TEMA: IDENTIFICACION DE

SalmonellaS

AUTORA

CAROLINA VILLAVICENCIO

Características Culturales: requerimientos nutricionales

ideales

Glucosa-positivo Catalasa - positivo Oxidasas - negativo Lactosa-negativas Sacarosa-negativas Ureasa-negativas Indol-negativas,

H2S-positivas Lisinodescarboxilasa -

positivas Citrato y TSI Xilosa - negativa

El género Salmonella, familia Enterobacteriaceae, bacilos Gram negativos anaerobios facultativos.

Actuales Técnicas de Diagnóstico para la

identificación de salmonellas El aislamiento y la identificación de Salmonella se realizan mediante métodos de cultivo tradicionales: Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo; Enriquecimiento en medios líquidos selectivos; Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos; Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas;

Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37ºC y deben examinarse a las 24 horas. La utilización de sustratos bioquímicos es la base para la identificación del Género

Salmonella. Según el método bacteriológico de cada laboratorio las colonias pueden ser inicialmente

seleccionadas por algunas pruebas bioquímicas antes de proceder a su biotipificación completa.

La confirmación de estas colonias requiere tiempo y la mayoría de ellas no son Salmonella, sino otros géneros relacionados, tales como Proteus o Citrobacter.

Métodos rápidos (normalmente tras preenriquecimiento y enriq.) ISO-GRID Detección con sondas DNA ELISA, inmunofluorescencia Impedancia

Preenriquecimiento: Agua peptonada Incubar a 35º C durante 24 h.

Peptona, nutrientes necesarios Cloruro de sodio, el equilibrio osmótico. verde de malaquita y el cloruro de magnesio, favorecen el

crecimiento de Samonella. El fosfato de potasio controla el pH del medio.

Enriquecimiento: Caldo Rapapport Vassiliadis

Incubar 24 h a 42 º C. Las peptonas proporcionan los nutrientes necesarios para el

desarrollo del microorganismo. El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmótico. El verde de malaquita y el cloruro de magnesio, favorecen el

crecimiento de Samonella. El fosfato de potasio controla el pH del medio.

Aislamiento O Detección en Agares Selectivos : Agar XLD

Incubar 24 h a 37. Desoxicolato de sodio, inhibe a los MO Gram

positivos. Xilosa es fermentada por casi todos los

microorganismos entéricos a excepción de Shigella. La lactosa y la sacarosa inducen la producción de

ácido por los coliformes. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico de amonio,

sistema indicador de la formación de S2H produciendo un precipitado negro en el centro de las colonias.

El género Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la producción de ácido sulfhídrico.

E.M.B. Agar

Aislamiento selectivo de bacilos Gram-negativos.

pH 7.2 Diferenciación de organismos capaces de

utilizar la lactosa y/osacarosa, Indicadores eosina y azul de metileno,

ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram-positivas.

peptona aportan los nutrientes Lactosa, hidrato de carbono fermentable, Por

fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia

Salmonella Shigella Agar

Aislamiento de Salmonella spp. Y de algunas especies de Shigella spp.

Sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Grampositivas, de la mayoría de coliformes y Proteus spp.

Diferencial , fermentación de lactosa, y a la formacióndeácidosulfhídricoapartirdeltiosulfatodesodio.

Identificación bioquímica:

2 colonias típicas sospechosas, bien aisladas de cada placa. Transferir con un asa cada colonia seleccionada a la siguiente serie de tubos.

Agar TSI: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.

Agar LIA: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.

Agar Citrato de Simmons: Sembrar por picadura el fondo y por estría el la superficie.

Caldo urea: Inocular el caldo.

Incubar a 35o C por 24 h.

Identificación bioquímica:Agar triple azúcar de hierro

TSI Diferenciación de Enterobacterias,

capacidad para utilizar la glucosa, lactosa y sacarosa

Formación de sulfuros. La fermentación de la lactosa y sacarosa

se observa en la superficie y de la glucosa en el fondo, con formación de ácido que se manifiesta por cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo.

La combinación del citrato férrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la detección de sulfuro de hidrogeno por la formación de un precipitado negro.

Identificación bioquímica:Agar lisina descarboxilasa LIA

La peptona de gelatina, soporte de crecimiento. Extracto de levadura, la fuente de vitaminas necesarias. Dextrosa, el carbohidrato fermentable. Se observa la fermentación de glucosa, producción de ácido

sulfhídrico, la descarboxilación u desaminación de la lisina. Los MO tienen enzima descarboxilasa, descarboxilan el

aminoácido lisina a cadaverina (amina primaria, liberando CO2) , debido a la alcalinidad, el pH se modifica con los siguientes resultados:

POSITIVA si la coloración en el fondo se observa morada o violeta-púrpura.

NEGATIVA si la coloración en el fondo es amarilla y la superficie permanece del color del medio, ya que solo hay fermentación de glucosa.

La desaminación de la lisina a ácido cetocarbónico, este forma compuestos pardo-rojizos en el pico de flauta del medio con la sal de hierro y por la acción del oxigeno.

La formación del ácido sulfhídrico da una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido.

Agar Citrato de Simmons

identificación de Enterobacterias, basándose en el citrato como única fuente de carbono.

El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del medio.

Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia de color inicial verde (neutro), que esta dado por la presencia de azul de bromotimol a color azul (alcalino, prueba positiva)

La reacción negativa , ausencia de crecimiento y no hay cambio de color.

Identificación bioquímica:Caldo urea

Urea como fuente de carbono. La enzima ureasa hidroliza la urea en

amoniaco y anhídrido carbónico, ante la variación del pH por la alcalinización el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.

Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea.

Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.

Actuales Técnicas de Diagnóstico

y Nuevo Sistema con PCR… Método serológico rápido utilizando sangre total y un antígeno coloreado en una prueba

rápida de aglutinación en placa, aunque las infecciones identificadas mediante este método deben ser confirmadas mediante una técnica bacteriológica clásica.

También existen métodos de aglutinación, tales como las técnicas de ELISA, principalmente usada para detectar a S. Enteritidis.

La ventaja de los exámenes serológicos es que se detecta la persistencia de los anticuerpos IgG circulantes, aunque el principal inconveniente es que las concentraciones séricas de IgG pueden ser bajas al principio de la infección y por ende indetectables, mientras que la excreción fecal es elevada. Otra ventaja de la prueba de ELISA consiste en su facilidad de aplicación para la detección en gran escala de aves infectadas.

Este enfoque ha sido reconocido por la Unión Europea y la OMS para S. Typhimurium y S. Enteritidis.

Nuevo Método de Detección Molecular La técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés

Polymerase Chain Reaction) diferencia de los métodos tradicionales, que requieren 6 o 7 días para dar un resultado definitivo, por el método de PCR esto mismo se logra en sólo 1 a 3 días, dependiendo de diversas modificaciones en el protocolo de trabajo.

Nuevo Sistema con PCR

Un método rápido método aplicable a la detección e identificación de Salmonella

y de otros patógenos. Además, las cepas carentes de antígenos somáticos (O) y/o

flagelares (H) (cepas rugosas), que sólo son reconocidas como Salmonella spp. por el método tradicional de serotipificación pueden ser identificadas mediante PCR, debido a que esta técnica detecta secuencias específicas de DNA y no es alterada por variaciones fenotípicas, que se pueden evidenciar por patrones bioquímicos.

GRACIAS