales ................................................................................................................... 68
Tabla 9 Recuperación M1 + A1, coliformes totales ............................................................... 70
TABLA 10 Recuperación M1 + A1, coliformes fecales......................................................... 71
TABLA 11 Recuperación M2 + A2, coliformes totales ......................................................... 72
TABLA 12 Recuperación M2 + A2, coliformes fecales......................................................... 73
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland. . ............................... 43
FIGURA 2. Esquema para preparar la concentración de 5 bacterias/ml ................................ 46
FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey ......................................................... 51
FIGURA 4 Identificación bioquímica de E. coli .................................................................... 52
FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre .............................................................. 52
FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC ..................................... 55
FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC ............................... 55
FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. ..................................................... 61
FIGURA 9 Recuento de los estándares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli ............... 63
FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. .......................................... 67
FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales ......................................................... 74
FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales ........................................................ 75
RESUMEN
Con el fin de contribuir con los procesos de Mejoramiento de la Calidad del
Laboratorio de Salud Publica del Huila y con el objetivo de iniciar un proceso de
acreditacion, se realizó una validación secundaria de tipo concurrente del método de
filtración por membrana para la detección de coliformes totales y Escherichia coli en
muestras de agua para consumo humano. Al inicio del proceso de validación se reviso
el historial de mantenimiento y calibración de los equipos para garantizar los
procedimientos y resultados obtenidos. Antes de iniciar la etapa de validación se
estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, para comprobar que efectivamente
se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL. Así mismo, se realizo un
ensayo preliminar de repetibilidad con el fin de obtener un dominio del método.
Para la validación se siguió un diseño experimental establecido por el Instituto
Nacional de Salud, en donde la cantidad de soluciones analizadas que conformaron
el diseño experimental fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones
cada una, analizando las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras
naturales, dos muestras más adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El
estudio se procesó durante seis días, en donde cada lote era un día. La precisión del
método fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada
solución, las cuales debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W),
correspondiente al 5% de la concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor
mínimo de interés que en este caso fue 8 y la exactitud se evaluó mediante la
recuperación de una concentración conocida de Escherichia coli en las dos muestras
naturales.
Al finalizar el estudio de validación se comprobó que mediante la validación
realizada se cumplieron con los dos parámetros evaluados, la precisión y la exactitud.
14
1. INTRODUCCIÓN
El recurso hídrico para el consumo humano debe ser entregado a las comunidades,
con excelente calidad, la cual inicia desde la misma generación, protección de fuentes
y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio
domiciliario. A pesar de ello Las enfermedades derivadas de la ingestión de agua son
muy frecuentes en los países en desarrollo y dentro de estos hay zonas de mayor o
menor compromiso epidemiológico.
El acceso de los colombianos al agua potable deja mucho que desear en el país a
pesar de las cifras globales que demuestran que el 56% de la población rural, el 97%
de la urbana, para un total general del 86% tienen agua potable.
Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y químicas que tienen origen en la
transmisión de estos agentes por el agua adquieren una especial connotación sanitaria
cuando las poblaciones ribereñas con inadecuado suministro del agua potable o
aquellas comunidades que a través de muchos años han carecido del recurso hídrico
necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.
En este sentido, los laboratorios de salud pública tienen la obligación de proteger las
comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnología y
la metodología que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen
los ciudadanos.
Cada laboratorio debe utilizar métodos y procedimientos apropiados para todas las
calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Estos incluyen muestreo,
transporte, almacenamiento y preparación de los elementos a ser calibrados o
ensayados.
15
Los laboratorios deben realizar controles internos los cuales garantizan que van
generar resultados altamente confiables, mediante el seguimiento de procedimientos
altamente calificados, los cuales van a depender del programa que se haya
implementado en el laboratorio donde generaran idoneidad y confiablidad de los
resultados emitidos.
Estos programas de control interno incluyen evaluación continua de los principales
materiales y objetos que se utilizan en los diferentes análisis, tales como, control de
los medios de cultivo a utilizar, personal idóneo, equipos, estandarización y
documentación de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del
procedimiento y asegurar que este se está efectuando en forma correcta cada vez que
se ejecute, lo cual se lograra con la realización de la validación de los métodos
utilizados por el laboratorio para sus respectivos análisis.
La validación de una técnica es el proceso por el cual se establece mediante estudios
de requerimientos la aplicación analítica propuesta, siendo su principal objetivo
confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Con ella se
determinan las posibles variaciones que se presentan entre diferentes números de
ensayos y de esta manera disminuir las posibilidades de error dentro del método,
generando un alto grado de confianza en los resultados finales arrojados por el
método validado.
Basada en etas premisas el presente trabajo de grado tiene como finalidad Validar el
Método de Filtración por Membrana para la detección de Coliformes Totales y
Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano, con el fin de asegurar
que el laboratorio va a tener un alto grado de confiabilidad en sus resultados
emitidos.
16
2. MARCO TEORICO
Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a través de las excretas de
seres humanos y animales, en particular de las heces. El uso de esta agua para beber o
preparar alimentos, el contacto de ella durante el baño o el lavado de ropa, e incluso
la inhalación de vapor o aerosoles, pueden producir la infección. La carga bacteriana
incide directamente en la potabilidad del agua y en las características y las
condiciones que la hacen apta para el consumo humano.
En muchas regiones, esta calidad de agua se consume sin ningún tipo de control de
calidad ni tratamiento. Las enfermedades relacionadas con la insalubridad del agua y
la falta de saneamiento son una de las causas de morbimortalidad. El número total
anual de defunciones producidas por diarreas y enteritis es aproximadamente de
12.000 casos al año y la morbilidad por las mismas causas es de 300.000 casos al año.
La población más afectada en Colombia por estos factores es la población rural y
marginal dispersa de la zona pacifica, la costa atlántica y el suroriente del país, sobre
todo en lugares densamente poblados. (OTALORA, 2005).
Por esta razón se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico del agua,
que asegure que es apta para el consumo humano y que posee las condiciones de
calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental.
2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN
Para conseguir la idoneidad en un resultado analítico es imprescindible la utilización
de un método confiable. Para asegurar confiabilidad, los métodos analíticos deben
someterse a un procedimiento de validación ya sea de carácter prospectivo,
retrospectivo o de revalidación; para comprobar, si el método es lo suficientemente
confiable, y si los resultados previstos satisfacen los requisitos analíticos prefijados.
17
La validación constituye un requisito imprescindible para las buenas prácticas de
laboratorio, conforme lo establecen diferentes agencias regulatorias y la
determinación de la incertidumbre debe formar parte de este proceso de validación y
es esencial para un control continuo de la calidad. A partir del criterio de que no
existe un modelo único para validación y que los parámetros a evaluar cambian de
acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones y de los
requerimientos analíticos particulares; solo es recomendable el seguimiento de una
guía general para la validación de métodos analíticos, en conformidad con pautas
aceptadas internacionalmente. (OTALORA, 2005).
2.1.1. Validación
Consiste en demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia
documentada que un proceso especifico producirá de forma consistente y permanente
productos que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO technical
Report Series, No. 823, 1992).
Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las
características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la
aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003), siendo su principal objetivo
confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos.
La validación de métodos analíticos consiste es la obtención de pruebas
documentadas que demuestran que un método analítico es lo suficientemente
confiable para producir un resultado previsto dentro de intervalos definidos.
(CORTES, 2006).
2.1.2. Validación primaria
La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene la meta de establecer los
límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo,
modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones
18
numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y
precisa del objeto de interés.
Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de
ensayos especialmente diseñados.
Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de una norma
existente deben realizar los pasos de la validación primaria. (PADILLA, 2007)
2.1.3. Validación secundaria
Demostración por experimento que un método establecido funciona de acuerdo con
las especificaciones en las manos del usuario. Esta validación se denomina
verificación la cual es la confirmación mediante el aporte de pruebas objetivas, de
que se han cumplido los requisitos establecidos. (ISO 9000:2000).
Normalmente la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas
de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque
posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el
material de ensayo óptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de
los límites operacionales establecidos por la validación primaria. (GTC 84, 2003).
Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas, para así optimizar
sus procesos, lo cual implica reducir gastos, el tiempo de desarrollo de la técnica, y
generar confiabilidad en los resultados que se emiten. De igual forma, sirve para dar
cumplimiento a las normas legales pertinentes o al logro de cumplimiento de normas
que aunque no son de obligatorio cumplimiento contribuyen a la credibilidad del
laboratorio y a obtener altos niveles de confiabilidad que generan confianza dentro de
sus clientes.
19
2.1.4. Tipos de validación
2.1.4.1. Validación prospectiva
Se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Se debe
realizar un análisis de riesgo para determinar si podrían conducir a situaciones
críticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que sucedan.
Posteriormente, se efectúan y se evalúan los ensayos y se hace una valoración
general. Si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los
procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva
validación demuestre su carácter satisfactorio. Además este tipo de validación busca
prever errores o limitar el riesgo de que estos se presenten durante el proceso.
(CORTES, 2002).
2.1.4.2. Validación retrospectiva
Se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información histórica del
proceso. Con esta recopilación de datos históricos se obtiene documentación útil para
la determinación de la reproducibilidad de dicho proceso. Por esto, para la obtención
de información no es necesario aplicar ensayos analíticos, o supervisión del proceso
en forma explícita. (GALEANO, 2007).
Los pasos involucrados en este tipo de validación requieren la preparación de un
protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos analizados. Dentro de
este tipo de validación es necesario tener en cuenta el control de la materia prima,
controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos
analíticos y especificaciones; es aplicada para productos que se encuentran en el
mercado que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones. (PADILLA, 2007).
20
2.1.4.3. Validación concurrente
La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la
implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las
variables criticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos
sobre la marcha del proceso está en estado productivo. Sin embargo cada
aproximación tiene sus características y limitaciones, y por lo tanto, antes de
desarrollar una validación deberá evaluarse que tipo de validación pueda dar mejor
información sobre la seguridad y la estabilidad del proceso. (GARCIA, 2001).
2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación
Los parámetro de rendimiento se establecen de acuerdo a la categoría a la que
pertenecen el método y siguiendo los requisitos exigidos por distintos organismos
internacionales que incluyen: intervalo de trabajo, linealidad, sensibilidad, limite de
detección, limite de cuantificación, exactitud, precisión, repetibilidad,
reproducibilidad, robustez, incertidumbre, etc.
Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de rendimiento se
llevan a cabo mediante equipos que cumplen con las especificaciones, funcionan
correctamente y están adecuadamente calibrados. Igualmente el operador que realiza
los estudios debe ser competente en el campo de trabajo en estudio y debe contar con
suficientes conocimientos respecto al trabajo, como para poder tomar decisiones
apropiadas a partir de las observaciones realizadas a medida que progrese el estudio.
(OTALORA, 2005).
2.1.5.1. Limite de detección
Es la concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no
es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas especificas.
21
También se conoce como mínima concentración neta detectable o limite de
determinación/limite de decisión y “El mínimo contenido de analito, de existir analito
presente, que se detectara y se podrá identificar”.
El límite de detección es un número, expresado en unidades de concentración (o
cantidad) que describe el más bajo nivel de concentración (o cantidad) de una
sustancia que puede determinarse como estadísticamente diferente del blanco.
(OTALORA, 2005).
2.1.5.2. Limite de cuantificación
Es la concentración mínima del analito que puede ser cuantificada con exactitud y
precisión en una muestra, bajo condiciones analíticas especificas.
2.1.5.3. Exactitud
Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximo
posible al valor verdadero. A diferencia de la precisión que refleja el error aleatorio,
la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (GALEANO, 2007).
2.1.5.4. Especificidad
Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente, el compuesto
de interés, en presencia de los demás componentes, que se esperan estén presentes en
la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser precursores de la síntesis o
subproductos de la misma, impurezas, excipientes o productos de degradación.
(WHO TECHNICAL REPORT, No823, 1992).
22
2.1.5.5. Selectividad
Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos
los analitos de interés, o cuando diferentes microorganismos pertenecientes al mismo
grupo deben ser detectados por el método.
2.1.5.6. Precisión
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando
se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del
mismo lote del material homogéneo. (USP 29, 2006). El parámetro estadístico que
caracteriza a este estudio es la variación estándar o preferiblemente el coeficiente de
variación (variación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la
incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que
corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y
GONZALEZ, 1996). Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de
repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación (USP 29,
2006).
Reproducibilidad: Es la medida de la precisión de los resultados de ensayos
realizados sobre la misma muestra homogénea, pero analizado en diferentes
laboratorios, por diferentes analista, diferentes días, diferentes instrumentos
(precisión entre laboratorios).
Repetibilidad: Es la medida de la precisión de un método cuando este se realiza por el
mismo analista, el mismo día, los mismos reactivos, los mismos instrumentos
(precisión dentro del ensayo).
23
2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO
La finalidad principal de un laboratorio de agua, es producir información precisa y
confiable que muestre las características cualitativas del cuerpo de agua bajo estudio.
Un elemento esencial para garantizar que los resultados analíticos son precisos y
confiables es el control de la calidad analítica precisa CCA, el cual consiste en la
aplicación rutinaria de los procedimientos necesarios para controlar el proceso de
medición.
El objetivo primordial de un programa de control de calidad interno es el de asegurar
que los resultados que se obtengan en el laboratorio se enmarquen dentro de los
límites aceptables de desviación a partir de los valores verdaderos. Se pueden hacer
duplicados de muestras naturales, de estándares, de muestras adicionadas, o de
blancos y para ello se utilizan las cartas de control.
Las cartas R son cuadros de control, en los cuales el ámbito promedio de las muestras
duplicadas R es la línea central. El límite de control inferior es cero y el límite de
control superior LCS se estima como: LCS = 3.27 x R/
Las cartas R hacen posible el control de los errores aleatorios y el límite de detección
con los blancos. (OTALORA, 2005)
2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme
2.2.1.1. Coliformes Totales
Los coliformes totales son un grupo de microorganismos que comprende varios
géneros de la familia enterobacteriaceae. Este grupo de microorganismos se encuentra
ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo, además, es habitante normal
del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente.
24
Se caracterizan por ser bacilos Gram. negativos, aerobios o anaerobios facultativos,
son oxidasa negativa, no formadores de esporas y son capaces de fermentar la lactosa
con producción de acido y gas a 35ºC +/- 2°C en un tiempo máximo de 48 horas.
(ORDOÑEZ, 2000).
El grupo de bacterias coliformes es el principal indicador de la adecuación del agua
para usos domésticos, industriales o de otro tipo. La experiencia ha mostrado que la
densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminación, y
por tanto, de la calidad sanitaria. (AWWA-WPC, 2000).
2.2.1.2. Coliformes fecales
Los coliformes fecales, también denominados coliformes termotolerantes, se
caracterizan por soportar temperaturas hasta 45ºC; comprende un grupo muy
reducido de microorganismos, entre los que se destaca Escherichia coli siendo el más
reconocido representante de contaminación de alimentos por origen fecal, por lo tanto
es el principal indicador de higiene en los alimentos. (ORDOÑEZ, 2000).
Escherichia coli se caracteriza por ser una bacteria Gram. negativa, capaz de
fermentar la lactosa a una temperatura entre 44ºC y 44.5ºC, es indol positivo, y tiene
un origen específicamente fecal, pues está siempre presente en grandes cantidades en
las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentra en agua o suelo
que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal.
Desde hace tiempo se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen
indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son
de fácil detección y se pueden enumerar en el agua. La presencia de Escherichia coli
en muestras de agua potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de
tratamiento de aguas, en la integridad del sistema de distribución, y por tanto
evidencia de contaminación de diferentes orígenes: suelo, superficies de agua dulce y
tracto digestivo. (MILLIPORE, 2005).
25
2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS
El agua cruda o el agua inadecuadamente tratada, puede contener microorganismos
patógenos, es decir, que pueden causar enfermedades y aun la muerte. Las bacterias
del grupo coniforme, están asociadas con los organismos patogénicos y son un buen
índice del grado de seguridad bacteriológico del agua. Las bacterias coliformes viven
y hacen parte de la flora del intestino humano y de otros animales, y son descargados
en gran cantidad en las heces humanas y las de esos animales. Cuando aparecen
bacterias coliformes en el agua, se asume que otra clase de microorganismos capaces
de causar enfermedades, pueden estar presentes. De igual forma, su ausencia es un
indicativo de que el agua es bacteriológicamente segura para el consumo humano.
En el análisis microbiológico de las aguas crudas no se buscan directamente las
bacterias o virus patógenos, sino algunas bacterias indicadoras de contaminación por
heces fecales y que sin ser patógenas residen en el intestino del hombre y de los
animales, las bacterias coliformes.
Existen diversas técnicas de análisis microbiológico que permiten detectar la
presencia de ciertos microorganismos indicadores de contaminación tales como el
método de filtración por membrana, la técnica del NMP o fermentación en tubos
múltiples, los cuales son utilizados como control de calidad en acueductos o
industrias donde se requiere procesar un gran número de muestras. (ORTIZ, 1999)
2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras)
Todo programa que se establezca para el control de calidad del agua tiene como base
fundamental el muestreo, la seriedad y responsabilidad con que se lleve a cabo esta
actividad.
26
Para la recolección de muestras de aguas se deben utilizar frascos de vidrio de fácil
esterilización los cuales son suministrados por el laboratorio que realiza el análisis,
con capacidad de 300 mL. El frasco estéril debe ser llenado hasta las tres cuartas
partes de su capacidad y tapado inmediatamente. Si la muestra es agua tratada con
cloro, el frasco debe contener 0.5 mL de tiosulfato de sodio al 10%. La solución de
tiosulfato de sodio actúa como inhibidor del cloro para evitar la muerte de los
microorganismos presentes en la muestra. (PALMA, 1999)
La muestra debe llevarse lo más rápidamente posible al laboratorio (no demorar más
de 4 horas). Si es necesario demorarla más tiempo se debe refrigerar desde el
momento de la toma (no más de 20 horas).
Condiciones generales para la recolección de muestras:
· Disponer de los recipientes y demás materiales apropiados según el estudio que
se vaya a realizar.
· Cerciorarse que el frasco tenga el aditivo apropiado (Tiosulfato de sodio)
· Asegurarse que la composición de la muestra tomada, refleje fielmente la del
total del suministro o fuente de agua, es decir, que sea representativa del sistema.
· Utilizar técnicas de recolección que no afecten por descuido u omisiones la
calidad del agua recolectada, con respecto a su fuente original.
· Cuando se vaya a tomar muestra para análisis microbiológico no enjuagar el
frasco con la muestra.
· Para análisis físico-químico el frasco no debe tener aditivos y debe enjuagarse
el frasco con la misma muestra.
· Identificar la muestra.
· Consignar inmediatamente después de la toma todos los datos importantes que
permitan identificar correctamente la muestra:
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* Lugar exacto del muestreo
* Fecha y hora de toma
* Cloro residual (total o libre) encontrado en el momento del muestreo
* Otras condiciones especiales: si la muestra viene directamente de la red de
distribución, de un tanque subterráneo o elevado, pozo, etc.
* Si es agua de río, quebrada, laguna, estanque, etc, o motivo de la solicitud
(Intoxicación, control, etc.)
* Anotar las condiciones en el momento de tomar la muestra (temperatura del
ambiente, temperatura del agua, viento, lluvia, etc.).
2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves
Se debe limpiar cuidadosamente el grifo o tubo. La abertura de salida y sus
inmediaciones deben flamearse con llama de alcohol. Se deben escoger grifos que no
tengan escapes por el vastazo, debido a que el agua que sale por allí se contamina e
invalida la muestra. Se deja fluir el agua lo más intensamente posible para quitar las
impurezas adheridas. Posteriormente se debe regular el chorro de agua al espesor de
un lápiz. Se llena rápidamente el frasco hasta la mitad más o menos, si es para
examen microbiológico evitando salpicaduras y totalmente lleno si es para análisis
físico-químico.
En pozos con bomba debe bombearse lenta y uniformemente durante 10 minutos
antes de tomar la muestra.
2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba
Preparar el frasco de la siguiente manera:
28
Fijar un alambre al cuello del frasco. Envolver el conjunto en papel de aluminio y
esterilizar. Al tomar la muestra no tocar el exterior del frasco. No tomar de la parte
sobrenadante del pozo.
2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas
Se debe estudiar la situación de acuerdo con los recursos del laboratorio, objeto del
examen, fuente de contaminación, etc., excepto en casos especiales, no tomar muestra
superficialmente en sitios donde permanezca estancada ni donde se presenten
turbulencias por agitación accidental.
Se realiza el procedimiento de la siguiente manera:
* Colocarse frente a la dirección de las corrientes de agua.
* Sumergir el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 a 20 cm, realizando un
semicírculo en la dirección de la corriente. Así se evita contaminar el agua por las
manos del operario. Si no hay corriente de agua, crearla por el movimiento del frasco.
* Evitar recoger material flotante. Este se puede tomar como muestra especial.
* Evitar tomar material del fondo.
2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras
Si las muestras no van a ser analizadas antes de una hora de haber sido tomadas,
deben refrigerarse durante el transporte a 4ºC, y deben estar completa e
inconfundiblemente identificadas.
No debe de transcurrir más de 6 horas entre la toma de muestra y el análisis y
máximo 2 horas en el laboratorio. Si esto no se puede cumplir, las muestras deben ser
conservadas a temperatura inferior a 4ºC sin ser congeladas.
29
2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Para la detección de coliformes totales y coliformes fecales (E. coli) es utilizado el
método de filtración por membrana, el cual es un método altamente reproducible,
puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen
resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a
cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. También se encuentra entre los
métodos standards. A los efectos de la filtración por membrana debe replantearse la
definición de coliformes: bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios facultativos, que
dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 horas de
incubación a 35ºC +/- 2°C. La determinación de coliformes fecales por filtración
puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente
incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5ºC.
2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana
La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por un filtro de celulosa de 0.45
micras de tamaño de poro, para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo
coniforme y las mesofílicas. El filtro es colocado en un medio de cultivo especifico
para lo que se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y
microorganismos mesofílicos), incubando a 35ºC +/- 2ºC durante 18 a 20 horas.
(PALMA, 1999 ).
2.4.2. Características del filtro de membrana
Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una
completa retención de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos
filtros estén libres de químicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo
bacteriano, que posean una velocidad de filtración satisfactoria. (MILLIPORE, 2005).
30
2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana
El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La
lectura de resultados se da en un menor tiempo (24 horas) a comparación del método
NMP, además se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios
adecuados. El análisis se dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante
carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la
muestra o haciendo inóculos muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a
analizar. (PALMA, 1999 ).
2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana
Colocar el portafiltros estéril sobre la base del manifold
Colocar el embudo estéril sobre el receptáculo y fijarlo con las pinzas que trae el equipo
Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estéril
Dejar filtrar aplicando vacio
Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 – 30 mLde alcohol al 70%
31
Con pinzas estériles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la cuadricula hacia arriba,
sobre la parte porosa del receptáculo
Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar
Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo
Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol encendido durante 3
minutos
Adicionar nuevamente 100 mL de agua destilada estéril y dejar filtrar
32
(Apha, 2005)
Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar
Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del manifold, retirar el
embudo, tomar el filtro con pinzas estériles y colocarlo sobre la superficie del medio Endo y
m-FC
Agua Tratada Agua Cruda
Filtrar 100 mL de cada muestra a analizar
Diluir la muestra 1/10 y filtrar
Incubar las cajas a la temperatura adecuada:
Medio Endo: 37°C +/- 2°C
Medio m-FC: 44.5°C en baño maría
Realizar el recuento de las colonias características:
Medio Endo: colonias rojas
Medio m-FC: colonias azules
33
3. JUSTIFICACIÓN
La acreditación es un proceso que contribuye a la mejora continua de la calidad de los
servicios que prestan los laboratorios. La participación en los procesos de
acreditación es decisión de la dirección de cada laboratorio, y por lo tanto, debe ser
accesible a todos los establecimientos que estén debidamente registrados y
habilitados por las autoridades nacionales del país. El propósito de la acreditación es
formalizar el reconocimiento, por un ente independiente, que los laboratorios han
implementado un sistema que pretende garantizar la calidad de sus servicios.
Para llevar a cabo el proceso de acreditación los laboratorios deben dar cumplimiento
a la norma ISO/IEC 17025 “Requisitos generales para la competencia de laboratorios
de prueba y calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de
acreditación del laboratorio. Esta norma contiene todos los requisitos que los
laboratorios de ensayo y de calibración deben conocer, si desean demostrar que
operan de acuerdo a un sistema de calidad, son técnicamente competentes y son
capaces de generar resultados válidos técnicamente. Según la norma ISO/IEC 17025
los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio,
tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes
bibliográficas o desarrollados por otros laboratorios. Además, es necesario que el
laboratorio valide los métodos de referencia; aunque en este caso, no es necesario que
el laboratorio realice una validación completa.
El laboratorio de salud pública del Huila (LSPH) está en busca de la acreditación, la
cual tiene por objeto reconocer la competencia técnica y la idoneidad de organismos
de certificación e inspección, con las normas y los reglamentos que le son de
aplicación, a través de evaluación y auditoría de las mismas, siguiendo criterios
transparentes y públicos.
Debido a esto se hace necesario validar el método de filtración por membrana para la
detección de Coliformes totales y Escherichia coli, en muestras de para consumo
34
humano, el cual es utilizado diariamente en el laboratorio para el análisis
microbiológico aguas para consumo humano.
35
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar la validación secundaria del método de filtración por membrana para la
detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano
analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Evaluar la calidad de los medios de cultivo Endo y m-FC por medio de
pruebas de esterilidad, selectividad y eficacia.
· Evaluar la precisión del método de filtración por membrana para la detección
de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo
humano.
· Evaluar la exactitud del método de filtración por membrana para la detección
de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano.
· Realizar el análisis estadístico de los resultados obtenidos durante el estudio.
36
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Se realizó un estudio experimental basado en la metodología aplicada por el Instituto
Nacional de Salud, donde la validación fue de tipo concurrente, ya que la información
fue obtenida durante el tiempo que duro el estudio, realizando monitoreo de todo el
proceso para garantizar que se estaba trabajando bajo control.
El presente trabajo de grado fue realizado en el Laboratorio de Salud Publica del
Huila.
Para llevar a cabo la validación del método de filtración por membrana, se analizaron
dos muestras de agua, que poseían las características requeridas para las cuales el
método es utilizado rutinariamente, así mismo, se evaluaron los parámetros de
precisión y exactitud del método.
5.2. MATERIALES
Filtros de membrana (poro de 0.45um)
Pinzas
Micro pipeta automática 100-1000 UL
Puntas azules estériles
Cepas microbianas
Cepa de Escherichia coli con número de referencia ATCC 25922
Cepa de Staphylococcus aureus con número de referencia ATCC 25923
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Material de vidrio
Tubos tapa rosca
Frascos grandes ámbar con alcohol al 70%
Frascos grandes ámbar con agua destilada estéril
Frascos Schott de 250 ml
Material de plástico
Cajas de petri grandes
Medios de cultivo
Cajas de petri plásticas con medio Endo listo para su uso
Cajas de petri plásticas con medio m-FC listo para su uso
Agar plate Count
Agar OGY
Agar Mc Conkey
Agar Sangre
Reactivos
Cloruro de bario
Acido sulfúrico
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Equipos
Incubadora a 35°C +/- 2°C
Baño de maría a 44.5°C
Espectrofotómetro
Vortex
Equipo de filtración por membrana
5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS
Se verificó que las cepas de referencia utilizadas para el estudio de validación, ATCC
25922 Escherichia coli y ATCC 25923 Staphylococcus aureus, estuvieran viables y
con una pureza del 100%. El Laboratorio de Salud Publica cuenta con su propio
cepario. Las cepas se encuentran conservadas en leche descremada a -70°C. Se tomo
un vial de cada cepa y se sembró por agotamiento en medio Mc Conkey la cepa de
Escherichia coli y en agar sangre la cepa de Staphylococcus aureus, las cuales fueron
incubadas a 37°C durante 24 horas. Pasado el periodo de incubación se procedió a
realizar coloración de Gram. e identificación bioquímica de cada cepa, utilizando API
20 E para E. coli y realizando prueba de oxidasa, catalasa y coagulasa para la S.
aureus. De igual manera la cepa se identificó en forma automatizada por el equipo de
Microscan, logrando un aceptabilidad de 99.9% con respecto a su identificación..
Determinada la pureza y viabilidad de cada cepa, se realizaron repiques en los
respectivos medios, para el trabajo diario y así mantener las cepas en fase
exponencial.
39
5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND
Se preparo el tubo 0.5 de la escala de Mcfarland, utilizando 0.05 mL de cloruro de
bario al 1% y 9.95 mL de ácido sulfúrico al 1% el cual contenía una pureza del 96.3%
leyéndose su absorbancia a una longitud de onda de 620nm.
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Para la detección de coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de aguas para
consumo humano se utilizaron los medios de cultivo Endo para Coliformes Totales y
el medio m-FC para la detección de Escherichia coli. Estos medios de cultivo son
medios que vienen listos para su uso, por lo tanto se verificó su esterilidad,
selectividad y eficacia para así poder comprobar las especificaciones entregadas por
el fabricante (Palma, 1998). Así mismo se realizo la prueba de esterilidad para los
medios de cultivos preparados, agar Mc Conkey, agar Ogy, agar Plate Count y para el
agar sangre el cual también viene listo para el uso, como también se realizo este
control al agua destilada estéril.
5.5.1. Control de esterilidad
La prueba de esterilidad de los medios de cultivo utilizados para el análisis se realizó
de la siguiente manera:
· Se seleccionó aleatoriamente el 10% de los medios de cultivo que se utilizaron
para la validación. Las cajas fueron hidratadas con agua destilada estéril. Las cajas
con medio Endo se incubaron a 37°C durante 24 horas y las cajas con medio m-FC a
40
44.5°C, con el fin de verificar que estos medios no presentaran crecimiento de ningún
tipo de microorganismo. (SARTORIUS, 2003).
· Se sirvieron en cajas de petri estériles los medios Mc Conkey, Plate Count y
OGY, tomando el 10% de cada medio para su respectivo análisis. Se incubo a 37°C
durante 48 horas. Se verifico que pasado el tiempo de incubación no hubiese
crecimiento de ningún tipo de microorganismo (Allaert, 2002)
· Se comprobó la esterilidad del agua destilada estéril que se utilizó para la
hidratación de los medios de cultivo, para las suspensiones y diluciones bacterianas.
Se tomaron 400 ml de agua la cual fue analizada por el método de filtración por
membrana, tomando 100 ml para cada replica. Se realizaron cuatro replicas de las
cuales 2 fueron incubadas en medio Endo a 37°C y las otras dos fueron incubadas en
medio m-FC a 44.5°C durante 24 horas. Se evaluó el crecimiento solamente de estos
dos microorganismos ya que los medios son selectivos para el microorganismo en
estudio (E. coli) según las especificaciones del fabricante.
5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia
Para evaluar la selectividad y eficacia de los medios Endo y m-FC se utilizó una
suspensión de Staphylococcus aureus y una suspensión de Escherichia coli obtenidas
del cepario del Laboratorio de Salud Publica del Huila. Cada suspensión fue realizada
en 10 mL de agua destilada estéril y comparada con la turbidez del tubo 0.5 del
patrón de Mcfarland, las cuales fueron analizadas por el método de filtración por
membrana, evaluando simultáneamente las cajas con medio Endo y las cajas con
medio m-FC incubando a las respectivas temperaturas. Para comprobar la
selectividad y eficacia de cada medio, se verifico visualmente que solo hubiera
crecimiento de Escherichia coli y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,
ya que son medios listos para el uso.
41
El medio Endo se utiliza para la identificación de coliformes totales a 37°C durante
24 horas, usando filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 micras. Al pasar
la muestra de agua a través de este filtro mediante la aplicación de vacio las bacterias
las cuales son de mayor tamaño quedan retenidas en este. Los coliformes totales que
fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y
convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metálico. (SARTORIUS,
2003).
El medio m-FC se utiliza para la determinación de Escherichia coli y coliformes
fecales, a temperatura de incubación de 44.5°C. Estos microorganismos crecen
formando colonias de color azul intenso brillantes y convexas (SARTORIUS, 2003).
5.6. CONTROL DE AMBIENTES
Se seleccionaron tres puntos de muestreo. Mediante la técnica de sedimentación, en
cada punto se colocó una caja con agar OGY para el recuento de hongos y levaduras
y una caja con agar Plate Count para el recuento de bacterias mesófilas, durante 15
minutos. Las cajas con agar Plate count fueron incubadas a 37°C +/- 2°C durante 24
horas, y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 días.
Finalizado el periodo de incubación, se realizo el recuento de microorganismos. Este
procedimiento fue realizado cada vez que se realizaba el estudio de validación.
5.7. CONTROL DE EQUIPOS
Se reviso la documentación de mantenimiento y calibración de equipos y se llevo el
registro del uso de cada uno de los equipos utilizados en el estudio de validación,
mediante la utilización de formatos de registro que ya tiene establecido el Laboratorio
de Salud Publica del Huila.
42
5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO
La metodología para realizar la validación del método de filtración por membrana, se
llevo a cabo de acuerdo al protocolo descrito por el Instituto Nacional de Salud.
(Palma, 1998).
Antes de llevar a cabo el proceso de validación se realizó la estandarización del tubo
0.5 del patrón de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de
obtener un dominio del método.
5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland
Se realizo la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland para comprobar
que efectivamente se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL, realizando
varias mediciones para obtener un rango promedio de lectura de absorbancia. (Ver
figura 1).
a. Lectura tubo Mcfarland
Tubo 0.5 de
Mcfarland Leer a 620 nm
43
b. Comparación de la suspensión de E. coli con el tubo de Mcfarland
comparar 15 x 107 UFC/mL
c. Diluciones de la suspension bacteriana
1/100 1/100 1/100
1/10
15 x 107 15 x 105 15 x 103 15x 103 15 Bact/mL
FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland. a) Lectura tubo 0.5 de Mcfarland. b) Comparación del tubo 0.5 de Mcfarland con la suspensión de E. coli. c) Preparación de las diluciones de la concentración de 5 bacterias/ml.
Tubo 0.5 de
Mcfarland Suspensión E.
coli
Leer a 620 nm
10 mL ADE
44
Obtenida la concentración de 15 bacterias/ml, se realizaron cuatro replicas tomando 4
mL de esta suspensión y adicionando 1 ml a cada frasco que contenía 99 ml de agua
destilada estéril, para completar un volumen final de 100 ml, la totalidad de cada
frasco fue analizada por el método de filtración por membrana. Se realizaron 10
mediciones de cuatro replicas cada una, realizando una medición diaria, de las cuales
dos eran para ser sembradas en medio Endo y dos en medio m-FC y se llevaron a
incubar a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Después de 24 horas se
realizo el recuento de las colonias características en cada medio. Este procedimiento
fue realizado cada vez que se hacia una medición. (Ortiz, 2008)
5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad
Se analizaron tres concentraciones diferentes de Escherichia coli, las cuales se
encontraran dentro del nivel bajo, medio y alto de detección del método. Las
concentraciones analizadas fueron: 5 bacterias/ml, 20 bacterias/ml y 70 bacterias/ml.
En todo el proceso de validación se partió inicialmente de una concentración de 130
millones de bacterias/ml, la cual fue determinada a través de las mediciones que se
realizaron en la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland.
Para llegar a la concentración de 5 bacterias/ml se procedió de la siguiente manera:
Se preparó una suspensión de E. coli en 40 ml de agua destilada estéril, se comparó
con el tubo 0.5 de Mcfarland, se leyó en el espectrofotómetro a 620 nm y se
comprobó que estuviera entre el rango de absorbencias establecido anteriormente. A
partir de esta suspensión, para obtener la concentración de 5 bacterias/mL, se utilizo
la fórmula: V1 X C1 = V2 X C2 en donde:
V1= 10 ml
45
C1= 130.000.000 bacterias/mL
V2= ?
C2= 50.000.000 bacterias/mL
Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denominó volumen
final.
V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 26 mL
50.000.000 bac/mL
El volumen final para la concentración de 50 millones de bacterias/mL fue de 26 mL,
como ya se tenían 10 mL del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10
mL iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estéril, para completar el
volumen final de 26 mL. (Ver figura 2).
Suspensión E.coli Adicionar
10 ml
Comparar
Tubo 0.5 de
Mcfarland
40 mL
ADE
46
50 X 106 UFC/ml
1/100 1/100 1/100 1/10
50 x 106 50 x 104 50 x 102 50 UFC/ml 5 UFC/ml
FIGURA 2. Esquema para preparar la concentración de 5 bacterias/ml
Este mismo procedimiento fue realizado para las otras dos concentraciones teniendo
en cuenta la concentración final a la que se quería llegar.
Una vez obtenida cada concentración final 5, 20 y 70 bacterias, se tomo veinte
mililitros de cada una adicionando un mililitro a frascos schott estériles que contenían
99 mL de agua destilada estéril para ser analizadas por el método de filtración por
membrana. Se realizaron veinte replicas de cada concentración sembrando 10
Volumen final
26 mL
16 mL
ADE
47
replicas en medio Endo y 10 replicas en medio m-FC e incubadas en las respectivas
temperaturas.
Con los datos obtenidos se realizo el análisis estadístico, calculando la media,
desviación estándar y coeficiente de variación el cual debe ser menor o igual al 10%.
(Ortiz, 2008)
5.8.3. Validación del método de filtración por membrana
De acuerdo a la metodología adoptada por el INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
(INS), la cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseño experimental
fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando
las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras
mas adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El estudio se procesó
durante seis días, en donde cada lote era un día.
Cada solución fue preparada como se explico en el ensayo preliminar de
repetibilidad. (Ver figura 2), tomando cuatro mililitros de cada concentración a
evaluar, para ser adicionado un mililitro en frascos schott que contenían 99mL de
agua destilada estéril, para obtener un total de cuatro replicas por concentración de las
cuales dos fueron para analizar coliformes totales y dos para analizar coliformes
fecales (E. coli). Cada solución fue analizada por duplicado, con el fin de realizar las
cartas de control.
No se realizo un control negativo, ya que al momento de hacer la prueba de
selectividad y eficacia de los medios, se comprobó cual era el crecimiento de E. coli y
S. aureus en cada medio.
48
5.8.3.1. Descripción de soluciones y muestras
Blancos: Se utilizo agua destilada estéril, el cual fue sometido al mismo
procedimiento analítico de las demás soluciones.
Soluciones estándares: Cubren el rango de detección del método. Se usaron dos
estándares, los cuales estaban cerca al límite inferior y superior del rango de
detección del método (0.09 C y 0.9 C, donde C es el límite superior de detección del
método), el cual fue de 80 UFC/mL, que ya está establecido por el Instituto Nacional
de Salud, además, es el máximo nivel en el que se puede hacer un recuento
significativo de microorganismos, que para este caso fue E.coli.
Muestras naturales: Deben de poseer las características para las cuales el método es
utilizado rutinariamente. Las muestras naturales analizadas, eran agua en bolsa de dos
marcas diferentes. A estas bolsas de agua se les realizo una evaluación antes del
proceso de validación, con el fin de comprobar que no presentaban crecimiento de
coliformes totales ni fecales. Se analizó el 10% de las bolsas de agua de cada marca,
adicionando 100 ml de cada muestra a frascos Schott estériles de 250 ml que
contenían 0.5 ml de tiosulfato, el cual es un inhibidor del cloro presente en cada
muestra, que permite determinar la concentración de microorganismos indicadores de
contaminación presentes en cada una. Cada muestra fue analizada por el equipo de
filtración por membrana sembrando simultáneamente en medio Endo y en medio m-
FC e incubadas a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Finalizado el periodo
de incubación se comprobó que ninguna de las dos marcas de agua presentara
crecimiento característico en cada uno de los medios de cultivo.
Muestras adicionadas: Hace referencia a las muestras naturales, a las cuales se les
adicionó una cantidad conocida del microorganismo en estudio, denominadas 0.4 C
(equivalente a 32 bacterias/ml) y 0.7 C (equivalente a 56 bacterias/mL). Con la
adición de cada concentración conocida se determino la exactitud del método
mediante la evaluación de la recuperación.
49
5.8.4. Elaboración de cartas R/ para el control de calidad analítica interna del laboratorio
Para realizar las cartas de control, los datos fueron obtenidos durante el
procedimiento de validación, en donde cada solución se analizo por duplicado.
Al terminar la validación se calculó el n (número de datos), E (sumatoria), y R/
(promedio) de la columna R.
Se calculo el LCS (límite superior de control) mediante la fórmula:
3.27 x R/
Se calculó el LCI (límite inferior de control) mediante la fórmula:
R x 0
(OTALORA, 2005)
5.8.5. Evaluación de la validación
Se realizo análisis estadístico de los resultados obtenidos mediante un programa
elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). (Anexos 4-7). La precisión del método
fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada solución, las
cuales debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5%
de la concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor mínimo de interés que en
este caso fue 8. Así mismo se evaluó la repetibilidad dentro de lotes, la cual fue
analizada solo para el blanco ya que fue la única solución que se realizo por
duplicado, y reproducibilidad entre los lotes, debido a que el estudio fue realizado en
6 días diferentes. A pesar de que todas las soluciones se realizaron por duplicado, el
valor de las dos mediciones fue tenido en cuenta para la elaboración de las cartas
50
control. Mientras que para el aplicativo se realizo el promedio de las dos replicas,
tomando el resultado como el valor encontrado, puesto que el diseño establece que
solo los blancos se repiten, las demás soluciones no. (Ortiz, 2202).
La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de
E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobándose que el promedio
de la recuperación no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperación
esperada.
5.9. INFORME DE RESULTADOS
Mediante la evaluación de los parámetros estadísticos tales como la media,
desviación estándar total dentro de lotes y entre lotes y recuperación, se analizaron
los respectivos datos obtenidos, para determinar la precisión y exactitud del método
de filtración por membrana para la detección de coliformes totales y fecales (E. coli)
en muestras de agua para consumo humano.
51
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA
Macroscópicamente la cepa de Escherichia coli, presentó las siguientes
características: colonias rosadas (lactosa positivas) grandes y redondas. (Figura 3).
FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey
En la coloración de Gram. se observo solo la presencia de bacilos Gram negativos y
mediante la utilización del API 20E, se comprobó la identificación del
microorganismo evaluado, encontrándose el código de lectura 5144552, el cual hace
referencia a Escherichia coli. (Figura 4).
52
FIGURA 4 Identificación bioquímica de E. coli
La cepa de Staphylococcus aureus macroscópicamente presentó las siguientes
características: colonias de color amarillo cremoso con presencias de halo de
hemolisis. (Figura 5).
FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre
53
Microscopicamente se evidenciaron cocos Gram positivos, y en la identificacion
bioquimica se obtuvieron los siguientes resultados: coagulasa (+), catalasa (+) y
oxidasa (-).
Con estos resultados se comprobo que las cepas utilizadas estaban completamente
puras ya que no se evidencio la presencia de microorganismos contaminantes como
se pudo observar en las coloraciones de Gram, de la misma manera, se comprobo la
viabilidad ya que las dos cepas obtuvieron un buen crecimiento en los respectivos
medios en que se realizaron las siembras.
6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El control de calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es
considerado como parte esencial de las buenas prácticas de laboratorio, el cual es
necesario para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica,
siendo este un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, hasta el
producto final utilizado, el cual es evaluado directamente por el laboratorio que
emplea el medio de cultivo para su análisis. Por esta razón, el control de calidad de
los medios de cultivo está considerado como uno de los puntos críticos de control, del
cual depende la seguridad y confiabilidad de los resultados que emiten los
laboratorios de ensayo. (Soler, 2006)
6.2.1. Control de esterilidad
Por medio del análisis del 10% de los medios de cultivo utilizados en el proceso de
validación, se comprobó la esterilidad de cada uno, ya que no hubo crecimiento de
ningún tipo de microorganismo, permitiendo así la utilización satisfactoria de cada
medio.
54
El agua destilada estéril que se utilizo, para la hidratación de los medios Endo y m-
FC, como para las suspensiones y diluciones bacterianas, estaba completamente
estéril, ya que al ser analizada por el método de filtración por membrana no presento
ningún tipo de crecimiento bacteriano.
6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia
La composición química de un medio de cultivo debe proveer los requerimientos
nutricionales básicos para el crecimiento de los microorganismos. Debido a la
variabilidad de pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, es
recomendable realizar una evaluación antes de su utilización, sin embargo, un medio
de cultivo debe cumplir con dos características importantes, la selectividad y la
eficacia. (Padilla, 2002).
Este control fue realizado para comprobar la eficacia y selectividad de los medios
Endo y m-FC, observándose crecimiento de la cepa de Escherichia coli en los dos
medios de cultivo utilizados, y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,
comprobándose que los medios de cultivo evaluados son altamente selectivos y
eficaces, ya que permitieron solo el crecimiento de Escherichia coli inhibiendo
completamente el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Figura 6 y 7). Comprobada
la ausencia de crecimiento de S. aureus, no se realizaron controles negativos durante
la validación, ya que los medios de cultivo solamente permiten el crecimiento de E.
coli.
55
Medio Endo Medio m-FC
FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC
FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC
6.3. CONTROL DE EQUIPOS
En la implementación de la norma ISO 17025, es de gran importancia dentro de los
procesos de validación de análisis microbiológicos, utilizar equipos debidamente
calibrados. Es importante que el laboratorio emplee métodos y procedimientos
apropiados para todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe
equiparse con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las
56
medidas que se realizan durante su utilización dentro de la ejecución del análisis o
método microbiológico y así avalar los resultados de las pruebas. (Soler, 2006).
En este caso el Laboratorio debe tener programas de mantenimiento y calibración;
calibrar y revisar los equipo antes de ponerse en servicio, con el fin de establecer si
reúne los requisitos de las especificaciones del Laboratorio y si cumple las
especificaciones de normatividad pertinente, (Soler, 2006).
De la misma manera, todos los equipos deben ser registrados con la indicación de la
frecuencia de mantenimiento así como de las operaciones que realiza este y el
responsable de su verificación. (Galeano, 2007).
Al iniciar el proceso de validación se reviso el historial de los equipos utilizados en el
proceso de validación, incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y
registro de su uso durante el estudio, (Anexo 3). Los equipos utilizados, se
encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos esperados.
6.4. CONTROL DE AMBIENTES
Durante el proceso de validación se llevo a cabo el control de ambientes por medio
del método de sedimentación en medio Plate count para bacterias mesófilas aerobias
y en medio OGY para la determinación de hongos y levaduras. EL recuento obtenido
se muestra en la tabla 1.
57
TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras
PRUEBA REALIZADA Recuento de bacterias
mesófilas aerobias UFC/
15 min. de exposición
Recuento de Hongos y
levaduras UFC/15 min.
De exposición
Prueba de esterilidad 0 0
Prueba repetibilidad
1 5 2
2 3 0
3 4 0
Fuente: Autor
Los resultados obtenidos del control de ambientes del área donde se realizo la
validación del método, indican una carga baja de microorganismos presentes, (Tabla
1), lo que permite inferir que se cumplen con buenas condiciones de limpieza y
desinfección de esta área.
Los formatos de registro de limpieza del Laboratorio se encuentran en el anexo 3.
6.5. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA
Es de vital importancia la validación de métodos dentro de un proceso de
acreditación, ya que mediante la utilización de técnicas validadas, se está dando la
confianza y seguridad requerida en los resultados que se emiten.
Para los Laboratorios de referencia se hace necesario llevar a cabo procesos de
validación de tipo secundario, ya que en la mayoría de estos laboratorios se emplean
58
métodos de referencia. En este caso, el laboratorio emplea el método de referencia de
filtración por membrana para la detección de coliformes totales y fecales en muestras
de aguas para consumo.
Para llevar a cabo el proceso de validación del método de filtración por membrana, se
evaluaron los parámetros de precisión y exactitud. La precesión fue evaluada en
función de repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad solo fue evaluada en el
blanco ya que fue la única solución que se realizo por duplicado. Mientras que, la
reproducibilidad fue evaluada en todas las soluciones debido a que el estudio fue
realizado en seis días diferentes.
Se evaluó la desviación estándar total tanto para coliformes totales como para
coliformes fecales, en donde la desviación estándar se comparó con W (meta a
alcanzar). W fue tomado como el 5% de la concentración de la gran media ó como
0.25 veces el valor mínimo de interés del método. Para que la desviación estándar
fuera aceptada esta debía de ser menor que W.
La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de E.
coli a las dos muestras naturales utilizadas. Se tomo un nivel de confianza entre el 95
y 105%, con un margen de error del 5%. La recuperación satisfactoria fue aceptada si
los resultados obtenidos estaban dentro de esta meta.
6.5.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland
Antes de iniciar con la etapa de validación, se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de
Mcfarland y se realizaron ensayos preliminares con el fin de obtener dominio del
método.
En los resultados obtenidos de la estandarización de la lectura de la suspensión de
E.coli para comprobar que se estaba partiendo de 150 millones de bacterias, se
observo que las mediciones realizadas con una absorbancia cercana a la encontrada
59
en la lectura del tubo 0.5 de Macfarland (Tabla, 2), presentaban una concentración
inicial de 130 millones de bacterias/ mL. Al realizar las 10 replicas que se
establecieron, se obtuvo un rango de absorbancias entre 0.295 y 0.310, las cuales
permitían que cada vez que se preparaba la suspensión de E.coli se tenía certeza de
que se estaba partiendo de una concentración inicial de 130 millones de bacterias/mL
(Tabla 3) (Figura 8).
TABLA 2 Comparación de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensión de E. coli
Tubo 0.5 Suspensión E. coli
Absorbancia 0.296 0.295 – 0.310
Fuente: Autor
60
TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensión de E. coli
ABSORBANCIA MEDIO ENDO
MEDIO
m-FC
R1 R2 PROMEDIO R1 R2 PROMEDIO
0.295 14 11 12 14 10 12
0.306 14 13 14 11 10 11
0.308 14 11 12 12 15 14
0.297 15 12 14 14 11 12
0.299 11 13 12 13 12 12
0.303 15 13 14 15 14 14
0.301 12 14 13 11 15 13
0.298 10 14 12 13 15 14
0.300 15 11 13 13 12 12
0.310 13 11 12 13 15 14
13 13
Fuente: Autor
61
a)
b)
FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. a) Recuento de E. coli a una absorbancia de 0.295. b) Recuento de E. coli a una absorbancia de 0.310.
6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad
En el ensayo de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variación para las
concentraciones de 20 y 70 bacterias/mL menores al 10%, mientras que para la
concentración de 5 bacterias/mL estos coeficientes de variación se encontraron por
62
encima del 10% tanto para coliformes totales como para coliformes fecales,
presentando una mayor dispersión en los recuentos obtenidos, (Tabla 4) (Figura 6).
Esto es debido a que el valor de la concentración esta cerca al límite de detección del
método, donde existe mayor incertidumbre y probabilidad de error. (Palma, 2008).
Tabla 4 Calculo de la media, desviación estándar y coeficiente de variación de las concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL
Fuente: Autor
5 BACTERIAS 20 BACTERIAS 70 BACTERIAS ENDO m-FC ENDO m-FC ENDO m-FC
R1 8 7 29 27 73 74
R2 6 6 27 28 77 69
R3 7 6 28 26 75 72
R4 7 6 27 26 74 71
R5 6 7 28 27 75 73
R6 8 7 27 25 72 69
R7 6 8 29 28 77 74
R8 7 6 25 24 73 75
R9 6 5 28 27 72 74
R10 7 6 26 25 75 73
MEDIA 6.8 6.4 27.4 26.3 74.3 72.4
DESVIACION
ESTANDAR
0.79 0.84 1.26 1.34 1.828 2.118
COEFICIENTE
DE
VARIACION
11.62% 13.18% 4.59% 5.09% 2.46% 2.92%
63
5 BACTERIAS
20 BACTERIAS
70 BACTERIAS
FIGURA 9 Recuento de los estándares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli
6.5.3. Validación del método de filtración por membrana
Los 48 resultados obtenidos fueron sometidos a tratamiento estadístico, mediante la
utilización del programa estadístico validar 1.1. Tanto para coliformes totales como
para coliformes fecales. Se obtuvieron datos como media, desviación estándar total
dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad
interna del laboratorio respectivamente y recuperación alcanzada.
En las tablas 5 y 6 se observan los resultados de los recuentos obtenidos de las
diferentes soluciones analizadas tanto para coliformes totales como para coliformes
64
fecales. En la figura 10 se observa el crecimiento de E. coli en medio Endo y medio
m-FC en las diferentes soluciones preparadas.
TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo.
TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES Constantes U C v V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
Solución LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77
4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8 5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 34 31 36 33 35 32 8-M2+A2 60 57 55 52 56 58
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99 Fuente: Aplicativo validar 1.1
U: concentración del agua natural sin adición M1 y M2
C: Concentración de la dilución anterior del estándar M1
C: Concentración de la dilución anterior del estándar M2
V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco
v: Volumen de la concentración M1 + A1 para ser analizado por el método de filtración por membrana
LMS: Límite máximo de detección del método.
65
TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES Constantes U C v V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
Solución LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75
4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4 5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 32 33 37 34 36 35 8-M2+A2 57 58 59 55 58 56
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99 Fuente: Aplicativo validar 1.1
U: concentración del agua natural sin adición M1 y M2
C: Concentración de la dilución anterior del estándar M1
C: Concentración de la dilución anterior del estándar M2
V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco
v: Volumen de la concentración M1 + A1 para ser analizado por el método de filtración por membrana
LMS: Límite máximo de detección del método.
a) b)
66
c) d)
e) f)
67
g)
FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC.
a) Recuento de blancos. b) Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar 0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C. e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento de M1 y M2.
6.5.3.1. Determinación de la precisión
Se evaluó la desviación estándar total de cada solución la cual fue comparada con W
(meta a alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentración de la gran media ó
como 0.25 veces el valor mínimo de interés del método, escogiendo la mayor de las
dos. Para que la desviación estándar fuera aceptada esta debía de ser menor que
cualquiera de los de niveles de meta a alcanzar.
En los datos obtenidos tanto para coliformes totales como para coliformes fecales, se
evaluó si la desviación estándar total de cada solución era menor o igual a la meta a
alcanzar. (Tablas 7 y 8), evidenciándose que la desviación estándar de cada solución
fue aceptada, lo cual indica que el método ha logrado su primer parámetro evaluado,
la precisión, ya que se cumplió con los requisitos de la meta establecida.
68
TABLA 7 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes totales
Valor mínimo de interés para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325 St2 = Se2 + Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667
St = Desviación estándar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
Concentración (GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333 W (meta a alcanzar)
0.05 X GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167
0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7583 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8167 St < W ? SI SI SI SI SI SI SI
Tabla 8 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes fecales
Valor mínimo de ínteres para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 St2 = Se2 + Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667 St (Desviacion estándar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 Concentración (GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667 W (meta a alcanzar)
0.05 X GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583
0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 W 2,0000 3,7500 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8583
St < W ? SI SI SI SI SI SI SI
69
6.5.3.2. Determinación de la exactitud
Para la recuperación se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% , con un
margen de error del 5%. La recuperación fue aceptada si los resultados obtenidos
estaban dentro de esta meta.
En las tablas de la 9-12 se observan varias hipótesis de la recuperación experimental
contra la recuperación teórica. La primera hipótesis es 1) Observar si la recuperación
experimental/recuperación teórica es menor o igual a 0.95. Si el resultado es positivo,
se continua con el análisis. 2) Esta hipótesis consiste en evaluar si la recuperación
experimental/recuperación teórica es menor o igual a 1.05, si el resultado es sí,
entonces se infiere que la recuperación fue satisfactoria.
En los datos obtenidos se observo que la recuperación de M1 + A1 y M2 + A2 para
coliformes totales como para coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 9-12), por lo
tanto se cumplió con el segundo parámetro de la validación, la exactitud.
70
Tabla 9 Recuperación M1 + A1, coliformes totales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A1.
S 1,8708 1,5352
t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01 2,01 1,5352
R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
Recuperación satisfactoria
35,14 .=A (ii)
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
S
6201´ .
1056
201, ,´ + ´dS 0 95
62 01, ,´ - ´d
S
71
TABLA 10 Recuperación M1 + A1, coliformes fecales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A1.
S 1,8708 1,5352
t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bilateral 2,01 2,01
1,5352
R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
Recuperación satisfactoria 35,14 .=A (ii)
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
S
6201´ .
1056
201, ,´ + ´dS 0 95
62 01, ,´ - ´d
S
72
TABLA 11 Recuperación M2 + A2, coliformes totales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A2.
S 2,7325 2,2422 t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01
R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
Recuperación satisfactoria 61,04 .=A (ii)
50,96 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
con y = 5 2,01
R= 56,33 d= 56,00
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd
NO
1,1,05Xd
cuperación satisfactoria
73
TABLA 12 Recuperación M2 + A2, coliformes fecales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A2.
S 1,4720 1,2079 t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01
R/d R= 57,17 d= 56,00 1,021 R/d>=0.95? SI NO R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO 1,05Xd 58,8 Recuperación satisfactoria 60,01 .=A (ii)
51,99 .=B (i)
R<=A? R>=B? NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria
Revisar metodologia y técnica
analítica
d R= 57,17 d= 56,00R/d>=0.95?
SI NOR/d<=1,05? 0,95Xd
SI NO1,05Xd
Recuperación satisfactoriaia
74
6.5.4. Cartas de control “R”
La grafica de control R, para coliformes totales arrojo un límite superior de control de
7.01, un límite medio de 2.14 , el límite inferior de control fue cero. (Ver figura 11).
La grafica de control R, para coliformes fecales arrojo un límite superior de control
de 7.32, un límite medio de 2.24 y el límite inferior de control fue de cero. (Ver figura
12).
Con los valores obtenidos en estas cartas de control, se analizo cada uno de los datos
después de realizada la validación, comprobándose que el proceso está bajo control
ya que ningún valor encontrado para coliformes totales como para coliformes fecales
estaban fuera de los limites de control superior calculados (ANEXO 8)
Grafico de Control “R”
LCS = 7.01 LC (R/) = 2.14 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
LCI = 0
Ensayo/Tiempo
DIF
ER
EN
CIA
S
FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales
75
Grafico de Control “R”
LCS = 7.32 LC (R/) = 2.24 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
LCI = 0
Ensayo/Tiempo
Figura 12.
Finalmente, gracias a los resultados obtenidos donde se evaluó la detección
simultanea de los microorganismos indicadores de contaminación presente en
muestras de aguas, se logró demostrar que se cumple con los parámetros evaluados
de precisión y exactitud.
Para que un método sea valido completamente bajo normas nacionales e
internacionales se deberán determinar además de éstos indicadores, otros parámetros
estadísticos como la determinación del límite de detección, el límite de
cuantificación, especificidad, sensibilidad y cálculo del límite de incertidumbre. Los
cuales deberán ser evaluados por el laboratorio para concluir de manera satisfactoria
con los requerimientos y necesidades del proceso de validación.
Con la realización de éste trabajo de grado se dio inicio al proceso de validación, en
donde se determinó la precisión y exactitud del método según los resultados
obtenidos, pero se deberá de complementar con otros indicadores estadísticos, cuya
determinación obedecerá a las necesidades del laboratorio.
D
IFE
RE
NC
IAS
FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales
76
7. CONCLUSIONES
· La validación del método de filtración por membrana para el análisis de
coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permitió
obtener resultados reproducibles y confiables.
· Se determinó la precisión del método mediante la aceptabilidad de las
desviaciones estándares de cada solución analizada cumpliéndose con el requisito de
la meta a alcanzada.
· Se determino la exactitud del método, en donde la recuperación de las
muestras adicionadas fue satisfactoria.
· Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre
0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotómetro a 620 nm.
· Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el análisis de coliformes
totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el
crecimiento del microorganismo de interés y completamente estériles ya que no se
evidencio crecimiento de ningún tipo de microorganismo.
· Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfección, ya que se
evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.
· El mantenimiento y calibración de los equipos garantizaron que las
mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.
· El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),
facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el
proceso de validación.
77
8. RECOMENDACIONES
· Se deberá tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibración
de equipos, con el fin de asegurar que se están utilizando equipos completamente
calibrados.
· Además de realizar validación secundaria, se deberá complementar con otras
pruebas, como el cálculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una
mayor confiabilidad en los resultados emitidos.
· Este método se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la
veracidad de los resultados.
· Una vez determinados estos dos parámetros de la validación (Precisión y
exactitud), se deberá complementar con la determinación del Límite de detección
para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del
cliente.
78
9. BIBLIOGRAFÍA
· APHA- AWWA-WPCF, 2005. Standard methods for analysis of waters and wastewaters. Edición 21. Editorial Diaz de Santos. Madrid, España. 1150 páginas.
· Castillo, B. Gonzales, R. 1996. Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos. Revista cubana de Farmacia. Enero – abril, Volumen 30. No 1.
· Cortes, Alejandra. 2002. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 93 páginas.
· Cortes, Natalia. Méndez, Y. Junio, 2006. Validación de las pruebas de esterilidad por la técnica de filtración por membrana y endotoxinas bacterianas por el método de LAL en 3 productos farmacéuticos. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.
· Galeano, Norma. 2007. Validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.182 paginas.
· GTC GUÍA TECNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del agua. Guía para la orientación acerca de la validación de métodos de análisis microbiológicos. Editado ICONTEC, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Científicas.
· ISO 9000:2000. Sistemas de gestión de calidad.
79
· MILLIPORE, 2005. Análisis microbiológico. Madrid, España. 48 paginas.
· NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración.
· NTC 3529-2 Exactitud (veracidad y precisión) de métodos de medición y resultados. Parte 2: Método básico para la determinación de repetibilidad y reproducibilidad de un método normalizado de medición.
· Ordoñez, J. 2000. Microorganismos de los alimentos. Volumen 1, segunda edición. Editorial Acribia S.A, Zaragoza, España.
· Otálora Andrés. Ortiz, J. Peñaranda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C. Peralta, A. Tovar, G. Junio, 2005. Séptimo curso – taller VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia de la calidad del agua potable, metales y no metales de interés en Salud Publica. Bogotá, D.C.
· Padilla, José Esteban. 2007. Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de alimentos en un laboratorio de referencia. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 109 paginas.
· Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. López, L. Peñaranda, S. Raad, J. 1999. Análisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe de Bogotá, D.C.
· Sartorius. 2003. Microbiological testing of foods, beverages and Pharmaceuticals. SARTORIUS, Publication No SM-4017-e97116. Goettingen, Germany, 19 paginas.
· THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA. USP 29. 2006. Pruebas microbiológicas. Prueba de esterilidad 71. Páginas 2728 – 2733.
· USP, 2003. The United States Pharmacopoeia XXVI. The National Formulary 21 (NF21), United States Pharmacopoeial convention, Rockville, MD.
80
9.1. RECURSOS ELECTRONICOS
· Garcia, E. 2001. Optimización, validación y modelización de un proceso de fabricación de comprimidos. Desarrollo de una aplicación interactiva multimedia. Doctorado en farmacia. Universitat de Barcelona. Facultat de farmacia. Barcelona, España, 166 paginas, [EN LINEA] http://www.tdx.cesca.es/TESIS UB/AVAILABLE/TDX-0618102-102213//TOL82A.pdf. Consulta 12 de febrero de 2008. Hora 10 am.
· Who Expert committee on Specifications for Pharmaceutical Preparation. Reporte 32 Ginebra, Suiza. World Healt Organization 1992. (WHO Technical Reports Series No. 823). [En linea]. <http//whglibdoc.who.int/trs/WHO TRS 823.pdf>. consulta 17 de febrero de 2008. Hora 3:30 pm.
81
10. ANEXOS
Anexo 1. Certificado de las cepas ATCC
82
83
Anexo 2. Certificados de medios de cultivo
84
85
Anexo 3. Certificados de mantenimiento y calibración de equipos
Destilador de agua
86
Equipo filtración por membrana
87
Analizador químico RA-50
88
Baño maría
89
90
Incubadora
91
92
Micropipeta 100-1000 UL
93
94
95
Anexo 4. Registro del uso de los equipos
96
97
ACTIVIDAD DIARIA: Cada vez que se use:
1. Limpiar exterior bomba de vacío 2. Lavar Manifold 3. Revisión funcionamiento llave de paso 4. Esterilizar portafiltros (alcohol y mechero)
ACTIVIDAD SEMANAL: Esterilizar en autoclave portafiltros y equipo
ACTIVIDAD ANUAL: Revisión técnica de la Bomba de vacío
Noviembre 2008
Día: Mes: Año:
Fecha
Bomba de vacío /
Limpieza exterior
de la bomba
Lavado
Manifold
Revisión
llave de
paso
Esteriliza
ción
portafiltro
s y
equipo
Firma
4 X X 1 JHISEL
PAEZ
5 X X 1 JHISEL
PAEZ
6 X X 1 JHISEL
PAEZ
7 X X 1 JHISEL
PAEZ
10 X X 1 JHISEL
PAEZ
98
11 X X 1 JHISEL
PAEZ
12 X X 1 JHISEL
PAEZ
13 X X 1 JHISEL
PAEZ
14 X X 1 JHISEL
PAEZ
18 X X 1 JHISEL
PAEZ
19 X X 1 JHISEL
PAEZ
20 X X 1 JHISEL
PAEZ
21 X X 1 JHISEL
PAEZ
24 X X 1 JHISEL
PAEZ
28 X X 1 JHISEL
PAEZ
1. C = CONFORME 2. NC = NO CONFORME
99
Anexo 4. Calculo de la Gran Media
Coliformes Totales Media
SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )
1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
3-E 0.9C 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 75,167
4-E 0.09C 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 6,833
5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
7-M1+A1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 33,500
8-M2+A2 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 56,333
COLIFORMES FECALES Media
SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )
1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
3-E 0.9C 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 75,000
4-E 0.09C 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 6,500
5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 7-M1+A1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 34,500
8-M2+A2 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 57,167
100
Anexo 5. Calculo de factor unico
a) Cálculo factor único coliformes totales
SOLUCION TESTIGO COLIFORMES TOTALES Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Suma de 0,000
columnas
L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
� L2 0,000
� x2 0,000
m = número de lotes. n 2 � L
2/n 0,000 n =
réplicas. m 6 � � L)2/mxn 0,000
Fuente: aplicativo validar 1.1
b) Cálculo factor único coliformes fecales.
SOLUCION TESTIGO COLIFORMES FECALES Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Suma de 0,000
columnas
L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
� L2 0,000
� x2 0,000
m = número de lotes. n 2 � L
2/n 0,000 n =
réplicas. m 6 � � L)2/mxn 0,000
Fuente: aplicativo validar 1.1
101
c) Cálculo factor único estándar 0.9C, coliformes totales
SOLUCION ESTANDAR
0,9C C. TOTALES Suma de filas LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000 Prueba 2 - - - - - - - Suma de 451,000 columnas
L 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000 � L
2 33969,000 � x
2 33969,000 m = número de lotes. n 1 � L
2/n 33969,000 n = réplicas. m 6 � � L)
2/mxn 33900,167
d) Calculo factor único estándar 0.9C, coliformes fecales
SOLUCION ESTANDA
R 0,9C
C. FECALES Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE
4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000 Prueba 2 - - - - - - - Suma de 450,000 Columna
s L 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000
� L2
33790,000
� x2
33790,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n
33790,000
n = réplicas. m 6
� � L)2/mx
n 33750,00
0
102
e) Calculo factor único estándar 0.09C, coliformes totales
SOLUCION ESTANDAR
0,09C C. TOTALES
Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 41,000
Columnas
L 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000
� L2 299,000
� x2 299,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n 299,000
n = réplicas. m 6 � � L)
2/mxn 280,167
f) Calculo factor único estándar 0.09C, coliformes fecales
SOLUCION ESTANDAR
0,09C C. FECALES Suma de
filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 39,000
Columnas
L 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000
� L2 271,000
� x2 271,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n 271,000
n = réplicas. m 6
� � L)2/mx
n 253,500
103
g) Calculo factor único estándar 0.4C, coliformes totales
MUESTRA NATURAL
ADICIONADA M1+A1
C. TOTALES Suma de
Filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 201,000
Columnas
L 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000
� L2 6751,000
� x2 6751,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n 6751,000
n = réplicas. m 6 � � L)
2/mxn 6733,500
104
h) Calculo factor único estándar 0.4C, coliformes fecales
MUESTRA NATURAL
ADICIONADA M1+A1
C. FECALES Suma de
Filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE
4 LOTE
5 LOTE6 � x
Prueba 1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 207,000 Columna
s
L 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000
� L2 7159,000
� x2 7159,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n 7159,000
n = réplicas. m 6
� � L)2/mx
n 7141,500
105
i) Calculo factor único estándar 0.7C, coliformes totales
MUESTRA NATURAL
ADICIONADA M2+A2
C. TOTALES Suma de
Filas
LOTE1 LOTE2 LOTE
3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 338,000
Columnas
L 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000
� L2 19078,000
� x2 19078,000
m = número de lotes. n 1 � L2/n 19078,000
n = réplicas. m 6 � � L)
2/mxn 19040,667
106
j) Calculo factor único estándar 0.7C, coliformes fecales
MUESTRA NATURAL
ADICIONADA M2+A2
C. FECALES Suma de
Filas
LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x
Prueba 1 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000
Prueba 2 - - - - - - -
Suma de 343,000
Columnas
L 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000
� L2 19619,000
� x2 19619,000
m = número de lotes. N 1 � L2/n 19619,000
n = réplicas. M 6 � � L)
2/mxn 19608,167
107
Anexo 6.
Análisis de varianza entre y dentro de lotes
Análisis de varianza para coliformes totales
ANALISIS DE VARIANZA
FUENTE DE VARIABILIDAD
Suma de los
Cuadrados Grados de Libertad Cuadrados Medios
SOLUCION Entre lotes
Dentro del lote TOTAL
Entre lotes
Dentro del lote Total
Entre lotes
Dentro del lote
SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo
TESTIGO 1 Y 2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000
3-E 0.9C 3 68,8333 0,0000 68,8333 5 0 5 13,7667 -
4-E 0.09C 4 18,8333 0,0000 18,8333 5 0 5 3,7667 #¡DIV/0!
5-M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 - 6-M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #¡DIV/0!
7-M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 -
8-M2+A2 8 37,3333 0,0000 37,3333 5 0 5 7,4667 #¡DIV/0!
108
Análisis de varianza coliformes fecales ANALISIS DE VARIANZA FUENTE DE VARIABILIDAD
Suma de
los Cuadrados Grados de Libertad Cuadrados
Medios
SOLUCION Entre lotes Dentro
del lote TOTAL Entre
lotes Dentro
del lote Total Entre lotes Dentro del lote
SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo TE
STIGO 1 Y 2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000 3-
E 0.9C 3 40,0000 0,0000 40,0000 5 0 5 8,0000 - 4-
E 0.09C 4 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 #¡DIV/0! 5-
M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 - 6-
M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #¡DIV/0! 7-
M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 - 8-
M2+A2 8 10,8333 0,0000 10,8333 5 0 5 2,1667 #¡DIV/0!
109
Anexo 7.
Calculo de las desviaciones estándares
Calculo desviaciones estándares coliformes totales
CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.
BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2
M0 0,0000000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!
M1 0,00000 13,76667 3,76667 0,00000 3,50000 0,00000 7,46667
Sd 0,00000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!
Se 0,00000 3,71035 1,94079 0,00000 1,87083 0,00000 2,73252
GMC 0,000 75,167 6,833 0,000 33,500 0,000 56,333 Calculo desviaciones estándares coliformes fecales
CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.
BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2
M0 0,0000000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!
M1 0,00000 8,00000 3,50000 0,00000 3,50000 0,00000 2,16667
Sd 0,00000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!
Se 0,00000 2,82843 1,87083 0,00000 1,87083 0,00000 1,47196
GMC 0,000 75,000 6,500 0,000 34,500 0,000 57,167
110
Anexo 8.
Datos para elaborar los gráficos de control
Datos para realizar la carta control de coliformes totales
ENSAYO CONCENTRACIÓN LECTURA
X1 LECTURA
X2 PROMEDIO DIFERENCIA
X1 – X2 1 BK 0 0 0 0 2 0.09C 6 4 5 2 3 0.9C 77 81 79 4 4 M1 0 0 0 0 5 M1 + A1 31 37 34 6 6 M2 0 0 0 0 7 M2 + A2 62 58 60 4 8 BK 0 0 0 0 9 0.09C 7 11 9 4 10 0.9C 70 68 69 2 11 M1 0 0 0 0 12 M1 + A1 33 29 31 4 13 M2 0 0 0 0 14 M2 + A2 54 60 57 6 15 BK 0 0 0 0 16 0.09C 7 9 8 2 17 0.9C 76 80 78 4 18 M1 0 0 0 0 19 M1 + A1 35 37 36 2 20 M2 0 0 0 0 21 M2 + A2 58 52 55 6 22 BK 0 0 0 0 23 0.09C 8 6 7 2 24 0.9C 74 76 75 2 25 M1 0 0 0 0 26 M1 + A1 31 35 33 4 27 M2 0 0 0 0 28 M2 + A2 50 54 52 4 29 BK 0 0 0 0 30 0.09C 4 4 4 0 31 0.9C 71 75 73 4 32 M1 0 0 0 0 33 M1 + A1 32 38 35 6 34 M2 0 0 0 0 35 M2 + A2 54 58 56 4 36 BK 0 0 0 0 37 0.09C 10 6 8 4 38 0.9C 75 79 77 4 39 M1 0 0 0 0 40 M1 + A1 29 35 32 6
111
41 M2 0 0 0 0 42 M2 + A2 56 60 58 4
Datos carta control para coliformes fecales
ENSAYO CONCENTRACIÓN LECTURA
X1 LECTURA
X2 PROMEDIO DIFERENCIA
X1 – X2
1 BK 0 0 0 0
2 0.09C 7 5 6 2
3 0.9C 79 75 77 4
4 M1 0 0 0 0
5 M1 + A1 34 30 32 4
6 M2 0 0 0 0
7 M2 + A2 56 58 57 2
8 BK 0 0 0 0
9 0.09C 11 7 9 4
10 0.9C 68 72 70 4
11 M1 0 0 0 0
12 M1 + A1 31 35 33 4
13 M2 0 0 0 0
14 M2 + A2 55 61 58 6
15 BK 0 0 0 0
16 0.09C 6 4 5 2
17 0.9C 73 79 76 6
18 M1 0 0 0 0
19 M1 + A1 34 40 37 6
20 M2 0 0 0 0
21 M2 + A2 58 60 59 2
22 BK 0 0 0 0
23 0.09C 6 10 8 4
24 0.9C 76 80 78 4
25 M1 0 0 0 0
26 M1 + A1 33 35 34 2
27 M2 0 0 0 0
28 M2 + A2 58 52 55 6
29 BK 0 0 0 0
30 0.09C 5 9 7 4
31 0.9C 71 77 74 6
32 M1 0 0 0 0
112
33 M1 + A1 32 33 39 6
34 M2 0 0 0 0
35 M2 + A2 60 56 58 4
36 BK 0 0 0 0
37 0.09C 5 3 4 2
38 0.9C 74 76 75 2
39 M1 0 0 0 0
40 M1 + A1 37 33 35 4
41 M2 0 0 0 0
42 M2 + A2 54 58 56 4
113
Anexo 9
INFORME DE VALIDACIÓN
114
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR
MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO
ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
Neiva, Noviembre de 2008
115
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA
OBJETIVO Realizar la validación secundaria del método de filtración por membrana para la
detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano
analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.
INTRODUCCIÓN El recurso hídrico para consumo humano debe ser entregado a las comunidades, con
excelente calidad, la cual debe ser iniciada desde la misma generación, protección de
fuentes y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio
domiciliario.
Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y químicas que tienen origen en la
transmisión de estos agentes por el agua adquieren una especial connotación sanitaria
cuando las poblaciones ribereñas con inadecuado suministro del agua potable o
aquellas comunidades que a través de muchos años han carecido del recurso hídrico
necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.
En este sentido, los laboratorios de salud pública tienen la obligación de proteger las
comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnología y
la metodología que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen
los ciudadanos.
Cada laboratorio debe utilizar métodos y procedimientos apropiados para todas las
calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Los laboratorios deben de
realizar controles internos los cuales garantizan que van generar resultados altamente
confiables, mediante el seguimiento de procedimientos altamente calificados
116
Estos programas de control interno incluyen evaluación continua de los principales
materiales y objetos que se utilizan en los diferentes análisis, tales como, control de
los medios de cultivo a utilizar, personal, equipos, estandarización y documentación
de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del procedimiento y
asegurar que este se está efectuando en forma correcta cada vez que se ejecute, lo
cual se lograra con la realización de la validación de los métodos utilizados por el
laboratorio para sus respectivos análisis.
MÉTODOS Para la validación del método de filtración por membrana, se analizó
simultáneamente la detección de coliformes totales y fecales en medio Endo y m-FC.
El medio Endo se utiliza para la identificación de coliformes totales a 37°C durante
24 horas, usando filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 micras. Al pasar
la muestra de agua a través de este filtro mediante la aplicación de vacío las bacterias
las cuales son de mayor tamaño quedan retenidas en este. Los coliformes totales que
fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y
convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metálico. El medio m-FC se
utiliza para la determinación de Escherichia coli y coliformes fecales, a temperatura
de incubación de 44.5°C. Estos microorganismos crecen formando colonias de color
azul intenso brillantes y convexas.
Procedimiento del método de filtración por membrana
· Esterilizar el equipo de filtración por membrana de acuerdo a las especificaciones
del fabricante
· Colocar el portafiltros estéril sobre la base del manifold
· Colocar el embudo estéril sobre el receptáculo y fijarlo con las pinzas que trae el
equipo
117
· Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estéril
· Dejar filtrar aplicando vacío
· Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 – 30 mL de alcohol al 70%
· Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol
encendido durante 3 minutos
· Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar
· Adicionar nuevamente 100 ml de agua destilada estéril y dejar filtrar
· Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo
· Con pinzas estériles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la
cuadricula hacia arriba, sobre la parte porosa del receptáculo
· Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar
· Para aguas tratadas filtrar 100 ml de la muestra a analizar y para aguas turbias
realizar dilución 1/10 y filtrar
· Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del
manifold, retirar el embudo, tomar el filtro con pinzas estériles y colocarlo sobre
la superficie del medio Endo y m-FC
· Incubar las cajas a la temperatura adecuada, el medio Endo a 37°C +/- 2°C y el
medio m-FC: 44.5°C en baño maría
· Realizar el recuento de las colonias características:
Medio Endo: colonias rojas
Medio m-FC: colonias azules
MATERIALES Y METODOS
Filtros de membrana (poro de 0.45um)
Pinzas
Micro pipeta automática 100-1000 UL
118
Puntas azules estériles
Equipos
Incubadora a 35°C +/- 2°C
Baño de maría a 44.5°C
Espectrofotómetro RA-50
Vortex
Equipo de filtración por membrana
Medios de cultivo
Cajas de petri plásticas con medio Endo listo para su uso
Cajas de petri plásticas con medio m-FC listo para su uso
Agar plate Count
Agar OGY
Agar Mc Conkey
Agar Sangre
Cepas microbianas
Cepa de Escherichia coli con número de referencia ATCC 25922
Cepa de Staphylococcus aureus con número de referencia ATCC 25923
119
Material de vidrio
Tubos tapa rosca
Frascos grandes ámbar con alcohol al 70%
Frascos grandes ámbar con agua destilada estéril
Frascos Schott de 250 ml
Reactivos
Cloruro de bario
Acido sulfúrico
Preparación de suspensiones bacterianas:
Se utilizo agua destilada estéril para preparar las suspensiones de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, utilizadas en la validación para efectuar las diluciones
correspondientes y obtener la concentración bacteriana requerida.
Volumen de muestra:
Se utilizaron 100 mL de agua por cada suspensión de las bacterias utilizadas en
concentración conocida.
Volumen de trabajo diario:
Se utilizaron aproximadamente 3500 mL de agua destilada estéril, con las cuales se
realizaron diluciones y suspensiones.
Fuente:
Se utilizó agua de dos marcas de agua diferente, para ser analizadas por el método de
filtración por membrana.
120
Control de calidad:
Control de ambientes: Se realizo por el método de sedimentación durante 15
minutos, utilizando agar Plate Count para bacterias mesófilas aerobias y agar OGY
para hongos y levaduras. Las cajas con agar Plate count se incubaron a 37°C durante
48 horas y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 días.
Esterilidad de los medios de cultivo: Se escogió el 10% de los medios de cultivo
utilizados siendo estos preparados en el laboratorio y listos para el uso, incubándose a
las respectivas temperaturas (m-FC a 44.5°C, OGY a temperatura ambiente, los
demás a 37°C), verificando crecimiento.
Selectividad y eficacia de los medios de cultivo: Se realizaron suspensiones de
Escherichia coli y Staphylococcus aureus en 10 ml de agua destilada estéril, cada
suspensión se analizo por el método de filtración por membrana incubando en medio
Endo y m-FC cada suspensión, verificando que solo hubiera crecimiento de
Escherichia coli.
Control de equipos: Se reviso el historial de mantenimiento y calibración de los
equipos utilizados en la validación.
Cepas utilizadas: Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC
25923 obtenidas del cepario con que cuenta el Laboratorio de Salud Publica. A estas
cepas se les realizaron pruebas bioquímicas que incluyeron, oxidasa, coagulasa y
catalasa para Staphylococcus aureus y se monto API 20E para la identificación de
Escherichia coli, para verificar la pureza y viabilidad de las mismas.
121
VALIDACIÓN
Antes de llevar a cabo el proceso de validación se realizo la estandarización del tubo
0.5 del patrón de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de
obtener un dominio del método. Para los ensayos preliminares y la validación se
utilizo la cepa de Escherichia coli, la cual se mantenía en fase exponencial realizando
repiques diarios en agar Mc Conkey. De las colonias obtenidas se realizaron
suspensiones en tubos que contenían 10 ml de agua destilada estéril, equivalente a la
turbiedad del tubo 0.5 de Mcfarland correspondiente a 0.296 absorbencias, leído en
un espectrofotómetro a una longitud de onda de 620 nm, obteniéndose 130 millones
de bacterias/ml.
La cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseño experimental fue de
48 , distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando las
siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras
más adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El estudio se procesó
durante seis días, en donde cada lote era un día.
A partir de la suspensión preparada de Escherichia coli se realizaron diluciones en
base 100 y 10 en frascos Schott que contenían 99 y 90 ml de agua destilada estéril,
necesarias para preparar los estándares 0.09C (7 bacterias/ml) , 0.9C(72
bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/ml).
Para la preparación de estas soluciones se utilizo el siguiente procedimiento:
El límite superior de detección ( C ) para el método de filtración por membrana es de
80 UFC/100mL, teniendo estándares de 0.09C (7 bacterias/mL) , 0.9C(72
bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/mL).
A partir de la suspensión de 130 millones de bacterias en 40 mL de agua destilada
estéril, para obtener el estándar de 72 bacterias/mL y 7 bacterias/mL, se utilizo la
fórmula V1 X C1 = V2 X C2 en donde:
122
V1= 10 ml
C1= 130.000.000 bacterias/ml
V2= ?
C2= 72.000.000 bacterias/ml
Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denominó volumen
final.
V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 18.1 mL
72.000.000 bac/ml
El volumen final para la concentración de 72 millones bacterias/ml fue de 18.1 ml,
como ya se tenían 10 ml del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10
ml iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estéril, para completar el
volumen final de 18.1 ml
Se agrego a un frasco Schott estéril 8.1 ml de agua destilada estéril y 10 ml de la
suspensión de E. coli, para obtener las 72 millones de bacterias/ml. A partir de esta
suspensión se realizaron diluciones en escala 100 hasta obtener 72 bacterias/ml y una
dilución en base 10 a partir de la concentración de 72 bacterias/ml para obtener una
concentración de 7 bacterias/mL aproximadamente. De la concentración de 72 y 7
bacterias/mL se tomaron 4 mL de cada una adicionando un mililitro de cada una a
frascos que contenían 99 mL de agua destilada estéril para completar un volumen
final de 100 y ser analizado por el equipo de filtración por membrana,. Se sembraron
dos replicas en medio endo y dos replicas en medio m-FC incubando a las
temperaturas adecuadas
Se realizo análisis estadístico de los resultados obtenidos mediante un programa
elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). La precisión del método fue evaluada
con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada solución, las cuales
debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5% de la
123
concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor mínimo de interés que en este
caso fue 8.
La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de
E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobándose que el promedio
de la recuperación no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperación
esperada.
RESULTADOS
Los resultados de la validación se muestran en las tablas siguientes tablas:
Tabla 1. Recuento de coliformes totales en medio Endo.
Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
Tabla 3. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para
coliformes totales
Tabla 4. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para
coliformes fecales
Tabla 5. Recuperación M1 + A1, coliformes totales
Tabla 6. Recuperación M1 + A1, coliformes fecales
Tabla 7. Recuperación M2 + A2, coliformes totales
Tabla 8. Recuperación M2 + A2, coliformes fecales
DISCUSION
Los 48 resultados obtenidos se sometieron a tratamiento estadístico, mediante la
utilización del programa estadístico validar 1.1(Figura 1). Tanto para coliformes
totales como para coliformes fecales, se obtuvo media, desviación estándar total
124
dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad
interna del laboratorio respectivamente y recuperación alcanzada. (Tablas 1-8).
Se observo que los blancos fueron los únicos que presentaron reproducibilidad y
repetibilidad, reproducibilidad porque está en función de seis lotes y repetibilidad
porque fue el único que se analizo por duplicado. En las demás soluciones solamente
existe reproducibilidad.
Se evaluó la desviación estándar total tanto para coliformes totales como para
coliformes fecales, en donde la desviación estándar se comparó con W (meta a
alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentración de la gran media ó como 0.25
veces el valor mínimo de interés del método. Para que la desviación estándar fuera
aceptada esta debía de ser menor que W. En los datos obtenidos tanto para coliformes
totales como para coliformes fecales, se observo que estas desviaciones fueron
aceptadas (Tablas 3-4), por lo cual se infiere que el método cumple con el primer
parámetro evaluado la precisión.
Para la recuperación satisfactoria se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% ,
con un margen de error del 5%. La recuperación satisfactoria se aceptada si los
resultados obtenidos estaban dentro de esta meta. En los datos obtenidos se observo
que la recuperación de M1 + A1 y M2 + A2 para coliformes totales como para
coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 5-8), por lo tanto se cumplió con el
segundo parámetro de la validación, la exactitud.
Finalmente, los análisis realizados demostraron que se cumplió con los parámetros
evaluados de precisión y exactitud, gracias a los resultados obtenidos evaluando la
detección simultanea de los microorganismos indicadores de contaminación presentes
en muestras de aguas.
125
CONCLUSIONES
· La validación del método de filtración por membrana para el análisis de
coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permitió
obtener resultados reproducibles y confiables.
· Se determinó la precisión del método mediante la aceptabilidad de las
desviaciones estándares de cada solución analizada cumpliéndose con el requisito de
la meta a alcanzada.
· Se determino la exactitud del método, en donde la recuperación de las
muestras adicionadas fue satisfactoria.
· Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre
0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotómetro a 620 nm.
· Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el análisis de coliformes
totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el
crecimiento del microorganismo de interés y completamente estériles ya que no se
evidencio crecimiento de ningún tipo de microorganismo.
· Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfección, ya que se
evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.
· El mantenimiento y calibración de los equipos garantizaron que las
mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.
· El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),
facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el
proceso de validación.
126
RECOMENDACIONES
· Se deberá tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibración
de equipos, con el fin de asegurar que se están utilizando equipos completamente
calibrados.
· Además de realizar validación secundaria, se deberá complementar con otras
pruebas, como el cálculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una
mayor confiabilidad en los resultados emitidos.
· Este método se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la
veracidad de los resultados.
· Una vez determinados estos dos parámetros de la validación (Precisión y
exactitud), se deberá complementar con la determinación del Límite de detección
para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del
cliente.
REFERENCIAS
1. Cortes, Alejandra. 2002. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas
virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Carrera Microbiología. Facultad
Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.
Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 93 páginas.
2. Cortes, Natalia. Méndez, Y. Junio, 2006. Validación de las pruebas de
esterilidad por la técnica de filtración por membrana y endotoxinas bacterianas por el
método de LAL en 3 productos farmacéuticos. Carrera Microbiología. Facultad
127
Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.
Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.
3. Galeano, Norma. 2007. Validación de la retención microbiana en los filtros de
acetato y nitrato de celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana para
la prueba de esterilidad. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas.
Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado.
Bogotá D.C.182 paginas.
4. NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de
laboratorios de ensayo y calibración.
5. Otálora Andrés. Ortiz, J. Peñaranda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C.
Peralta, A. Tovar, G. Junio, 2005. Séptimo curso – taller VALIDACIÓN DE
MÉTODOS ANALÍTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia
de la calidad del agua potable, metales y no metales de interés en Salud Publica.
Bogotá, D.C.
6. Padilla, José Esteban. 2007. Validación secundaria del método de recuento en
placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de
alimentos en un laboratorio de referencia. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias.
Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de
Pregrado. Bogotá D.C. 109 paginas.
7. Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. López, L. Peñaranda, S. Raad, J.
1999. Análisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe
de Bogotá, D.C.
128
ANEXOS
Tabla 1. Recuento coliformes totales en medio Endo
TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES Constantes U C V V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
Solución LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0 3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77 4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8 5-M1 0 0 0 0 0 0 6-M2 0 0 0 0 0 0 7-M1+A1 34 31 36 33 35 32 8-M2+A2 60 57 55 52 56 58
Constantes U C v V
M2 0,00 5600 1 99
Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.
TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES Constantes U C V V LMS
M1 0,00 3200 1 99 80
Solución LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6
1-BK1 0 0 0 0 0 0
2-BK2 0 0 0 0 0 0
3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75 4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4 5-M1 0 0 0 0 0 0
6-M2 0 0 0 0 0 0
7-M1+A1 32 33 37 34 36 35 8-M2+A2 57 58 59 55 58 56
Constantes U C V V
M2 0,00 5600 1 99
129
a) b) c)
d) e) f)
g)
Figura 1. Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. a) Recuento de blancos. b)
Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar 0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C.
e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento de M1 y M2.
130
Tabla 3. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes totales Valor mínimo de interés para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325 St2 = Se2 + Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667
St = Desviación estándar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325
Concentración (GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333 W (meta a alcanzar)
0.05 X GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167
0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7583 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8167 St < W ? SI SI SI SI SI SI SI
Tabla 4. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes fecales Valor mínimo de ínteres para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 St2 = Se2 + Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667 St (Desviacion estándar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 Concentración (GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667 W (meta a alcanzar)
0.05 X GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583
0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000
W 2,0000 3,7500 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8583 St < W ? SI SI SI SI SI SI SI
131
Tabla 5. Recuperación M1 + A1, coliformes totales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A1.
S 1,8708 1,5352
t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01 2,01 1,5352
R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
Recuperación satisfactoria 35,14 .=A (ii)
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
S
6201´ .
1056
201, ,´ + ´dS 0 95
62 01, ,´ - ´d
S
132
Tabla 6. Recuperación M1 + A1, coliformes fecales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A1.
S 1,870
8
1,535
2
t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bilateral
2,01 2,01
1,5352
R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078
R/d>=0.95
?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4
SI NO
1,05Xd 33,6
Recuperación satisfactoria 35,14 .=A (ii)
28,86 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
S
6201´ .
1056
201, ,´ + ´dS 0 95
62 01, ,´ - ´d
S
133
Tabla 7. Recuperación M2 + A2, coliformes totales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A2.
S 2,7325 2,2422 t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01
R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
Recuperación satisfactoria 61,04 .=A (ii)
50,96 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica
con y = 5 tabla t bílateral 2,01
d R= 56,33 d= 56,00
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd
SI NO
1,05Xd
Recuperación satisfactoria
134
Tabla 8. Recuperación M2 + A2, coliformes fecales
EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A2.
S 1,4720
1,2079
t0.95=2.015
con y = 5 tabla t bílateral 2,01
R/d R= 57,17 d= 56,00 1,021
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2
SI NO
1,05Xd 58,8
Recuperación satisfactoria 60,01 .=A (ii)
51,99 .=B (i)
R<=A? R>=B?
NO SI SI NO
Recuperación satisfactoria
Recuperación no satisfactoria
Revisar metodologia y técnica analítica
5 con y = 5 tabla t bílateral 2,01
d R= 57,17 d= 56,00
R/d>=0.95?
SI NO
R/d<=1,05? 0,95Xd
SI NO
1,05Xd
cuperación satisfactoria