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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E13Materia de Especialización CEBI_E13Técnicas de formulación y
estabilización de biomateriales
Docente a cargo: Pilar BueraColaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita
Desarrollo del curso
Lunes 24/10 18-20 Teórica. Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.
Lunes 31/10 20-22 Metodología para la caracterización de las transiciones. Procesos de congelación. Problemas 4 a 6.
Martes 08/11 18-22 TP DSC; Problemas 7 a 10.
Teo: Liofilización. Problemas 11 y 12.Teo: Liofilización. Problemas 11 y 12.
Martes 15/11 18-22 Demostraciones prácticas RMN y encapsulación.
Secado por aspersión. Isotermas de sorción de agua. Problemas 13 a 18.
Lunes 21/11 18-22 Estabilidad/reacciones de deterioro. Problemas 19 a 22.
Lunes 05/12 18-20 Examen
•Aspectos básicos de las formulaciones paraconservación de biomoléculas y microorganismos.
Teórica 1.
conservación de biomoléculas y microorganismos.
•Transiciones de fase y estado.
Aspectos
Ciencia dePolímeros
Estabilidad de biomoléculas
Ciencia de Materiales
AspectosEstructuralesbiomoléculas
Aplicaciones
Medicina Biotecnología
embriones
enzimascélulas
Tecnología
Farmacia
Biología
anticuerposliposomas
hormonas
Objetivo Objetivo
obtener biomoléculas conservables a biomoléculas conservables a largo plazo, con actividad recuperable.largo plazo, con actividad recuperable.
Para ello:�deben estar inhibidas las reacciones químicas y biológicas que son responsables de la degradación.�Debe conservarse la estructura física y funcionalidad
Mapa de estabilidad y aW
Opciones:
Congelación�Congelación
�Deshidratación
Pero…Pero…Qué pasa si las biomoléculas quedan Qué pasa si las biomoléculas quedan en ambientes restringidos de agua?en ambientes restringidos de agua?
Puntos críticos:Puntos críticos:
•Membranas celulares
•Proteínas
En ambientes de humedad restringida las biomoléculas sufren estrés causado por sufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.agua.
La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.
También el agua juega un papel decisivo en las También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.
Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.
-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y condiciones extremas de humedad y temperatura.
Cómo se busca la solución?Cómo se busca la solución?
1. Planteando cómo resuelve la 1. Planteando cómo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? en condiciones extremas? en condiciones extremas? en condiciones extremas?
•Muy altas o muy bajas temperaturas
•Muy altas o muy bajas presiones
•Deshidratación
Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:ambientales sean favorables:
Extremófilos
Criptobiotes
Anhidrobiotes
α, α -trehalosa
O
H
HO
H
HO
H
OHHH
OH
O
H
OH
H
OH
H
HO H
OH
H
O
Tardigrade 500mmTardigrade 500mm
α, α -trehalosa
Células de levadura Células de levadura 3 ~ 8mm 3 ~ 8mm
Artemia salinaArtemia salina 0.1cm 0.1cm
O
H
HO
H
HO
H
O
OHHH
OH
H
H
HO H
H OHO
OH
OH
SacarosaPlantas de la resurrecciónPlantas de la resurrección
Polen Polen
Plantas de la resurrección
Anhidrobiosis
resurrección
Ej.Selaginella lepidophylla
O
OCH2
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
rafinosa
OCH2
OCH2OHOH
OH
OH
O
O
OCH2OH
OHOH
OH OH
OH
OH
CH2
OH
O
CH2
β -fructofuranósidosrafinosa
β-fructofuranósidos
SemillasSemillas
OH OH
sacarosa
O
O
O
CH2OH
OHOH
OHOH
OH
OHCH2OH
α,α- trehalosa
α-glucopiranósido
sacarosa
Lecciones de la Naturaleza:Lecciones de la Naturaleza:
Solutos que acumulan organismos Solutos que acumulan organismos
resistentes a la deshidrataciónresistentes a la deshidratación
� Proteínas
� Sales/aminoácidos
Contribuyen al ajuste osmótico
Estabilización de
proteínas y membranas
aminoácidos
� Azúcares
Puentes de H
Medios de alta viscosidad
Capturan radicales libres
VidVidriosrios
Protector de Protector de proteínasproteínas
Protector de Protector de proteínasproteínas
Protector de Protector de membranasmembranasProtector de Protector de membranasmembranas
w.o. T, 200Cw.o. T, 52C
Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T
Pereira et al. Biophys J 2004
w.o. T, 200C
+ T 1M, 200C + T 2M, 200C
Totalmentehidratado
Parcialmentedeshidratado
Deshidratadodeshidratado
Deshidratado
Totalmentehidratado
Parcialmentedeshidratado Deshidratado
Solutos protectores de biomoléculas
•Sacarosa.
•Manitol.
Lactosa.•Lactosa.
•Trehalosa.
•Sorbitol.
Propiedades estabilizantes de azúcares amorfos..
Inhibición de reacciones químicas
Medios de alta viscosidad
Vidrio
}Protección de proteínas
Protección de membranas
Capacidad de interactuar por puentes H
No cristalino (vítreo o sobreenfriado)
}
Pasos para el desarrollo de sistemas de biomoléculas estables:
• Formulación
• Operación y control de proceso
• Evaluación de la calidad
• Estimación de la estabilidad
Principales aspectos:
•Características de los comp. activos del producto(proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.)
•Características de componentes del medio buffers(biopolímeros, azúcares, sales, buffers)
•Proceso, equipos
•Acondicionamiento final de producto
•Estabilidad
Requerimientos:Requerimientos:
Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser :
• preservadas durante el proceso.
• preservadas durante su posterior almacenamiento.
• su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.
Aspectos a considerar:
•Mecanismos involucrados
•Relación vitrificación estabilidad
Las Las transiciones de fase y estadotransiciones de fase y estado de las de las biomoléculas afectan su funcionalidad biomoléculas afectan su funcionalidad y pueden servir como índice para y pueden servir como índice para predecir estabilidadpredecir estabilidadpredecir estabilidadpredecir estabilidad
Esencialmente corresponden a:Esencialmente corresponden a:
VitrificaciónVitrificación
Transiciones entálpicasTransiciones entálpicas
VitrificaciónVitrificación
La estabilidad de muchas La estabilidad de muchas biomoléculasbiomoléculasen medios congelados o deshidratados en medios congelados o deshidratados se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de vidrios.vidrios.
Matriz
Interacciones
Agua
Biomoléculas
Vitrificación.Vitrificación.
Los sólidos amorfos son materiales Los sólidos amorfos son materiales
��metameta--estables estables con con
��alta viscosidadalta viscosidad y y
��baja movilidad molecularbaja movilidad molecular, ,
��existen en un estado de existen en un estado de nono--equilibrioequilibrio
��Muchos cambios químicos y estructurales Muchos cambios químicos y estructurales
ocurren muy lentamente en los sistemas ocurren muy lentamente en los sistemas
vítreos, y no se perciben en marcos de vítreos, y no se perciben en marcos de
tiempo prácticos. tiempo prácticos.
vidriosvidrios
SiO2 en su estado cristalino: cuarzo
cristalcristal
Vidrio (amorfo)
Demasiado quebradizo y muy alta Tm
Vidrio común
El estudio de los El estudio de los vidriosvidrios se se realizó inicialmente en sólidos realizó inicialmente en sólidos inorgánicos, y se desarrolló en inorgánicos, y se desarrolló en ciencia de polímeros, pero ciencia de polímeros, pero sustancias como azúcares sustancias como azúcares sustancias como azúcares sustancias como azúcares pueden generar estructuras pueden generar estructuras vítreas y están ampliamente vítreas y están ampliamente relacionados con la estabilidad relacionados con la estabilidad de biomoléculas.de biomoléculas.
��El cambio en el estado físico que sufre un El cambio en el estado físico que sufre un
material material amorfo vítreoamorfo vítreo al pasar al estado de al pasar al estado de
líquido sobreenfriadolíquido sobreenfriado se conoce comose conoce como
transición vítreatransición vítrea..
��Esta transformación ocurre a cierta Esta transformación ocurre a cierta ��Esta transformación ocurre a cierta Esta transformación ocurre a cierta
temperatura,temperatura, temperatura de transición temperatura de transición
vítrea (Tvítrea (Tgg),), que depende del contenido de agua que depende del contenido de agua
y de las características de cada sistema. y de las características de cada sistema.
Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperaturasupera el valor de TTgg, temperatura detransición vítrea.
En este punto pierden la rigidez que los En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.
En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.
control Almacenada a T>Tg
Colapso estructural por Colapso estructural por almacenamiento de muestras de almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tsuperiores a su Tgg..
Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua.
Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización.
Hay que considerar 2 casos:
•Sistemas en equilibrioen equilibrio con formación de eutéctico.
•Sistemas que forman vidriosforman vidrios fuera del equilibrio.
Caso 1.Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol
A
D
C
Tm
Tms
Reid, 2006
D
B
E La línea DBE determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido
Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.
A medida que se agrega agua al soluto o A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).
La curva CB corresponde a la de solubilidad.
Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura TT y composición CC22 , en forma lenta para permanecer en permanecer en equilibrioequilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta TT11 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.
T
T1
solución
Solución
Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se U
Solución
+ soluto Solución
+ hielo
solución, que se concentra. En el punto UU tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3
U
Si consideramos ahora una solución de composición CC33 a la temperatura TT, podemos ver que es necesario enfriarla hasta TT22
para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de CC33 será idéntica a la de CC22
enfriada hasta TT22. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.
T
T
solución
Solución
Cuanto más Cuanto más concentrada es concentrada es T2
T
Solución
+ soluto Solución
+ hielo
concentrada es concentrada es la solución la solución inicial, menos inicial, menos cantidad de cantidad de hielo presente.hielo presente.
Reid, 2006
La realidad:La realidad:
Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva ABAB.
En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.
A
B
Reid, 2006
Reid, 2006
��En los procesos de deshidratación o En los procesos de deshidratación o
congelación se pueden generar sistemas congelación se pueden generar sistemas
vítreos. vítreos.
Sólidos amorfos y estado vítreo
��La fusión de sólidos cristalinos, seguido La fusión de sólidos cristalinos, seguido
por un enfriamiento rápido también por un enfriamiento rápido también
genera estructuras vítreas. genera estructuras vítreas.
Esquema de la formación de Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinossólidos amorfos o cristalinos1. Durante la congelación1. Durante la congelación
aguasoluto
Congelado rápido
matriz amorfa
Congelado lento
hielo
Esquema de la formación de Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinossólidos amorfos o cristalinos2. Durante la deshidratación2. Durante la deshidratación
aguasoluto
Deshidratación rápida
Deshidratación lenta
Cristales de soluto
matriz amorfa
Tem
pera
ture
4
150
100
50
0
Diagrama de estado
Tem
pera
ture
W0.25 0.5 0.75 1
2
0
-50
-100
-150
0
CompuestoCompuesto TTgg (C)(C)
TriosasTriosas
GlicerolGlicerol --9393
PentosasPentosas
RibosaRibosa --1010
XilosaXilosa --1010
ArabinosaArabinosa --22
HexosasHexosas
FructosaFructosa 1313
GlucosaGlucosa 3939
ManitolManitol 3030
Temperaturas de transición vítrea de compuestos secos.
ManitolManitol 3030
SorbitolSorbitol --33
DisacáridosDisacáridos
SacarosaSacarosa 7070
TrehalosaTrehalosa 106106
MaltosaMaltosa 8787
TrisacáridosTrisacáridos
RafinosaRafinosa 109109
MaltotriosaMaltotriosa 100100
TetrasacáridosTetrasacáridos
EstaquiosaEstaquiosa 132132
•Metodología para la caracterización de las
Teórica 2.
•Metodología para la caracterización de lastransiciones.
•Procesos de congelación.
Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado
Propiedades térmicas
DTA
DSC
TGA
Propiedades eléctricas
Propiedades mecánicas
MS
DMA
DMTA
Propiedades espectroscópicas
RMN
IR
Raman
RSE
Propiedades eléctricas
DETA
DEA
Conductividad
Técnicas microscópicas y
análisis de imágenes
DSC Differential Scanning Calorimetry
Horno
Determinación de las Determinación de las temperaturas de transición temperaturas de transición
Sensores
Referencia
Muestra
DSC Differential Scanning Calorimetry
Flujo de calor hacia la referenciaTm TR
TC
Flujo de calorhacia la muestra
Tm = Temperatura de la muestraTR = Temperatura de la referenciaTC = Temperatura de la celda
Tm - TR = dT
TC
Sensor-vista superiorsuperior
Tanque de N2 (g)
caudalímetro
Tanque de N2 (l)
DSC
TRANSICIÓNTRANSICIÓNVíTREAVíTREA
Región vítrea Formación de
cristales
Transiciones de fase de un sólido amorfo
CalorimetríaCalorimetría diferencialdiferencial dede barridobarrido:: TermogramaTermograma típicotípico dede ununazúcarazúcar liofilizadoliofilizado (adaptado(adaptado dede Roos,Roos, 19921992))..
Región sobreenfriada
Fusión de
cristales
Temperatura/tiempo
Determinación de la Determinación de la temperatura de transición temperatura de transición
vítrea por DSCvítrea por DSC
∆cp
Τg onset
Τg midpointF
lujo
exo
térm
ico
de c
alor
Temperatura
Τg endsset
Flu
jo e
xoté
rmic
o de
cal
or
��Efecto del agua:Efecto del agua:
Variación de Variación de TTgg en función en función del contenido del contenido de agua para de agua para de agua para de agua para glucosa y glucosa y maltosa.maltosa.
�� Transición vítrea de mezclasTransición vítrea de mezclas
Además del agua, otros compuestos miscibles Además del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tmodifican la Tgg de un dado componente de un dado componente
�� Transición vítrea de mezclasTransición vítrea de mezclas
Ecuación de Ecuación de Gordon y Taylor:Gordon y Taylor: Relaciona TRelaciona Tgg de mezclas de mezclas
binarias con la fracción en masa y la Tbinarias con la fracción en masa y la Tgg de los componentes de los componentes
individuales. individuales.
21
2211
wkw
TwkTw
gmezclaggT ⋅+
⋅⋅+⋅=TTgg mezclamezcla == TTgg observadoobservado parapara unauna mezclamezcla binariabinaria
ww11 yy ww22 == fracciónfracción enen masamasa dede loslos componentescomponentes purospuros
TTgg11 yy TTgg22 == TTgg dede loslos componentescomponentes purospuros
kk == constanteconstante (representa(representa lala fuerzafuerza dede interaccióninteracción entreentre loslos
componentescomponentes deldel sistema)sistema)..
Transiciones entálpicasTransiciones entálpicas
Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización
polioles,polioles,
Almidón gelatinización retrogradación
Proteínas desnaturalización agregación
DSC Differential Scanning Calorimetry
mW
-2
0
1
2 Exot.
Deflección inicial
Area = calor involucrado
Flujo de calor (dh/dt) =
TS - TR
dU/S
-6
-4
min
C130 132 134 136 138 140 142 144
0 1 2 3 4 5 6 7
Endot.
Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas
Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1
Spelt
exo Vegetable Proteins (1) 13.03.1998 10:14:32
Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1
Soybean
Lupines
WheatmW
2
°C50 60 70 80 90 100DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S
2. Gelatinización de almidón
Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C
Corn
Rice
exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38
Wheat
Potato
Rice
mW
2
°C40 50 60 70 80DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S
3. Fusión/crist. de lípidos
Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)
Sacandé y col., 2002
Técnicas complementarias:Técnicas complementarias:Microscopía Microscopía
Microestructura de Microestructura de sistemas amorfossistemas amorfos
Heating and Freezing stage
Videocamera
Platina térmica
50µm
AUTO SEQUENTIAL SWITCHING UNIT
Temperaturecontrol system
N tank2Optical microscope
Clausse, 2006Clausse, 2006
Platina térmica Sistema de control de temperatura
Tanque de N2 L
-100
0
100
200
300H
eat f
low
(m
W)
Exo
ther
mic
+20°C
Fre
ezin
g
-17°C-20°C
Unfrozenwater
Ice
� �
Termogramas de agua (DSC)
-300
-200
-100
-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)
Hea
t flo
w (
mW
)
En
do
ther
mic
Icemelting
-1°C +4°C
Clausse, 2006Clausse, 2006
masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g
Micrografías de soluciones de NaCl (180x)
Clausse, 2006Clausse, 2006
Rayos X
Para analizar cristalinidad o amorficidad
Técnicas complementarias:Técnicas complementarias:
Todos los solutos forman vidrios?
Dulcitol
(galacti-tol)
Sorbitol
Manitol
solución cristal solución cristal
cc
vv
cc
No deben modificar su conformación al cristalizar
Iditol
Maltitol
Conformaciones moleculares de polioles
vv
vv
Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores
temperaturas de fusión y mayores ∆Hf
0
20
40
60
80
Tem
pera
ture
(
°C) Tm
Ts
solution
Maximum
100
120
G
B
A
D
F
Vitrificación Vitrificación por por
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0 0.2 0.4 60 80 100
Solid mass fraction (%)
Tem
pera
ture
(
Tg cg'
ice+glass
glass
Tg'
V
Maximum ice crystallization rate
ice + freeze-concentrated solutionC
BE
ce
por por congelación congelación rápida o rápida o secadosecado
�� Cuando el agua se encuentra formando parte de una Cuando el agua se encuentra formando parte de una mezcla binaria con un soluto es importante mezcla binaria con un soluto es importante determinar cuáles son las fases presentes en función determinar cuáles son las fases presentes en función de la composición, temperatura o de la presión.de la composición, temperatura o de la presión.
�� Además de las condiciones de equilibrio que Además de las condiciones de equilibrio que proveen los diagramas de fase, los proveen los diagramas de fase, los diagramas de diagramas de
Diagramas de estado suplementadosDiagramas de estado suplementados
proveen los diagramas de fase, los proveen los diagramas de fase, los diagramas de diagramas de estado suplementadosestado suplementados incorporan la curva de incorporan la curva de temperatura de transición vítrea. Proveen temperatura de transición vítrea. Proveen información acerca de condiciones de no equilibrio y información acerca de condiciones de no equilibrio y estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, incluyen la noción de tiempo completando así la incluyen la noción de tiempo completando así la información de los diagramas de fase. información de los diagramas de fase.
Estos diagramas son especialmente Estos diagramas son especialmente útiles para analizar la estabilidad en útiles para analizar la estabilidad en sistemas congelados, deshidratados o sistemas congelados, deshidratados o parcialmente deshidratados que no parcialmente deshidratados que no corresponden a estados de equilibrio corresponden a estados de equilibrio termodinámico.termodinámico.termodinámico.termodinámico.
Diagrama de estado suplementado para Diagrama de estado suplementado para un sistema binario.un sistema binario.
Líquido sobreenfriado
Solución
Hielo + solución
Tem
pera
tura
, °C
Concentración de soluto, %
•• Temperatura de transisición vítrea (TTemperatura de transisición vítrea (Tgg) ) •• Fusión de hielo (TFusión de hielo (Tmm) ) •• Solubilidad (TSolubilidad (Tmm
ss))
Dichas curvas definen regiones Dichas curvas definen regiones de estabilidad variable. de estabilidad variable.
(adaptado de Fennema, 1996).(adaptado de Fennema, 1996).
Hielo + líq. sobreenfriado Vidrio
Tem
pera
tura
,
��RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre TTmm (equilibrio)(equilibrio) yy TTgg::
ElEl sistemasistema sese encuentra,encuentra, concon rarasraras excepciones,excepciones, enen
unun estadoestado dede nono equlilibrioequlilibrio.. LaLa curvacurva TTmm definedefine laslas
condicionescondiciones dondedonde elel solventesolvente (agua)(agua) puedepuede
cristalizarcristalizar.. SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lalacristalizarcristalizar.. SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lala
concentraciónconcentración definidadefinida porpor elel puntopunto eutécticoeutéctico enen elel
diagramadiagrama dede fases,fases, puedepuede formarseformarse unun sólidosólido
eutécticoeutéctico (soluto(soluto yy solvente)solvente) oo bienbien elel solventesolvente
continúacontinúa cristalizandocristalizando enen unauna soluciónsolución
sobresaturadasobresaturada.. LaLa primeraprimera situaciónsituación ocurreocurre concon laslas
salessales mientrasmientras queque lala segundasegunda ocurreocurre comúnmentecomúnmente
concon azúcares,azúcares, polímerospolímeros yy compcomp.. polioxhidrílicospolioxhidrílicos..
ZonaZona metaestablemetaestable dondedonde puedepuede ocurrirocurrircristalizacióncristalización dede solutossolutos.. EnEn condicionescondiciones dedetemperaturatemperatura yy concentraciónconcentración cercanascercanas aa lala curvacurvadede solubilidad,solubilidad, lala velocidadvelocidad dede cristalizacióncristalizaciónaumentaaumenta concon lala sobresaturaciónsobresaturación.. SinSin embargo,embargo,cuandocuando elel sistemasistema sese acercaacerca aa lala curvacurva dede TTgg,, yayaseasea porpor concentraciónconcentración oo congelación,congelación, lala
RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre laslascurvascurvas TmTmss yy TTgg::
seasea porpor concentraciónconcentración oo congelación,congelación, lalaviscosidadviscosidad aumentaaumenta drásticamentedrásticamente yy lala velocidadvelocidaddede cristalizacióncristalización disminuyedisminuye debidodebido aa limitacioneslimitacionesdifusionalesdifusionales.. AA TTgg,, laslas restriccionesrestricciones enen lalamovilidadmovilidad molecularmolecular deldel sistemasistema sonson talestales quequeimpidenimpiden lala cristalizacióncristalización enen escalasescalas dede tiempotiemporazonablesrazonables.. CabeCabe remarcarremarcar queque ésteéste eses unun estadoestadodinámicodinámico (restringido(restringido cinéticamente)cinéticamente) yy nono ununestadoestado dede equilibrioequilibrio..
�� RegiónRegión comprendidacomprendida debajodebajo dede lala curvacurva dede TTgg::
SiSi elel materialmaterial adquirióadquirió elel estadoestado vítreo,vítreo, enen
general,general, laslas reaccionesreacciones oo procesosprocesos queque dependendependen
dede lala transferenciatransferencia dede masamasa oo dede lala difusióndifusióndede lala transferenciatransferencia dede masamasa oo dede lala difusióndifusión
estánestán restringidosrestringidos yy sonson muymuy lentoslentos..
LaLa cristalización,cristalización, porpor ejej..,, nono ocurreocurre enen unauna
escalaescala dede tiempotiempo prácticapráctica..
NoNo eses unauna condicióncondición dede equilibrioequilibrio sinosino unun estadoestado
metaestablemetaestable..
CongelaciónCongelación
Efecto de la Efecto de la Efecto de la Efecto de la velocidad de velocidad de enfriamientoenfriamiento
Control de la cristalización.
Variables extrínsecas
1. Velocidad de cristalización
2. Temperatura mínima alcanzada
Control de la cristalización:
Variables intrínsecas (Composición)
a) Presencia de agentes nucleantes:
Ejs. IAg; bacterias.Ejs. IAg; bacterias.
b) Modificación del crecimiento de los cristales de hielo:
Péptidos anticongelantes (en realidad inhiben el crecimiento de los cristales): peces antárticos.
Presencia de biopolímeros: gomas
Presencia de sales
La fuerza impulsora para los procesos de cristalización es la diferencia en potencial químico entre la fase solución y el sólido cristalino.
Puede expresarse como la diferencia de concentración respecto a la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el sistema que cristaliza y su punto de fusión.
Formación de hielo: La línea que se extiende desdeel punto eutéctico (TE) a Tg’, representa condicionesde no equilibrio. Si el sistema se almacena a:
CongelaciónFormas de congelación y cantidad de
hielo formado
de no equilibrio. Si el sistema se almacena a:
T > TE ⇒ fusión del hielo
T < Tg’ ⇒ sistema altamente viscoso, movilidadmolecular muy reducida, limitaciones difusionalesque impiden la cristalización de agua.
Máxima formación de hielo ⇒ congelación lenta a temperaturas entre TE y Tg’.
Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.
(A)(A)Enfriamiento previo a Enfriamiento previo a --100100°°C a 30C a 30°°C/min. Se observa C/min. Se observa formación de hielo al calentar (5formación de hielo al calentar (5°°C/min) por encima de Tg.C/min) por encima de Tg.
(B)(B) Enfriamiento a Enfriamiento a --100100°°C, mantenimiento 15 min a C, mantenimiento 15 min a --4848°°C, reC, re--enfriamiento a enfriamiento a --100100°°C, para máxima formación de hielo.C, para máxima formación de hielo.
Cambios inducidos en las biomoléculaspor la congelaciónpor la congelación
Estrés Respuesta celular
Reducción de T Cambios de fase de lípidos de membrana
Aumento de la conc. de soluto
Encogimiento osmótico
Aumento de fza iónica. Efectos directos en membranas, solubilización de proteínas de membrana
Deshidratación Desestabilización de bicapas lipídicas
Precipitación de sales y formación de eutécticos
variable
Formation de burbujas de gas
Daño mecánico a membranas/citoesqueleto
Aumento de viscosidad Los procesos difusivos (ósmosis) se limitan
Cambios de pH Desnaturalización de proteínas etc.
Las células se comprimen
Daños en membranas
Efecto de distintos crioprotectores en la estabilidad de LDH en congelado/descongelado
Comparación daño por cong./descong (tramado) con liofilizado (sólido). PFK con aditivos 0,5M
Velocidades de congelación:
Lenta: ≤ 1 °C/min
Rápida ≥ 100°C/minRápida ≥ 100°C/min
La temperatura crítica que usualmente tiene efacto sobre la supervivencia de organismos vivientes es -40°C.
Los procedimientos desarrollados para la preservación de organismos por congelación o secado son aún altamente empíricos.
La presencia de cierto contenido de agua y el La presencia de cierto contenido de agua y el mantenimiento de un rango de temperaturas es un requerimiento para organismos vivientes.
Cuando a dos tipos de células distintas se aplica la misma velocidad de congelación, se obtienen diferentes niveles de congelación intracelular.
En células de levadura permanece una En células de levadura permanece una significativa cantidad de agua a velocidades > 10°C/min.
En glóbulos rojos, un aumento similar de agau remanente en las células se observa cuando la velocidad es > 1000°C/min.
Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.
Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.
La supervivencia de células de Saccharomyces cerevisiae luego de congelar y descongelar es máxima para una velocidad de congelación de 1 a 10°C/min.1 a 10°C/min.
La existencia de este óptimo se debe a dos fenómenos:
Efectos mecánicos
Efectos de los solutos
Efectos mecánicos
Congelación extracelular
•Cuando una suspensión de células se somete a enfriamiento lento, la cristalización de hielo comienza en el medio externo y su interior se comienza en el medio externo y su interior se mantiene en estado sobre-enfriado hasta ~ -10°C.
•En ese rango de T el agua sobre-enfriada tiene mayor presión de vapor que el hielo, y el agua intracelular se expele, causando deshidratación progresiva de las células.
Efectos mecánicos
•El agua que sale de las células congela en el exterior al encontrarse con cristales ya formados.
•Si el enfriamiento es lento, el sistema se equilibra con la expulsión de agua y las células se equilibra con la expulsión de agua y las células se encogen por pérdida de agua intracelular, cuya concentración de solutos aumenta.
•
aguahielo
Causa de daño por congelación intracelular
hielo hielo
Cell
waterExtracell.
ice
Sistemas congelados Sistemas congelados
Mecánicos
Químicos
Cambios de pH
Aumento de fuerza
Daño por congelación intracelular
ice iceice iceSupercooled cytoplasm
Dependientes de la velocidad
Aumento de fuerza iónmica.
Efectos mecánicos
Congelación intracelular
•De un enfriamiento rápido, resulta cristalización intracelular, como resultado de la nucleación con hielo que proviene del exterior a través de ductos en las membranas.
•A su vez, si el enfriamiento es muy rápido, los cristales son pequeños y si es ultra-rápido ocurre vitrificación.
•Si se debe evitar el crecimiento de cristales, el descongelado debe ser muy rápido también.
Efectos mecánicos
•El enfriamiento muy rápido lleva a alta supervivencia, si está seguido de un descongelado rápido.
•Pero si el descongelado no puede ser lo •Pero si el descongelado no puede ser lo suficientemente rápido, es mejor congelar más lentamente ya que la deshidratación de las células limita el desarrollo de cristales intracelulares.
•La velocidad de congelación que causa congelaciónintra y extracelular depende de la velocidad de movimiento del agua de adentro hacia afuera.
•Las condiciones de congelación que provocancristalización intracelular causan disminución de viabilidad.
Tanto plantas como animales tienen mecanismos para evitar la cristalización de hielo.
Los tres principales mecanismos son:
Sistemas congelados
Los tres principales mecanismos son:
•Formación de vidrios.
•Cristalización extracelular.
•Proteínas anticongelantes.
Congelaciónlenta
Congelaciónrápida
Can
tidad
de
hiel
o fo
rmad
o, %
Congelación rápidaCongelación rápida (ej. con nitrógeno líquido): (ej. con nitrógeno líquido): Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se obtiene un sistema amorfo con un valor de Tobtiene un sistema amorfo con un valor de Tgg
(menor que T(menor que Tgg’) que será dependiente de la cantidad ’) que será dependiente de la cantidad de agua asociada a la fase amorfade agua asociada a la fase amorfa..
Congelación lenta:Congelación lenta: Favorece la formación de hielo, Favorece la formación de hielo, que será máxima a Tque será máxima a Tgg’ < T’ < T<< TTE, E,
Tiempo
Can
tidad
de
hiel
o fo
rmad
o, %
CCgg’, T’, Tgg’:’:
Punto en el diagrama de estado definido por la Punto en el diagrama de estado definido por la intersección de las curvas de fusión y de Tintersección de las curvas de fusión y de Tgg. . Corresponde a una concentración de Corresponde a una concentración de soluto/temperatura a la cual la cristalización de soluto/temperatura a la cual la cristalización de agua está inhibida cinéticamente.agua está inhibida cinéticamente.
CrioconcentraciónCrioconcentración
CCgg’ ’ es la concentración correspondiente a la matriz es la concentración correspondiente a la matriz máximamente concentrada por formación de máximamente concentrada por formación de hielo: a Chielo: a Cgg’ se alcanza la mínima cantidad de agua ’ se alcanza la mínima cantidad de agua asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar por crioconcentración. por crioconcentración.
TTgg’ ’ es la temperatura de transición vítrea es la temperatura de transición vítrea correspondiente a esa matriz. correspondiente a esa matriz.
Caraterísticas de TCaraterísticas de Tgg’ :’ :
•• El valor es independiente de la concentración El valor es independiente de la concentración inicial, sólo depende de la composición o tipo de inicial, sólo depende de la composición o tipo de soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su diagrama de estado característico que diferirá diagrama de estado característico que diferirá cuantitativamente pero no cualitativamente del cuantitativamente pero no cualitativamente del diagrama mostrado en la Figura anterior. diagrama mostrado en la Figura anterior.
•• Se determina generalmente por DSC a partir de Se determina generalmente por DSC a partir de soluciones que fueron almacenadas en soluciones que fueron almacenadas en condiciones de máxima formación de hielo. condiciones de máxima formación de hielo.
•• Conocer el valor de TConocer el valor de Tgg’ es importante para ’ es importante para evaluar la estabilidad de productos congelados (los evaluar la estabilidad de productos congelados (los cuales a Tcuales a Tgg’ son estables a la cristalización de ’ son estables a la cristalización de agua por largos períodos de tiempo). agua por largos períodos de tiempo).
CompuestoCompuesto T’T’gg ((°°C)C)
PentosasPentosas
RibosaRibosa --4848
XilosaXilosa --4747
HexosasHexosas
FructosaFructosa --4242
GlucosaGlucosa --4343
ManitolManitol --4040
Temperaturas de transición vítrea de carbohidratos máximamente concentrados. DisacáridosDisacáridos
SacarosaSacarosa --3232
TrehalosaTrehalosa --3030
LactosaLactosa --2828
TrisacáridosTrisacáridos
RafinosaRafinosa --2626
TetrasacáridosTetrasacáridos
EstaquiosaEstaquiosa --2424
MaltohexaosaMaltohexaosa --1515
CiclodextrinaCiclodextrina --99
concentrados.
• Gráfico ∆H de fusión vs. Cont. de agua.
Extrapolando hasta ∆H =0 se obtiene el cont. de agua de la matriz concentrada.
Determinación de la matriz máximamente concentrada (Tg’/cg’)
• A partir de los termogramas, disminuyendo el contenido de agua hasta que no aparezca agua congelable.
• Luego de efectuar una serie de templados, determinando la Tg de la matriz concnetrada y calculando su contenido de agua por Gordon y Taylor.
Muchas sales forman soluciones sobresaturadas durante el enfriamiento y eventualmente vitrifican. Durante la descongelación muestran una transición vítrea y luego cristalización del eutéctico.
Las soluciones binariasbinarias agua-sal tienden a Las soluciones binariasbinarias agua-sal tienden a formar eutécticos pero las mezclas ternariasmezclas ternarias de dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua generalmente vitrifican.
La formación de eutécticos parciales puede estar entonces acompañada de importantes cambios de pH.
Formación de vidrio y separación de fases eutéctica en soluciones de sal
Sal Sal TTgg’ T’ Tee
NaCl.2H2O <-60 -21.7
NaHCO3 -52 -4
Tris base -55 -4
Glicina -70 -4Glicina -70 -4
β-Ala -65 -14
CaCl2 -95 -52
NaCit -41 --
KCit -62 --
NaAc -64 --
KAc -76 --
Influencia de la velocidad de congelación sobre la Influencia de la velocidad de congelación sobre la morfología de los cristales en la muestra congeladamorfología de los cristales en la muestra congelada
LentoLento RápidoRápido
hielohieloSólidos en la matriz no Sólidos en la matriz no congeladacongelada
Posibles estrategias para evitar daños por hielo.
1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados)1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados)
2. Aumento de la velocidad de nucleación extracelular INAsINAs
3. Inhibición del crecimiento de cristales AFPAFP
Son lipoproteínas de cerca de 30 kD que reducen el grado de sobreenfriamiento.
Ice nucleating Agents Ice nucleating Agents (INAs)(INAs)
Proveen estructuras parecidas al hielo que sirven de molde.
Colorado potato beetle
Termogramas de agua pura y agua con agentes nucleantes (AgI o bacterias).
Ice nucleating bacteria from insects (Pseudomona syringae and Erwinia herbicola)
Muchos sistemas biológicos promueven nucleación heterogénea por medio de agentes nucleantes de hielo (INAs). Estos agentes nuclean hielo entre las células. Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C.
Agentes nucleantes de hielo
Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C.
INAs adaptativos: son generalmente proteínas con PM hasta 30000. Los aminoácidos se encuentran ordenados de tal forma que forman un molde para el hielo. Se forma una capa de hielo en la superficie de los INAs. Sin embargo, esto no llevará al crecimiento de cristales si no alcanzan un tamaño mayor que r*
Proteinas anticongelantes AFP
En condiciones de baja temperatura muchas plantas producen crioprotectores muchas plantas producen crioprotectores coligativos, como prolina o sacarosa.
En otras, ocurren cambios en proteínas y lípidos de membranas.
Unas pocas plantas son capaces de producir AFP que las protegen de los efectos negativos de la congelación.
AFPAFP
Se identificaron en peces antárticos pero luego se encontraron en microorganismos, insectos, microorganismos, insectos, plantas y nematodos.
(2,600 - 33,000 Daltons)
Actúan evitando el crecimiento de los cristales de hielo (bajo efecto sobre propiedades coligativas).
Antarctic Notothenoid
Mecanismo
Las AFP inhiben el crecimiento de hielo por adsorción-inhibición. Se adsorben específicamente a los planos de crecimiento de hielo evitando la de crecimiento de hielo evitando la propagación. Se comportan como “agentes inhibidores de hielo estructurales”
Hexagonal ice grown Hexagonal ice grown in aqueous solution
(flat disc)
Ice crystal grown in AFP solution
(bipyramidal)
ice-binding site
Type III antifreeze protein (AFP) linked through its N-terminus to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP).
Pertaya et al., 2007
AFPAFP--GFP on the surface of ice crystalsGFP on the surface of ice crystals
Pertaya et al., 2007
J Phys: Cond Matter
INAs Sobre-enfriamiento Tn
Tiempo de congelación
Caracterización de los efectos
Costos de energía
Tamaño de los cristales
Caracterización de los efectos
AFPs Sobre-enfriamiento
temperatura de congelación
Inhiben crecimiento de los cristales, modifican la morfología del hielo
Tamaño de los cristales,
Rate
INAS
Overall crystallization
Rate
TemperatureTgTm
Rate
AFPOverall crystallization
Rate
TemperatureTgTm
Rate
AFPINAS
Overall crystallization
Rate
TemperatureTgTm
Tem
pera
ture
4
150
100
50
Control cinético de la cristalización de solutos
y agua
Tem
pera
ture
W0.25 0.5 0.75 1
2
0
-50
-100
-150
0
Modificación de los diagramas de estado por cambios en la formulación
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