201103_guias_bioqca_1_2013

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA GUIA COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO: 201103 – BIOQUÍMICA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO

201103 – BIOQUÍMICA

GOLDA MEYER TORRES VARGAS (Director Nacional)

ALBERTO GARCÍA JEREZ Acreditador

DUITAMA ENERO 2013

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2. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El presente material en primera instancia fue diseñado por el Ingeniero Rubén Darío Munera en el 2008, quien en ese entonces era el director de curso, era y es tutor de la UNAD Cead Palmira. El ingeniero Rubén Munera recopilo además las guías de laboratorio que están contenidas en el material impreso de la Unisur “Bioquímica” de Gerardo Pérez y Yolanda Navarro publicado en 1992.

Este material ha tenido tres actualizaciones, la primera en el 2008 el Ingeniero Rubén Darío Munera, la segunda en el 2009 r y la tercera en agosto de 2010 por Q.A de alimentos Golda Meyer Torres, tutor de la UNAD del Cead de Duitama, y quien se desempeña actualmente como directora del curso.

El proceso de revisión de estilo del material y aportes disciplinares, didácticos y pedagógicos en el proceso de acreditación de material didáctico desarrollado en el mes de JULIO de 2009, ENERO y AGOSTO de 2010 se hizo por parte del Biólogo Alberto García, tutor del Cead de Bucaramanga y se mantiene la vigencia para el 2011,2012 y en el 2013-1 se hacen algunos pequeños ajustes en los contenidos referentes a materiales y reactivos.

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3. INDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 7

JUSTIFICACIÓN 7

PRÁCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

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PRÁCTICA No. 2: FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD

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PRÁCTICA No. 3: ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS 33

PRÁCTICA No. 4 :ESTUDIO CINÉTICO DE LA UREASA 48

PRÁCTICA No. 5: DETERMINACIÓN DE VITAMINA C 64

PRÁCTICA No. 6: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA 71

PRÁCTICA No. 7: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 76

PRÁCTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 84

PRÁCTICA No. 9- HIDRÓLISIS DE POLSACARIDOS, MÉTODO DEL REACTIVO 3,5-DINITROSALICILATO

91

PRÁCTICA No. 10: RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS: RECONOCIMIENTO DEL GLUCÓGENO .

99

PRÁCTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LÍPIDOS 110

PRÁCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS (Opcional, puede hacerse en lugar de las prácticas #1, 6, 7, 8,10 y 11.

119

FUENTES DOCUMENTALES 143

ANEXOS

SEGURIDAD INSUTRIAL

144

PREPARACIÓN DE REACTIVOS 147

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4. LISTADO DE TABLAS

Tabla 1: reactivos práctica 1……………………………………………………………14

Tabla 2: Marcha de la práctica 1……………………………………………………….19

Tabla 3: Rúbrica de la práctica 1………………………………………………………21


Tabla 5: batería de tubos método Biuret para la cuantificación de proteínas…...28

Tabla 6: batería de tubos método Folin Lowry cuantificación de proteínas……...29

Tabla 7: Rúbrica de la práctica 2……………………………………………………...31


Tabla 9: Marcha de la práctica 3……………………………………………………….37

Tabla 10: Marcha de la práctica 3 alfa- amilasa………………………………..........40

Tabla 11: batería de tubos efecto de la concentración, alfa-amilasa……………...42

Tabla 12: batería de tubos efecto del pH, alfa-amilasa……………………………..43

Tabla 13: batería de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa………………..44

Tabla 14: Rúbrica de la práctica 3…………………………………………………….46

Tabla 15: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco………………...52

Tabla 16: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa, tubos problema…………….53

Tabla 17: resultados pH óptimos de la ureasa, tubos problema……………….......53

Tabla 18: resultados pH óptimos de la ureasa, método espectrofotométrico…….54

Tabla 19: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco método 2…….56

Tabla 20: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos problema método 2…56

Tabla 21: expresión de resultados pH de la ureasa tubos problema método 2…..57

Tabla 22: baterías de tubos variación concentración de sustrato, tubos problema58

Tabla 23: expresión de resultados variación concentración de sustrato…………..58

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Tabla 24: baterías de tubos variación de la temperatura……………………………60

Tabla 25: baterías de tubos extracción de ureasa de leguminosas……………….61


Tabla 27: reactivos práctica 5…………………………………………………………..66

Tabla 28: baterías de tubos cuantificación de vitamina C…………………………..68




Tabla 32: reactivos la práctica 7………………………………………………………78




Tabla 36: reactivos de la práctica 9…………………………………………………..93

Tabla 37: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis química…..95

Tabla 38: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis enzimática.96


Tabla 40: reactivos de la práctica 10……………………………………………….101

Tabla 41: Marcha de la práctica extracción de glicógeno…………………………103

Tabla 42: Marcha de la práctica extracción de disacáridasas……………………105

Tabla 43: Marcha de la práctica acción de disacáridasas…………………………106

Tabla 44: Rubrica práctica 10………………………………………………………..108

Tabla 45: Reactivos práctica 11…………………………………………………….112

Tabla 46: Rúbrica de la práctica 12…………………………………………………117

Tabla 47: reactivos práctica 12………………………………………………………128

Tabla 48: Rúbrica de la práctica 12…………………………………………………140

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4.1 LISTADO DE GRÁFICOS Y FIGURAS

Figura 1: fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad……………………………………………………………………………… 27

Figura 2: Extracción de biomoléculas……………………………………………….132

Figura 3: Extracción de lípidos de la tema de huevo……………………………..135

Figura 4: Montaje para destilación en el método de Micro Kjeldahl……………..138

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5. CARACTERÍSTICAS GENERALES

Introducción Uno de los cursos fundamentales es la Bioquímica el cual permite comprender los mecanismos de formación y transformación de los nutrientes que componen un determinado alimento.

La presente guía de prácticas de laboratorio contiene una serie de experimentos básicos que complementan los conceptos fundamentales.

El trabajo de laboratorio utiliza como materiales de experimentación, materias primas de uso común como harinas de cereales y leguminosas, féculas, frutas y verduras, tejidos de origen animal, que ayudan al estudiante a asimilar las técnicas de uso común en la investigación bioquímica con fuentes alimenticias o potencialmente alimenticias.

La investigación no es completa sino se divulgan los resultados obtenidos en la experiencia. Es importante que el estudiante aprenda la forma de reportar sus datos y a saber interpretar las conclusiones obtenidas por otros investigadores, con el fin de evaluar su propia investigación. Esto hace necesario que elabore un informe donde presente sus datos, resultados y conclusiones obtenidos durante el trabajo experimental.

En esta guía de prácticas de laboratorio, se presentan 12 sesiones. Para el porcentaje dentro del 100% del curso equivalen al 30%, de las cuales las prácticas del 1 a la 11 tienen una ponderación de acuerdo a la complejidad de la guía.

La práctica #12, no esta considerada dentro de esta ponderación (30%), porque se recomienda que esta práctica puede reemplazar de alguna manera las prácticas #1, 6, 7, 8,10 y 11, que bien disponiendo de los recursos de cada Cead, pueden ponderarla a libertad del tutor que oriente el laboratorio.

Justificación Un curso de bioquímica sin experiencia práctica es un curso incompleto, sólo con el desarrollo de laboratorios, los estudiantes asimilan los complejos conceptos que encierra una bioquímica general.

EL desarrollo de los laboratorios, conlleva a los estudiantes adquirir competencias académicas al argumentar en los análisis de resultados, al interpretar los resultados y a proponer aplicación de dichas experiencias en los contextos regionales.

Intencionalidades PROPÓSITOS

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formativas Reconocer mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

Cuantificar fracciones proteicas y glúcidos mediante las técnicas de análisis instrumental, volumétrico y gravimétrico.

Interpretar los resultados obtenidos en cada observación para argumentar los resultados en el análisis de resultados y proponer posibles aplicaciones en los contextos regionales.

Reconocer a las biomoléculas como unidades fundamentales y su importancia en los diferentes procesos metabólicos

Complementar con cada práctica los conceptos fundamentales de las 45 lecciones del módulo.

OBJETIVOS

Que el estudiante reconozca mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

Que el estudiante cuantifique fracciones proteicas y glúcidos mediante las técnicas de análisis instrumental, volumétrico y gravimétrico.

Que el estudiante interprete los resultados obtenidos en cada observación para argumentar los resultados en el análisis de resultados y proponer posibles aplicaciones en los contextos regionales.

Que el estudiante reconozca a las biomoléculas como unidades fundamentales y su importancia en los diferentes procesos metabólicos

Que el estudiante complemente con cada práctica los conceptos fundamentales de las 45 lecciones del módulo.

COMPETENCIAS

El estudiante reconoce mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

El estudiante cuantifica fracciones proteicas y glúcidos mediante las técnicas de análisis instrumental, volumétrico y gravimétrico.

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El estudiante interpreta los resultados obtenidos en cada observación para argumentar los resultados en el análisis de resultados y proponer posibles aplicaciones en los contextos regionales.

El estudiante reconoce las biomoléculas como unidades fundamentales y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

METAS

El estudiante presentará y sustentará un informe personal (pre informe) y un trabajo grupal (informe de laboratorio) como resultado del estudio, aplicación y análisis sistemático del desarrollo de cada práctica de laboratorio, presentando un análisis de resultados utilizando un lenguaje amplio relacionado con la temática.

El estudiante describirá a las diferentes biomoléculas identificadas en las pruebas cualitativas cuantitativas.

El estudiante resolverá los cuestionarios planteados en cada una de las prácticas de laboratorio.

El estudiante aprenderá el manejo de las principales técnicas bioquímicas generales para la identificación de biomoléculas.

Denominación de practicas

Práctica no. 1: métodos cualitativos para la identificación de aminoácidos y proteinas.

Práctica no. 2 – fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad.

Práctica no. 3 – ensayos enzimáticos cualitativos.

Práctica no. 4 – estudio cinético de la ureasa.

Práctica no. 5- determinación de vitamina C.

Práctica no. 6- aislamiento del en ARN levadura.

Práctica no. 7- aislamiento y determinación de ácidos nucleicos.

Práctica no. 8- propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos.

Práctica no. 9- hidrólisis de polisacáridos, método del reactivo 3,5-dinitrosalicilato.

Práctica no. 10- reconocimiento cualitativo de carbohidratos: reconocimiento

10



del glucógeno a partir del almidón.

Práctica no. 11- reconocimiento cualitativo de lípidos

Práctica no. 12- fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (opcional, puede hacerse en lugar de las prácticas practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11.

Número de horas 16 H

Porcentaje 30%

Curso Evaluado por proyecto

SI___ NO_x_

Seguridad industrial

El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo. (Ver Anexo).

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6. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS

PRACTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Tipo de practica

Presencial X Autodirigida Remota Otra ¿Cuál

Porcentaje de evaluación 2,5% Horas de la practica 1 H Temáticas de la práctica Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 1, aminoácidos

y capítulo 2, péptidos y proteínas. Intencionalidades formativas Propósitos

Reconocer a los aminoácidos como unidades estructurales de las proteínas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de las proteinas y pérdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitación y desnaturalización).

Objetivos

Que el estudiante reconozca los aminoácidos como unidades estructurales de las proteínas. Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos en las muestras.

Que el estudiante establezca la relación entre la estructura y la función de las proteinas y pérdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitación y desnaturalización).

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura de aminoácidos y proteínas.

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El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a través de la elaboración de informes escritos.

Metas

Al finalizar la práctica #1:

El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.

Fundamentación Teórica

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso, enfatizando en:

• Clasificación de aminoácidos

• Enlace peptídico

• Niveles de estructuración

• Solubilidad de proteínas: desnaturalización por calor y pH extremos. Precipitación por metales pesados, Precipitación acídica

2. Pruebas cualitativas: enfatizar en las reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método.

1. Reacción de la ninhidrina

2. Reacción xantoproteica

3. Reacción de millón

4. Reacción del ácido glioxílico

5. Prueba de Pauly

6. Prueba del Nitroprusiato

7. Reacción de Sakaguchi

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8. prueba de Biuret.

Descripción de la practica

En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminoácidos que componen las proteínas de los extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R ó cadena lateral.

Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas en tratamientos de precipitación y desnaturalización.

Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 1, aminoácidos y capítulo 2, péptidos y proteínas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los aminoácidos y la función biológica de las proteinas en los tejidos biológicos.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Material de vidrio Material biológico y otros (estudiantes)

Reactivos Equipos

Tubos de ensayo Alimento de origen vegetal o animal: concentrados, proteína cárnica, hígado, huevo, etc.

Reactivo de millón Estufas ( 5)

gradillas tapabocas Agua destilada, Solución de CuSO4 1%

pHmetro (1)

espátulas Libros de bioquímica Solución NaOH 30% y 40%, Solución saturada de NaCl

Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10 ml

Marcador de vidrio HNO3 concentrado, Cristales de sacarosa

Balanza analítica

Mallas de asbesto Cinta para rotular HCl concentrado, Acido triclorácetico 10%

Termómetros 120 ºC

Papel filtro Cuaderno de laboratorio Solución ácido pícrico saturada, Etanol 95%

mecheros

Embudos Bata blanca Solución de (NH4SO4) al 50%, acetona

Espectrofotómetro

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Agitador de vidrio Marcador para vidrio Solución de acetato de plomo 0.5 %

Erlenmeyers 100 y 250 ml

Reactivo de sakaguchi, Ácido acético glacial

Vasos de precipitado 250 ml

HSO4 concentrado, Acido acético al 30%

Vasos precipitado 500 ml

Aminoácidos: glicina, tirosina, triptófano, aminoácidos azufrados, leucina

Probeta 100 ml Ninhidrina ( 2g/l) prepárese en fresco, Hidróxido de amonio.

Pinzas para tubos en madera

Ácido sulfanilico (10 g/l en solución de HCl 1 mol/l).

Vidrios reloj grandes

Nitrito de sodio, Carbonato de sodio

Mortero con mango

Acetato de plomo, Nitrato de mercurio.

Soporte para embudos

Nitroprusiato de sodio (20 g/l, prepárese fresco).

Pinzas para tubos de ensayo metálicas

Alfa- naftol, Agua de bromo

Vasos de precipitado de 1000 ml plástico

Ácido fosfórico, Molibdato de sodio

Vasos de precipitado de 600 plástico

Tungsteno de sodio, Sulfato de cobre, Nitrato de sodio

Tabla 1: reactivos práctica 1.

Software a utilizar en la práctica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la práctica

Objeto de Aprendizaje (OA): pruebas cualitativas para determinar aminoácidos y proteínas partes 1 y 2.

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Ubicación: Página principal del curso, tópico Unidad 1.

Seguridad Industrial

REACTIVO PROTECCION RIESGO

Ácidos inorgánicos concentrados

Gafas de seguridad, tapabocas.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #1 del curso.

La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #1 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Procedimiento:

1. Pruebas Cualitativas

1. 1 Obtención de los Extractos:

-En el caso de alimentos en polvo, coloque unos 30 gramos en un vaso de precipitado, agregue 100 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtre a través de tela limpia. Conserve el líquido (filtrado) para las pruebas de las proteínas.

-En el caso de los alimentos concentrados ó sólidos, muélala o macérelas por separado y recoja el molido en vasos de precipitado. Agregue 100 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtra a través de tela. Recoja los filtrados en vasos de precipitado o en Erlenmeyers previamente marcados. Deseche los residuos.

-En el caso de la solución de clara de huevo: Haga un pequeño orificio en uno de los extremos del huevo y

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vierta por él la clara en un vaso precipitado, dejando dentro la yema. Luego agregue a la clara 100 ml de agua destilada y agite con el fin de disolverla.

Marcha de la práctica:

Prueba PROCEDIMIENTO

en un tubo de ensayo colocar:

VOLUMEN RESULTADO ANALISIS DEL RESULTADO

Biuret extracto problema 2 ml

NaOH al 30% 2 ml

Mezclar e ir añadiendo gota a gota el sulfato cúprico al 1% (CuSO4), agitando después de cada adición, hasta la aparición de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica la reacción positiva.

MILLON

extracto problema 2 ml

Reactivo de millón 0.5 ml

XANTOPRO-

TEICA


HNO3 concentrado ( observar ) 1m

Mezclar bien, calentar a la baño maría y observar. Adicionar solución de NaOH al 40% lentamente sin agitar y observar.

2 ml

LIEBERMAN


Cristales de sacarosa Una pizca

HCl concentrado 5 ml

Calentar a ebullición por 5 a 7 min.

GRUPOS SH


Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH) 1ml

Acetato de Plomo al 0.5 % 1 ml

Mezclar bien, calentar a la llama por 4 min , mezclando continuamente y observar

SAKAGUCHI extracto problema 2 ml

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Reactivo de sakaguchi 0.5 ml

Mezcla bien y observar

REACCIÓN DEL ÁCIDO GLIOXÍLICO


Ácido acético glacial 2 ml

HSO4 concentrado, dejar caer lentamente por las paredes del tubo inclinado, hasta que se formen dos capas. Observe el cambio de color en la interfase. Si se forma un anillo violeta en la interfase de los dos líquidos, la reacción se considera positiva

2 ml

Reacción de la ninhidrina

Extracto problema, ajustar pH a 7.0 1 ml

Solución de ninhidrina, hervir a baño maría por 2 min. Observar coloración.

5 gotas

Prueba de Pauly

Acido sulfanílico 1 ml

Extracto problema 2 ml

Enfriar en hielo

Agregar solución de NaNO2 y dejar enfriar por 3 min.

Adicionar Na2CO3. Anotar colores formados.

2m

Prueba del nitroprusiato

Solución de nitroprusiato de sodio 0.5 ml

Mezclar con el extracto problema 2 ml

Adicionar Hidróxido de amonio, deje reposar por 5 min.

0. 5 ml

Precipitación de proteínas

Prueba PROCEDIMIENTO


VOLUMEN

RESULTADO ANALISIS DEL RESULTADO


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PRECIPITACION ACIDICA

ácido pícrico saturado 1 ml

Agite y observe la formación precipitado (enturbamiento)



ácido acético al 30% 0.5 ml


Solución saturada de Cloruro de sodio (NaCl)

1 ml

Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. se presenta un enturbamiento mas o menos intenso que persiste al enfriamiento, también puede observarse pequeños grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro.


extracto problema 2ml

ácido tricloroacetico al 10% 2 ml


SOLVENTES ORGANICOS


Etanol al 95%. 2 ml

Observe la formación de precipitado (enturbamiento)

SOLVENTES ORGANICOS


Acetona 2 ml

Observe la formación de precipitado (enturbamiento)

SULFATO DE AMONIO


Solución de Sulfato de amonio al 50 %

2 ml

Mezclar bien. Dejar en reposo durante 10 min. Observe si se forma

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un Precipitado. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 min., observar. La reacción positiva se manifiesta por la formación de un precipitado, dependiendo directamente de la concentración de albúmina presente en la muestra.

DESNATURALI-

ZACIÓN POR CALOR


Caliente en agua hirviendo durante 10 minutos asegurándose que la temperatura interna llegue a los 95 – 100ºC. Observe la formación de precipitado (enturbamiento).

METALES PESADOS

Extracto problema 2 ml

Gotas del metal 5 gotas

Calentar suavemente a baño maría si no observa reacción inmediata.

Tabla 2: Marcha de la práctica 1.

Cuestionarios:

1. Diga cuáles son los fundamentos químicos de las pruebas estudiadas para el reconocimiento de aminoácidos. En esta parte Ud tiene que analizar el fundamento teórico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el color obtenido, que indica cada prueba?)

2. Explique con argumentos válidos el comportamiento observado de las proteinas en cada una de las pruebas de precipitación. Que indica la presencia de precipitado?

3. Determine mediante graficas el extracto que más pruebas positivas obtuvo y analice esta situación.

4. Presente los cálculos para la determinación de la concentración de proteína a partir de los datos de Absorbancia y concentración de la curva patrón.

Sistema de Evaluación

Evaluación individual:

• cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe.

• desempeño y desenvolvimiento durante la sesión de laboratorio

Evaluación grupal:

• el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de

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resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Informe o productos a entregar

Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.

Rúbrica de evaluación

Ítem Evaluado Valoración Baja Valoración Media Valoración Alta

Máximo Puntaje

Asistió y participó activamente del desarrollo de la práctica

El estudiante no asistió. (Puntos = 0)

El estudiante asistió pero su desempeño no fue en la habilidad del trabajo en grupo y desempeño de la práctica no fu excelente. (Puntos =3.0 )

El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo del laboratorio

(Puntos = 7.0)

10

Entrega del debido pre informe y sustentación del mismo

No hay entrega de los productos solicitados

(Puntos = 0).

Hay entrega de los productos solicitados pero su contenido no es pertinente.

(Puntos = 5.0 )

Hay entrega de los productos solicitados y contenido es pertinente.

(Puntos =10)

20

Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis) , conclusiones y referencias)

máximo de hojas 8

El informe no presenta una excelente estructura.

(Puntos = 0)

Aunque el informe presenta una estructura base, la misma carece de algunos elementos del cuerpo solicitado.

(Puntos = 0.5 )

El informe presenta una excelente estructura y presentación.

(Puntos =1.0)

5

Redacción y ortografía

El informe presenta deficiencias en redacción y errores ortográficos (Puntos = 0)

No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el

5

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Tabla 3: Rúbrica de la práctica 1.

Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles , para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta,

(Puntos = 0.5 ) cuerpo del texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0)

Fines del informe

El informe no da respuesta a los lineamientos de las prácticas de laboratorio.

(Puntos = 0)

Aunque presenta resultados y análisis de resultados estos no son pertinentes. Se evidencia la ausencia de análisis y deducción.

(Puntos =4)

El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el análisis de resultados.

Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8)

45

Referencias

Se maneja de manera inadecuada el uso de citas y referencias (Puntos = 0)

Aunque presenta referencias, estas no se articulan adecuadamente con el trabajo (Puntos = 0.5)

El manejo de citas y referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0)

5

TOTAL DE PUNTOS POSIBLES 90

Retroalimentación

El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiva retroalimentación del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica de evaluación.

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PRACTICA No. 2 – FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS EN SEMILLAS DE

LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD 1

Tipo de practica Presencial X Autodirigida Remota

Porcentaje de evaluación 2.5% Horas de la practica 2H Temáticas de la práctica Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 2,

péptidos y proteínas, lección 10: Clasificación y Propiedades Fisicoquímicas.

Intencionalidades formativas Propósitos

Comprobar la teoría con la práctica en relación al comportamiento según la solubilidad de proteínas.

Obtener las fracciones de albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biológicos.

Calcular mediante espectrofotometría, la concentración de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.

Objetivos

Que el estudiante compruebe la teoría con la práctica en relación al comportamiento según la solubilidad de proteínas.

Que el estudiante obtenga las fracciones de albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biológicos.

Que el estudiante calcule mediante espectrofotometría, la concentración de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los

1 Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur.

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resultados del fraccionamiento de proteínas con cada uno de los solventes utilizados.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada fracción de proteína y el solvente usado.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos.

Metas





El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método:

1. Solubilidad y precipitación de las proteínas

2. Clasificación de Osborne de las proteínas, por el criterio de solubilidad

3. Métodos cuantitativos para la determinación de proteínas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford).

Nota: algunas de las temáticas las encuentra en el módulo del curso.

Como fuentes documentales consulte:

Pérez, G. (1992). Ciclo de krebs. En G. Pérez, BIOQUIMICA (pág. 163). Bogotá DC: Unisur.

Rodney, B. (1999). El ciclo del ácido cítrico. En B. Rodney, Conceptos de Bioquímica (págs. 489-

494). México: International Thomson Editores S.A de C.V.

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Rawn, J (2005). Bioquímica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.


En esta práctica mediante prueba cuantitativa, se identifica y se calcula la extracción fraccionada de los componentes proteínicos de las semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de solubilidades de los diferentes tipos de proteínas. Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el método de Folin- Lowry ó Biuret. Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas en tratamientos de precipitación y desnaturalización.

Esta práctica corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 2, péptidos y proteínas, lección 10: Clasificación y Propiedades Fisicoquímicas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que identifican a partir de un tejido vegetal los diferentes tipos de proteínas de acuerdo a su solubilidad y analizar a partir de ello, la relación que guarda dicho comportamiento y su función biológica.


Material de vidrio Material biológico y otros (estudiantes)

Reactivos Equipos

Tubos de ensayo Harinas de diferentes cereales y leguminosas: soya, arveja, trigo y frijol.

Reactivo de folin Estufas ( 5)

gradillas tapabocas Solución de sulfato de cobre –tartrato sódico de potasio ( 5g/l de CuSO4.5H2O en tartrato sódico potásico 10 g/l).

Espectrofotómetro

espátulas Libros de bioquímica Carbonato de sodio en NaOH 0.1 mol/l.

Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10 ml

Marcador de vidrio NaCI al 1%, Balanza analítica

Balones aforados Cinta para rotular Etanol al 75%,

25



de 25 ml

Vasos de precipitado de 1000 ml plástico

Cuaderno de laboratorio NaOH 0.1 N,

Vasos de precipitado de 600 plástico

Bata blanca Solución patrón de albúmina de huevo de concentración conocida.(0.25 mg/ml).

Agitador de vidrio Marcador para vidrio Reactivo de Biuret.

Erlenmeyers 100 y 250 ml

Vasos de precipitado 250 ml

Vasos precipitado 500 ml

Probeta 100 ml

Vidrios reloj grandes


Software a utilizar en la practica

Se recomienda observar el siguiente video sobre el uso del espectrofotómetro u otro material multimedia semejante:

http://www.youtube.com/watch?v=4KU8eqcjNeQ


No hay situaciones o eventos de peligrosidad.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 2, péptidos y proteínas, lección 10: Clasificación y Propiedades Fisicoquímicas. Métodos cuantitativos para la determinación de

26



proteínas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford).



Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #2 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Procedimiento:

Preparación de la muestra

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de: arveja, soya, fríjol, haba, trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y centrifugar la suspensión a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior.

Después de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extracción se adiciona al balón que contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase. Así se tiene separada la fracción de las albúminas:

27



figura 1: fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad

Sobre el residuo que queda de la separación de las albúminas, se repite ahora todo el proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Después de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extracción con NaCl al 1%, se llevan a otro balón aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fracción de las globulinas.

Sobre el residuo anterior se extrae en idéntica forma la fracción de las prolaminas, usando esta vez alcohol etílico al 75% y una temperatura de extracción cercana a 60°C.

Por último sobre el mismo residuo, con la adición de solución de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiento general, se separa la fracción de las glutelinas.

Método de Biuret :

Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo procederá a la determinación de proteínas, aplicando el método de Biuret.

La curva de calibración se hará utilizando como patrón una solución de albúmina de huevo de concentración conocida.

Para las muestras de soya, arveja y fríjol, de las fracciones de albúminas y glutelinas deberá tomarse para cada una y por aparte, una alícuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 ml

28



(dilución 1 a 10) con agua desmineralizada para las albúminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarán como extractos problemas para dichas fracciones.

En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican en el siguiente cuadro.

Condiciones Tubos

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Sol. patrón albumina, ml

––

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

1.2

–– –– –– –– –– –– –– ––

Fracción albuminas, ml

––

–– –– –– –– –– –– 0.5

1.0

–– –– –– –– –– ––

Fracción globulinas, ml

––

–– –– –– –– –– –– –– –– 0.5

1.0

–– –– –– ––

Fracción prolaminas, ml

––

–– –– –– –– –– –– –– –– –– –– 0.5

1.0

–– ––

Fracción glutelinas, ml

––

–– –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– 0.5

1.0

H2O destilada, ml 2 1.9

1.7

1.5

1.3

1.1

0.8

1.5

1.0

1.5

1.0

1.5

1.0

1.5

1.0

Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml

Tabla 5: batería de tubos método Biuret para la cuantificación de proteínas

Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos en un baño de agua a 30°C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usando el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.

2. Cálculos y resultados

Consultar tablas de conversión para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondientes valores de absorbancia o calcúlelos utilizando la fórmula:

A = 2 - log (%T)

Trazar en papel milimetrado la gráfica de calibración (absorbancia en ordenadas vs. concentración (mg/mI) en abcisas) e interpolar las Absorbancias de los tubos problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada caso, a calcular los porcentajes de cada fracción proteínica.

29



Deberán compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada.

Método de Folín- lowry :

Preparación de los reactivos:

1. Solución alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0.1 mol/l).Se debe preparar primero el NaOH al 0.1 M y luego el carbonato se debe disolver en este, preparar 200 ml.

2. Solución de sulfato de cobre –tartrato-sódico potásico: Preparar una solución de sulfato de cobre SO4Cu en tartrato sódico potásico 10 g/l) preparar de esta solución 300 ml.

3. El día de la práctica se debe preparar la solución salina: mezclar 50 ml de (1) y 1 ml (2).

4. El reactivo de Folin se debe diluir: en un volumen igual de agua, el mismo día que se va a utilizar. 1:1

5.Patrón de proteína: 0.25 mg/ml

Procedimiento: a 1 ml de muestra agregue 5 ml de una solución alcalina (mezclar 50 ml de la solución alcalina de carbonato de sodio más 1 ml de solución de sulfato de cobre –tartrato sódico potásico). Mezcle vigorosamente y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min o más. Agregue 0. 5 ml del reactivo de Folin en forma rápida y mezclando inmediatamente. Después de 30 minutos lea la Absorbancia a 750 nm. Utilice un blanco de reacción.

REACTIVO BLANCO T1 T2 T3 T4 T5 T6 M1 M2

H2O 1 ml 0.9 ml

0.8 ml 0.7ml 0.6 ml

0.5

ml -0

PATRON ml --- 01 0.2 0.3 0.4 0.5 1 ---- ---

PROBLEMA ------ --- --- --- --- --- -- 1ml 1ml

SOLUCION ALCALINA ( ó Folin A+C)

5 ml en todos los tubos: agitar bien y esperar 10 minutos.

REACTIVO DE FOLIN DILUIDO 1:1

Ó 1:2

0.5 ml, esperar 30 minutos en la oscuridad luego leer la absorbancia a 500 ó 750 nm.

Tabla 6: batería de tubos método Folin Lowry para la cuantificación de proteínas .

Determine la concentración de proteínas de una solución problema después de preparar una

30



curva patrón con BSA (albúmina sérica bovina).

Expresión de resultados:

Complete la siguiente tabla:

tubo Absorbancia (nm= )

Concentración de proteína ( mg/ml)

T1 T2 T3 T4 T5 T6 M1 M2

Tabla 7: presentación de resultados práctica 2.

Para hallar la concentración del patrón en mg/ml, debe realizar el respectivo análisis de la concentración de la solución patrón: 0.25 mg/ml y el volumen que se toma de la solución patrón.

5. Con los valores de Absorbancia y Concentración graficar:

Concentración de proteína en las abscisas (X) y Absorbancia en la ordenadas (Y).

6. Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión. Ecuación del tipo y = m x + b. Se recomienda que el valor del coeficiente de correlación sea como mínimo de 0.995.

La ecuación encontrada, servirá para realizar los cálculos de concentración de proteína en mg/ml de M1 y M2.





Evaluación grupal:

El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

31






Ítem Evaluado Valoración Baja

Valoración Media Valoración Alta Máximo

Puntaje





(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5



No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es coherente en su totalidad

5

32




Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles, para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta.

(Puntos = 0.5 ) (Puntos 1.0)

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5


Retroalimentación


33



PRACTICA No. 3 – ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS

Tipo de practica

Presencial X Autodirigida Remota

Porcentaje de evaluación 2.5% Horas de la practica 1H Temáticas de la práctica Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 3,

Enzimas. Intencionalidades formativas Propósitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas la actividad enzimática de la sacarasa y alfa-amilasa.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de las enzimas y pérdida de esta al variar al variar su temperatura óptima de trabajo.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas la actividad enzimática de la sacarasa y alfa-amilasa.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la función de las enzimas y pérdida de esta al variar al variar su temperatura óptima de trabajo.

COMPETENCIAS


34



El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene la prueba para carbohidratos y la actividad enzimática.


Metas






1. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso. Adicionalmente realizará la siguiente investigación:

2. Qué es la sacarasa, cual es su sustrato, a qué clase de enzima pertenece, cuáles son sus productos de hidrólisis. En qué consiste la prueba de Fehling y para qué clase de carbohidratos es indicativa, Por que se usa la prueba anterior en la actividad de la sacarasa?

3. Estructura química del substrato para la alfa-amilasa., enlaces que rompe o hidroliza la α-

amilasa, clase de enzima que es la α- amilasa, Productos de la hidrólisis de la α- amilasa. En qué consiste la reacción de lugol el almidón?¿ que entienden por temperatura óptima de una

enzima, en el cuerpo humano donde se encuentra esta la α- amilasa?, que se entiende con pH óptimo de una enzima?.

4. estructura del almidón y su mecanismo de hidrólisis: enzimas implicadas.


En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los productos de hidrólisis de la acción de la sacarasa sobre la sacarosa, y la acción de la alfa- amilasa sobre el almidón.

35



Inicialmente se debe eatraer la enzima sacarasa o sucrasa de la levadura mediante métodos utilizados en la separación de proteínas y determinar tanto su presencia como su actividad enzimática. Demostrar que en la saliva existe actividad α - amilásica. Comprobar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción. Determinar el pH óptimo de la enzima α - amilasa Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 3, Enzimas. Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan las enzimas, las cuales son de naturaleza proteína, por lo tanto su la función biológica debe ser afectada por los mismos factores que las proteínas. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Material de vidrio Material biológico ( estudiantes)

Reactivos Equipos

Vaso de precipitado de 50 ml

Vaso de precipitado de 50 ml( para el grupo 2)

Levadura granulada comercial. (No sirve pulverizada).

300 ml Acetona Estufa a 38ºC

Mortero con mango Solución de saliva. Agua destilada Balanzas (5)

espátula 100 ml de Solución de sacarosa al 5%

Estufas (4)

Vidrio reloj Reactivo de Fehling Mallas (4)


Hielo Termómetros (4)


100 ml TCA al 10% Baño termostatado a 38ºC previamente.


200 ml Solución de almidón 2%.

Papel filtro ( 5 para cada grupo)

Vaso de precipitado plástico 100 ml de KCl al 1.0% pHmetro ( 2)

36



de 1000 ml

Vaso de precipitado plástico de 600 ml

100 ml de solución de lugol.

hielo

Agitador de vidrio 50 ml Solución ácido tartárico al 1%

Termómetro de mercurio( grupo 2)

Pipeta pasteur 50 Solución de NaOH al 0.1 N

Equipo de filtración al vacio.

Probeta de 100 ml 50 Solución de NaOH al 0.5 N

Embudos y soporte 50 ml de buffer fosfato pH 6.9-7.0

Erlenmeyers 250 ml 50 ml de ácido clorhídrico al 10%

Erlenmeyers 50 ml 100 ml de solución de glucosa al 5%

Tubos de ensayo Reactivo de selliwanoff

gradillas 150 ml de acido tartárico al 1%

Pipetas 1, 5,10 ml 150 ml de NaOH 0.1 M

Pinzas para tubos de ensayo

Solución de HCl al 5%, Solución de NaOH al 5%

Pinzas de madera para tubos de ensayo

Hielo y agua caliente



Ninguno.



37





Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.




1. Experimento No. 1 Sacarasa

1.1 extracción de la enzima:

Tome 17 gramos de levadura granulada (no utilice levadura molida) en un mortero y tritúrela. Una vez reducida a polvo, transfiérala a un vaso de precipitado que contenga 100 ml de agua destilada y agite durante 10 minutos. Filtre a través de tela y luego a través de papel de filtro en un embudo.

Vierta el filtrado en un vaso de precipitado y agregue 50 ml de acetona. Mezcle bien y deje la mezcla quieta durante 10 minutos. Decante parte del líquido cuidando de no perder el precipitado porque es donde esta la enzima sucrasa, colóquela en hielo para evitar la desnaturalización. Marque el recipiente como SOLUCIÓN DE ENZIMA.

1.2 marcha de la práctica:

38



prueba PROCEDIMIENTO


V (ml) RESULTADO

ANALISIS

DE

RESULTADOS

actividad enzimática

enzima hervida

Solución de enzima 3 ml

Agua destilada 3 ml

Disuelva el precipitado y lleve a ebullición a 95 ºC internamente por 10 minutos. a baño maría.

Deje enfriar, adicionar sacarosa en solución fresca.

2 ml

Colocar el tubo a 38ºC durante 30 minutos

Realizar prueba de Fehling

prueba de Fehling

En un tubo aparte colocar:

Solución A de Fehling 1 ml

Solución B de Fehling 1 ml

Agua destilada 3 ml

Solución enzima hervida 3 ml

Colocar el tubo en una solución de agua hirviendo por 5- 10 minutos

Observar

seliwanoff Enzima hervida 5 ml

Reactivo de selliwanoff 5 ml

Caliente a baño Maria

Observar.

actividad enzimática

enzima cruda

Solución de enzima 3 ml

Agua destilada 3 ml

adicionar sacarosa 2 ml

Colocar el tubo a 38ºC durante 30

39



minutos

Realizar prueba de Fehling

prueba de Fehling




Agua destilada 3 ml

Solución enzima hervida 3 ml


Observar ..

Repita la prueba de Fehling usando en vez de la solución de enzima cruda glucosa al 5%

Observar

seliwanoff

Enzima cruda 3ml

Reactivo de seliwanoff 1 ml

Caliente a baño María y observar

Repetir el procedimiento de la prueba de selliwanoff pero en lugar de la enzima hervida colocar fructosa al 5%

3 ml

Observar en los dos tubos si hay formación de un color rojo intenso indicativo de cetosas como fructosa proveniente de la Hidrólisis de la sacarosa.

l

Tabla 9: Marcha de la práctica 3.

Cuestionario:

1. Por qué se utiliza acetona para precipitar la enzima? 2. Diga cuáles son los fundamentos químicos de las pruebas estudiadas para el

reconocimiento de la hidrólisis de la sacarosa. En esta parte Ud tiene que analizar el fundamento teórico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el color obtenido, que indica cada prueba?

40



3. Qué le sucede a la sacarosa al ser tratada con la enzima sucrasa?

2. Experimento No. 2: α-amilasa

2.1 Obtención de la enzima:

Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solución de enzima. Para ello enjuáguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 ml aproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solución de saliva y rotule el

erlenmeyer como SOLUCIÓN DE ENZIMA αααα - AMILASA, manténgala incubada a 37º - 38ºC.

2.2 Marcha de la práctica

Pruebas PROCEDIMIENTO


V(ml) RESULTADO ANALISIS DE

RESULTADOS

Preparación de la solución de reacción

Alistar cuatro tubos de ensayo ( marcar del 0-4):

Adicionar Acido tricloroacetico al 10%

0.5 ml

Aparte en un beaker de 50 ml Preparara r una solución de reacción:

Solución de almidón (hervir durante 2 minutos).

Enfriar y agregar agua destilada

6.0 ml

2.0 ml

Cloruro de potasio 1.0 % e incubar a 38ºC.

2.0 ml

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA

αααα - AMILASA. tiempo : cinco minutos

Solución de reacción* 10 ml Agitar y tomar inmediatamente

solución alfa- amilasa* 6 ml

tomar de esta solución 3 ml

Colocarla en el tubo 0 con ácido tricloroacetico

Gotas reactivo de lugol gota a gota hasta coloración rojiza o

Gotas

41



café.


αααα - AMILASA. tiempo : 10 minutos

Solución de reacción+ amilasa *( la misma cantidad de arriba)

tomar de esta solución a los 10 minutos

3 ml


Gotas reactivo de lugol Gotas



Solución de reacción+ amilasa *( la misma de arriba)


3 ml


Gotas reactivo de lugol gota a gota hasta coloración rojiza o café.

Gotas 5



Solución de reacción+ amilasa *( la misma de arriba)


3ml


Gotas reactivo de lugol gota a gota hasta coloración rojiza o café.

Gotas

Prueba de Fehling




Agua destilada 2 ml

Solución restante de reacción + amilasa*

3ml

42




Observar

Tabla 10: Marcha de la práctica 3 alfa- amilasa.

Cuestionario:

• Explique y analice los resultados obtenidos • cuando reacciona con el lugol, que resultados se obtiene? • Que coloración produce los productos de la hidrólisis del almidón y cuales son?

2.2 preparación de la solución de enzima y Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción

Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solución de enzima. Para ello enjuáguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 ml aproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solución de saliva y rotule el

erlenmeyer como SOLUCIÓN DE ENZIMA αααα - AMILASA e incube a 38ºC.

Prepare cuatro tubos de ensayo de la siguiente forma:

Tubo reactivo

1 2 3 4

Cloruro de potasio

0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solución de almidón

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agua destilada 1.2 ml 1.1ml 1.0 0.9

Tabla 11: batería de tubos efecto de la concentración, alfa-amilasa.

Adicione a cada tubo: (no se olvide agitar)

Tubo reactivo

1 2 3 4

enzima 0.5ml 2 ml 3.5 ml 5 ml

43



Coloque cada tubo a incubar a 38ºC por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de ensayo adicionar 0.2 ml de acido triclorácetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo (o hasta el 4) t gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

• Cuál es la relación del efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción en la enzima según el experimento?

• Cuál es el papel del acido tricloroacetico? 2.3 Determinación del pH óptimo de la αααα - amilasa salival

Mida el pH de:

Ácido tartárico al1%. Tomar pH ________

Acido clorhídrico al 10%. Tomar pH

NaOH al 0.1 N Tomar pH ____

NaOH al 0.5 N Tomar pH ____

Prepare cinco tubos de ensayo así:

Tubo reactivo

1 2 3 4 5

Ácido clorhídrico al 10%

1.0 ml

Ácido tartárico al 1%

1.0 ml

Buffer fosfato pH 6.9

1.0 ml

NaOH 0.1 N 1.0 ml

NaOH 0.5 N 1.0 ml

KCl 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solución de almidón

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agua 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

44



destilada

Tabla 12: batería de tubos efecto del pH, alfa-amilasa.

Adicione a cada minuto a cada tubo: (no se olvide agitar)

Tubo reactivo

1 2 3 4 y 5

enzima 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml

Coloque cada tubo a incubar a 38ºC por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de ensayo colocar 0.2 ml de acido triclorácetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

• Explique y analice los resultados obtenidos • Cuál es el papel del lugol en la reacción • de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los

cambios de pH. • Escriba el valor óptimo de pH de la enzima y explique como llega Ud. A esa

conclusión.

2.4 efecto de la temperatura sobre el efecto de la actividad enzimática.

Prepare tres tubos de ensayo así:

Tubo reactivo

1 2 3

Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

KCL 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solución de almidón 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Tabla 13: batería de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa.

Coloque el tubo #3 en baño con hielo por 20 minutos

Coloque el tubo # 1 por 10 minutos a 90ºC

Coloque el tubo # 2 a temperatura ambiente.

Anote las temperaturas respectivas en cada tubo. Después de este tiempo añada a cada tubo:

45



Tubo reactivo

1 2 3

enzima 2 ml 2 ml 2 ml

Coloque cada tubo a incubar a 38ºC por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de ensayo añadir 0.2 ml de acido triclorácetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

• Cuál es el papel de cloruro de potasio (KCL) presente en todo los experimentos al igual que el ácido tricloroacetico?

• de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los cambios de temperatura.

• Escriba el valor de la temperatura óptima de la enzima y explique cómo llega Ud. A esa conclusión

Experimento No. 3: Degradación Enzimática De Polisacáridos2

1. Coloque 3.0 mL de solución de almidón y 2 gotas de saliva en tres tubos de ensayo previamente marcados A, B y C.

2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador universal. Registre los resultados.

3. Agregue al tubo A 1.0 mL de ácido clorhídrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de NaOH al 5%; y al tubo C 1.0 mL de agua.

4. Prepara un baño María con una temperatura de 37 ºC y coloque los tres tubos de ensayo durante 10 minutos.

5. Retire los tubos de ensayo del baño María y añada cinco gotas de lugol a cada uno. Registre los cambios de color, olor, temperatura, etc. En otros tres tubos de ensayo, previamente marcados como D, E y F, adicione tres mL de almidón y dos gotas de saliva, a cada uno.

6. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el baño María a 37 ºC y el tubo F en agua hirviendo.

7. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue cinco gotas de lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe.

Cuestionario:

1. ¿En qué situación se registró la mayor actividad enzimática y como la evidencia? Sistema de Evaluación


2 Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia.

46





Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.




Ítem Evaluado Valoración Baja Valoración Media Valoración Alta Máximo

Puntaje





(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0) 5

47





No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos (Puntos = 0.5 )

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0)

5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5



Tabla 14 : Rúbrica de la práctica 3.

Retroalimentación


48



PRACTICA No. 4 – ESTUDIO CINÉTICO DE LA UREASA3

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 2.5 % Horas de la practica 1 ½ H Temáticas de la práctica Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 3,

Enzimas. Intencionalidades formativas Propósitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Evaluar la capacidad enzimática de la ureasa frente a cambios de pH, concentración de enzima y temperatura.

Comparar mediante dos métodos (espectofotometrico y volumétrico), la capacidad enzimática de la ureasa frente a cambios de pH.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante evalúe la capacidad enzimática de la ureasa frente a cambios de pH, concentración de enzima y temperatura.

Que el estudiante compare mediante dos métodos (espectrofotométrico y volumétrico), la capacidad enzimática de la ureasa frente a cambios de pH, concentración de enzima y temperatura.

COMPETENCIAS

3 Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur.

49



El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados obtenidos en cada método de análisis ((espectrofotométrico y volumétrico) y relaciona el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y el mecanismo enzimático de la ureasa.


Metas






1. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso. Adicionalmente realizará la siguiente investigación:

ureasa

2. presencia de grupos SH.

3. Oxidación de los grupos SH


En esta práctica, se va a evaluar la presencia de la ureasa en leguminosas y tortas de oleaginosas midiendo su actividad biológica, mediante la hidrólisis de la urea. Se determinará su actividad, a través de dos métodos: el espectrofotométrico y por titulación con HCl

50




100 gramos de habas verdes (grupo 1)

100 gramos de frijoles verdes (grupo 2)

100 gramos de habichuelas verdes (grupo 3)

100 gramos de frijol de soya (grupo 4).

Hojas de papel milimetrado, regla, borrado y lápiz.

Buffer fosfato, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0 a 0.05 M

Solución de Urea 0.25 M

Solución de HgCI2 1%

Indicador de tashiro

Solución de HCI 0.1 N

Buffer fosfato, a pH 4.0, 5.5, 7.0, 8.5,10.0 0.1 M 50 ml de c/u

Solución de NaCl 1%

Solución fenol – nitroprusiato de sodio : 4,7g fenol y 6mg de nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada

Disolver 2g de NaOH en 100ml de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio comercial al 5%. Guardar en frasco ámbar.

Solución de HCI 1.0 M (titulada exactamente). Mortero con mango

Agitadores de vidrio, Tubos de ensayo, gradillas, Balón aforado de 25 ml , Vasos de precipitado ,1000 ml de vidrio , Vasos de precipitado, 50 ml , 200,600., Vasos de precipitado, 200, 600,1000 ml plásticos., Pipetas 1, 10 y 5 ml, Probetas 100 ml y 50 ml, Estufas con mallas, espátulas, espectrofotómetro, Centrifuga, Erlenmeyers de 50 y 250 , Incubadora o estufa entre 50-60ºC, Vidrio reloj, Balanzas analíticas, Tablas de disección, Bureta de 25 ml , Pinzas y soporte para titulación


Programa Excel.


51






Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #4 del curso.



Extracción de la ureasa

Pesar 5 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de leguminosas o de las tortas de oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecánicamente durante 15 minutos y centrifugar la suspensión a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir el sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI 1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto que contiene ureasa. Dejar en baño con hielo

52



Determinación de la actividad a diferentes pH: pH óptimo de una enzima:

Método 1:

Prepárese 2 series de 5 tubos: 5 servirán como blanco y 5 para determinar el efecto de pH. (Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubándolos como se indica. Terminada la incubación transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferente, agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad conocida.

Primera Serie TUBOS BLANCO

Condiciones Tubo

1 2 3 4 5

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5

Buffer Fosfato pH 5, ml 4.5 –– –– –– ––

Buffer Fosfato pH 6, ml –– 4.5 –– –– ––

Buffer Fosfato pH 7.2, ml –– –– 4.5 –– ––

Buffer Fosfato pH 8, ml –– –– –– 4.5 ––

Buffer Fosfato pH 10, ml –– –– –– –– 4.5

HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Incubar a 50 ºC durante cinco minutos agitando.

Extracto de Ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubar a 50 ºC durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N

Volumen de HCl gastado en la titulación

Tabla 15: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco

Segunda Serie TUBOS PROBLEMA

Condiciones Tubos P

1p 2p 3p 4p 5p

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5

53










HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Titular con HCl 0.1N

Tabla 16: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa, tubos problema

Expresión de resultados

Tabular los resultados obtenidos así:

Tubo número ml de HCl gastado Titulación corregida Micromoles /ml de HCl gastado

1p

2p

3p

4p

5p

Tabla 17: resultados pH óptimo de la ureasa, tubos problema

El valor corregido de la titulación es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en el blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.

Tubo número Micromoles de urea hidrolizada pH correspondiente

1p

2p

3p

4p

54



5p

Tabla 17: resultados pH óptimo de la ureasa, tubos problema

Determinación de la actividad a diferentes pH: pH óptimo de una enzima:

Método 2:

Extracto enzimático de material vegetal: El extracto que contenga la ureasa se puede obtener de una serie de leguminosas, las recomendadas son: frijol, habas, habichuela y frijol soya. Pese aproximadamente 5,0 g del material vegetal a utilizar, colóquelo en un mortero y macere con 20ml de NaCl 1% previamente enfriado en un baño de hielo-agua y realice la extracción por 15 minutos; luego Centrifuge por 10min a 2500 rpm. Transfiera el sobrenadante a un balón aforado de 50ml y el residuo transfiéralo nuevamente al mortero y realice una segunda extracción con 10ml de NaCl al 1% y frío, por 15 min. Centrifuge a 2500 rpm por 10 min y coloque el sobrenadante en el balón aforado y complete a volumen con NaCl al 1%. Guarde el extracto enzimático refrigerado en un baño agua-hielo.

Marque doce tubos de ensayo y adicione a cada uno las siguientes soluciones:

Tabla 18: resultados pH óptimos de la ureasa, método espectrofotométrico.

Mezclar bien el contenido de los tubos de ensayo y colocarlos en un baño termostatado entre 50 y 60o C por 10 min para el desarrollo del color. Dejar enfriar y leer la absorbancia a 630 nm; si la absorbancia es mayor a 2.0, realizar la dilución adecuada y volver a leer.

Cuestionarios:

55



Del método 1: exprese gráficamente en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizados (en las ordenadas Y) Vs el pH en las abscisas (X). , para ello debe buscar resultados del grupo que realice dicha determinación.

Del método 2: Haga una gráfica de pH vs Absorbancia y de temperatura vs Absorbancia e identifique el pH óptimo de la ureasa, para ello debe buscar resultados del grupo que realice dicha determinación.

Compare los resultados del método 1 y 2 y realice su propio análisis y conclusiones.

Que efecto tiene el pH sobre la actividad biológica de una enzima?

Método 3:

El trabajo experimental se hará en dos sesiones consecutivas de laboratorio así:

• En la primera sesión se determinará el efecto del pH, concentración de sustrato, temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática.

• En la segunda sesión se determinará la presencia de ureasa en leguminosas y tortas de oleaginosas midiendo su actividad por el mismo método utilizado en la sesión anterior.

1. Primera sesión

1.1 Determinación de la actividad a diferentes pH

Prepárese 2 series de 5 tubos: 5 servirán como blanco y 5 para determinar el efecto de pH. (Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubándolos como se indica. Terminada la incubación transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferente, agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad conocida.

Primera Serie TUBOS BLANCO

Condiciones Tubo

1 2 3 4 5

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5





56




HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Incubar a 50 ºC durante cinco minutos agitando.



Volumen de HCl gastado en la titulación

Tabla 19: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco método 2

Segunda Serie TUBOS PROBLEMA

Condiciones Tubos P

1p 2p 3p 4p 5p

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5








HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Titular con HCl 0.1N

Tabla 20: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos problema método 2

1.1.1 Expresión de resultados

Tabular los resultados obtenidos así:

Tubo número ml de HCl gastado Titulación corregida Micromoles/ml de HCl gastado

57



1p

2p

3p

4p

5p

Tabla 21: expresión de resultados pH de la ureasa tubos problema método 2

El valor corregido de la titulación es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en el blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.

Exprese gráficamente (gráfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De acuerdo con los resultados de su gráfica, deduzca el pH óptimo, con el cual va a trabajar en las siguientes etapas.

Tubo número Micromoles de urea hidrolizada pH correspondiente

1p

2p

3p

4p

5p

1.2 Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción enzimática

En 8 tubos de ensayo marcados, pipetear en cada uno las cantidades de reactivos que a continuación se indican:

Condiciones Tubos

B 1 2 3 4 5 6 7

Urea 0.25 M, ml 5 1.0 1.5 2.0 3.0 6.0 8.0 9.5

Buffer de fosfato pH óptimo, ml 5 8.5 8.0 7.5 6.5 3.5 1.5 ––

HgCl2, gotas 4 –– –– –– –– –– –– ––

Colocar todos los tubos en un baño maría a 50 ºC por cinco minutos y sin sacarlos agregar:

Ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

58



Dejar en baño maría a 50 ºC durante 25 minutos y al final agregar:

HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4 4 4 4

Mezclar y sacar los tubos del baño

Tabla 22: baterías de tubos variación concentración de sustrato, tubos problema

Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, agregar a cada uno 3 gotas de indicador, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferentes titulaciones con el blanco.

1.2.1 Expresión de resultados :Tabular los resultados obtenidos así:

Tubo número

Micromoles de urea

ml de HCl gastados

Titulación corregida

Micromoles de HCl gastados

1

2

3

4

5

6

7

Titulación corregida, corresponde a: ml de HCl gastados - ml de HCl del blanco.

Tubo número

Micromoles de urea hidrolizada

Velocidad en moles/min

1/v [S] moles de urea inicia/ml

1/[S]

1

2

3

4

5

6

7

Tabla 23: expresión de resultados variación concentración de sustrato

59



En papel milimetrado y con datos de la tabla anterior construir las siguientes gráficas:

• Gráfica No. 2 de su informe: En ordenadas datos de y o sea micromoles de urea hidrolizados por minuto. En abscisas datos de [S] o sea micromoles de urea iniciales/ml.

• Gráfica No. 3 de su informe: Siguiendo el procedimiento Lineweaver-Burk, en ordenadas datos de 1/v y en abscisas 1 / [S].

De estas dos gráficas, deducir la constante de Michaelis y la velocidad máxima para esta reacción. El valor de Km (constante de Michaelis) debe expresarse en moles/litro.

1.3 Determinación de la actividad a diferentes temperaturas

Se usarán cinco baños de agua a diferentes temperaturas y cada tubo se incubará como se indica a continuación:

Tubo número Incubar en:

1

2

3

4

5

baño de agua con hielo

baño de agua a temperatura ambiente aproximadamente 16 °C

baño de agua a 37 °C

baño de agua a 60 °C

baño maría (92 °C)

Luego proceda a agregar los reactivos y a mantener las condiciones que se indican enseguida:

Condiciones Tubos

B 1 2 3 4 5

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5 5

Buffer de fosfato pH óptimo, ml 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5

HgCl2, gotas 4 –– –– –– –– ––

Temperatura de incubación, ºC 16 0 16 37 60 92

Colocar cada tubo en baño de agua a la temperatura indicada por cinco minutos y sin sacarlos agregar.

Solución de ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agitar e incubar por 25 minutos a la temperatura correspondiente

HgCl2 1%, gotas –– 4 4 4 4 4

Titular con HCl (normalidad conocida)

60



Resultados, ml de HCl

Tabla 24: baterías de tubos variación de la temperatura

1.4 Expresión de resultados

Con los resultados de la anterior serie de temperaturas y el obtenido a 50 °C (ver determinación de la actividad a diferentes pH, tubo No. 3p), grafique en papel milimetrado (gráfica No. 4 de su informe) los micromoles de urea hidrolizada (ordenadas) vs temperatura °C (abscisas). Explique el efecto de cada temperatura en la actividad de la ureasa.

2. Segunda sesión

2.1 Extracción de la ureasa

Pesar 5 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de leguminosas o de las tortas de oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecánicamente durante 15 minutos y centrifugar la suspensión a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir el sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI 1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto que contiene ureasa.

En 5 tubos de ensayo marcados pipetear en cada uno las cantidades de reactivos como en la tabla siguiente se indica.

Mezclar y sacar los tubos del baño. Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferentes titulaciones con el blanco.

Condiciones Tubos

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5

Buffer de PO4 pH óptimo, ml 5 5 4.5 4 2.5

HgCl2 1%, gotas 4 –– –– –– ––

Colocar todos los tubos en baño maría a 50 ºC por cinco minutos y sin sacarlos agregar:

Extracto de ureasa, ml 0.5 0.5 1 1.5 3

Dejar en baño maría a 50 ºC durante 25 minutos y al final agregar:

61



HgCl2 1%, gotas –– 4 4 4 4

Tabla 25: baterías de tubos extracción de ureasa de leguminosas

Nota: Si la actividad de la enzima es muy baja con las alícuotas utilizadas, repetir el ensayo usando una alícuota del extracto de ureasa mayor. Por el contrario si la enzima presenta una actividad afta repita el ensayo utilizando una dilución del extracto de ureasa (por ejemplo: 1:5 v/v).


Determine la actividad ureásica de la leguminosa o la torta analizada, expresándola como micromoles de urea hidrolizado / ml del extracto de ureasa.

Compare la actividad ureásica de su extracto con los obtenidos por los demás grupos y con los datos bibliográficos.

Cuestionario

1. ¿Qué tipo de inhibición enzimática se presenta con el uso de metales pesados? 2. ¿Qué representan los valores de Vm y Km? 3. ¿Qué entiende por metalo-enzimas? Dé ejemplos. 4. ¿Qué sucedería si se reemplaza el HgCl2 por CaCI2? Explique su respuesta. 5. ¿Todas las enzimas tienen CySH en su sitio activo? Especifique cuáles son los aminoácidos

presentes en el sitio activo de las enzimas cuyos sitios activos usted conoce. Sistema de Evaluación










62



Puntaje





(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias

Se maneja de manera inadecuada el uso de citas y referencias


El manejo de citas y referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0) 5

63



(Puntos = 0)




Retroalimentación


64



PRACTICA No. 5- DETERMINACIÓN DE VITAMIAN C4

Tipo de practica

Presencial Autodirigida Remota

Porcentaje de evaluación 2.0% Horas de la practica 1 ½ H Temáticas de la práctica Esta práctica no se deriva de ninguna de las

contenidas en el curso, pero esta indirectamente relacionada con la Unidad 1, en la parte de biomoléculas.

Intencionalidades formativas

Propósitos

Reconocer la presencia de vitamina C en diferentes muestras de alimentos.

Cuantificar el contenido de vitamina C en las muestras analizadas y comparar su valor con datos teóricos.

Establecer la importancia biológica de la vitamina C en los procesos metabólicos.

Objetivos

Que el estudiante reconozca presencia de vitamina C en diferentes muestras de alimentos.

Que el estudiante cuantifique el contenido de vitamina C en las muestras analizadas y comparar su valor con datos teóricos.

Que el estudiante establezca la importancia biológica de la vitamina C en los procesos metabólicos.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa

4 Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia.

65



y cuantitativa; relaciona el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la función biológica de la vitamina C.


Metas






1. estructura de la vitamina C ó ácido ascórbico.

2. Función biológica de la vitamina C.

3. estabilidad de la vitamina C.


En esta práctica, se va a evaluar la presencia cualitativa y cuantitativa de vitamina C en frutas y vegetales. La determinación cualitativa se realiza por observaciones directas y la forma cuantitativa, se realiza por el método espectrofotométrico. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

66



Material de vidrio Material biológico Reactivos Equipos

gradilla Jugo de naranja, limón, tomate, zanahoria y durazno

Solución de almidón al 5%

termómetros

Tubos de ensayo Tabletas de Vitamina C.

Lugol

Papel indicador

Pipetas de 5 y 10 ml 2-nitroanilina 0.16% en acético – HCI

Espectrofotómetro

Tapones de caucho Nitrito de sodio 0,08% en H2O

mecheros

Probetas de 100 ml Etanol 96% mallas

Acido oxálico 0.15% y Solución de vitamina C, recién preparada (0.2 mg/mI).



Ninguno.


No hay riegos en el desarrollo de la práctica.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Todo lo relacionado con vitaminas. Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #5 del curso.


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que

67



contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #5 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Procedimiento 1: forma cualitativa

1. Disuelva 0.5 g de almidón en 10.0 mL de agua. 2. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de la solución de almidón y 1.0 mL de lugol.

Adicione media tableta de vitamina C. Registre sus observaciones. La decoloración de la mezcla es una indicación de la presencia de vitamina C; tenga en cuenta este resultado como patrón de referencia.

3. Identifica cinco tubos de ensayo como A, B, C, D y E y coloca en cada uno de ellos 1.0 mL de la solución de almidón y 1.0 mL de lugol. Añada unas gotas de jugo de naranja al tubo A; unas gotas de jugo de limón al tubo B; 1.0 mL de jugo de tomate al tubo C; 1.0 mL de jugo de zanahoria al tubo D; y 1.0 mL de jugo de durazno al tubo E. Tape cada tubo con un tapón de caucho y agítelos. Registre sus observaciones para cada tubo.

Cuestionario:

1. Identifique cual de los alimentos empleados contiene mayor cantidad de vitamina C. 2. Consulte un método sencillo de laboratorio para identificar otras vitaminas diferentes a la

C. Procedimiento 2: forma cuantitativa

Cada grupo traerá una fruta y una verdura de acuerdo con lo convenido previamente con el profesor.

Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso de las frutas cítricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de ácido oxálico al 0,15%, se mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer la determinación colorimétrica.

Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible con 4 ml de solución de ácido oxálico al 0,15%. Después de filtrar completar el filtrado con la solución de oxálico hasta un volumen final de 5 ml. De ahí tomar 1 ml de cada extracto problema para tubos D1 (fruta) y D2 (verdura).

Si la extracción se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar 30 ml de ácido oxálico al 0.15%.

68



Si el extracto exhibe coloración se recomienda adicionar una pequeña cantidad de carbón activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se agita y luego se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solución patrón de ácido ascórbico contiene 0.2 mg/ml y debe estar recientemente preparada.

El nitrito de sodio también debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro anilina se diazotice bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se decolora la solución.

Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:

Condiciones

Tubos

B 1 2 3 4 5 6 Fruta D1

Verdura D2

2-nitroanilina, ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Nitrito de sodio, ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Mezclar y esperar la decoloración

Etanol 96%, ml 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8

Patrón vitamina C, ml –– 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 –– ––

Ácido oxálico, ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 –– –– ––

Extracto problema, ml –– –– –– –– –– –– –– 1.0 1.0

Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos

NaOH 10%, ml 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Agua destilada, ml 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8

Tabla 28: baterías de tubos cuantificación de vitamina C.

Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotómetro las Absorbancias correspondientes a una longitud de onda de 540 nm.

Elabore la curva de calibración e interpole las Absorbancias de sus muestras.

2. Expresión de resultados

De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y verdura correspondiente, expresándolo como mg/100 g de fruta o verdura o como mg/100 ml de jugo. Finalmente compararlo con el valor reportado en la bibliografía.

Cuestionario

69



1. Compare el método que utilizó con otro método de determinación de la misma vitamina. 2. ¿Qué ocurriría si no se decolora por completo la solución de 2-nitroanilina al adicionar nitrito

de sodio? 3. ¿Cuál es la función del hidróxido de sodio en la determinación de la vitamina C? 4. ¿Cómo se afectaría la determinación si la muestra ha sido tratada previamente con calor? 5. ¿Cómo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales? 6. Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubérculos) ricos en vitamina C.











Puntaje





(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20

70





máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5



Retroalimentación


71



PRACTICA No. 6- AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA5

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación

2.5%

Horas de la practica

1H

Temáticas de la práctica

Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.


Propósitos

Extraer el ARN de los demás componentes celulares a partir de la levadura.

Analizar, los reactivos con laso cuales se separa el ARN de los demás componentes celulares

Analizar la composición química del ARN

Objetivos

Que el estudiante aprenda a extraer el ARN de los demás componentes celulares a partir de la levadura.

Que el estudiante analice , los reactivos con los cuales se separa el ARN de los demás componentes celulares

Que el estudiante analice la composición química del ARN

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en la prueba y relacionar el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene la prueba y la estructura del ARN.


5 Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.

72



Metas






1. Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética del módulo del curso.

Además se servirá investigar:

2. composición química del ARN

3. Tipos de ARN


En esta práctica, se va a extraer e identificar la composición química del ARN en células de levadura.

Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.

Es una práctica cualitativa para identificar la extracción de este tipo de sustancias. Una vez obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar técnicas de identificación de pentosas y bases nitrogenadas

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan las funciones de loa ácidos nucleicos y su relación con la conservación de la expresión genética.


73




gradilla Levadura seca. Solución de fenol termómetros

Tubos de ensayo Acetato de potasio

Centrifuga

Pipetas de 5 y 10 ml

Etanol absoluto

Tapones de caucho Etanol absoluto

Probetas de 100 ml

Vasos de precipitado de 250, 600 ml.



Ninguno.

Seguridad Industrial: No hay riegos en el desarrollo de la práctica

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética del módulo del curso.


La metodología es la siguiente: Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #6 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

74



Procedimiento: Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37ºC. Deje reposar por 15 min a esta temperatura y agregue 160 ml de solución concentrada de fenol (precaución: muy corrosivo). Agite mecánicamente la suspensión durante 30 min a Tº ambiente. Luego Centrifuge en frío a 3000 g durante 15 min, para romper la emulsión.

Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 10000 g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la proteína desnaturalizada. Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final de 20g/L y precipite el ARN añadiendo 2 volúmenes de etanol.

Enfríe la solución en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugación en frio a 2000 g por 5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1) , luego con etanol y finalmente con éter; deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4% de su peso seco.









Ítem Evaluado Valoración Baja Valoración Media Valoración Alta Máximo

Puntaje





(Puntos = 7.0)

10

75





(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias



El manejo de citas y referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0) 5




Retroalimentación


76



PRACTICA No. 7- AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS6

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 2.5% Horas de la practica 1 ½ H Temáticas de la práctica Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.


Propósitos

Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biológicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y ARN en los tejidos biológicos.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de ARN y ADN en los procesos metabólicos.

Objetivos

Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biológicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y ARN en los tejidos biológicos.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de ARN y ADN en los procesos metabólicos.

COMPETENCIAS


El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura de ARN y ADN.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de

6 Universitas Malacitana (2008). Prácticas de biomoléculas. Consultado en julio, 16, 2009 en http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf.

77



la elaboración de informes escritos.

Metas






1. Unidad didáctica 2: ácidos nucleicos y bioenergética: lecciones 16 a la 25.

2. EL estudiante puede complementar su gestión investigando en la bibliografía recomendada los siguientes temas:

- Ácidos Nucleicos: ADN y ARN. Identificación bioquímica.


Mediante esta práctica, se quiere separar el ARN ADN de los demás componentes celulares de la levadura, del hígado de ternera y del tejido de una cebolla cabezona, para posteriores identificaciones. Es una práctica cualitativa para identificar la extracción de este tipo de sustancias. Una vez obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar técnicas de identificación de pentosas y bases nitrogenadas.

Esta práctica corresponde a los temas que se tratan en los Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los ácidos nucleicos para en las reacciones bioquímica de los organismos vivos.


78



Tabla 32: reactivos la práctica 7.

Material de vidrio Material biológico

Reactivos Equipos

Balanza, espátula , vasos de precipitado de 600 y 250 ml

Levadura seca

Solución de fenol Balanza analítica

Probeta de 100 ml, pipetas de 2 5 y 10 ml, agitadores de vidrio.

Hígado de ternera

Acetato de potasio

Termómetros

Tubos de ensayo, tubos falcon de 15 ml, ,

Cebolla cabezona fresca

Etanol absoluto centrifuga

Tampón + detergente: NaCl 0,14 M, acetato magnésico 1,5 mM, KCl 5 mM, dodecil sulfato sódico (SDS) al 1%.

Detergente lavavajillas, sal, zumo de piña o papaya.

Éter etílico, alcohol de 96º muy frío

espectrofotómetro

Fenol/cloroformo/isoamilico (25:24:1).

batidora

Acetato sódico 3 M pH 5,2.

Tampón Tris-EDTA: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5.


Ninguno.



Solución de fenol. Gafas de seguridad, tapabocas.

Metodología

79



Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Unidad didáctica 2: ácidos nucleicos y bioenergética: lecciones 16 a la 25.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica # 7 del curso.



1. experimento 1: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA7

Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37ºC. Deje reposar por 15 min a esta temperatura y agregue 160 ml de solución concentrada de fenol (precaución: muy corrosivo). Agite mecánicamente la suspensión durante 30 min a Tº ambiente. Luego centrifugue en frío a 3000 g durante 15 min, para romper la emulsión.

Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 10000 g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la proteína desnaturalizada. Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final de 20g/L y precipite el ARN añadiendo 2 volúmenes de etanol.

Enfríe la solución en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugación en frio a 2000 g por 5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol y finalmente con éter; deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4% de su peso seco.

2. experimento 2: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS8

7 Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.

80



1. En un tubo de vidrio de fondo redondo, tomar 0,1-0,2 g de un hígado de ternera, pesarlo y anotar su peso húmedo. 2. Desmenuzarlo tanto como sea posible con una varilla de vidrio y añadirle 10 veces el peso húmedo (en ml) de tampón salino más detergente. 3. Transferirlo a un tubo Falcon de 15 mL (tubo de plástico con tapón rojo). 4. Añadir el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico que se haya añadido de tampón salino con detergente. 5. Agitar vigorosamente. 6. Centrifugar a 3.500 rpm (en centrífuga de mesa) durante 5 minutos y separar con cuidado la fase acuosa (fase superior). 7. Añadir 1/10 del volumen, de fase acuosa recuperada, de acetato sódico 3 M pH 5,2, y mezclar bien. 8. Añadir, gota a gota, 2,5 volúmenes, de fase acuosa recuperada, de etanol absoluto. 9. Al añadir el etanol el DNA precipita en forma de un ovillo. Si no aparece el ovillo de DNA de forma clara, incubar 5 minutos en hielo (o en el congelador de la nevera). Centrifugar a 3.500 rpm 5 minutos y resuspender el precipitado de ácidos nucleicos en 2 mL de tampón Tris/EDTA pH 7,5. Si el ovillo se ve claramente, se puede "pescar" el DNA con la pipeta Pasteur, escurrir el exceso de etanol y transferirlo a un tubo limpio que contenga 2 mL de Tris/EDTA 1 pH 7,5.

• Determinación del espectro de absorción de la disolución de los ácidos nucleicos

Preparar 3 mL de una dilución 1/10 de la solución de DNA obtenida en el paso anterior y determinar el espectro de absorción de la muestra entre 300 y 200 nm. Anotar las Absorbancias a 260 y 280 nm. 3. experimento 3: EXTRACCION DEL ADN DE UNA CEBOLLA9

Corta la zona central de la cebolla en cuadrados

• En un vaso de agua adiciona 3 cucharaditas de detergente lavavajillas y una de sal y añade agua destilada hasta llenar el vaso.

• Mezcla esta solución con los trozos de cebolla • Licúa el conjunto, con la batidora, a velocidad máxima durante 30 segundos • Filtra el líquido obtenido con un filtro de café • Llena hasta la mitad aproximadamente un vaso de cristal alto con la disolución filtrada • Añade 3 cucharaditas de café de zumo de piña o papaya y mezcla bien • Añade un volumen de alcohol muy frío equivalente al del filtrado, cuidadosamente,

haciéndolo resbalar por las paredes del vaso para que forme una capa sobre el filtrado. Puedes utilizar la varilla de vidrio o una cucharilla para ayudarte.

• Deja reposar durante 2 ó 3 minutos hasta que se forme una zona turbia entre las dos

8 Universitas Malacitana (2008). Prácticas de biomoléculas. Consultado en julio, 16, 2009 en http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf.

9 Tato M. (2000). Extracción del ADN de una cebolla. Consultado en julio, 16,2009 en http://centros5.pntic.mec.es/ies.victoria.kent/Rincon-C/Practica/PR-5.htm.

81



capas. A continuación introduce la varilla y extrae una maraña de fibras blancas de ADN.

Cuestionarios

1. Valorar la pureza de la preparación de ácidos nucleicos obtenida y calcular su concentración y la cantidad de ácidos nucleicos por gramo de tejido. Comentar el resultado. 2. ¿Por qué las proteínas tienen un máximo de absorción a 280 nm? 3. ¿Qué tipo de detergente es el SDS, y cómo actúa frente a las membranas y proteínas? 4. ¿Por qué al extraer con fenol los ácidos nucleicos van a la fase acuosa y no al fenol? 5. Acción del lavavajillas y sal sobre la pared celular y las membranas plasmática y nuclear. 6. Acción de los zumos de piña y papaya 7. Acción del alcohol sobre el ADN Sistema de Evaluación




Evaluación grupal:





Ítem Evaluado Valoración Baja Valoración Media Valoración Alta

Máximo Puntaje





(Puntos =

10

82



7.0)



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



45

83



Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles , para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta,


(Puntos = 8)

Referencias




5


Retroalimentación


84



PRACTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 10

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 2.5% Horas de la practica 1H Temáticas de la práctica La Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de

Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.


Reconocer a los monosacáridos como unidades estructurales de los polisacáridos como la celulosa, almidón y glucógeno y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de monosacáridos y la presencia del enlace glucocósidico en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de los monosacáridos y polisacáridos y pérdida de esta al variar sus propiedades fisicoquímicas.

Objetivos

Que los estudiantes reconozcan los monosacáridos como unidades estructurales de los polisacáridos como la celulosa, almidón y glucógeno y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de monosacáridos y la presencia del enlace glucocósidico en las muestras.

10

Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad

Nacional Abierta y a Distancia.

85



Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la función de los monosacáridos y polisacáridos y pérdida de esta al variar sus propiedades fisicoquímicas.

COMPETENCIAS


El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la de monosacáridos y polisacáridos.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a través de la elaboración de informes escritos.

Metas





El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas, :

1. estructura general de carbohidratos.

2. clasificación de carbohidratos: monosacáridos y disacáridos (enfatizando en al formación del enlace glicosídico).

3. principio y reacciones de:

• prueba de tollens

86



• prueba de Fehling

• reacción del lugol y el almidón

• prueba de Benedict

• Prueba de Barfoed


En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los monosacáridos y la identificación del comportamiento químico de los carbohidratos según sus funciones químicas (aldehídos y cetonas).

Esta práctica es un apoyo para la comprensión de los temas se tratan en la Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el aporte de energía metabólica.




Reactivos Equipos

Tubos de ensayo Trozo de pan Solución de glucosa Mecheros de gas

Vasos de precipitado de 250 y 600 ml

Una papa Solución de fructosa Estufas, termómetros.

Pipetas de 10 ml Solución de almidón

Solución de yodo o reactivo de lugol

Solución diluida de HCl

Alcohol etílico, reactivo de tollens, reactivo de Fehlin A y B).


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de

87



las pruebas a realizar.

Como complemento a la fundamentación teórica, se recomienda revisar el presentación de OA: Presentación: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la página principal del curso en campus virtual de la Unad.



Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Los temas dados en la fundamentación teórica.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #8 del curso. La metodología es la siguiente:


Parte A: solubilidad

1. Se toma 0.5 g de un azúcar en cada uno de los tubos de ensayo, debidamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en la gradilla.

2. Añada 2.0 ml. de agua a cada tubo de ensayo. Agite cada tubo de ensayo fuertemente durante un minuto y deje en reposo durante 30 segundos. Anote sus observaciones.

3. Repita los dos pasos anteriores utilizando otros tubos de ensayo, pero en vez de agua utilice 2.0 mL de alcohol etílico. Anote sus observaciones.

4. Construya un cuadro en donde cualifique cualitativamente el grado de solubilidad de las diferentes muestras.

Parte B: prueba con los reactivos de Tollens y Fehling

1. Realice un montaje de baño de María y caliente a 60ºC. 2. Prepare soluciones de cada azúcar al 10%. Tome 1.0 mL de cada solución y llévela a

diferentes tubos de ensayo, previamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en la

88



gradilla. 3. Adicione 1.0 mL del reactivo de Tollens a cada tubo de ensayo. 4. Verifique que la temperatura en el baño María se sostenga a 60 ºC. Coloque dentro un vaso

de precipitado los diferentes tubos de ensayo y lleve este conjunto al baño María por 5 minutos. Anote sus observaciones.

5. Repita los pasos dos, tres y cuatro, pero en lugar del reactivo de Tollens utilice 0.5 mL del reactivo A de Fehling y 0.5 ml. del reactivo B de Fehling.

6. Ahora, tome 2.0 mL de solución de sacarosa y agregue tres o cuatro gotas de solución diluida de HCL Agite y caliente suavemente por un minuto. Permita que se enfríe y luego agregue 0.5 mL de reactivo A de Fehling y 0.5 mL de reactivo B de Fehling. Caliente en el baño de María por tres minutos. Anote sus observaciones.

C: polisacáridos

1. Prepare una solución concentrada de almidón en agua. Caliente suavemente hasta que se forme engrudo. Déjela en reposo hasta que enfríe. Luego añada dos gotas de solución de yodo o de reactivo de lugol. Anote sus observaciones.

2. Repita esta prueba utilizando reactivo de lugol en una rebanada de papa o de pan. Anote sus observaciones.

Cuestionario:

1. ¿Qué resultados muestra la prueba con el reactivo de Tollens? ¿y con el reactivo de Fehling?

2. ¿Qué resultados muestra la prueba de solubilidad?





Evaluación grupal:

El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.




89



Ítem Evaluado Valoración Baja Valoración Media Valoración Alta Máximo Puntaje





(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe

El informe no da respuesta a los lineamientos de las

Aunque presenta resultados y análisis de resultados estos no son pertinentes. Se evidencia la ausencia de

El informe presenta una excelente articulación entre

45

90





prácticas de laboratorio.

(Puntos = 0)

análisis y deducción.

(Puntos =4)

los resultados y el análisis de resultados.


(Puntos = 8)

Referencias




5


Retroalimentación


91



PRACTICA No. 9- HIDRÓLISIS DE POLSACARIDOS, MÉTODO DEL REACTIVO 3,5-DINITROSALICILATO 11

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 2.5% Horas de la practica 1 ½ H Temáticas de la práctica Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de

Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.


Propósitos

Comparar tres métodos de hidrólisis de polisacáridos, determinando la cantidad de azúcar reductor formado mediante la reacción de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio.

Reconocer los productos de hidrólisis de polisacáridos.

Cuantificar la concentración de glucosa residual como producto de las hidrólisis ácida, enzimática por el método 3,5-dinitrosalicilato de sodio del almidón y celulosa.

Objetivos

Que los estudiantes comparen tres métodos de hidrólisis de polisacáridos, determinando la cantidad de azúcar reductor formado mediante la reacción de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio.

Que los estudiantes rreconozcan los productos de hidrólisis de polisacáridos.

Que los estudiantes cuantifiquen la concentración de glucosa residual como producto de las hidrólisis ácida, enzimática por el método 3,5-dinitrosalicilato de sodio del almidón y celulosa.

11

Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur.

92



COMPETENCIAS


El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y los procesos de hidrólisis de polisacáridos.


Metas






1. estructura y función biológica del almidón, glucógeno y celulosa.

2. método del reactivo 3,5-dinitrosalicilato para cuantificación de azúcares.


En esta práctica se compara tres métodos de hidrólisis de polisacáridos, determinando la cantidad de azúcar reductor formado mediante la reacción de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio.


93



Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el aporte de energía metabólica. Es importante además que los estudiantes adquieran la competencia básica de cuantificar carbohidratos por los métodos tradicionales como el DNS y Somogy-Nelson.



Reactivos Equipos

Tubos de ensayo, saliva Solución de almidón soluble (6 mg/ml) en buffer fosfato de sodio 0.02 M y pH 6.9

espectrofotómetro

Vasos de precipitado de 1000, 600, 50 ml.

200 gramos

de maizena.

NaOH2, 4 N, HCI 4 N. NaOH 20% Balanza

Pipetas de 10 ml, probetas de 100 ml, agitadores de vidrio.

Reactivo 3,5-dinitro salicilato de sodio: (disolver 5 g de ácido 3,5-dinitro salicílico en 100 ml de NaOH 2N, calentar. Por separado, adicionar 150 g de tartrato de sodio y potasio a 250 ml de H2O, calentar. Mezclar las dos soluciones y completar a 500 ml)

centrifuga

Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH 6.9 en NaCI 0.005 M.

Reactivo de Lucas. (134 g de ZnCI2 en 89 ml de HCI concentrado).

Tabla 36: reactivos de la práctica 9.


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de las pruebas a realizar.


94





Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Los conceptos sugeridos en la fundamentación teórica.



Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #9 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento:

El tutor en el momento de la práctica distribuirá el trabajo de tal manera que cada grupo realice una hidrólisis diferente sobre el mismo polisacárido; por ejemplo el grupo 1 efectuará hidrólisis ácida sobre almidón proveniente de maizena y el grupo 2 efectuará la hidrólisis enzimática sobre la misma muestra a fin de que puedan comparar los resultados.

La solución del polisacárido tendrá una concentración de 6 mg/ml y se preparará en Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH = 6,9.

Todos los grupos realizarán la hidrólisis ácida de la celulosa en presencia de ZnCl2 (o reactivo de Lucas)

1.1 Hidrólisis ácida

Rotular ocho tubos de ensayo y agregar en orden los siguientes reactivos:

Condiciones Tubos

B 0 1 2 3 4 5 6

95



Solución almidón, ml –– 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua destilada, ml 0.4 –– –– –– –– –– –– ––

NaOH, 2.4 N 1 1 –– –– –– –– –– ––

HCl 4N, ml 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

Colocar los tubos 1 a 6 en un baño maría a ebullición y dejarlos en los siguientes tiempos:

Tiempo de incubación, minutos 0 0 3 6 9 12 15 25

Finalizado el tiempo de incubación, sacar cada tubo y detener la hidrólisis agregando:

NaOH, 2.4N, ml –– –– 1 1 1 1 1 1

Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml 1 1 1 1 1 1 1 1

Introducir todos los tubos en el baño a ebullición durante cinco minutos, enfriar y agregar 7 ml de agua destilada. Agitar y medir transmitancia a 540 nm. Utilice el B para ajustar el 100% de transmitancia.

Tabla 37: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis química.

1.2 Hidrólisis enzimática

Recoger 2 ml de saliva en un vaso de precipitados. Cuando esté todo listo para la hidrólisis enzimática, diluya la saliva original tomando 0.3 ml de saliva y 19.7 ml de buffer de fosfato de sodio pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Use inmediatamente la saliva diluida.

Si la velocidad de hidrólisis es muy rápida para obtener una rata lineal en los primeros minutos o demasiado lenta, para observar una rata apreciable, repita el ensayo usando otra dilución de saliva.

Rotular ocho tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos:

Condiciones Tubos

B 0 1 2 3 4 5 6

Solución almidón, ml –– 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua destilada, ml 0.4 –– –– –– –– –– –– ––

Saliva diluida, ml 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

Inmediatamente adicione la saliva a los tubos B y 0, agregue el siguiente reactivo:

Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml 1 1 –– –– –– –– –– ––

96



Agite todos los tubos y deje incubar a temperatura ambiente:

Tiempo de incubación, minutos 0 0 3 6 9 12 15 25

Luego de terminar la incubación, agregue:

Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml –– –– 1 1 1 1 1 1

Coloque todos los tubos en un baño a ebullición durante cinco minutos, enfríe y agregue 8 ml de agua destilada. Mida la transmitancia a 540 nm y use el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.

Tabla 38: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis enzimática.

1.3 Hidrólisis ácida de la celulosa en presencia de ZnCI2

Colocar en una cápsula un trozo de algodón bien desmenuzado o vanos pedacitos pequeños de papel de filtro. Agregue 3 ml del reactivo de Lucas y caliente durante tres minutos, agitando energéticamente. Deje enfriar y neutralice rápidamente con NaOH al 20%. Si se forma un precipitado centrifugue a 2.500 rpm durante 10 minutos y luego pase 0.5 ml del sobrenadante a un tubo, adicione 1 ml de NaOH 2,4 N y 1 ml del reactivo, 3,5-dinitro salicilato y proceda en igual forma a la utilizada en las hidrólisis anteriores. Repita el procedimiento calentando durante 6 minutos.


La glucosa libre que queda después de la hidrólisis completa del almidón, (tubo No. 6 de la hidrólisis ácida), representa el 100% de conversión del polisacárido en glucosa.

Tomando el valor de absorbancia de este tubo como el 100% de hidrólisis, calcule el porcentaje de hidrólisis en los demás tubos de las diferentes hidrólisis.

Grafique el porcentaje de hidrólisis o formación de azúcar reductor vs tiempo para la hidrólisis ácida y enzimática del almidón.

Compare el porcentaje de hidrólisis a los 3 minutos de cada polisacárido para la hidrólisis ácida, la hidrólisis ácida en presencia de ZnCI2 e hidrólisis enzimática.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis enzimática parcial y total del almidón, del glicógeno y de la celulosa?

2. ¿Cuál es el efecto de la adición de NaCI al buffer fosfato usado para diluir la saliva? 3. Explique la diferencia estructural entre la celulosa y el almidón. ¿Cómo puede degradarse

enzimáticamente la celulosa? 4. ¿Qué son los compuestos llamados dextrinas y cuál es su importancia en la elaboración de

alimentos?

97







Evaluación grupal:

el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.







(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20

Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y


(Puntos = 0)



5

98





análisis) , conclusiones y referencias)

máximo de hojas 8

(Puntos = 0.5 ) (Puntos =1.0)





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5


Retroalimentación


99



PRÁCTICA No. 10- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS: RECONOCIMIENTO DEL GLUCOGENO A PARTIR DEL ALMIDÓN.

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación

6%

Horas de la practica 2H Temáticas de la práctica

Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.


Propósitos

Extraer el glucógeno presente en materiales biológicos como el hígado.

Reconocer cualitativamente la presencia de glucógeno en hígado mediante su hidrólisis enzimática.

Analizar, mediante reacciones cualitativas los productos de la hidrólisis del glucógeno extraído.

Establecer relaciones entre la estructura y la función del glucógeno y las reacciones metabólicas en las cuales participa.

Objetivos

Que el estudiante aprenda a extraer el glucógeno presente en materiales biológicos como el hígado.

Que el estudiante reconozca cualitativamente la presencia de glucógeno en hígado mediante su hidrólisis enzimática.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas los productos de la hidrólisis del glucógeno extraído.

Que el estudiante relaciones la estructura y la función del glucógeno y las reacciones metabólicas en las cuales participa.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco teórico y

100



los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura y función del glucógeno..


Metas






1. Glucógeno:

a. que es el glucógeno b. donde se encuentra el glucógeno y cuál es su función biológica c. cuál es la composición química del glucógeno d. cuáles son los productos de la hidrólisis del glucógeno vía enzimática. e. De qué organismos es característicos el glucógeno? f. En qué otros tejidos fuera del hígado se almacenan glúcidos en forma de

glucógeno? g. Escriba con fórmulas la estructura química del glucógeno y el almidón. Mencione las

diferencias encontradas. h. Porque se relaciona la alfa amilasa con el glucógeno. i. Porque se usa la prueba de Tollens y Fehling en el experimento?

2. Digestión intestinal de glúcidos:

a. Que tipos de enzimas se encuentran en el intestino delgado de Humanos y rumiantes.

101



b. Cuáles son los sustratos de dichas enzimas y los productos de hidrólisis c. En qué consiste la prueba de Benedict y de barfoed y porque se usan en el experimento?

3. Resumen Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.


En esta práctica se va a extraer glucógeno a partir del hígado, realizar reconocimiento de azucares a partir del glucógeno y extraer las enzimas intestinales que actúan en la hidrólisis digestiva de glúcidos y comprobar su actividad enzimática.


Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el aporte de energía metabólica. En esta práctica, los estudiantes profundizan la relación que tiene el glucógeno como reserva energética en las reacciones de generación de ATP.


MATERIALES DE VIDRIO MATERIALES BIOLOGICO

REACTIVOS EQUIPOS

Vasos de precipitado 200 ml 100 g de hígado fresco de cerdo

Solución de KOH 30% 50 ml Balanza analítica (1)

Vasos de precipitado de 1000 ml (vidrio y plástico)

Solución de tricloroacetico TCA 10%.

Incubadora

Erlenmeyers 250 ml 50 ml Solución saturada de Na2SO4

Centrifuga y tubos

Pipetas de 5 y 10 ml Solución amortiguadora: tampón fosfato sódico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH

Estufas (1)

Agitadores de vidrio Reactivo de Fehling A y B. Mallas

micro pipetas Reactivo de tollens.

Probetas 100 ml 10 ml de tolueno

102



Vidrio reloj Reactivo de Benedict

espátulas Acido acético glacial

Tubos de ensayo hielo

gradillas Sacarosa

Pinzas para tubos de ensayo Lactosa

Tollens

Fehling A y B.

Tabla 40: reactivos de la práctica 10.


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de las pruebas a realizar.




Proceso de digestión con KOH al 30%


Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.



Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla

103



de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #10 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.





Evaluación grupal:


Procedimiento:

EXTRACCION DE GLUCOGENO OBSERVACIONES

Pese un erlenmeyer de 50 ml.

Se ponen 3 ml de la solución de hidróxido potásico al 30% en un erlenmeyer de 50 ml.

Se pesan 8 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el erlenmeyer. Se pesa este conjunto.

Se calienta en un baño de agua hirviendo, agitando con cuidado para acelerar el proceso, durante 20 minutos (o hasta su digestión). Se enfría el tubo una vez acabada la digestión.

Una vez enfriado el tubo de se añaden 0,2 ml de la solución saturada de Na2SO4 y se mezclan fuertemente. Reposar 5 minutos.

Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 m de etanol al 95%. Se agita y deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.

104



Primera centrifugación:

Se pesan los tubos de centrifuga.

Se pasa la solución a tubos de centrífuga se centrifuga 3000 rpm durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante Se añaden 5 ml de la solución de TCA al 10% al tubo y se disuelve totalmente el sedimento agitando fuertemente.

Segunda

centrifugación:

Se centrifuga de nuevo.

Se añade el sobrenadante a un tubo de ensayo largo, al que previamente se han añadido 10 mL de etanol al 95%, desechando el sedimento de la centrifugación. Se deja reposar 5 minutos para que se produzca la precipitación del glucógeno.

Tercera

centrifugación:

Se traslada la solución al tubo de centrífuga previamente pesado, y se centrifuga durante 5 minutos

Una vez acabada la centrifugación se tira el sobrenadante. El sedimento obtenido representa el glucógeno prácticamente exento de sustancias contaminantes. Secar en la estufa a 35°C hasta su utilización.

Cantidad de glucógeno

Se pesa en la balanza el tubo con el glucógeno desecado, obtenido en la parte anterior, y se anota el resultado.( determinar la cantidad de glucógeno obtenido).

Solución de glucógeno

De acuerdo a la cantidad de glucógeno obtenido hacer la siguiente relación:

8 mg de glucógeno por 0.5 ml de solución tampón fosfato 0,02 M pH 7,0 que contenga NaCl 0,005 M,

De esta manera queda preparado el glucógeno para las siguientes determinaciones.

Hidrólisis enzimática del glucógeno por la enzima alfamailasa.

Pruebas PROCEDIMIENTO VOLUMEN RESULTADO PRUEBA POSITIVA PARA:

Recolección de la alfa amilasa

Recoja 20 ml de alfa amilasa salival fresca.

Adición de la alfa amilasa

Tome cuatro tubos de ensayo y en cada uno agregue:

105



sobre el glucógeno

de solución de glucógeno 1 ml

solución de saliva 3 ml

Incubar a 37 ºC por 45 minutos

AL cabo del tiempo adicionar a caca tubo TCA (ácido tricloroacetico `para parar la reacción)

1 ml.

Realice las pruebas respectivas para determinar los productos de la hidrólisis del almidón.

Prueba de

FEHLING



Agua destilada 1 ml

Solución de glucógeno + enzima 2 ml


Prueba de

TOLLENS

Reactivo de tollens 2ml

Solución de glucógeno + enzima 2 ml

Agite los tubos y déjelo un baño de agua a 35º C, durante 5 minutos

Un espejo de plata o un precipitado negro es prueba positiva indica la presencia de glucosa proveniente de la hidrólisis del glucógeno.

Tabla 41: Marcha de la práctica extracción de glicógeno.

1.2 EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES

Prueba EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES Observaciones ( escriba aquí sus observaciones)

Extracción de las enzimas

Utilice intestino delgado (duodeno) de res u oveja recién sacrificada (no sirve intestinos de más de un día, y estos deben refrigerasen (no congelar) en el menor tiempo posible. En caso de que el Laboratorio no se realice inmediatamente se

106



intestinales. sacrifique el animal, extraer la primera porción del intestino delgado (duodeno) y manténgalo en el refrigerador a un tiempo no mayor de 12 horas a la práctica.

REALICE TODAS LAS OPERACIONES BAJO BAÑO DE HIELO.

Utilice de 10 a 15 cm de duodeno. Córtelo a lo largo con unas tijeras provistas de buen corte, lave el intestino preferiblemente con agua destilada, córtelo en pedazos pequeñitos y en un mortero, tritúrelo, en baño de hielo

Recoja el molido en un vaso de precipitado en baño de hielo y agregue 50 ml de agua destilada y 2 gotas de tolueno. Agite bien. Es aconsejable que trabaje hasta aquí lo más rápido posible. Agitar. Durante unos 15 minutos y filtre a través de una tela limpia, sobre un baño de hielo. En el líquido, que debe salir claro, están las enzimas.

SOLUCIÓN DE ENZIMA

Mantenga en hielo el tubo de enzima cruda.

Tabla 42: Marcha de la práctica extracción de de disacáridasas.

ACCION DE LAS DISACARIDASAS

Pruebas PROCEDIMIENTO VOLUMEN RESULTADO PRUEBA POSITIVA PARA:

Acción enzimática

Solución de sacarosa recién preparada al 5%

5 ml

A cada tubo adicionar enzima cruda 5 ml

Incubar a 38ºC por una hora.

Repetir:

Solución de lactosa y maltosa recién preparada al 5%

5 ml

A cada tubo adicionar enzima cruda 2 ml

107



Incubar a 38ºC por una hora. Realice las pruebas respectivas para determinar los productos de la hidrólisis del la sacarosa y la lactosa respectivamente.

PRUEBA DE BENEDICT

Reactivo de Benedict 2m

Solución enzimática 2.0 ml

Baño maría por 5 minutos

Repita el procedimiento para la siguiente solución problema.

Repita la experiencia sobre soluciones de sacarosa y lactosa.

PRUEBA DE BARFOED

Reactivo de BARFOED 2m

Solución enzimática 2.0 ml

Baño maría por 5 minutos

Repita el procedimiento para la siguiente solución problema.

Para que sea positivo para monosacáridos, la coloración una vez en el baño maría no debe durar mas de 5 minutos. Después de los 5 min se consideran disacáridos.

PRUEBA DE FEHLING

Realice la prueba de Fehling a las soluciones enzimáticas con los siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y maltosa. De igual forma realice patrones para glucosa, sacarosa, lactosa y maltosa.

Prueba de tollens

Realice la prueba de tollens a las soluciones enzimáticas con los siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y maltosa. De igual forma realice patrones para glucosa, sacarosa, lactosa y maltosa.

Tabla 43: Marcha de la práctica acción de disacáridasas.


108










(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

109





Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5


Retroalimentación


110



PRACTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LIPIDOS

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 2% Horas de la practica 2 H Temáticas de la práctica Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de

Biomoléculas, específicamente el capítulo 8, Metabolismo de lípidos.


Reconocer los diferentes tipos de lípidos que se encuentran en los tejidos biológicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas la presencia de algunos de los tipos de lípidos como fosfolípidos, ácidos grasos, colesterol y glucolipidos en cada una de las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de las los lípidos y su participación en los diferentes procesos metabólicos.

Objetivos

Que el estudiante reconozca los diferentes tipos de lípidos que se encuentran en los tejidos biológicos.

Que el estudiante analice los resultados obtenidos en las reacciones cualitativas, la presencia de algunos de los tipos de lípidos como fosfolípidos, ácidos grasos, colesterol y glucolipidos en cada una de las muestras.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la función de las los lípidos y su participación en los diferentes procesos metabólicos.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los

111



resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura y función con el tipo de lípido.


Metas





Marco teórico


1. Qué son los lípidos compuestos, 2. quiénes integran a los lípidos compuestos, 3. Qué es el colesterol, 4. cuál es la importancia biológica del colesterol, 5. estructura del colesterol, 6. que pruebas coloreadas existen para identificar el colesterol 7. a qué tipo de lípidos pertenece el colesterol. 8. composición química de la yema de huevo. 9. que son los fosfolípidos, 10. Cuál es la estructura química de los fosfolípidos 11. cuál es la importancia biológica de los fosfolípidos. 12. Qué son los esfingolípidos 13. Cuál es la estructura de los esfingolípidos

112



14. Qué son los glucolipidos 15. Cuál es la estructura de los glucolipidos 16. Qué son los fosfolípidos


En esta práctica se extraer y separar entre sí lípidos compuestos de la yema de huevo y reconocerlos y se reconocen mediante su composición química. También se extraen lípidos del cerebro y analizar las diferentes clases de lípidos que se encuentran en este tejido biológico.

Esta práctica se relaciona con la Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 8, Metabolismo de lípidos.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan los lípidos en las reacciones del catabolismo y anabolismo para el aporte de energía metabólica. En esta práctica, los estudiantes profundizan en los diferentes tipos de lípidos que se encuentran en los tejidos biológicos.


MATERIALES DE VIDRIO

MATERALES BIOLOGICO

REACTIVOS EQUIPOS

Probeta de 100 ml 3 huevos 180 ml de etanol Estufa y malla

Agitador de vidrio 20 gramos de cerebro fresco de res.

200 ml de éter centrifuga


50 ml de KOH 1.5N Perlas de vidrio


50 ml de acetona Varilla para reflujo

Vaso de precipitado de 600 ml plástico

50 ml de HNO3 Corchos con orificios


Solución de molibdato de amonio

Microcoscopio (1)


50 ml de acetona Plancha de calentamiento

espátula 20 ml de etanol Papel filtro

113



Erlenmeyer de 250 ml 20 ml de éter mechero

Pipetas de 10 ml

Soporte universal y pinzas.

10 ml de acetona

Pinzas para la varilla refrigerante

10 ml de HNO3

Pinzas para crisol Solución de molibdato

de amonio

Crisol o cápsula mediana y pequeña.

30 ml de acetona

Pinzas de madera 10 ml de HCl

Embudos 50 ml de NaOH al 30 %

Reactivo Ay B DE

Fehling

Tabla 45: reactivos práctica 11


Ubicación: Página principal del curso, tópico Unidad 3 Video Beta- oxidación de ácidos grasos insaturados



Solventes orgánicos: acetona, éter Gafas de seguridad, tapabocas.

Ácidos inorgánicos concentrados Gafas de seguridad, tapabocas.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

114






Procedimiento #1: reconocimiento de colesterol y fosfolípidos a partir de la yema de huevo

Preparar una solución de alcohol éter así: 40 ml de alcohol y 20 ml de éter.

Tome un huevo, hacer un orifico en uno de los extremos y a través de él deje salir la clara. Luego transfiera la yema a un vaso de precipitado que contenga una mezcla de 40 ml de etanol y 20 ml de éter, disuelva bien la yema, agitando durante 10 minutos, filtre a través de papel filtro y recoja el filtrado en un vaso de precipitado seco.

Prepare una solución de mezcla de etanol- éter (2:1), tome 14 ml de etanol y mezcle con 7 ml de éter.

Lave el residuo con 20 ml de de la mezcla de etanol- éter (2:1).

Evapore a sequedad el filtrado anterior sobre una plancha de calentamiento o a baño maría, cuidando de no dejar quemar el residuo. Disuelva el residuo en 5 ml de éter y viértalo poco a poco y agitando en un vaso de precipitado que contenga 20 ml de acetona. Se debe formar un precipitado que generalmente es fosfolipidos. Centrifugue y recoja el sobrenadante en un vaso de precipitado de 50 ml. El precipitado debe recogerlo guardarlo para la prueba de fosfolipidos.

1.1 Reconocimiento de colesterol

Evapore el liquido anterior a baño maría, hasta que se forme una pasta Agregue 15 ml de de solución de KOH al 1.5 N, agite bien y transfiera a un erlenmeyer de 250 ml y deposite en él perlas de vidrio y caliente la mezcla a reflujo durante 20 minutos. Enfriar y añadir 20 ml de

115



éter, agitar durante 10 minutos y centrifugar. El precipitado es jabón, descartar. Guardar el sobrenadante que contiene colesterol.

Tome el sobrenadante, evapórelo en una baño de vapor, lejos de la llama, cuando ya quede sólo el residuo, adicionar

5 ml de alcohol y pasar la solución a un tubo de centrifuga y centrifugar durante 5 minutos. Pasar el líquido sobrenadante a otro tubo de centrifuga y añadir agua gota a gota hasta que se forma bastante precipitado. Dejar en reposo durante 15 minutos y centrifugar nuevamente y decantar el líquido sobrenadante, guardar y marcar como sobrenadante de colesterol. Recoger el precipitado.

1.2 Reconocimiento de fosfoglicéridos o fosfolípidos

Utilice el resto del precipitado. Paséelo a un crisol y caliente sobre un mechero hasta convertirlo completamente en cenizas. Disolver el residuo en 5 ml de agua destilada y 5 gotas de HNO3 concentrado, filtren y agregue al filtrado 1 ml de solución de Molibdato de amonio. Observe la coloración y la formación de precipitado.

Cuestionario:

• Describa microscópicamente el colesterol • es el colesterol una sustancia saponificable? explique su respuesta. • que significa la prueba del glicerol sobre los lípidos de la yema de huevo? • que significa la prueba para fosfato sobre los lípidos de la yema de huevo? • Explique los resultados.

2. Procedimiento #2: extracción de lípidos del cerebro

Pese 4 gramos de cerebro fresco de res. Repártalos en dos tubos de centrifuga, macérelos con ayuda de un agitador suavemente contra las paredes del tubo. Agregue 5 ml de acetona, mezcle durante 10 minutos, centrifugue a 3000 rpm por dos minutos. Decante la acetona en un erlenmeyer de 50 ml y colóquele el nombre de extracto I.

Con el residuo, agregue 10 ml de acetona, vuelva a centrifugar y el sobrenadante colóquelo en el vaso de extracto I

Coloque el residuo de los tubos a baño maría por 10 minutos y agréguele 5 ml de éter, mezcle, centrifugue a 3000 rpm por 1 minuto, decante el éter en otro vaso de 50 ml marcado como extracto II.

Al residuo adiciónele 5 ml de éter y vuelva a centrifugar y el líquido deposítelo en el vaso del extracto II. Repita nuevamente la operación.

Extienda en los tubos el residuo y séquelo a baño maría, una vez secos adicione 5 ml de etanol

116



al 97% caliente, mezcle bien, centrifugue a 3000 rpm a 2 minutos, decante el etanol en un tercer vaso de 50 ml y marcado como extracto III. Repita una vez más el procedimiento desde la adición de los 5 ml de etanol caliente.

2.1 separación de los lípidos del extracto II

Evapore a baño maría el extracto II. Agregue al residuo 5 ml de acetona, mezcle bien y centrifugue por 2 min. Decante el líquido en el vaso de extracto I.

Al residuo que queda, agregué 5 ml de éter, mezcle bien, y centrifugue, decante el liquido en el vaso del precipitado extracto II.

Al residuo adicione, 3 ml de etanol caliente, mezcle y centrifugue y decante el etanol en el vaso de extracto III.

Evapore los extractos II y III, hasta sequedad. (en baño maría),

Tome el extracto II, adicione 4 ml de etanol caliente y realice las pruebas para fosfolipidos.

2.2 prueba para fosfolípidos:

Coloque el extracto en una cápsula de porcelana, evapore el etanol, continúe calentando hasta que el residuo quede completamente en cenizas, adicione 5 gotas de HNO3, y 5 ml de agua destilada, disuelva bien las cenizas y filtre, al filtrado adicione 5 ml de Molibdato de amonio , observe la coloración y formación de precipitados.

Cuestionario:

Para qué clase de lípidos es positiva esta prueba?

Que sustancia se forme en el precipitado?

Dentro de la composición de los lípidos que átomo o grupo de átomos es la que se identifica con esta prueba.

2.3 prueba para glucolipidos y esfingolipidos

Disuelva el extracto III, en 3 ml de etanol, calentando para disolverla, agregue 4 ml de agua y realice:

Agregue 1 ml de HCL concentrado, agite bien, caliente a baño de agua hirviendo por 15 minutos. Deje enfriar y adiciónele gota a gota NaOH al 30% hasta alcalinizar (con tiras de papel indicador de pH), realice la prueba de Fehling. Cuestionario:

1. Qué indica esta prueba. Para quién es positiva esta prueba, que se deduce de la prueba. 2. que esperaban encontrar en el extracto I

117







Evaluación grupal:

• el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía

Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.







(Puntos = 7.0)

10



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20

Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y


(Puntos = 0)



5

118





análisis) , conclusiones y referencias)

máximo de hojas 8

(Puntos = 0.5 ) (Puntos =1.0)





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5


Retroalimentación


119



PRÁCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS12 (Opcional, puede hacerse en lugar de las prácticas practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11.

Tipo de practica


Porcentaje de evaluación 30% Horas de la practica 16 horas divididas en 3 y 4 sesiones. Temáticas de la práctica Unidad 1, 2, y 3 del módulo del curso.


Reconocer a los aminoácidos como unidades estructurales de las proteínas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Reconocer a los nucleótidos como unidades estructurales de los ácidos nucleicos y su importancia en los diferentes procesos genéticos.

Reconocer a los lípidos como unidades estructurales de membranas biológicas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Reconocer a los monosacáridos como unidades estructurales de las polisacáridos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos, diferentes tipos de lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de las de las biomoléculas.

Objetivos

Que el estudiante reconozca a los aminoácidos como unidades estructurales de las proteínas y su importancia en los diferentes

12

Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur.

120



procesos metabólicos.

Que el estudiante reconozca como unidades estructurales de los ácidos nucleicos y su importancia en los diferentes procesos genéticos.

Que el estudiante reconozca a los lípidos como unidades estructurales de membranas biológicas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante reconozca a los monosacáridos como unidades estructurales de los polisacáridos y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos, diferentes tipos de lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos en las muestras.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la función de las de las biomoléculas.

COMPETENCIAS


El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura de las biomoléculas.


Metas



El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de

121



resultados.

fundamentación Teórica

Debido a las diferencias químicas que existen entre las moléculas de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, éstas presentan diferente solubilidad en solventes orgánicos y además en ácidos semejantes al tricloroacetico (ATA) de acuerdo con la temperatura. Es posible entonces utilizar tales solubilidades diferenciales para separarlos, una vez que los tejidos han sido triturados y se han roto sus membranas.

Acción del ácido tricloroacetico a baja temperatura

• Sobre carbohidratos

A baja temperatura los monosacáridos son estables en medio ácido, mientras que si se tratan en caliente, sufren deshidratación produciéndose los furfurales.

Los polisacáridos en medio ácido sufren hidrólisis del enlace glicosídico, reacción que aumenta su velocidad a medida que se eleva la temperatura. A temperaturas interiores a 4°C, la velocidad de hidrólisis es tan lenta que para fines prácticos se considera que no ocurre reacción.

En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solución de ácido tricioroacético al 20% a temperaturas inferiores a 4°C y que no sufren cambios químicos en estas condiciones.

• Sobre lípidos

Según sus propiedades fisicoquímicas, estos compuestos son poco solubles en soluciones acuosas y no son extraídos si se trata el tejido con soluciones acuosas de ácido tricioroacético.

• Sobre proteínas

Forman sales insolubles en ácidos como tricloroacetico o perclórico, por tanto no son solubles en soluciones de ácido tricioroacético al 20% en frío.

• Sobre ácidos nucleicos

Lo mismo que las proteínas, estos ácidos son insolubles en soluciones frías de ácido tricloroacetico. Por otra parte el ácido desoxirribonucleico (DNA) está unido a histonas, lo cual lo hace más insoluble en estas condiciones.

En conclusión, al tratar un tejido previamente triturado con ácido tricioroacético al 20% y a 4°C y someter a centrifugación la suspensión resultante, en el sobrenadante se obtienen los azúcares, mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos quedan en el residuo.

122



Acción del etanol-éter-cloroformo (2: 2: 1 v/v)

Si el residuo de la extracción con ácido tricloroacético a 4°C, se trata con solución de etanol-éter-cloroformo, al solvente solo pasan los lípidos, mientras que las proteínas y los ácidos nucleicos quedan en la fase sólida.

Acción del cloruro de sodio al 10% en caliente

Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCI al 10% y se calienta en baño maría (92°C) durante 40 minutos, se desnaturalizan las proteínas, en tanto que los ácidos nucleicos, principalmente el ribonucleico (RNA), quedan en solución. Por este procedimiento es posible separar las proteínas de los ácidos nucleicos. Si al sobre nadante se le agrega ahora etanol absoluto en un volumen igual al doble de la solución original y se enfría en baño de hielo durante 10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugación y que contiene los ácidos nucleicos.

1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENTES TEJIDOS

Fundamento teórico

Carbohidratos

Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacáridos de reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el metabolismo en forma monomérica.

Las propiedades químicas de tales compuestos permiten diferenciarlos, así:

• Los polisacáridos son solubles en soluciones acuosas ácidas, pero insolubles en etanol. • Los polisacáridos como el almidón, el glicógeno y los dextranos, forman compuestos

coloreados característicos cuando se combinan con yodo molecular.

A pesar de que la naturaleza de estos complejos no está bien definida, la evidencia disponible indica a formación de complejos de absorción entre las cadenas helicoidales del polisacárido y el yodo. Para que haya estructura helicoidal se necesita por lo menos una cadena con ocho unidades de monosacárido.

Los polisacáridos que a todo lo largo de su molécula muestran estructura helicoidal, dan coloración azul intensa, ej. la amilosa. Aquellos que son ramificados con hélices interrumpidas, producen coloraciones menos intensas, ej. la amilopectina. Los altamente ramificados con segmentos cortos de ramificación, producen color pardo o rojizo, ej. el glicógeno.

Reacción de Molisch

123



Un azúcar tratado con a-naftol y ácido sulfúrico concentrado, produce una coloración violeta. Se presume que el ácido sulfúrico actúa como deshidratante formando derivados del tipo de los furfurales que reaccionan con el a-naftol para dar productos coloreados.

Reacción de Benedict

Azúcares reductores tratados con solución alcalina suave (citrato-carbonato de sodio) de ión cúprico, lo reducen a óxido cuproso de color ladrillo.

Lípidos

En cuanto a solubilidad, los lípidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos.

Los triglicéridos forman un complejo coloreado (vino tinto) con el ácido hidroxámico y el hierro en medio ácido y oxidante.

Los hidroxiesteroides con insaturación en la posición 5 reaccionan con el anhídrido acético para dar ésteres, que en medio sulfúrico se deshidratan produciendo una coloración verde.

Los fosfolípidos por acción del NaOH se hidrolizan produciendo fosfatos inorgánicos, que con el ácido molíbdico dan fosfomolibdato y estos, por acción de reductores como el ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico o el ácido ascórbico, producen complejos de óxidos de molibdeno de color azul.

Si los jabones resultantes de la hidrólisis alcalina se someten a la acción del éter, los jabones se sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol. Los compuestos que en su estructura tienen grupos ( > CHOH)n forman complejos con iones metálicos como el Cu+2 por tanto si el sobrenadante anterior se evapora al baño de maría el residuo se disuelve en agua caliente y se acidifica con HCI; si los jabones no se habían separado totalmente, los ácidos grasos de estos se separan en una capa insoluble en agua. Después de evaporar la capa acuosa, el residuo se disuelve en etanol y por la adición de solución de sulfato de cobre se formará un quelato de cobre de color verde, luego de agregar NaOH 0.1 N.

Ácidos nucleicos

• Hidrólisis

124



Los álcalis diluidos (0.3 a 1.0 N) hidrolizan los enlaces éster del ácido ribonucleico.

En cambio los enlaces éster del ácido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo mismo que los enlaces N-glicosídicos de DNA y RNA. La facilidad de hidrólisis en el RNA parece estar asociada a la presencia de hidroxilos en los carbonos 2’ y3’, lo cual permite la formación de intermedios cíclicos 2’, 3’-fosfonucleótidos, que finalmente dan los complejos monofosfonucleótidos- 2’ o 3’. Como la deoxirribosa del DNA no forma tales intermediarios, es relativamente estable en presencia de álcali diluido. La acidificación de la solución después del tratamiento alcalino precipita las moléculas de DNA intactas.

Los nucleótidos obtenidos en la hidrólisis anterior fluorecen a la luz ultravioleta.

Con orcinol

Los nucleótidos del RNA, debido a la presencia de ribosa, reaccionan con el reactivo ácido de orcinol (cloruro férrico en HCI concentrado + solución alcohólica de orcinol), dando coloración verdosa.

Desnaturalización de proteínas

Por acción de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura secundaria de las proteínas. Las proteínas a temperaturas mayores de 50°C precipitan, por formación de agregados que resultan de la destrucción de la estructura secundaria y terciaria.

Millon

Las proteínas que contienen tirosina reaccionan con mercurio disuelto en ácido nítrico, produciendo nitroderivados mercuriales de color rojo.

Ninhidrina

Los grupos amino terminales de las proteínas reaccionan con la ninhidrina en caliente, dando complejos de color violeta. En ellos, el amoníaco desprendido reacciona con una molécula de ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido.

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Biuret

Los nitrógenos del enlace peptídico forman complejos coloreados con los iones cúpricos en medio alcalino.

Reacción Xantoproteica

Esta reacción se basa en la nitración del anillo bencénico por el HNO3 concentrado, dando derivados amarillos de nitrobenceno. Las proteínas que contienen tirosina y triptófano dan esta reacción, pero el color amarillo resultante se transforma en naranja si se le adiciona NH4OH. Para nitrar la fenilalanina se requiere H2SO4 como catalizador.

2. EXTRACCIÓN DE LA YEMA DE LÍPIDOS DEL HUEVO

La separación de los lípidos es extremadamente difícil por extracción con vanos solventes orgánicos puros. Se hace uso de la propiedad que tienen la mayoría de los lípidos de ser solubles en mezclas de etanol: éter o etanol: cloroformo. La yema de huevo contiene buenas cantidades de grasas neutras, lecitinas y colesterol.

Las lecitinas tienen un pH aproximadamente neutro, ya que contienen grupos ácidos (HPO4-2) y

básicos (Colina) formando Zwiteriones muy polares. Se dispersan coloidalmente en agua en contraste con las grasas neutras que no se emulsionan. Las lecitinas se precipitan a partir de una solución etérea por adición de acetona y su reconocimiento se basa en un test para saponificación y en un test para Colina. Las esfingomielinas también tienen Colina pero son solubles en éter y se presentan en cantidades despreciables en el huevo crudo.

El colesterol no precipita por tratamiento con acetona de una solución etérea y como no es saponificable después del tratamiento con KOH puede extraerse con éter, en tanto que los triglicéridos se han saponificado dando jabones solubles en agua. Para el reconocimiento del colesterol se aplica el test de Liebermann-Burchard. El colesterol requiere de 15 a 20 minutos para el desarrollo de un color verde profundo, precedido de un color lila.

Se requieren condiciones completamente anhidras para esta reacción.

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3. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR EL MÉTODO DE MICRO KJELDAHL

Método Kjeldahl

Este método, diseñado para la determinación de nitrógeno total, puede aplicarse al análisis de proteína bruta de una muestra o de proteína verdadera, haciendo una extracción previa de ésta o también determinando el nitrógeno no proteínico.

El resultado de los análisis por Kjeldahl se expresa como proteína bruta, multiplicando el porcentaje de nitrógeno en la muestra por 6.25. Esta conversión se basa en el contenido promedio de nitrógeno del 16% de muchas proteínas. Aunque este promedio puede no ser válido para proteínas específicas purificadas, es suficientemente exacto para la mayoría de propósitos.

Para la determinación del nitrógeno presente en la muestra, es necesario hacer la digestión del compuesto hasta CO2 e iones NH4

+, por tratamiento en caliente con H2SO4 concentrado y en presencia de mezcla catalizadora. Cuando se trata de determinar el nitrógeno de compuestos que contengan enlaces N-N, NO y NO2, previamente debe practicarse tratamiento con agentes reductores para convertirlos en grupos amina.

La cantidad de amonio producido se determina agregando un exceso de álcali a la solución ácida que los contiene, con lo cual se desplazan tales iones del bisulfato amónico y en la forma de hidróxido de amonio son arrastrados por una corriente de vapor de agua a un sistema cerrado y absorbidos en una solución de ácido de concentración conocida.

El exceso de ácido que queda en la solución, después de haber recogido todo el amoniaco desprendido, se valora con un álcali de título conocido.

También el amonio desprendido puede recogerse sobre una solución de ácido bórico, y el borato ácido de amonio producido se titula por retroceso con solución de un ácido fuerte de concentración conocida.

El método que se usa en la realidad se ha ajustado a la técnica micro.

Las reacciones que ocurren durante todo el proceso son:

• Digestión: 32244Caral Mezcla42orgánico SOSOCOSONHSOHN +++ →+

• Destilación: 44Vaporcon Arrastre44 NaHSOOHNHNaOHHSONH + →+

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• Absorción: OHBOHNHBOHOHNH 2324334 +→+

• Titulación: 334324 BOHClNHHClBOHNH +→+

La suma miembro a miembro de las ecuaciones de absorción y titulación, da la ecuación definitiva de titulación:

OHClNHHClOHNH 24Indicador4 + →+

El método es reproducible, requiere el tratamiento de muestras con un contenido de proteína mayor de 3 mg y puede calificarse como consumidor de tiempo y dispendioso en general. Sin embargo, como es posible conocer el contenido de nitrógeno no proteínico (haciendo una extracción previa de este y determinándolo en la solución de extracción), se obtienen entonces valores bastante exactos del contenido real de proteína.

Se recomienda usarlo para determinar proteína en mezclas crudas y relativamente grandes, pero no es rápido ni muy aconsejable para aplicarlo a gran número de muestras de proteína soluble relativamente pura.


El desarrollo de esta práctica puede reemplazar a las practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11, ó puede ser una práctica de complemento, ya que contiene el desarrollo de las principales temáticas de la Unidad 1, 2, y 3 del módulo del curso.

En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminoácidos que componen las proteínas de los extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R ó cadena lateral.

Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas en tratamientos de precipitación y desnaturalización.

Los objetivos de esta sección de prácticas son:

Investigar la presencia de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos en las tracciones obtenidas de diferentes tejidos del animal empleado, utilizando para ello reacciones características para cada uno de los componentes anteriores.

Extraer y caracterizar los fosfolípidos, colesterol y triglicéridos presentes en la yema de huevo. Determinar el contenido total de nitrógeno en harinas de leguminosas y cereales utilizando el método de micro Kjeldahl.

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Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan los principales componentes de los tejidos, haciendo referencia a aminoácidos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, temáticas de relevancia dentro de un curso general de bioquímica para los programas de las ciencias básicas biológicas.




Probeta de 100 ml Huevos ATA al 10% Equipo de digestión para proteínas.

Agitador de vidrio Harina de leguminosas.

Arena lavada Centrifuga


Etanol del 95% , Éter etílico. Plancha de calentamiento


NaCI al 10%, HCI 2N, Ninhidrina al 0.2%

Equipo de titulación


etanol éter cloroformo (2: 2:1)



Etanol, Solución de lugol, Reactivo de Molish, Acido sulfúrico concentrado,

espátula Reactivo de Benedict

Reactivo de Millón

Reactivo de Biuret

Erlenmeyer de 250 ml NaOH al 15% y 50%, Hidroxilamina al 10%, KOH 2N. FeCl3 al 5% Cloroformo, Anhídrido acético, AcOH 10%.

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Fenolftaleína , Acido molíbdico, Acido 1,2,4-aminonaftolsulfónico

Pipetas de 10 ml Ácido nítrico concentrado, Hidróxido de amonio concentrado, Almidón , Glucosa

Soporte universal y pinzas. o ácido ascórbico (150 mg/100 mI), Bencidina al 4% en ác. acético , Triglicéridos, Colesterol, Lecitina, Albumina

Pinzas para la varilla refrigerante

Reineckato de amonio al 2% en etanol, Glicina, Tirosina, Solución de pentosa

Pinzas para crisol Mezcla de alcohol-éter (2:1), Éter etílico, Acetona, Ba(OH)2 saturado, Acido acético al 10%

Crisol o cápsula mediana y pequeña.

Pinzas de madera

Embudos

Mezcla catalizadora Sysoev: K2SO4 100 g, CuSO4 25 g, KMnO4 7.5 g y Se metálico 0.5 g.

H2SO4 concentrado, del 98% y d = 1.84 g/ml

Solución de ácido bórico al 4%.

Indicador “Taschiro”: rojo de metilo (al 0.2% en Etanol) 1 volumen + verde de bromo resol (al 0.2% en Etanol) 5 volúmenes.

NaOH al 50%.

HCI 0.01 N.

130




Ninguno.



Ácidos inorgánicos concentrados.


Catalizador y otros reactivos del método de Kjeldahl

Gafas de seguridad, tapabocas con filtro de carbono, mascara para vapores ácidos.

Solventes orgánicos: acetona, éter


Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Unidades 1,2 y 3 del curso de Bioquímica.



Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #12 de laboratorio, para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación del informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

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Procedimiento

Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre un tejido determinado. Para comparar los diferentes tejidos desde el punto de vista del contenido de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, deberá confrontar sus resultados con los obtenidos por los otros grupos.

NOTA: Las diferentes fracciones obtenidas en esta práctica, deben guardarse para la siguiente sesión de laboratorio.

A cada grupo se le entregará una muestra de tejido en ATA al 10% con los siguientes datos:

• peso del tejido. • origen del tejido. • ATA al 10% adicionado (1,5 mI/g de tejido).

Este tejido se tratará conforme al diagrama esquemático del método para fraccionar un tejido en sus constituyentes que se encuentra en la siguiente página.

Cada grupo recibirá cinco frascos donde guardará y marcará adecuadamente cada fracción que obtenga.

Cuando tenga que evaporar las fracciones, lo hará en una plancha de calentamiento sobre una malla de asbesto; para secar, debe utilizar la estufa.


Compare sus resultados con los obtenidos por los demás grupos y con los datos bibliográficos. De acuerdo con la función fisiológica y con los resultados, diga cuáles son los tejidos que cualitativamente contienen más proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos.

Cuestionario

1. ¿Por qué se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a baja temperatura?

2. ¿Qué sucede al contenido celular si la temperatura a que se mantiene es de 37°C?

3. ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación? Haga una explicación breve de los principios.

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figura 2: Extracción de biomoléculas.

1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENTES TEJIDOS

Con las muestras M1, M2, M3, M4 y M5 obtenidas en la práctica anterior, se harán las siguientes pruebas de caracterización.

Carbohidratos: Muestras M1, M2 y patrones de mono y polisacáridos.

Lugol : A una fracción de cada una de las muestras agregarles 3 gotas de solución de Lugol. Observar las coloraciones. A otras porciones iguales de estos compuestos, adicioflanes 1 ml de HCI 2N y colocarlos al baflo maría durante 25 minutos. Dejar enfriar y agregarles nuevamente Lugol. Obsérvese los resultados y explíquelos en el informe.

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Molisch

A una nueva fracción de los compuestos anteriores, agrégueles 1 ml de agua destilada, 2 gotas de reactivo de Molisch. Mezcle cuidadosamente y con los tubos inclinados agregue 1 ml de ácido sulfúrico concentrado de manera que se forme una capa de ácido debajo de la fase acuosa. Anote el color del anillo formado en la interfase.

Benedict : Coloque al baño maría durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones, con 2 ml de solución de Benedict. Observe los resultados y continúe calentando por 15 minutos. De nuevo observe los tubos.

Lípidos: Muestra M3 y patrones de lecitina, colesterol y triglicéridos.

Ácidos hidroxámicos: A una fracción de las muestras, agregue 1 mI de hidroxilamina al 10% a la cual se le ha incorporado 0.01% del indicador timolftaleína. Adicione lentamente solución de NaOH al 10% hasta color azul permanente. Caliente en baño maría por 10 minutos, enfríe al chorro y adicione HCI al 10% lentamente y con agitación, hasta desaparición del color azul. Agregue unas 2 gotas del mismo ácido en exceso. Por último adicione 0.5 ml de solución de FeCl3 al 5%. Observe los cambios de coloración que ocurren y anote los resultados.

3.2.2 Prueba de Lieberman-Burchard: Tome una fracción de cada una de las muestras, agrégueles 3 ml de cloroformo, mezcle bien. Agregue después 1 ml de anhídrido acético, agite y adicione con cuidado 3 gotas de ácido sulfúrico, por las paredes del tubo. Observe la coloración en la interfase al minuto y a los 15 minutos. Explique.

3.2.3 Saponificación: A una cantidad análoga a la anterior de las fracciones, agregue 3 ml de NaOH al 15% coloque en la boca del tubo una estera de vidrio y ponga al baño maría durante 20 minutos. Añada 15 ml de éter etílico y filtre los jabones resultantes. Después de la hidrólisis neutralizar con ácido acético al 10% usando fenolftaleína como indicador.

Colina: A 10 ml del filtrado anterior añadir 6 ml de Reineckato de amonio al 2% en etanol y colocarlo en nevera por 30 minutos hasta que cristalice.

Ácidos nucleicos

Muestra M5: Tome una tracción de la correspondiente a los ácidos nucleicos, adicione 3 mI de KOH 2 N y coloque en la boca del tubo una esfera de vidrio. Ponga el tubo al baño maría durante 30 minutos. Acidifique la solución con HCI y observe si se forma precipitado. Separe éste por centrifugación.

Pentosas: A 0,5 ml del sobrenadante anterior adicione 0,5 ml de solución de bencidina al 0,4% en ácido acético caliente la solución al baño maría durante 10 minutos, colocando una bola de vidrio en la boca del tubo. Observe la coloración. Repita la experiencia con 0,5 ml de solución patrón de

134



pentosa.

Fosfatos: A 1 ml del mismo sobrenadante acidificado, agregar 1 ml de ácido molibdico, mezcle bien y después de dejar en reposo 10 minutos adicione 0,5 ml de ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico o 1 ml de ácido ascórbico. Observe la coloración.

Proteínas

Muestra M4 y patrones de proteína y de aminoácidos.

Millon: A una tracción de la muestra y de los patrones, suspendidas en 1 mI de agua, agregue 3 gotas del reactivo de Millon; caliente durante unos minutos al baño maría; observe el precipitado.

Ninhidrina: A una fracción de la muestra y los patrones agregue 1 ml de la solución de ninhidrina al 0,2%. Caliente al baño maría durante 10 minutos y observe el color.

Biuret: Tome una fracción de la muestra y de los patrones, agregue 1 ml del reactivo de Biuret. Mezcle, espere 10 minutos y observe el color.

Xantoproteica : Caliente una tracción de la muestra y de los patrones con 1 ml de ácido nítrico concentrado, enfríe y observe el color. Agregue cuidadosamente un exceso de hidróxido de amonio concentrado. Observe la interfase.


De acuerdo con los resultados, deduzca qué tipo de polisacáridos, aminoácidos en las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos están presentes en el tejido.

Cuestionario

1. Explique la reacción con el reactivo de Lugol, de las fracciones de carbohidratos y patrones, antes y después del tratamiento con HCI 2N.

2. ¿Por qué el colesterol no es saponificable?

3. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta práctica.

4. ¿En qué tejidos se almacena el glicógeno? y ¿cuál es su función?

5. Si en su muestra de proteínas están presentes sales de amonio, ¿Cuál de las reacciones de reconocimiento de aminoácidos no se debe usar? Dé sus razones.

135



EXTRACCIÓN DE LA YEMA DE LÍPIDOS DEL HUEVO

Procedimiento

Trate la muestra como se indica en el esquema de extracción:

figura 3: Extracción de lípidos de la tema de huevo.

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Preparación de Lecitina : Amasar la yema de huevo cocido y mezclarla con 40 ml de la mezcla de alcohol- éter (2:1). Dejar reposar 10 minutos con agitación ocasional, filtrar con papel humedecido con alcohol. Remover el residuo del papel filtro y mezclarlo con otros 10 ml de la mezcla de alcohol-éter y filtrar. Combinar los dos filtrados en una cápsula previamente pesada.

El filtrado se evapora hasta sequedad en un baño maría. Pesar y disolver el residuo en 5 ml de éter y agregar esta solución lentamente y con agitación a 15 ml de acetona y con ayuda de un policía agitar de manera que las partículas de lecitina se aglomeren y formen una bola. Guardar la solución de éter-acetona para la segunda parte.

Solubilidad : Mezclar un poco de lecitina con agua. Observar que se dispersa formando un coloide.

Hidrólisis: Agregar 20 ml de Ba(OH)2 saturado al resto de lecitina y luego hidrolizar durante 30 mm en un erlenmeyer con varilla para reflujo.

Después de la hidrólisis neutralizar con CH3COOH al 10% usando fenolftaleína como indicador. Filtrar y descartar el residuo. Al filtrado añadir 6 mI de reineckato de amonio al 2% en etanol y colocarlo en la nevera por 20 ó 30 minutos hasta que cristalice.

Preparación del Colesterol : La solución de éter-acetona obtenida durante la preparación de la lecitina, evaporarla en un baño de vapor hasta obtener una pasta. (El residuo no debe o’er a éter o acetona). Enfriar y pesar. Añadir 10 ml de KOH alcohólico al 10%, perlas de vidrio y colocar en reflujo por 30 mm. Enfriar y luego añadir 30 ml de éter. Filtrar el precipitado de jabón si se forma. La solución de éter contiene entonces el colesterol.

Evaporar hasta sequedad en un vidrio de reloj, descartar los restos de agua o secar con un papel de filtro.

Extraer el colesterol calentando el residuo con 5 ml de alcohol en un baño de vapor y pasar la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml. Al residuo sobre el papel agregar otros 3 ml. de alcohol con el fin de lograr una extracción completa, combinar los dos extractos alcohólicos, centrifugar durante 5 minutos. Pasar el líquido sobrenadante que contiene el colesterol a otro tubo de centrífuga y añadir agua gota a gota hasta que no se forme más precipitado. Dejar en reposo durante 15 minutos y centrifugar. Decantar el líquido sobrenadante.

Si se desea, el colesterol puede purificarse por recristalización con unos pocos mililitros de alcohol caliente. Cuando esté frío, la adición de unas gotas de agua asegura la cristalización. Centrifugar. Dejar secar el precipitado y sobre el producto seco realizar el test de Liebermann-Burchard así: en un tubo de ensayo seco colocar unos pocos mg de colesterol, 1,5 ml de cloroformo anhidro, 0,5 mI de anhídrido acético y 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. El desarrollo del color generalmente demora de 15 a 30 minutos y durante este tiempo debe colocarse en la oscuridad.

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Calcular el porcentaje de lípidos totales, lecitina, colesterol y triglicéridos presentes en la yema de huevo.

Comparar con los valores reportados en la bibliografía.

Escribir las reacciones de caracterización de cada uno de los lípidos extraídos.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son los productos de hidrólisis completa de la lecitina? 2. Si la extracción del colesterol no se realiza en condiciones anhidras ¿qué resultado esperaría? 3. ¿Por qué la lecitina forma una emulsión en presencia de H2O? 4. ¿Es el colesterol saponificable? Explique su respuesta. 5. Escriba las estructuras del colesterol, ácido desoxicólico, estradiol, progesterona, vitaminas A y

D ¿Qué similitud estructural encuentra entre ellas? 6. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método de extracción utilizado?

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR EL MÉTODO DE MICRO KJELDAHL

Digestión

En un balón de digestión marcado colocar en su orden lo siguiente:

• Muestra de harina de leguminosa, 30 a 35 mg; o en su defecto muestra de harina de cereal, 45 a 50 mg

• Mezcla catalizadora, aproximadamente 100 mg. • H2SO4 concentrado, 1 ml.

Para todo el grupo se correrán únicamente dos blancos. En tales balones se coloca lo mismo a excepción de la muestra.

Llevar los balones al digestor, calentar al principio suavemente-aproximadamente durante 15 minutos-con el fin de sacar por evaporación la mayor parte de la humedad que acompaña a la muestra. Aumentar luego gradualmente el calor hasta una temperatura tal, que los vapores de SO3 (precaución: estos son producidos por descomposición del H2SO4, causan irritación y producen tos de no hacerse la operación en vitrina) no alcancen sino la mitad del cuello del balón de digestión.

Mantener estas condiciones aproximadamente por una hora, hasta obtener una solución de color verde esmeralda. Dejar enfriar los balones al aire.

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Destilación y absorción

En la figura 66 se muestra el aparato correspondiente. Al balón del generador de vapor se agregan perlas de vidrio o trozos de corcho o vidrio para ayudar a regular la ebullición.

Operar el generador de vapor hasta alcanzar un flujo constante de vapor, lo que se consigue aumentando o disminuyendo el calor. Entre tanto, la llave de doble paso debe conducir el vapor al vertedero. Agregar con cuidado un poco de agua destilada al balón de digestión y agitar para disolver la suspensión. Transferir totalmente la mezcla digerida al balón de destilación que tiene cuello esmerilado.

Lavar unas tres veces el balón de digestión con pequeñas porciones de agua destilada y agregar estas aguas de lavado al balón de destilación.

Medir 10 ml de H3BO3 al 4% en un erlenmeyer de 125 ml, agregar 3 gotas de indicador y colocarlo debajo del refrigerante, de modo que la punta del tubo interior del mismo quede sumergida en el ácido bórico, ver figura 66.

Coloca el balón de destilación que contiene la mezcla digerida en el extremo del tubo que conduce el vapor y asegurarse que quede perfectamente ajustado para prevenir escapes. Levantar la tapa del embudo (cuidando de dejar un pequeño nivel en el mismo para que actúe como sello) para permitir el paso de aproximadamente unos 5 ml de NaOH del 50%. Tapar rápidamente el embudo y operar la llave de doble paso para que el vapor penetre al balón de destilación al cual se le acaba de agregar la soda concentrada.

Figura 4: Montaje para destilación en el método de Micro Kjeldahl

A partir del momento en que empiecen a condensarse vapores de NH3 en la parte superior del refrigerante, lo cual se conoce porque la solución de ácido bórico vira a un violeta o azul, cronometre cinco minutos. Transcurrido este tiempo, baje el erlenmeyer de modo que el extremo del tubo interior del refrigerante quede por encima del nivel del líquido en el erlenmeyer. Hecha la

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anterior operación, esperar tres minutos más para que el refrigerante escurra y se lave.

Con el frasco lavador, lave la punta del refrigerante y reciba estas aguas de lavado en el erlenmeyer. Desmontar el balón de destilación y dejar pasar el vapor para efectos de lavado. Operar enseguida la llave de doble paso para dirigir el vapor hacia el vertedero.

Por último, con el frasco lavador, lavar también el extremo del tubo que conduce el vapor al balón de destilación, con el fin de dejarlo limpio para la próxima destilación.

Titulación : Titular el destilado del blanco recogido sobre el ácido bórico, con el HCI estándar, hasta alcanzar la misma coloración que tenía antes de recibir el destilado.

El destilado de cada muestra recogido sobre el ácido bórico, que por efecto del NH3 absorbido ha tomado color azul, se titula con el mismo ácido, hasta obtener una coloración final igual a la alcanzada con el blanco.


A partir de los volúmenes de ácido gastados en las titulaciones de la muestra (Vm) y el blanco (Vb), calcular el porcentaje de nitrógeno total con la ecuación:

( )mgen Muestra Peso

100 x 14 x N x VbVmN%

HCl−=

Donde:

Nt = nitrógeno total

Vm = Volumen de HCI gastado en la muestra

Vb = Volumen de HCI gastado en el blanco

N = Normalidad del HCI

y el porcentaje de proteína bruta, aplicando la ecuación:

16

100%Nt x Bruta oteínaPr% =

.256%Nt x Bruta oteínaPr% =

Comparar los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada para la leguminosa o el cereal analizado.

Incluir en su informe el contenido de proteínas en: soya, maíz, trigo, cebada, fríjol, arveja, lenteja, garbanzo, papa y leche.

140



Cuestionario

1. ¿Qué se conoce con el nombre de proteína bruta?, ¿de proteína real? ¿Cómo se determinaría cada una utilizando el método de micro-Kjeldahl?

2. Al comparar los métodos de Biuret y Kjeldahl ¿qué ventajas y desventajas encontraría en cada uno?

3. Explique porqué el contenido total de proteína determinado sobre una muestra de harina vegetal, no es el mismo que se determina sobre un extracto de la misma harina con NaCI 1%.

4. ¿El factor de conversión usado (6,25) es válido cuando se determina el contenido de proteína en leches? Explique su respuesta.





Evaluación grupal:

el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga:

portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.









(Puntos = 7.0)

10

141





(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


(Puntos =10)

20


máximo de hojas 8


(Puntos = 0)


(Puntos = 0.5 )


(Puntos =1.0)

5





5

Fines del informe


(Puntos = 0)


(Puntos =4)



(Puntos = 8)

45

Referencias




5

142






Retroalimentación


143



7. FUENTES DOCUMENTALES

Miguez, J. (1997). Prácticas de Bioquímica. Tunja: Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.

Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur. Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.

Rawn, J (2005). Bioquímica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.

Rodney, B. (1999). El ciclo del ácido cítrico. En B. Rodney, Conceptos de

Bioquímica (págs. 489-494). México: International Thomson Editores S.A de C.V.

Universidad Nacional de Colombia (2003). Laboratorio de Bioquímica. Bogotá: Universidad Nacional.

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ANEXO

ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO13

El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo.

3.1 NORMAS PERSONALES

• Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. • Es conveniente la utilización de bata, ya que evita que posibles proyecciones de sustancias químicas

lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en sus prendas de vestir. • Use gafas de seguridad. • Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleve recogido. • En el laboratorio está terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni comidas. • Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rótulo. • No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con

el profesor. • Verifica el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estén

siendo usados deben permanecer desenchufados. • Usa siempre guantes de asbesto, para el aislamiento térmico, al manipular material caliente. • Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe,

aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua. • No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos. • No pipetear con la boca, se debe utilizar una pera manual o dispositivo que se disponga para tal fin. • Los ácidos requieren un cuidado especial. Nunca se debe adicionar agua sobre ellos, cuando se

quiera diluirlos; siempre al contrario, es decir, ácido sobre agua. Tenga en cuenta que normalmente hay desprendimiento de calor.

• Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama.

• Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor.

• Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente. • Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. • El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar

antes de tocarlo. • Las manos se protegerán con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo de vidrio. • Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas

dos normas: o Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún

compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente.

o Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente. • Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel de filtro sobre

los platos de la misma y si es necesario, porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj.

• Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.

3.2 NORMAS PARA EL MANEJO DE REACTIVOS Y SOLUCIONES

La alta calidad en un análisis químico requiere reactivos y soluciones de excelente pureza. Las siguientes normas deben observarse para prevenir la contaminación accidental de los reactivos y de las soluciones:

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13 Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad


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• Seleccionar el reactivo químico de mejor calidad que se encuentre disponible. Elegir la botella de menor volumen para obtener la cantidad deseada.

• Tapar la botella inmediatamente después de haber tomado la cantidad deseada. Por ningún motivo delegue a otro esta acción.

• Mantener los tapones de las botellas de los reactivos entre los dedos, nunca debe colocarse un tapón sobre la mesa.

• A menos que se diga otra cosa, nunca se debe devolver el reactivo a una botella. El dinero ahorrado por retornar el exceso de reactivo rara vez supera el riesgo de contaminar toda la botella.

• A menos que se diga otra cosa, nunca se deben insertar espátulas, cucharas, o cuchillos en una botella que contenga un reactivo sólido.

• 3.3 MANEJO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS

La seguridad en el laboratorio no se limita únicamente a la protección personal o de la infraestructura, sino también a un manejo adecuado de los reactivos químicos encaminado a preservarlos de la contaminación y del desperdicio.

• Sustancias sólidas Como costumbre se debe leer la etiqueta de un reactivo antes de usarlo. Los reactivos sólidos normalmente se almacenan en recipientes de boca ancha y antes de abrirlos se gira e inclina la vasija de tal manera que algo del contenido pase a la tapa plástica. A continuación se remueve cuidadosamente la tapa con sólido dentro de ella y se golpea suavemente hasta obtener la cantidad deseada. Cuando se requieren cantidades apreciables comparadas con el contenido del frasco, se inclina la botella suavemente y se gira hacia atrás y hacia adelante hasta retirar lo necesario. Si el reactivo se encuentra compactado, se tapa el recipiente y se agita fuertemente para lograr romper los terrones. Evitar introducir elementos como destornilladores, espátulas de hierro u otro objeto que pueda contaminar el sólido. Si el reactivo es muy fino y libera polvo fácilmente, debe utilizarse una mascarilla apropiada.

• Sustancias líquidas Los líquidos se almacenan por lo general en recipientes de boca angosta o en frascos con gotero. Para medir una cantidad de líquido, sea una solución o un líquido puro, se debe sacar una pequeña porción a un vaso limpio y seco, y de allí se toma la cantidad requerida mediante una pipeta. No deben introducirse pipetas o cualquier otro dispositivo directamente dentro de la botella que contiene el líquido, esto conduce generalmente a la contaminación de todo el contenido.

Cuando se van a transferir líquidos desde un gotero tipo medicinal, la manera más correcta es verter el líquido sin introducir el gotero en el recipiente en el cual se va a almacenar el líquido, para evitar la posibilidad de contaminación del gotero y de la solución original.

3.4 CAMPANA DE EXTRACCIÓN

Las reacciones que liberan gases tóxicos o corrosivos deben realizarse dentro de una vitrina o campana de extracción. Este dispositivo es una cabina provista de un ventilador que succiona el aire del laboratorio llevando los gases fuera de él.

3.5 SÍMBOLOS DE RIESGO

Para manejar con seguridad las sustancias químicas se han ideado diversos códigos dependiendo de la casa fabricante, pero en general los sistemas clasifican las sustancias en las siguientes categorías:

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• Sustancias explosivas Peligro. Este símbolo señaliza sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio.

Precaución. Evitar choques, percusión, fricción, formación de chispas y contacto con el calor.

• Sustancias oxidantes (comburentes) Peligro: Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la amplitud de incendios ya declarados, dificultando

Su extinción. Ejemplo: permanganato de potasio, peróxido de sodio. Precaución: Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.

• Sustancias fácilmente inflamables Sustancias autoinflamables: Ejemplo: alquilos de aluminio, fósforo. Precaución. Evitar contacto con el aire. Gases fácilmente inflamables: Ejemplo: butano, propano. Precaución. Evitar la formación de mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignición. Sustancias sensibles a la humedad: Productos químicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad.

• Líquidos inflamables En términos muy sencillos, los líquidos inflamables son aquellos que fácilmente pueden arder. El que un líquido arda con más o menos facilidad depende de su punto de llama. Entre más bajo sea este punto más fácilmente arde el reactivo y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en su manejo, almacenamiento y transporte. Con estos líquidos se ha realizado una clasificación teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto y su solubilidad en el agua:

o Peligro Clase A Esta clasificación se le asigna a líquidos que tienen un punto de llama por debajo de 100 ºC y que no se disuelven en el agua a 15 ºC.

AI Líquidos con punto de llama por debajo de 21 ºC.

AII Líquidos con punto de llama entre 21 y 55 ºC.

AIII Líquidos con punto de llama entre 55 y 100 ºC.

o Peligro Clase B Esta clasificación se le asigna a líquidos que tienen punto de llama por debajo de 21 ºC y que se disuelven en agua a 15 ºC, o a aquellos cuyos componentes inflamables se disuelven en agua también a 15 ºC. Este tipo de líquidos no se puede apagar con agua.

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• Sustancias tóxicas Peligro: Tras una inhalación, ingestión o absorción a través de la piel pueden presentarse, en general, trastornos orgánicos de carácter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trióxido de arsénico, cloruro de mercurio (II). Precaución: Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir inmediatamente al médico.

• Sustancias nocivas Peligro: La incorporación de estas sustancias por el organismo produce efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaución: Evitar el contacto con el cuerpo humano así como la inhalación de vapores. En caso de malestar acudir al médico.

• Sustancias corrosivas Peligro: Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y también otros materiales. Ejemplo: bromo, ácido sulfúrico. Precaución. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.

• Sustancias irritantes Peligro: Este símbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir acción irritante sobre la piel, los ojos y sobre los órganos respiratorios. Ejemplo: amoníaco, cloruro de bencilo. Precaución. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel y los ojos.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS14

4.1 DISOLUCIÓN DE YODO

Reactivos

1. Yodo, 1.0 g 2. Agua destilada, 300.0 mL

Procedimiento

Se mezclan ambos reactivos y se filtra la solución.

4.2 REACTIVO DE LUGOL – DETECCIÓN DE ALMIDÓN

En la detección de almidón se emplea el reactivo Lugol. El almidón y el yodo forman un complejo de color violáceo. Si se le agrega unas gotas de lugol a una muestra y esta permanece de color amarillento, la reacción es negativa. Si da un color azul violáceo es positivo.

Reactivos

1. Yodo (I), 1.0 g 2. Yoduro potásico (KI), 2.0 g 3. Agua destilada, 300.0 mL

Procedimiento

Se mezclan los tres reactivos y se filtra la solución. La solución final que se obtiene presenta color ámbar.

4.3 REACTIVO DE TOLLENS – DETECCIÓN DE ALDEHÍDOS

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14 Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad


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En las pruebas que se utiliza este reactivo se forma un precipitado de plata que se deposita en la superficie de los recipientes de vidrio, formando un espejo de plata, por lo que no se recomienda la agitación. Se debe utilizar recién preparado porque de lo contrario no se forma el espejo de plata.

La reacción para la preparación del reactivo de tollens es la siguiente:

AgNO3 + NH4OH = Ag(NH3)2OH

Se estabiliza por la adición de NaOH.

Se utiliza para identificar aldehídos ya que ocurre la siguiente reacción:

RCHO + 2 Ag(NH3)2OH = RCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O

En donde la plata se precipita formando un espejo de plata o un precipitado gris.

Reactivos

1. NaOH al 5%, dos gotas 2. AgNO3 al 5%, 1.0 mL 3. NH4OH, 2N

Procedimiento

Cuando se requiera el reactivo, se debe mezclar en un tubo de ensayo dos gotas de una disolución de NaOH al 5% y 1.0 mL de disolución acuosa de AgNO3 al 5%. Agitar el tubo y añadir gota a gota NH4OH 2N, hasta que se consiga disolver el precipitado de AgOH, que previamente se había formado. Si es necesario se debe filtrar la solución.

No se debe exceder en el uso del NH4OH 2N para que el reactivo así preparado sea bastante sensible. Debe trasladarse a un frasco opaco ya que la solución puede ser alterada por la acción de la luz.

Precaución

El isocianato de plata, AgNCO, compuesto muy explosivo en seco, puede estar presente en los residuos de las soluciones del reactivo de Tollens; por esta razón, es conveniente tirar el resto de la disolución de Tollens no utilizada y lavar los tubos con HNO3 diluido (disuelve el espejo de plata formado).

4.4 REACTIVO DE FEHLING – DETECCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

El reactivo de Fehling, tambien conocido como Licor de Fehling, es una disolución descubierta por el químico alemán Hermann von Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores. Sirve también para demostrar la presencia de glucosa en la orina.

El ensayo con el licor de Fehling se funda en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehído. Éste se oxida a ácido y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a óxido de cobre (I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor.

Se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores, y es útil para demostrar la presencia de glucosa en la orina, y también para detectar derivados de la glucosa como la sacarosa o la fructosa.

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Al mezclar las soluciones A y B de Fehling se forma complejo con el ión cúprico que es reducido por los aldehídos. Si la reacción es positiva se forma un precipitado rojo de CuO2. Al reaccionar con monosacáridos, se torna verdoso; si lo hace con disacáridos, toma el color del ladrillo.

La reacción que se produce es la siguiente:

RCHO + 2Cu++ + OH- → RCOOH + CuO2 + H2O

Reactivos

1. Sulfato de cobre (CuSO4), 34.64 g 2. Tartrato sódico potásico (KNa(C4H4O6) · 4H2O), 17.6 g 3. Hidróxido sódico en escamas (NaOH), 7.7 g

Procedimiento

Se preparan las soluciones A y B de la siguiente manera:

• Solución A: Se disuelven 34.64 g de sulfato de cobre en 500 mL de agua. • Solución B: Se disuelven 17.6 g de tartrato sódico potásico y 7.7 g de hidróxido sódico en 50 mL de

agua.

Cuando se requiera su utilización se mezclan volúmenes iguales de cada una de las soluciones. Ambas soluciones se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la precipitación del hidróxido de cobre (II).

4.5 REACTIVO DE BIURET – DETECCIÓN DE PROTEÍNAS

Para la detección de proteínas en los alimentos se usa el reactivo de Biuret. cual se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino.

Si al agregar unas gotas del reactivo la muestra no cambia de color, la reacción es negativa; en este caso se puede decir que la muestra no contiene proteínas o presenta una cantidad que no es posible detectar. Si la muestra cambia de color, primero a un tono rosado, luego se pone azul y, finalmente, violeta, la reacción es positiva, lo que indica la presencia de proteína.

Reactivos

1. Sulfato cúprico (CuSO4.5H2O), 2.5 g 2. Hidróxido de sodio en escamas, 440g 3. Agua destilada

Procedimiento

Disuelva 2.5 g de sulfato cúprico en un litro de agua destilada. Disuelva 440 g de hidróxido de sodio en un litro de agua destilada. Luego mezcle estas dos soluciones. Esta preparación debe almacenarse en botellas oscuras (color ámbar).

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