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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1_3 : Western y Southern Blots
Materia de Especialización CEBI_E1
Técnicas de análisis en biotecnología
Módulo I: Moléculas pequeñas.
Módulo II: Macromoléculas.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas
en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.
Es utilizado en biología molecular, bioquímica e inmunogenética
para la detección de proteínas en una muestra.
4 PASOS:
1) Utiliza electroforesis en geles de
poliacrilamida. Caso más común: separar
proteínas desnaturalizadas por peso molecular
(SDS PAGE).
2) Las proteínas son transferidas desde el gel
hacia la membrana (generalmente nitrocelulosa),
donde permanecen fijas.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
3 y 4) Luego las proteínas son
detectadas utilizando anticuerpos
específicos para dicha proteína.
Esquema
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
SDS-PAGE:
- Separo los complejos de proteínas en
individuales
- Separo las proteínas por tamaño
Western Blot Análisis:
- Transferencia de las proteínas a una
membrana de nitrocelulosa
- Son más estables y permanentes
- Identifiicación de proteínas por
immunodetección: uso de anticuerpos
especificos contra la proteína de interés
BIORAD ©
Tandem
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Las electroforesis más utilizadas
son las que utiliza geles de
poliacrilamida, SDS-PAGE o IEF.
La separación de las proteínas de
la muestra puede ser por su punto
isoeléctrico (pI) o por su peso
molecular (MW).
Por lo tanto el tipo de separación
depende del tratamiento de la
muestra y de la naturaleza del gel.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparación de las muestras:
Las muestras deberán ser tratadas según su tipo.
Si fuese de un cultivo o tejido sufrirán pasos de lisis celular y
solubilización de proteínas, centrifugación y filtración si fuese
necesario.
Luego de la extracción se prepara la muestra según la
electroforesis a utilizar.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PASOS WESTERN
a) Preparación del sistema de blotting y transferencia
b) Bloqueo de la membrana (de nitrocelulosa)
c) Incubación con soluciones de anticuerpos
d) Desarrollo de color del blot
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparación para la
transferencia de las
proteínas a la
membrana (de
nitrocelulosa) Corte del gel
BIORAD ©
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia:
Para hacer accesibles las proteínas a la detección de los
anticuerpos, éstas deberán ser transferidas desde el gel hacia
una membrana. Las más utilizadas son las de nitrocelulosa o
polyvinylidene difluoride (PVDF). Estas son elegidas por su
propiedad de pegado de proteínas no especifico, basado en
interacciones hidrofóbicas e interacción de cargas.
2 métodos generales:
- capilaridad
- electrotransferencia
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Electrotransferencia.
Se usa corriente eléctrica para impulsar las proteínas del gel hacia
la membrana. Corren hacia el polo positivo.
El sandwich del gel, membrana y papeles de filtro (o goma espuma)
se coloca entre dos planchas metálicas, conectadas
respectivamente a los polos.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Esquema de la celda
de Trans-Blot
BIORAD ©
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia de
proteínas desde el
gel hacia la
membrana
30 minutes
100V
Buffer para el blotting
1x Tris-glicina con
20% etanol
Co
rrie
nte
elé
ctric
a
BIORAD ©
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparando la
transferencia
electroforetica
Tips
Se puede adicionar una unidad congelada en el tanque para paliar el aumento de temperatura (Bio-Ice cooling unit)
BIORAD ©
Uso de barra de agitación magnética para mantener la distribución de iones y temperatura
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
BIORAD ©
https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ
6dBOfs
BIORAD, video completo
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia x capilaridad:
La membrana se coloca sobre el gel y sobre este una pila de
papeles de filtro.
El sandwich formado se sumerge en una solución buffer, que
ingresa por capilaridad, llevándose la proteína a la membrana.
Demora mucho más tiempo que la electrotransferencia
(overnight).
Nota: la nitrocelulosa es mas barata que el PVDF, pero mas frágil.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
La uniformidad y eficiencia de transferencia se puede confirmar
con colorantes como el Ponceau S.
Ponceau S es el más comúnmente utilizado por su alta
sensibilidad, rápido teñido (5 min) y su solubilidad en agua lo que
hace mas fácil su posterior desteñido.
Útil para nitrocelulosa, PVDF
(reversible en ambos casos)
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Bloqueo
Se debe prevenir la interacción entre el anticuerpo utilizado y la
membrana.
Para ellos, se incuba la membrana con una solución de proteínas
(BSA, leche en polvo descremada-funciona muy bien y es
económica-) que no serán detectadas por el anticuerpo y llenarán
los espacios libres de la membrana evitando que interaccione el
anticuerpo “inespecíficamente” con esta. Esto reduce el “ruido” del
producto final dejando resultados más claros.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Bloqueo
Buffer de bloqueo: BSA 0,1-1% + Tween 20 0,005% - leche en
polvo 3-5% + Tween 20 0,025-0,05%, Caseína, etc. (en buffer TBS
o PBS, que mantiene el correcto pH y fuerza iónica)
Luego del bloqueo se realizan lavados para eliminar el exceso de
proteína de bloqueo. Se realizan con TBS o PBS + Tween 20
0,05%.
TBS: Tris/Borate/saline
PBS: Phosphate/Borate/saline
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Detección:
Uso de anticuerpos como herramienta de
diagnóstico
BIORAD ©
Hoy en día hay compañías que se
especializan en proveer
anticuerpos (monoclonales y
policlonales – éstos últimos son los
más usados-) contra una gran
cantidad de proteínas.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
BIORAD ©
1) La proteína de interés es enfrentada
contra un anticuerpo especifico
1) Unión de un 2do anticuerpo contra el
primero (no hay necesidad que sea
específico). Posee enzima.
1) Detección por adición de sustrato de la
enzima. Reacción colorimétrica/
quimioluminiscente.
3 pasos:
Proteínas en la membrana
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Detección
Los anticuerpos se diluyen en la solución
de bloqueo.
La incubación debe llevar una leve
agitación, la temperatura puede variar,
cuanto mayor sea se incrementará la
unión tanto especifica (señal deseada)
como no especifica (ruido).
Puede dejarse 1 h a T amb, también a
37C; u overnight en heladera, de
preferencia con agitación (tb fciona sin).
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Tomada de
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classe
s/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
1er anticuerpo: 0,5 - 5 g/ml
2do anticuerpo: dirigido a la porción “especie específico” (Fc) del
anticuerpo primario
Otras opciones: ej. puede estar unido a biotina, o a enzimas tales
como fosfatasa alcalina o peroxidasa
Los más utilizados son los unidos a peroxidasa, con los cuales se
utiliza como sustrato alfa-cloronaftol (más barato y menos
sensible), o reactivos quimioluminiscentes (se revela en una placa
fotográfica)
(ver catálogos)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Resultado: Western Blot
Si el Blot se hizo
desde un gel no teñido
Si el Blot se hizo
desde un gel teñido
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Recomendaciones:
Algunos anticuerpos pueden reusarse (entre 1 y 3 veces, y según
como están conservados-buffer, leche-), pero hay que definir según
la técnica.
Agitación constante en las incubaciones, excepto en frío overnight.
Respetar tiempos y lavados. Es importante sacar el exceso de
bloqueo y de anticuerpo para eliminar background.
Nitrocelulosa es mas barata pero mas frágil.
Sensibilidad: 0,1 ng.
No dejar burbujas de aire.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Recomendaciones y aplicaciones:
Identificación de la proteína (criterio de identidad).
Detección de agregados no muy degradados.
Alta concentración de albúmina puede interferir.
No es cuantitativo.
Permite diferenciar entre moléculas de mayor PM y agregados de
la proteína.
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Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Deteccíón de proteína CKK47 por SDS-PAGE y Western Blot
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Similar a la técnica descripta para Western
Se puede hacer tanto para geles de agarosa com poliacrilamida,
pero precaución en el método de transferencia (electrotransferencia
únicamente).
Paso 1:
Como preparar y correr un gel de agarosa
(How to Make and Run an Agarose Gel (DNA Electrophoresis))
http://www.youtube.com/watch?v=2UQIoYhOowM
Paso 2: Procedimiento de Southern
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Membranas más comunes: nitrocelulosa (ojo, es frágil), nylon
(positivas o negativas, permiten reuso)
Luego de la transferencia, se debe FIJAR el DNA a la
membrana. Métodos más comunes: irradiación UV (para nylon)
o “cocinado” (nitrocelulosa).
Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20
Ver capítulo de libro anexo (Brown, Current Protocols in Molecular
Biology (1999) 2.9.1-2.9.20) donde se dan detalles de protocolos
para transferencias en medio ácido o básico según polaridad de
membrana.
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Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Procedimiento completo Southern blot
http://v.youku.com/v_show/id_XMjYwODM5MTY4.html
http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Revelado más comunes
-Radioactivos: Probe radioactiva – autoradiografia
-No radioactivos: quimioluminiscenica, colorimétrico
(streptoavidina-biotina-enzima).
Los métodos de revelado más comunes no son los mismos que
para Western
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Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Aplicaciones y selección de membrana
-Nylon retiene fragmentos hasta 50 nucleot, mientras
nitrocelulosa, 500. (Ojo en análisis de fragmentos de DNA
digeridos con enz. restricción)
-Para PCR: mejor nylon, pero se usa nitrocelulosa dada la alta
cantidad de DNA de partida.
Principales aplicaciones:
a) identificación de clones y localización de fragmento más
pequeño conteniendo el gen de interés.
b) Mapeo RFLP (restriction fragment length polymorphism)
(ver detalles en Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001)
Nature Publishing Group)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Otros Blots
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Existen los llamados Northern blot y “Eastern blot”.
Northern blot
Se basa en la detección y separación de ARN a partir de geles
de agarosa
(video de muestra del proceso
http://www.dnatube.com/video/2999/Nouthern-Blot)
“Eastern blot”.
Variante (y extensión) del Western blot. Se usa principalmente
para analizar modificaciones post-traduccionales de proteínas
(lipi-, glico-, fosfo-rilaciones). Polémica y no aceptaciones global
del término.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
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