Fundamentos del PRP y su aplicación en Reumatología

Fundamentos del PRP y su Aplicación en Reumatología

Lucía Gato Calvo

Jornada Cátedra BioIbérica de Ingeniería Tisular y Terapia Celular 18 de noviembre de 2015

¿Qué es el PRP?

Plasma Rico en Plaquetas

Volumen de plasma con un recuento plaquetario superior al de la sangre periférica (150.000 – 350.000/µL)

Plaquetas o Trombocitos

Megacariocito y plaquetas Fuente: ASH Image Bank

Diámetro: 2 – 3 µm Vida media: 7 – 12 días

Funciones:

Coagulación y hemostasia Vasoconstricción Inflamación

Inmunidad Angiogénesis Regeneración tisular

Plaquetas en a, c) reposo y b, d) activadas Fuente: Bettache et al.2003; J Cell Sci 116(Pt 11):2277-84 y Hughes et al.Blood.2000; 96(1):188-194

Plaqueta

Eritrocito Pared dañada del vaso

Plaqueta activada

Coágulo Fibrina

Formación de un trombo para taponar un vaso sanguíneo dañado Fuente: www.merckmanuals.com

Granúlos alfa (α), densos (δ, flechas), lisosomas (ly) y gránulos T con TLR9 y PDI (derecha) Fuente: Heijnen et al. J Thromb Haemost. 2015; 13:1-11 y Thon et al. J Cell Biol. 2012; 198(4):561-74

Gránulo Contenido Funciones

α

Proteínas adhesivas Fibrinógeno, vWF, trombospondina, fibronectina, vitronectina, TSP-1, laminina 8, SCUBE1

Hemostasia primaria y secundaria, coagulación, reparación de la herida, inflamación, angiogénesis, defensa inmunitaria

Proteínas plasmáticas Albúmina, IgG

Factores de crecimiento VEGF, PDGF, bFGF, TGF-β1, TGF-β2, EGF, HGF, IGF, angiopoyetina, CXCL12, MMP-1, MMP-2, MMP-9, heparanasa, SDF-1, fosfato de esfingosina, PF-4, TSP-1, angiostatina, endostatina, TIMP-1, TIMP-4, BMP-2, BMP-4, BMP-6, CTGF

Quimioquinas proinflamatorias

GRO-α, CXCL4, CXCL5, CXCL7, IL-8, SDF-1α, CCL2, MIP-1α, RANTES

Factores y cofactores de coagulación

Factor V/Va, factor XI, factor XIII, protrombina, quininógeno de alto peso molecular, multimerina

Factores fibrinolíticos Plasmina, plasminógeno

Factores antifibrinolíticos α₂-macroglobulina, α₂-antiplasmina, PAI-1, u-PA

Inhibidores de coagulación

Antitrombina, inhibidor C1, TFPI, proteína S, proteasa nexina-2

Proteínas inmunitarias Precursores de los complementos C3 y C4, inhibidor de C1, factor H, trombocidinas

Proteínas de membrana Glicoproteína IIb/IIIa, GPVI, receptores Fc, PECAM, GPIb-IX-V, CD9, P-selectina, fibrocistina L, CD109

δ ADP, ATP, serotonina, histamina, Ca²⁺, tromboxano A₂, pirofosfato, polifosfato, 5-hidroxitriptamina, proteínas de membrana CD63, LAMP1/2, P-selectina, GPIb, integrina αII-β3, rab27a, rab27b

Hemostasia primaria

Lisosoma

Catepsinas, hexosaminidasa, β-galactosidasa, arilsulfatasa, β-glucuronidasa, fosfatasa ácida, CD63, LAMP1/2

Digestión celular, fibrinólisis, degradación de matriz, remodelación de vasculatura

T TLR9, PDI, VAMP-8 Defensa inmunitaria.

Un poco de Historia 1

99

7

Primera descripción de un concentrado de plaquetas como agente terapéutico

19

98

Definición de “plasma rico en plaquetas”

PRP: preparación

SISTEMA

Manual Automático

Abierto Cerrado

CIRCUITO

trombina

Mecánica Química Endógena

ACTIVACIÓN

rápida masiva

lenta progresiva

congelación

descongelación

1 2

SIMPLE

DOBLE

FILTRADO SELECTIVO

Recoger plasma

Pellet de plaquetas

METODOLOGÍA

PRP: composición le

uco

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Factor Actividades

PDGF Activación de macrófagos y angiogénesis Quimiotaxis y proliferación de fibroblastos ↑Síntesis de colágeno de tipo I Proliferación de células mesenquimales

TGF-β Proliferación de fibroblastos Quimiotaxis, proliferación y diferenciación de MSCs ↑Síntesis de colágeno tipo I y fibronectina Deposición de matriz ósea ↓Osteoclastogénesis y resorción ósea

bFGF Proliferación celular Angiogénesis

IGF-1 Quimiotaxis de fibroblastos ↑Síntesis proteica Proliferación y diferenciación de osteoblastos y MSCs

IGF-2 Proliferación celular en la etapa fetal Foliculogénesis Neurogénesis

VEGF Angiogénesis Migración y proliferación de células endoteliales Vasculogénesis Quimiotaxis de macrófagos y granulocitos Vasodilatación mediada por NO

TSP-1 ↓Angiogénesis

Factor Actividades

EGF Proliferación celular Quimiotaxis y diferenciación de células epiteliales

KGF Proliferación de keratinocitos

CTGF Proliferación y diferenciación de condrocitos Adhesión celular Angiogénesis

PF-4 ↓Angiogénesis ↓Proliferación endotelial Quimiotaxis de neutrófilos y fibroblastos Actividad anti-heparina

HGF Angiogénesis Proliferación, motilidad y morfogénesis celular

Ocn Regulación metabólica Formación de hueso

On Formación de hueso Angiogénesis Proliferación y migración celular

BMP-2, -4 y -6

Osteogénesis y osificación endocondral

PDAF Vasculogénesis

PDEGF Proliferación de keratinocitos y fibroblastos dérmicos

ESTANDARIZACIÓN

Legislación aplicable al PRP

Directiva 2002/98/CE Reglamento 2007/1394/CE

Directiva 2001/83/CE

Garantías mínimas para el uso del plasma autólogo y sus fracciones

Calidad de producción Sistema abierto: certificación de instalaciones, producción y control de calidad adecuados Sistema cerrado: seguir las instrucciones del kit comercial, que deberá disponer de marcado CE para cada uso

Eficacia Necesidad de ensayos clínicos para establecer niveles de evidencia adecuados en cada patología y tipo de PRP Listado en colaboración con expertos de: - Aplicaciones con evidencias suficientes para recomendar el tratamiento con uno o varios tipos de PRP - Aplicaciones con beneficio/riesgo negativo en las que se recomienda no uso - Aplicaciones en las que se necesitan mayores evidencias para aceptar el uso

Trazabilidad Objetivo: aun siendo autólogo, impedir la transmisión de enfermedades infecciosas (analíticas y requisitos del RD 1088/2005)

Farmacovigilancia Comunicación a los Centros de Farmacovigilancia de cada Comunidad Autónoma de las sospechas de reacciones adversas

Información Información mínima al paciente sobre calidad, eficacia, ventajas sobre otras terapias, riesgos conocidos y posibles reacciones adversas

INFORME/V1/23052013

Ley 29/2006

Medicamento de uso humano. Producción industrial no aplicable. No terapia avanzada. Elaboración para pacientes concretos.

Aplicaciones del PRP

ARTROSIS: dosis óptima de plaquetas sin definir → Estandarización del medicamento

Estudios in vitro Ensayos preclínicos Ensayos clínicos

Implantología Pie

diabético Ojo seco Esclerosis múltiple

Artritis reumatoide

Quemaduras

Otros: Cirugía oral y maxilofacial

Tendón Músculo Cartílago

Hueso Alopecia androgénica

Cosmética Cirugía vascular

Nuestra visión

OBJETIVO:

Definir la dosis óptima de plaquetas a aplicar en artrosis y en defectos focales de cartílago.

Nuestro PRP:

Sin leucocitos

Activación con CaCl₂

Sin trombina bovina

Hipótesis: 1. Geles de PRP con MSCs para reparar lesiones focales.

2. PRP líquido como agente anti-inflamatorio y condrogénico para frenar y/o revertir la degeneración en artrosis.

rpm t (min)

800 8

1000 8

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1500 rpm_8' 1600 rpm_7'

1700 rpm_5' 1800 rpm_5'

Nuestros estudios: Protocolo de centrifugación

• 1700 rpm, 5 min • 1800 rpm, 5 min

• 1500 rpm, 8 min • 1600 rpm, 7 min

Selección inicial:

* Se aumentó n para alcanzar resultados con valor estadístico.

1600 rpm_7’ aporta enriquecimientos significativamente inferiores a las demás condiciones de centrifugación, que son equivalentes entre sí.

Selección final: 1700 rpm, 5 minutos

t=5

t=6

t=7t=8

0

0,5

1

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rpm

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Nuestros estudios: Geles de PRP con MSCs

Células viables

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24h 7d 14d 21d 30d

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14 días 21 días 30 días

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H-E MM

SO-FG

COLII

AA

AT

SO

COLI 20x

Geles estables

Nuestros estudios: Estado actual y planes futuros

Condrocitos

Cartílago reparado

MSCs

Efecto anti-inflamatorio Efecto condrogénico

Defecto focal

Explante Modelo de reparación

in vitro

Gel de PRP con MSCs PRP líquido

UNIDAD CIBER-BBN:

Dr. Francisco J. Blanco Dra. Elena F. Burguera

Grupo de Reumatología

INIBIC – Hospital Universitario de A Coruña

Universidade de A Coruña

Cristina Ruiz Romero

Ángela Vela

Tamara Hermida

Joana Magalhães

Noemi Gómez

Cristina Álvarez

Cristina Rodríguez

Colaboradores:

GRUPO DE HEMATOLOGÍA:

Esther Lourés Fraga

José Luis Núñez Amboage

PLATAFORMA DE HISTOMORFOLOGÍA:

Purificación Filgueira

Noa Goyanes


¡Gracias!


Health & Medicine

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