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UNIVERSIDAD VERACRUZANA Instituto de Medicina Forense
“Estudios preclínicos farmacológicos de extractos de raíz
Anthurium schlechtendalli Kunth en la remisión o prevención del daño
hepático inducido por 4-ter-octifenol en Modelos Murinos”
PROTOCOLO DE TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN MEDICINA FORENSE
PRESENTA GLADIS GUADALUPE ESPINOSA MARTINEZ
DIRECTOR:
DR. OCTAVIO CARVAJAL ZARRABAL
CO- DIRECTOR: MTRA. DULCE MARÍA BARRADAS DERMITZ
BOCA DEL RIO, VERACRUZ.
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CONTENIDO
Pág.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABLAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1.-INTRODUCCIÓN………………………………………………………………3
2.-JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
3.- HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …9
4.-OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
5.- MATERIALES Y MÉTODOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......11
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ..23
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CAPITULO I
1.- INTRODUCCIÓN
1.1 Hígado y Hepatotoxicidad
El hígado es un órgano complejo que realiza múltiples funciones; su relación con
otros órganos y rutas metabólicas así como sus funciones de desintoxicación
(Gomes da Silveira y Ribeiro Filho, 2006) le confieren un importante papel en la
salud de un individuo pues cualquier deficiencia en alguna de sus funciones puede
ocasionar graves transtornos con el paso del tiempo.
Las enfermedades hepáticas conllevan una alta tasa de mortalidad en el mundo. La
principal de ellas, la insuficiencia hepática aguada (IHA), es definida como el
“compromiso grave de inicio súbito de la función del hígado, en ausencia de daño
hepático previo, que se manifiesta por ictericia y luego encefalopatía dentro de las
ocho semanas del inicio del cuadro” (Soza Ried, 2002).
En los últimos años la incidencia de enfermedades hepáticas ha aumentado en la
población mexicana. Actualmente ocupan el cuarto lugar como causas de muerte en
México después de las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, la diabetes
mellitus y la cirrosis hepática (INEGI. Estadísticas de mortalidad, 2011).
El hígado se afecta en numerosos procesos inflamatorios como infecciones víricas,
toxicidad por fármacos y sus metabolitos, metabolopatías, procesos autoinmunes y
distintos defectos genéticos. En los últimos años numerosas publicaciones sugieren
que las reacciones adversas a fármacos son responsables de una mayor proporción
de casos de lesión hepática de lo que inicialmente se pensaba, constituyendo un
desafío para el médico de atención primaria, al que acuden con frecuencia pacientes
tratados con varios fármacos que presentan, muchas veces en el curso de revisiones
rutinarias, una alteración en la analítica hepática (Farrel, 2004).
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La hepatotoxicidad (HTX) se define como la lesión o daño hepático causado por la
exposición a un medicamento u otros agentes no farmacológicos. Con el término
reacción medicamentosa adversa se designa a la aparición de efectos de deletéreos
no intencionales que se producen con dosis farmacológicas utilizadas con fines
profilácticos y terapéuticos (Farrel, 2004).
Estas reacciones adversas que afectan al hígado son más difíciles de definir, por lo
que dicho concepto ha sido establecido por reuniones de consenso e incluye, al
menos, una de las siguientes alteraciones de los análisis bioquímicos hepáticos: 1)
aumento de Alanina aminotransferasa ( ALT) superior a dos veces el límite alto de la
normalidad, 2) aumento de la concentración de bilirrubina directa (BD) sérica más de
dos veces el límite alto de la normalidad, 3) aumento de aspartato aminotransferasa
(AST), fosfatasa alcalina (FA) y la concentración total de bilirrubina, siempre que uno
de ellos supere más de dos veces el límite alto de la normalidad (Benichou, 1990).
Aunque las reacciones adversas hepáticas (RAH) se consideren relativamente raras
en el conjunto de las reacciones adversas (4-10%), tienen una especial
trascendencia clínica debido a su potencial gravedad con hasta un 5% de mortalidad
según las series Davis, 1977; Pillans, 1996; Friis y Andreasen, 1992; Zimmerman,
1992. Es más, la hepatotoxicidad representa un problema sanitario de primer orden
en aumento en las últimas décadas, dado que es una de las principales causas de
muerte secundaria a medicamentos y supone la principal causa de retirada,
suspensión de comercialización y restricción de las indicaciones de productos
farmacológicos del mercado farmacéutico en Europa y en Estados Unidos (Bakke, et
al, 1995; Larrey, 2002; Temple y Himmel, 2002).
Los avances científicos y tecnológicos conllevan a la mejoría del diagnóstico y
tratamiento de muchas patologías, pero también están aumentando la incidencia de
enfermedades iatrogénicas. Dado que el hígado es el principal órgano implicado en
el metabolismo de nutrientes, fármacos y otros xenobióticos potencialmente tóxicos
que deben atravesarlo antes de alcanzar el torrente sanguíneo y otros tejidos, lo
hace particularmente susceptible a los fenómenos de toxicidad química. Es más, el
número de sustancias ajenas al organismo con actividad biológica capaces de
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inducir enfermedad hepática es muy amplio, habiendo sido incriminados en la
actualidad más de 1.100 fármacos en episodios de hepatotoxicidad, excluyendo
drogas de abuso y remedios de herboristería (Biour,2000).
1.2 factores de riesgo
Las causas de la Insuficiencia hepática pueden ser clasificadas en las siguientes
categorías:
Ø Infecciones virales
• Virus hepatotropos: hepatitis A, B, D, y E.
• Virus no hepatotropos: Citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr,
herpes simple virus, varicela zoster, adenovirus y virus de la fiebre
hemorrágica.
Ø Fármacos y toxinas
Daño relacionado con la dosis: acetaminofeno, tetracloruro de carbono,
Amanita phalloides, fósforo amarillo, toxina de Bacillus cereus, anti-
inflamatorios no esteroideos, sulfonamidas, tetraciclina, éctasis
(metildioximetanfetamina) y remedios basados en plantas medicinales.
Ø Reacción idiosincrásica: halotano, isoniazida, rifampicina, ácido valproico,
disulfiram.
• Cardiovascular. Insuficiencia cardiaca derecha, síndrome de Budd-Chiari,
enfermedad veno-oclusiva del hígado, golpe de calor.
• Metabólica. Hígado graso del embarazo, enfermedad de Wilson, síndrome de
Reye, galactosemia, intolerancia hereditaria a la fructosa, tirosinemia.
• Otras causas. Infiltración neoplásica (linfoma o metástasis), hepatitis
autoinmune.
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Frecuentemente el consumo de productos herbolarios o comúnmente denominados
"naturistas", no cuenta con una regulación sanitaria apropiada y se pueden comprar
libremente. Diversas hierbas y preparados herbales han sido implicados como causa
de daño hepático tanto en forma aguda como crónica. Algunas hierbas con toxicidad
demostrada son Teucrium chamaedrys (camedrio o germander), Celedonium
majus (celandina mayor), Piper methysticum rhizoma (kava-kava), Larrea
tridentata (chaparral o gobernadora), Cassia angustifollia (senna), Camellia
sinensis (té verde),Cimifuga racemosa (cohosh negro).
Las Hierbas y flores contienen diferentes polifenoles :flavonoides (rutina , hiperósido
, isoquercetina , quercitrina ,quercetina , I3 , II8 - biapigenin , amentoflavona ,
astilbina miquelianin ), ácidos fenólicos (ácido clorogénico ,De ácido 3 - O-
coumaroylquinic ) , diferentes naphtodianthrones( Hipericina , pseudohipericina ,
protohipericina ,protopseudohypericin ) , floroglucinoles ( hiperforina ,adhiperforina ) .
Parece que la acción farmacológica de estos compuestos biológicamente activos
contenidos en la planta.
Una de las plantas sujetas a estudio es Anthurium schelechtendalii Kunth (raíz de
piedra) miembro de la familia Araceae. Esta familia es principalmente tropical con
una mayor diversidad de especies en Asia y América tropical (Croat, 1998; 2004). En
México se han registrado 121 especies y 18 géneros, siendo los géneros
Philodendron y Monstera los más numerosos (Espejo y López–Ferrari, 1993). La
mayoría de las especies se concentran en las zonas tropicales de los estados de
Chiapas, Oaxaca, Yucatán y Veracruz, aunque existen algunos elementos de zonas
templadas; por ejemplo, Arisaema (Bunting, 1965).
No existen hasta ahora estudios fitoquímicos específicos de Anthurium,
schelechtendalii, sin embargo existe un reporte de la actividad antiproliferativa de
los extractos de raíz y hojas (Stark, et al., 2009). Por otra parte, en las hojas de
Anthurium versicolor, se han encontrado antioxidantes y compuestos fenólicos tipo
flavonoides en forma de glucósidos (Aquino, et al., 2001).
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Es bien sabido que la mayor parte de nuestra comprensión fundamental de la
bioquímica humana, fisiología, endocrinología y farmacología procede de los
estudios originados de los mecanismos en modelos animales (Larsen, M.Ø., 2001
citado en Hau, J., 2003).
Se ha podido establecer en ratas que una resección del 95% del hígado es un buen
modelo de FHF (He Y, et al, 2003), mientras que en ratones una hepatectomia de
menos del 90% es el límite de seguridad como modelos de estudio de regeneración
hepatica ya que por encima de dicho valor se encuentra en un nivel de fallo hepático
mortal (Makino H, et al, 2005).
Se ha demostrado que el Octifenol estimula la producción de radicales libres, lo que
resulta en el deterioro oxidativo de los lípidos, proteínas y ADN, y el inicio de varias
condiciones patológicas en seres humanos y animales. Por otra parte, se ha
demostrado que, tanto in vivo y en hepatocitos cultivados, en paralelo a daños en el
hígado, Octifenol puede también determinar una fragmentación reconocible de ADN
nuclear y cariolisis (Kim et al. 2006). Por otro lado, el propóleos puede ser útil para
mejorar los efectos tóxicos de diferentes sustancias (Aso et al. 2004).
Por tanto, se realizara el presente estudio para investigar la capacidad de extractos
obtenidos de la raíz de A. Schelechtendalii para remitir o prevenir el daño hepático
por Octifenol en Modelos murinos.
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JUSTIFICACIÓN
Desde los inicios de la humanidad el hombre ha tenido como aliadas a las plantas.
Un ejemplo claro es la familia Araceae, pues en México, desde la época
prehispánica diversas especies de esta familia eran utilizadas con fines medicinales,
alimenticios, mágico-religiosos y ornamentales (Mandujano et al., 2002; Anderson et
al., 2001).
Sin embargo, algunas de las plantas de esta familia carecen de estudios químicos y
de su actividad biológica, entre ellas podemos citar a las especies del género
Anthurium, del cual poco se sabe de sus propiedades biológicas. Aunque se han
realizado escasos estudios y actualmente se conoce que los extractos de
Stenocereus eruca así como Dracontium loretense tienen efectos analgésicos y
antinflamatorios (Imai et al., 2006; Okazaki et al., 2007). Tomando en cuenta lo
anterior, en este proyecto se propone determinar la actividad antiinflamatoria, efecto
regenerativo y citotóxica de extractos orgánicos y metabolitos secundarios de raíz
Anthurium schelechtendalii kunth aplicados en específico a nivel hepático.
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HIPOTESIS
Si existen compuestos bioactivos provenientes de la raíz de Anthurium
schelechtendalii Kunth (Raíz de piedra) en los extractos en estudio, que muestren
capacidad de remisión o prevención del daño hepático inducido por 4-ter-octifenol,
se harán evidentes en los modelos murinos de experimentación a través de las
valoraciones y exámenes de parámetros bioquímicos e histopatológicos.
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Establecer la capacidad de extractos de raíz anthurium schlechtendalli kunth en la remisión o prevención del daño hepático por 4-ter-octifenol.
3.2 Objetivos específicos
1.- Establecer la Concentración Letal 50 (LC 50) de los extractos de Anthurium schlechtendalli Kunth en Artemia salina sp.
2.- Definir las alteraciones bioquímicas, histopatológicas (hígado) y de fragmentación de DNA inducidas por el 4-ter-octifenol, en los animales de estudio.
3.- Establecer la capacidad de remisión de extractos de anthurium schlechtendalli kunth frente al daño hepático inducido.
4.- Establecer la capacidad hepatoprotectora de los extractos de anthurium schlechtendalli kunth frente a la administración de 4-ter-octilfenol.
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CAPITULO V
MATERIAL Y METODOS
5.1 Área física
El trabajo experimental se realizara en el laboratorio de química del Instituto Tecnológico de Veracruz (ITV) en el puerto de Veracruz.
5.2.- Recolección del material vegetal
La recolección de la raíz de Anthurium schelechtendalii kunth se realizara en
tlacojalpan en el estado de Veracruz, México. Se colectara también un ejemplar para
el herbario, el cual fue depositado en el Herbario Instituto Tecnológico del Estado de
Veracruz. La raíz colocara en papel periódico y será envuelto para su transporte al
laboratorio.
5.3 Análisis estadistico
La bioquímica y datos morfológicos se expresan como la desviación estándar media ± (x ± SD). La significancia estadística se determinó con el análisis de los procedimientos de la varianza, con un hoc de Tukey después de la prueba de rango múltiple-para la comparación de los medios (P <0,05). Los datos fueron analizados utilizando iBMC SPSSc Estadísticas Versión 20, 2011.
5.4 Métodos
1.-Tratamiento preliminar: limpieza, reducción de tamaño y secado
• La muestra total se fracciono en dos partes (A y B). • Parte A 950 g ( Muestra Fresca) • Parte B 900 g (Muestra Seca). Se dejó secar a temperatura ambiente
aproximadamente 1 semana para material seco.
a).- De material fresco completo
El material se lava con agua corriente para quitar tierra, y después se enjuaga con
agua desionizada. se desmembra y se corta en trozos de aprox. 5-10 cm.
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2.- Extracciones
Primer experimento 100g para cada caso: maceración, infusión y extracción por
solvente
Modo 1: Extracción por MACERACIÓN
Solvente: agua; temperatura: ambiente; relación materia prima: agua=
Recipiente: de vidrio ámbar con tapa rosca, tiempo:
Modo 2: Extracción por INFUSIÓN
Solvente: agua; temperatura: ebullición; relación materia prima: agua= 100g: 500ml
Recipiente: vaso de pp de volumen adecuado, parrilla de calentamiento y agitación;
tiempo:
Modo 3: Extracción por solvente orgánico
Solvente: acetato de etilo; temperatura: ebullición (77 ºC); relación materia prima:
acetato de etilo= ; recipiente: Soxhlet; tiempo:
Primer experimento 100g para cada caso: maceración, infusión y extracción por
solvente.
b).- De material seco y molido
Modo 1: Extracción por MACERACIÓN
Solvente: agua; temperatura: ambiente; relación materia prima: agua=
Recipiente: de vidrio ámbar con tapa rosca, tiempo: 24 hrs
Modo 2: Extracción por INFUSIÓN
Solvente: agua; temperatura: ebullición; relación materia prima: agua= 100g: 500ml
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Recipiente: vaso de pp de volumen adecuado, parrilla de calentamiento y agitación;
tiempo:
Modo 3: Extracción por solvente orgánico
Solvente: acetato de etilo; temperatura: ebullición (77 ºC); relación materia prima:
acetato de etilo= ; recipiente: Soxhlet; tiempo:
3.- Tratamiento de los Extractos
EXTRACTOS ACUOSOS
Separar el material vegetal del extracto por filtración (matraz kitasato, embudo
Buchner con papel filtro no. 1 ó 2, bomba de vació por aspiración con agua) para los
casos de extracciones acuosas. Recolectar el extracto filtrado para proceder a su
secado.
Poner a secar el material vegetal sobre papel estraza.
Medir el volumen de extracto, y distribuirlo equitativamente en viales para secado
por liofilización previamente pesados, y el volumen restante prepararlo para el
secado por aspersión.
EXTRACTOS CON SOLVENTE ORGANICO
En caso de extractos sin sólidos, proceder a la evaporación del solvente en
evaporador rotatorio al vació. Registrar el peso del extracto (considerar el peso
original del matraz de evaporación para obtener el peso del extracto).
4.- Secado de los Extractos
Extractos acuosos
• Por Liofilización: se requiere congelar las muestras contenidas en los viales y
ya congeladas proceder al secado.
• Por Aspersión: se procede a aplicar la muestra en el secador por aspersión
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Extractos con solvente orgánico
• Secar con corriente de Nitrógeno
5.- Experimentos en modelos in vivo
Todos los experimentos en modelos in vivo siguieron protocolos aprobados
internacionalmente, así mismo fueron autorizados por el comité de ética de
investigación en pequeños animales de la universidad veracruzana-UV.
Diseño Experimental
a).- De material fresco completo
Modo 1.- Extracción por INFUSIÓN
Extracto Secado Dósis (mg/kg peso):
Acuoso por Infusión Por Liofilización 200, 400, 600, 800, 1000,
1200, 1400,1600.
Por Aspersión 200, 400, 600, 800, 1000,
1200, 1400,1600.
Los resultados se someten a ensayo PROBIT
El criterio de selección para el extracto a experimentar en cuanto a efecto
nefroprotector es el de aquel o aquellos extractos que presenten la DL50 mayor ( el
o los de menor toxicidad).
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6.- Fase experimental con modelos murinos
Las fases experimentales se llevaron a cabo estableciendo procedimientos
metodológicos realizados en modelo murino de rata, comparando los casos de
tratamiento contra grupos control. Con el diseño experimental planteado se realizara
la evaluación del efecto tóxico de 4-ter Octifenol en hígado, mediante indicadores
bioquímicos que reflejan el daño por estrés oxidativo, pruebas metabólicas y
actividad enzimática en suero que reflejan la modificación de las funciones hepática;
así mismo se utilizara la técnica histológica para evaluar los cambios patológicos de
los tejidos muestreados de animales en experimentación que recibieron 4-ter
Octifenol.
6.1 Valoración de daño hepático
Se determinaran un total de 16 indicadores bioquímicos en suero para estimar las
siguientes enzimas:
Se determinara glucosa (GLUC) con el método de oxidasa. colesterol total (CHOL),
triglicéridos (TGL), proteínas totales (PT), albúmina (ALB), bilirrubina directa (BD),
transaminasa glutámico pirúvica (TGP), transaminasa glutámico oxalacética (TGO),
fosfatasa alcalina (FA), colinesterasa, y amilasa se determinó con un analizador
automático (RA 1000 XT, Bayer Technicon) a través de métodos enzimáticos
colorimétricos utilizando kits comerciales obtenidos de Bayer y BioMerieux.
Fosfatasa Alcalina(FA), Creatinfosfokinasa (CPK), Gammaglutamiltranspeptidasa
(GGT), Aspartatoaminotransferasa (AST), Alaninoaminotransferasa (ALT), Albúmina
(Alb), Bilirrubina total (BT), Bilirrubina Directa (BD), Proteínas totales (PT), Glucosa
(G), Acido Úrico (AU), Urea, Calcio (Ca), Fosforo (Pho), Colesterol total (Chol-T),
Trigliceridos (TG) y Creatinina (CREA) mediante el empleo de un analizador
automatizado Hitachi 704 de la Boehringer Mannheim utilizando kits comerciales de
la misma firma. También se determino el coeficiente proteico Albumina/ Globulina.
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6.2 Efecto Hepatoprotector de cada extracto seleccionado
Ratas macho Wistar DE 9-10 semanas de edad, pesando 249 ± 10 g, se colocan en
jaulas metálicas para su adaptación bajo condiciones establecidas: temperatura,
humedad, con periodos de obscuridad luz cada uno de 12 h; y con acceso ad libitum
de agua y de una dieta comercial. Esta contiene: Fósforo, Calcio, Magnesio,
Proteína cruda, Vitamina D3.
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• Los animales (n=30) se mantienen por una semana en las condiciones
referidas para su adaptación. Se dividen al azar en 6 grupos con 5 ratas cada
uno.
• El tiempo total de experimentación para el estudio en estos 6 grupos es de 4
semanas.
Grupo 1 (n=5)
Grupo 5 (n=5)
Grupo 2 (n=5)
Grupo 3 (n=5)
Grupo 4 (n=5)
Grupo 6 (n=5)
Grupo control ( gc)
• Solo se le administra la dieta
Grupo daño hepático inducido (gdhi)
• (Dieta + Octifenol)
Grupo al que se le administra la Dieta y el extracto a una concentración
• (Dieta + ExtAx%)
Grupo al que se le administra la Dieta y el extracto a otra concentración.
• (Dieta + ExBy%)
Grupo daño hepático Inducido, Administración de Octifenol y Extracto.
• (gdhi + ExtA% + Octifenol)
Grupo daño hepático Inducido, Administración de Octifenol y Extracto.
• (gdhi + ExtB% + Octifenol)
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PROCEDIMIENTOS Y DETERMINACIONES
• Peso: se pesaran semanalmente durante los 28 días del estudio
RECOLECCION DE SANGRE Y PLASMA TOTAL
• Después de la recolección de orina de 24 horas, las ratas se anestesian con
una inyección Intraperitoneales de ketamina (75 mg/kg) y xylazina (5mg/kg)
para recolectar sangre de la vena cava anterior, en un volumen aproximado
de 3.5 ml
• Esta sangre se coloca en tubos heparinizados.
• La sangre se centrifuga a 900 º g a 4ª C por 15 minutos. El plasma se
almacena a 80º C para los análisis correspondientes.
OBTENCION DE ORGANOS
Inmediatamente después de la muerte, el hígado derecho es removido y pesado. La
mitad del hígado derecho se almacena en nitrógeno líquido a -80ºC. La otra mitad
derecha se fijara en formaldehido al 10%.
Posteriormente a la inclusión del tejido en parafina se obtienen secciones de 5
micras las cuales se tiñen con tinción de hematoxilina-eosina.
Indicadores de daño
• Se removerá el hígado derecho, se seca sobre papel filtro y se pesan.
• Se fraccionaran muestras pequeñas de 2 x 2 cm de tejido de hígado (Lóbulo
Derecho) para colocarlos en formaldehido al 10% para estudios histológicos.
• Se obtendrán muestras de 1 g de tejido para hidrolizarlo con KOH 30% para
determinar glucógeno hepático (Fong et al., 1953); además se utilizó 0.5 g de
tejido (de hígado) para obtener un homogeneizado al 10% en KCl 1.15%,
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para medir el grado de lipoperoxidación en función de la cuantificación de
MDA con Acido 2-Thiobarbiturico (Uchiyama et al., 1978).
• La mitad de los órganos se congelan (debidamente etiquetados) a -80º C para
realizar estudios bioquímicos a realizar dentro de los 3 días siguientes
(medición de Glutatión y de Super oxido dismutasa).
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Metodología general
RECOLECCION DEL MATERIAL VEGETAL Y TRATAMIENTO PREVIO A LA MUESTRA
OBTENCION DE LOS EXTRACTOS DE Anthurium schelechtendalii Kunth Y SECADO DE LOS EXTRACTOS SEGÚN SU METODO.
DETERMINAR CL50 Y DL50 MEDIANTE LOS ENSAYOS CON Artemia salina sp. Y POSTERIORMENTE EN MODELOS in vivo.
PRUEBAS PRECLÌNICAS EN LOS MODELOS MURINOS:
-‐ACLIMATIZACIÓN DE LOS ANIMALES.
-‐TRATAMIENTO DE LOS ANIMALES
-‐OBTENCIÒN DE MUESTRAS
-‐PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y
GENERACIÓN DE RESULTADOS.
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Fase experimental con modelos murinos
22
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Recolección del material vegetal
Tratamiento preliminar a la muestra
Extracciones de los extractos tanto acuoso como del material orgánico
Determinar Concentración Letal 50 (CL50) de los extractos mediante el ensayo de Artemia salina sp.
septiembre – mayo
2014
Recolección del material vegetal necesario para proceder a la extracción y generar mayor cantidad del extracto el cual se utilizara a conveniencia en el diseño experimental.
junio – julio
2014
1. Realizar el análisis para elegir a los modelos murinos
2. Adquirir a los modelos murinos, verificar que cumplen los criterios
3. Proceder a administrar 4-ter-octifenol en su alimentación para producir el daño hepático
4. Realizar la determinación de orina, sangre y biopsia histológica para corroborar el grado de daño Hepático
5. Administrar a los murinos con daño hepático el extracto de la raíz de piedra y monitorear si existe la remisión
6. Corroborar la mejoría de la enfermedad tomando muestra histológica para comparar.
agosto – diciembre
2014
Organizar los datos enero 2015
Análisis estadístico de resultados febrero 2015
Presentación de resultados y conclusiones abril 2015
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REFERENCIAS
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