02_cultivo microorganismos MG 08-09

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Microbiología general

2008 - 2009Antonio G. Pisabarro

Catedrático de Microbiología



Tema 2: Cultivo de microorganismos

• Crecimiento microbiano.• Cultivo de microorganismos.

• Medios de cultivo.• Métodos de aislamiento.• Concepto de cultivo puro.• Crecimiento microbiano en medio líquido.

• Crecimiento microbiano en medio sólido.• Concepto de muerte de un microorganismo.• Medida del crecimiento y enumeración de microorganismos.• Crecimiento microbiano equilibrado.

• Cinética de crecimiento de un cultivo estanco.• Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento.• Rendimiento de los cultivos.• Cinética de crecimiento en un cultivo continuo.• Tipos de fermentadores.



Crecimiento microbianoCiclo celular Crecimiento

20-30 min E. coli a 37º



Medios de cultivo

• Soporte para el crecimiento demicroorganismos

• Clasificación– definidos y complejos

– líquidos y sólidos– En función de los microorganismos que puedencrecer en ellos, los medios pueden ser:

• Generales

• Selectivos• Diferenciales• Selectivo-diferenciales

• Medios de enriquecimiento



Nutrición y cultivo de

microorganismos

• Varios tipos de metabolismo– Foto- / Quimio-

– - lito - / - organo –

• Concentración de nutrientes: oligotrofía

• La mayoría de las especies microbianas no soncultivables





Cultivos puros y recuento de

microorganismos• Tiene sólo un tipo de microorganismo

• En medio sólido forma una colonia aislada

• Cada colonia procede de

un único individuo inicial

• El número de colonias nos

indica el número de célulasiniciales



Medios de cultivo

• Soporte para el crecimiento de microorganismos

• Clasificación – definidos y complejos

– líquidos y sólidos

– En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser:

• Generales

• Selectivos• Diferenciales

• Selectivo-diferenciales

• Medios de enriquecimiento



Esterilización de medios de cultivo

• Eliminación de todo tipo de microorganismo

• Concepto de esterilidad y asepsia• Autoclaves



Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios decultivo. Esterilización.

Práctica 2: Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de

manipuladores.

Práctica 3: Obtención de cultivos puros.Práctica 4: Recuento del número de bacterias por

mililitro de un cultivo líquido.Práctica 5: Cultivo de bacterias anaerobias.Práctica 6: Observación de bacterias teñidas. Tinción Simple y Tinción de Gram.Práctica 7: Transformación bacteriana por resistencia a ampicilina.

Práctica 8: Antibiograma.Práctica 9: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbianoPráctica 10: Aislamiento y caracteristicas de un bacteriófago (virus de bacterias).Práctica 11: Observación de levaduras.Práctica 12: Tinción de esporas.

Práctica 13: Tinción de cápsula.

Programa de prácticas



Cultivos puros y recuento de

microorganismos• Tiene sólo un tipo de microorganismo

• En medio sólido forma una colonia aislada

• Cada colonia procede de

un único individuo inicial

• El número de colonias nos

indica el número de célulasiniciales



Medida del crecimiento

Número de células

Masa celular

Componentes celularesPared celular

DNA

RNAproteínas




Número de células




Biología de los Microorganismos de Brock








Masa celular



Cinética del crecimiento

2gg

….….

1287

646

325

164

83

42

2110

Número decélulas N

Nº generaciones(g)

N = N0 2g




6553616

3276815

1638414

819213

409612

204811

102410

5129

2568

1287

646

325

164

83

42

21

10

Ng

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 5 10 15 20

N = N0 2g

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 5 10 15 20




0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 5 10 15 20

N = N0 2g

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 5 10 15 20

Log N = Log N0 + g Log 2

N puede ser

Biomasa

Densidad ópticaNúmero de células

Conc proteína

Conc. DNA

Conc. RNAetc ..




dN / N = µ dt

∫dN / N = µ

∫dt

Ln N – Ln N0 = µ t

dN / dt = µ N La velocidad (tasa) de

crecimiento es proporcional al

número de células

LnN = Ln N0 + µt

El logaritmo del número de

células varía de forma linealcon el tiempo.

La pendiente de la recta de

proporcionalidad es la tasa de

crecimiento µ

N = N0eµt El aumento del número de

células es exponencial




LnN = Ln N0 + µtN = N0eµt

N = N0 2g





2g = eµt

g Ln2 = µt

µ = g Ln2 / t g = t / τ

µ = Ln2 / τ

N = N0eµt

N = N0 2g




LnN = Ln N0 + µt

Tiempo (t)

LnN

Ln N0

Pendiente = µ





Log N = Log N0 + (t/τ) Log 2

Log N = Log N0 + t (Log 2 / τ)




Tiempo (t)

LogN

Log N0

Pendiente = Log2/τ

Log N = Log N0 + t (Log 2 / τ)



Cinética del crecimientoProblema 1:

Calcular la tasa de crecimiento y el tiempo de generación de las bacterias

de un cultivo que pasa de tener una DO550 de 0.1 a 0.78 en 120 min.

LnN = Ln N0 + µt

Ln0.78 = Ln 0.1 + µ 120 min

µ = 1.03 h-1

τ = 0.67 h τ = 40.38 min



Cinética del crecimientoEquivalencias entre la tasa de crecimiento y el tiempo de generación

µ = Ln2 / τ

Cuando µ = 1 h

-1 ,

entoncesτ

= 0.69 h = 41 min (aporx.)Cuando τ = 0.5 h, entonces µ = 1.4 h-1

Cuando τ = 1 h, entonces µ = 0.69 h-1

Ti d ió d l b t i di i



Bacteria Medio Tiempo gen (min)

Escherichia coli Glucosa sales 17Bacillus megaterium Sacarosa sales 25Streptococcus lactis Leche 26Streptococcus lactis Caldo de lactosa 48

Staphylococcus aureus BHI 27-30Lactobacillus acidophilus Leche 66-87Rhizobium japonicum Extr. Manitol levadura 344-461M. tuberculosis Sintético 792-932Treponema pallidum Testículo ratón 1980

Tiempo de generación de algunas bacterias en condiciones

óptimas de cultivo.




Efecto de la temperatura sobre la



Efecto de la temperatura sobre lavelocidad de crecimiento de los

micoorganismos


Clasificación de los microorganismos



Clasificación de los microorganismossegún la temperatura


Efecto del ion Na+ sobre el



Efecto del ion Na sobre elcrecimiento microbiano


Efecto del pH sobre el crecimiento de



Efecto del pH sobre el crecimiento demicroorganismos


Efecto del oxígeno sobre el



Efecto del oxígeno sobre elcrecimiento de microorganismos




Rendimiento del cultivo

Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilización delsubstrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puedeproducirse por unidad de substrato consumido

Rendimiento del cultivo



Tiempo (t)

L o g B i o m a s a ( N )

[S1]

[S2]

[S3]

[N1]

[N2]

[N3]

N

[S]

m = Ys



Tasa específica de consumo de substrato

Comparación del Transporte Activo




Concentración Externa de solutos

Concentración

Interna desolutos

Transporte

activo

Difusión Simple

con la Difusión Simple



Ecuación de Monod

[substrato]

T a s a d e

c r e c i m i e n t o ( µ )

µmax

µmax / 2

Ks

F d



Fermentador


F t d



Fermentador

New Brunswick Scientific Co., Inc.

Genentech, Corporate Communication

F t d



Fermentador

ICI, Ltd. factory, Billingham, UK,

F t d



Fermentador

Novo Nordisk



C lti ti



Cultivo continuo

Tasa de diluciónD = Φ / V

D = µ


C lti o contin o



Cultivo continuo


Cultivo continuo



Cultivo continuo

D

Biomasa

Concentración

de substrato

µmax



Referencias

• Una buena parte de las imágenes de esta presentación proceden dellibro Brock. Biología de los Microorganismos

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