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Institut de Recerca
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Proteòmica i Metabolòmica:
Tècniques disponibles,
planificació i disseny
d'experiments
25 de Març de 2014
RICARDO GONZALO
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Introducció a la metabolòmica.
•Introducción a la metabolómica. PrincipalesTécnicas utilizadas.
•Diseño de experimentos
•Análisi de dades de metabolómica
CONTENIDO:
METABOLOMICA. Definiciones
Definición Estudio de los procesos químicos de los metabolitos
Cualquier molécula
intermediaria o producida
durante el metabolismo
“Estudio sistemático de la única huella química
que los procesos celulares dejan atrás”
MetabolomaRepresenta la colección de metabolitos de una célula, de
un tejido, de un órgano o de un organismo, los cuales son
los productos finales de los procesos celulares.
METABOLOMICA. Definiciones
Genómica Proteómica Metabolómica
Nos explican lo que ha pasado
después de un estímulo,
mutación,...
Explica lo que está pasando
después de un estímulo,
mutación,...
Seria muy interesante poder integrar estos tres tipos de
datos para saber lo que está pasando en un organismo
METABOLOMICA. Adquisición de datos
Técnicas de separación:
•Cromatografía de gases (GC)
•Cromatografía líquida (UPLC)
Técnicas de detección:
•Espectrometría de masas (MS)
•Resonancia magnética nuclear (NMR)
Combinación de técnicas:
•GC-MS
•H/UPLC-MS
1
METABOLOMICA. Adquisición de datos.
Sirve para separar diferentes componentes de una muestra
Es un método físico de separación en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en
reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se
mueve en una dirección definida.
Técnicas de separación
•líquido o gas
•Alta pureza
•Inerte químicamente
•Sólido, líquido o gas
•Sólido = partículas empaquetadas
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación
Cromatografía de gases
•Fase movil: gas inerte.
•Fase estacionaria: columna
•Permite la separación de mezclas órganicas
complejas
•Suele requerir derivatización química
(sólamente los compuestos químicos volátiles
pueden ser analizados sin derivatización)
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación
Cromatografía líquida. HPLC/UPLC
•Permite la separación de mezclas muy complejas
•Menor resolución cromatográfica
•Pueden ser analizados un amplio rango de metabolitos (analitos poco volátiles)
•UPLC permite trabajar a P mucho mayores y así reducir tiempo y costes
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación
Cromatografía líquida. HPLC/UPLC
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección
GC H/UPLC
Separan, identifican y cuantifican compuestos....¿qué pasa si hay muestras
que coeluyen...?
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
•Permite identificar, cuantificar y elucidad la estructura de manera casi inequívoca
cualquier sustancia pura
•Necesita que las sustancias estén previamente separadas (espectros generados
son complejos)
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección
Muestra es ionizada (=destruída)
pierde algunos electrones y
se fragmenta dando
diferentes iones
Iones son acelerados por
un campo magnético
hacia un detector
Cada compuesto se ioniza y
fragmenta de una
determinada y única manera
(relación masa/carga)
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Detector
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-Qtof
MS-Tiempo de vuelo (Qtof)
•Un ión con determinada relación masa/carga es analizado en el tiempo
•Los iones son acelerados bajo un campo eléctromagnético de fuerza conocida
•La velocidad del ión dependerá de su relación masa/carga
•Se mide el tiempo que tarda el ión en llegar al detector
1
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ
•Sistema fluídico y de adquisición de
muestras Acquity.
•4 líneas de solvente, el usuario tiene de
escoger 2.
•Flujo de 0.01 a 2.00 mL/min
•Presión máxima 15.000 psi
•Capacidad para procesar 96 muestras
•Detector masas Txevo TQ
•Fuente en Zspray. Capacidad de ser
ESI/APCI/ESCi
•Dos cuadrupolos analizadores de alta resolución.
•Celda de colisión T-Wave
•Rango de masas: 2 – 2048 m/z
MS-QQQ
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ
1
METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección
Resonancia magnética nuclear
•No se basa en la separación de los analitos. La muestra se suele poder recuperar
•Detecta todos los metabolitos a la vez. No es selectiva
•Principales ventajas es la alta reproducibilidad y facilidad de preparación de las
muestras
•Es menos sensible que MS
METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental
Diseño experimental:
•Definición: La estadística que sucede antes del experimento. Técnica estadística que
permite identificar y cuantificar las causas de un efecto dentro de un estudio
experimental.
•Beneficios:
un buen diseño puede ahorrar tiempo y dinero (evita repeticiones)
reduce el tiempo de análisis y la probabilidad de error.
buena estimación del error
reduce el tiempo experimental al mínimo.
permitirá una validación amplia de los resultados (=muestra de una población)
METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental
Varianza, análisis de
clusters y potencia
Experimento
Validación
de los datos
Análisis estadístico Análisis preliminar
METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental
•Fases en las que interviene el diseño estadístico:
PreadquisiciónPlanificación y discusión del experimento global
Estudiar las fuentes de variabilidad
Elección de la metodología a utilizar
Definir el/los objetivo/s del estudio
Obtención del especimenElegir las muestras a utilizar
Determinar el número de muestras
Forma de recolección de las muestras
Pooles
Diseño del ensayo Número y tipo de replicados
Gente que va a manipular, kits, ...
Si hay más de una tanda de adquisición, repartir bien las muestras
METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental
Número de muestras necesario:
•¿Cuánta variabilidad tiene mi sistema de estudio?
•¿cuántas muestras necesito?
•¿Qué nivel de significación se necesita?
Fuentes de variabilidad
•Biológica (la que nos interesa)
•Técnica (protocolo, operador....)
•Sistemática (instrumentos, reactivos,...)
Se debería estimar la
magnitud de las tres
fuentes de variabilidad
Estudio Piloto
Cambios sutiles requieren elevado número de replicas
METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental
Diseño del ensayo
Principios básicos del diseño experimental:
• Aleatorización: Asignar de forma aleatoria las muestras a los grupos
• Réplicas: Aplicar el mismo tratamiento de forma independiente a más de una
muestra. El número de replicados dependerá de la precisión del equipo.
Tipos: biológicos/técnicos
•Bloqueo o control local: Muestras pueden no ser homogéneas (hombres/
mujeres), pueden existir diferencias debidas a los bloques. Asignar
correctamente el tratamiento entre los bloques.
METABOLOMICA. Análisis de datos
Datos metabolómica
espectros digitalizados
lista de medidas sobre metabolitos
Se genera una matriz donde
las filas corresponden a las
muestras y las columnas
corresponden a los niveles
analizados en los metabolitos.
Suelen ser análisis complicados que requieren de personal y equipo
especializado
METABOLOMICA. Análisis de datos.
Tipos de análisis que se pueden hacer:
1. Análisis exploratorio
i. Revisión de los resultados
ii. Detección de “outliers”
iii. Patrones de agrupación
3. Clasificación
i. Construcción de un modelo para la predicción/clasificación de nuevas
muestras
2. Descubrimiento de biomarcadores
i. Identificar metabolitos que son significativamente diferentes entre grupos
METABOLOMICA. Análisis de datos.
Aspectos del análisis de datos
1. Normalización de los datos crudos
• Eliminar la variabilidad sistemática entre las condiciones experimentales que no estén
relacionadas con las diferencias biológicas (diluciones, varios operadores, “dyes”…)
• Hacer todos los datos comparables
2. Problema del Multi-testing
• Al realizar muchos test estadísticos (miles) hay que ajustar el p valor para que no
aparezcan falsos positivos.
3. Agrupaciones
• No supervisados
• Muy interesantes porque permiten echar un vistazo a los datos rápidamente
• Ej. PCA, Heatmap, dendogramas, ….
METABOLOMICA. Análisis de datos.
PCA (Análisis de componentes principales)
•Analiza y extrae la variabilidad sistemática en los datos
•No necesita conocer la naturaleza de las muestras antes de hacer el análisis
•Nos mostrará cualquier diferencia significativa entre los grupos de muestras (sea o no
sea importante para el estudio en sí)
METABOLOMICA. Análisis de datos.
4. Clasificación
• Métodos supervisado (conocemos la naturaleza de las muestras)
• Muchos métodos estadísticos tradicionales no se pueden utilizar (pocas muestras con
miles de datos)
• Se han desarrollado métodos nuevos, algunos derivados del análisis de datos de
microarrays
PLS (Partial Least Square)
• Similar al PCA, pero se utiliza la información sobre que se
conoce de las muestras (supervisado)
• Recomendado cuando se estudian dos grupos
• Se maximiza la covarianza entre los resultados obtenidos
y la información previa conocida de las muestras.
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