COLUMNAS CAPILARES COLUMNAS CAPILARES EN CROMATOGRAFÍA EN CROMATOGRAFÍA

DE GASESDE GASES

Willy Knedel

Cromatografía de Gases Cromatografía de Gases Empleando Columnas CapilaresEmpleando Columnas Capilares

• Existen suficientes diferencias entre el desempeño y la instrumentación relacionadas con las columnas capilares que ameritan que lo que mejor se conoce como CROMATOGRAFÍA DE GASES DE ALTA RESOLUCIÓN reciba un capítulo dedicado

Cromatografía de Gases Cromatografía de Gases Empleando Columnas CapilaresEmpleando Columnas Capilares

• Se requiere un instrumento que pueda manejar columnas capilares

• Se deben considerar otros aspectos, como lo son la forma de inyectar las muestras logrando optimizar la separación

Cromatografía de Gases Cromatografía de Gases Empleando Columnas CapilaresEmpleando Columnas Capilares

•Pero, OJO, también hay formas interesantes de modificar cromatógrafos de columna empacada para manejar las columnas megaboro, un buen paso hacia el trabajo con capilares

Columnas Capilares vrs. EmpacadasColumnas Capilares vrs. Empacadas

Longitud (m) 0.5 – 5 5 – 100 DI (mm) 2 - 4 0.1 – 0.53 Flujo (ml/min) 10 - 60 0.5 – 15 Presión cabeza de columna psig 10 - 40 3 – 40 Número de platos 4000 250,000 Capacidad 10 µg/pico 100 ng/pico Espesor de película µm 1 - 10 0.1 - 8

Columnas CapilaresColumnas Capilares

• Diámetro interno mucho menor

• Longitud significativamente mayor

• Carecen de material de empaque• Tienen menor capacidad de carga

Esto permite que los componentes residan mayor tiempo en la columna, lográndose

picos de buena forma y muy definidos

Mayor sensibilidadMayor sensibilidadAl ser los picos más estrechos, la sensibilidad mejora

Empacada

Capilar

Ambos picos tienen un área de 5000 unidades arbitrarias

Pero como el pico en la capilar tiene mayor altura, lo que se obtiene es una mayor relación señal/ruido

ColumnasColumnasDisponibles en dos presentaciones

• Recubiertas Sílice fundida con un revestimiento de fase

• Enlazadas Fase química enlazada mediante uniones silano

Ambos tipo se hallan recubiertas por fuera con una capa de poliimida para conferirles mayor flexibilidad y otras

ventajas

Factores que afectan la Factores que afectan la separaciónseparación

Longitud de la columnaDíametro interno de la columna

Espesor de la película de fase estacionaria

Tipo de gas acarreadorVelocidad del gas acarreadorTemperatura de la columna

Gas acarreadorGas acarreador• Nitrógeno Logra la menor altura

equivalente a un plato teórico, a costa de la velocidad

• Helio Mayor velocidad que el nitrógeno con pequeño incremento en la AEPT

• Hidrógeno El mejor

Flujo vs. tipo de gas acarreadorFlujo vs. tipo de gas acarreador

hidrógenohelionitrógeno

Todos determinados con la misma columna y muestra

flujo

Nú

mer

o d

e p

lato

s

Resolución por efecto del gas acarreadorResolución por efecto del gas acarreador

nitrógeno helio hidrógeno

Temperatura de la columnaTemperatura de la columna

Presenta un efecto muy fuerte sobre el análisis

La temperatura de la columna se emplea para controlar la retención de la columna

Un incremento en la temperatura reduce los tiempos de retención, mas no todos los analitos son afectados con la misma intensidad

Efecto de la temperaturaEfecto de la temperatura

Al aumentar T, se reduce k para cada analito

La intensidad de este efecto no es el mismo para todos los analitos

La resolución puede mejorar o empeorar para un par crítico, e incluso el orden de elución se puede invertir

Temperatura del horno

Tie

mp

o d

e re

ten

ción

Dimensiones de la columnaDimensiones de la columna

Espesor de la fase estacionaria

Díametro interno de la columna

Longitud de la columna

El espesor de la película y el diámetro interno son los que mayor impacto

causan

Espesor de película de fase Espesor de película de fase estacionaria y diámetro internoestacionaria y diámetro interno

( ) en fase líquida( ) en fase gaseosa

Constante de distribución KD =

Constante de distribución KD = k β

k = factor de retención

β = relación de fases

Espesor de película de fase Espesor de película de fase estacionaria y diámetro internoestacionaria y diámetro interno

k = masa del soluto en la fase líquidamasa del soluto en el gas acarreador

β =

volumen del gas acarreador en la columnavolumen de fase estacionaria en la columna

Espesor de película de fase Espesor de película de fase estacionaria y diámetro internoestacionaria y diámetro interno

β = r

df =r = diámetro interior de columna

espesor de la película

2df

β =

retención

tiempo de análisis

resolución

Regla Número 1

df resolución

df= espesor de película

Regla Número 2

DI resolución

= diámetro internoDI

Regla Número 3

df capacidad

df= espesor de película

Regla Número 4

df

analitos poco volátiles

Regla Número 5

df

analitos volátiles

Longitud de la columnaLongitud de la columna

• Representa el efecto menos significativo

• La resolución es proporcional a la raíz cuadrada de la longitud

• Si una columna de 10 metros da una resolución moderada, se necesita casi una columna de 50 metros para mejorar significativamente la resolución

Longitud de la columnaLongitud de la columna

Longitud de columna vs. resoluciónLongitud de columna vs. resoluciónDI: 0.25mm

Espesor de película: 0.1 µm

Corrida isotérmica

Consideraciones instrumentalesConsideraciones instrumentales

Al trabajar con columnas capilares, los sistemas de inyección y de detección deben de ser modificados

• los flujos y las masas de analitos son menores

• los picos son significativamente más angostos

Consideraciones instrumentalesConsideraciones instrumentales

• Detectores - deben de ser rediseñados para minimizar los volúmenes muertos

• Inyectores - deben ser modificados para manejar la menor capacidad de la columna o bien para acoplarse a métodos alternos de inyeccion

Métodos de inyecciónMétodos de inyección

• Las columnas capilares tienen mucho menor capacidad de muestra en contraste con las empacadas (1/100 hasta 1/1000)

• Se puede reducir la cantidad de muestra (inyección con división de flujo) o bien reducir la cantidad de solvente que entra a la columna (inyección según Grob)

Sistema de inyeccióna - columna

b - inserto

c - septum

d - manómetro presión cabeza columna

e - vávlula de purga

f - flujo total

g - flujo de septum

h- flujo dividido

Inyección con división de flujoInyección con división de flujo

• Como resulta impráctico tratar de medir con suficiente precisión cantidades menores de 1 µl, lo que se hace es dividir la muestra después de la inyección, reduciendo así la masa total analito/solvente que entra efectivamente a la columna

Inyección con división de flujoInyección con división de flujo

• Después de su volatilización, durante la cual se mezcla con el gas acarreador, la mayor parte del flujo se elimina por la salida exterior del divisor - es sóla un fracción de la muestra la que entra efectivamente en la columna

Inyección con divisor

Con división de flujo

Flujo en columna

Relación de división 50:1

Cálculo de la relación Cálculo de la relación de divisiónde división

Relación de división= flujo salida divisor + flujo de columna

flujo de columna

El flujo a la salida del divisor es fácil de medir con un burbujómetro

Medir el flujo de la columna resulta un tanto más complejo

Medición del flujo de la columnaMedición del flujo de la columnaColoque el cromatógrafo a la temperatura isotérmica deseadaInyecte butano de un encendedor común y determine su tiempo de retención

Calcule el volumen de la columna según la siguiente ecuación:

V = x (radio columna)2 x longitud

Medición del flujo de la columnaMedición del flujo de la columnaEjemplo

Para una columna de 30 m x 0.2 mm DI, el tiempo de retención para el butano fue de 1.45 minutos

flujo

Inyección con división de flujoInyección con división de flujo

• Lo fundamental es asegurar una vaporización total y una mezcla óptima con el gas acarreador en el interior del inserto, antes de la división

• se requiere buena transferencia de calor

• buena mezcla entre gas y muestra

• se puede utilizar la superficie para atrapar componentes no volátiles

Insertos

El inserto depende del método de inyección

Debe de reemplazarse regularmente

Es donde se condensa la suciedadCon

divisiónSin división

Autoinyector

Sobrecarga del insertoSi el volumen expandido térmicamente de la muestra es mayor que el volumen del inserto, se obtienen resultados erráticos

Agua 1277:1 Acetatode Etilo

235:1

MeOH 567:1 Pentano 197:1

MeCl2 360:1 Hexano 176:1

MeCl3 286:1 Isooctano 139:1

Sobrecarga del insertoComo regla general: Mantenga el volumen expandido por debajo de 500 µL

Expansión de solventes comunes a 250ºC y 13 psig

Inyección sin división de flujoInyección sin división de flujo• La inyección con división de flujo se

emplea cuando se tienen concentraciones altas de los analitos

• Para el análisis de trazas se debe usar uno de los dos procedimientos

Sin división: toda la muestra entra a la columna

Sin división/con división, conocida como técnica según Grob

Inyección sin división de flujoInyección sin división de flujo

• Se puede catalogar como estrategia de fuerza bruta

• Toda la muestra se introduce en la columna

• Esto es malo para la columna y rinde resultados muy pobres

• La gran cantidad de solvente satura la fase estacionaria y la fase móvil

Sin división/Con divisiónSin división/Con división

• Se inyecta la muestra cerrando la división de flujo

• Se abre la válvula del divisor de flujo después de un lapso de tiempo

• El objetivo es introducir la mayor cantidad posible de analitos en la columna, eliminando la mayor cantidad posible de solvente al ambiente

Sin división/Con división

Paso 1: Divisor de flujo cerrado

Con el divisor cerrado, todo el flujo a través del inyector pasa hacia la columna

La presión a la cabeza de la columna se mantiene haciendo pasar el flujo normal hacia el exterior

Paso 2: Divisor de flujo abierto

Después de un tiempo establecido fijo, se abre el divisor de flujo

Cualquier componente residente en el inyector es empujado hacia el exterior

Cómo funciona ?• El solvente debe de ser más volátil

que los analitos de interés

• La temperatura inicial de la columna debe de ser 5 a 10 ºC menor que el punto de ebullición del solvente

• La temperatura del inyector debe ser suficiente para volatilizar todos los analitos de interés

Bajo las condiciones antes descritas, sólamente un pequeña fracción del solvente entra a la columna.Allí actúa como trampa para los analitos, ayudando a “enfocarlos”, es decir a lograr bandas estrechas de aplicación que se traducen en picos estrechos

Enfocando

Existen tres procedimientos para enfocar:

• Enfoque con solvente: los analitos se disuelven en el solvente condensado

• Enfoque con fase estacionaria: los analitos se disuelven en la fase estacionaria

• Enfoque por temperatura: los analitos se condensan al inicio de la columna por la baja temperatura

Enfoque con solvente

Solvente y analitos entran a la columna

El solvente satura el inico de la columna dando un lugar para que se disuelvan los analitos

Se abre el divisor, no entra más solvente , el solvente se evapora al incrementarse la temperatura de la columnaLos analitos quedan concentrados en una banda angosta al incio de la columna

Solvente Punto deebullición

Temperaturainicial

Dietiléter 35 30Diclorometano 36 30Disulfuro deCarbono

46 40

Hexano 69 60Octano 125 120

Temperatura inicial de columna

ºC

Tiempo de purga (divisor abierto)

• Dejar suficiente tiempo para que los analitos de interés entren a la columna

• Si el tiempo es excesivo, entra demasiado solvente a la columna y el enfoque de bandas angostas se pierde

• El tiempo óptimo se logra mediante una serie de inyecciones, haciendo variar el tiempo de purga

Tiempo de purga

El tiempo óptimo, es cuando todos los analitos de interés presentan una respuesta máxima

Esto se logra típicamente entre 30 a 60 segundos

Tiempo de purga (seg)

Áre

a d

e p

ico