2.2.01_carbunco

S E C C I Ó N 2 . 2 .

ENFERMEDADES DE VARIAS ESPECIES EN LA L ISTA B

C A P Í T U L O 2 . 2 . 1 .

CARBUNCO

RESUMEN

El carbunco es primariamente una enfermedad de animales herbívoros, aunque todos los mamíferos, incluyendo los humanos, y al menos algunas especies aviares pueden contraerla. La mortalidad puede ser muy alta, especialmente en herbívoros. El agente etiológico es Bacillus anthracis, que forma esporas, es Gram positivo y tiene forma bacilar. La enfermedad tiene distribución mundial y es una zoonosis. El carbunco es importante en la industria de producción animal, en algunas poblaciones de vida salvaje, y para los humanos, especialmente para aquellos que por motivos ocupacionales están expuestos a esta enfermedad.

Esta enfermedad está mediada por exotoxinas. Se han descrito formas hiperagudas, agudas, subagudas y raramente crónicas de la enfermedad. Las señales clínicas ante-morten pueden estar virtualmente ausentes en las formas hiperagudas y agudas de la enfermedad. La forma subaguda de la enfermedad puede estar acompañada de fiebre progresiva, depresión, inapetencia, debilidad, postración y muerte. La enfermedad crónica puede mostrar hinchazón localizada, fiebre y agrandamiento de nódulos linfáticos; puede ocurrir la muerte si se obstruye el tracto respiratorio. Un examen post-mortem de animales recién muertos (que debe llevarse a cabo con mucho cuidado para evitar la infección de quien está haciendo el examen o la contaminación ambiental) puede mostrar un número indeterminado de lesiones, ninguna de las cuales tiene suficiente entidad como para ser considerada patognomónica de la enfermedad o ser por completo consecuente. Las lesiones que se ven con más frecuencia son una septicemia generalizada acompañada a menudo de un bazo agrandado, con consistencia de "mermelada de mora" y sangre poco coagulada. Las hemorragias nasales, bucales y/o anales en el momento de la muerte no constituyen un síntoma común.

Identificación del agente: La visualización de los bacilos encapsulados, generalmente en gran número, en frotis de sangre teñida con azul de metileno policrómico (reacción de M'Fadyean) es un diagnóstico completo. Bacillus anthracis se aísla de la sangre o de los tejidos de un animal recién muerto de carbunco en cantidades relativamente grandes, y en cultivo puro, sobre cualquier medio sólido incubado aeróbicamente a 37°C. Su apariencia característica sobre medio sólido con sangre hace de éste el medio de elección. A medida que se descompone la res muerta, especialmente en climas cálidos, las bacterias responsables de la putrefacción compiten con el organismo infeccioso dentro del cadáver y finalmente lo eliminan. En estos casos la confirmación del carbunco puede depender del aislamiento del suelo que resulta contaminado por las descargas terminales.

La morfología de las colonias de B. anthracis es característica después de su incubación durante la noche en agar sangre. La colonia es relativamente grande, de aproximadamente 0.3-0.5 cm de diámetro. Su color varía del blanco grisáceo al gris, no es hemolítica, presenta apariencia rugosa y vítrea y tiene una consistencia muy adhesiva y pegajosa. A veces se ven masas microbianas

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Capítulo 2.2.1. — Carbunco

radiales aisladas y unidas a la colonia principal, todas en la misma dirección. Esta característica se ha descrito como morfología en "cabeza de medusa".

Las células vegetativas de B. anthracis son grandes, de 3-5 µm de largo y aproximadamente 1 µm de ancho. Al final de la fase de crecimiento exponencial se forman esporas centrales elipsoidales, que no hinchan el esporangio. Las células se tiñen fuertemente como Gram positivas y se ven largas cadenas de células in vitro, mientras que in vivo se ven parejas o cadenas cortas. En el tejido infectado los bacilos están encapsulados, pero esta característica se pierde cuando la bacteria se crece in vitro aeróbicamente. La formación de cápsula puede inducirse incubando en sangre de caballo desfibrinada durante al menos 5 horas, o cultivando el aislado en agar nutritivo que contenga 0.7% de bicarbonato sódico e incubando a 37°C en presencia de CO2.

Otras pruebas de laboratorio, adicionales y útiles, son la ausencia de movilidad, la susceptibilidad diagnóstica al bacteriófago "gamma" y la sensibilidad a la penicilina. Se aconseja precaución cuando se usan estas pruebas, ya que se ha demostrado que algunos genotipos son resistentes al fago gamma y a la penicilina. En la actualidad se pueden usar cebadores disponibles para mostrar la presencia de los genes de la toxina y de la cápsula mediante reacción en cadena de la polimerasa como confirmación de la virulencia, sustituyendo a la inoculación animal. Una prueba de termoprecipitina describa por Ascoli en 1911 se usa aún en algunos países para proporcionar evidencia retrospectiva de la existencia de carbunco en cadáveres descompuestos o en productos animales.

Pruebas serológicas: La detección de anticuerpos en suero de animales infectados se usa raramente para diagnosis y es esencialmente una herramienta de investigación. El procedimiento actualmente predominante es el enzimoinmunoensayo (ELISA).

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: La vacuna del carbunco usada más ampliamente en ganadería, desarrollada por Max Sterne en 1937, es una forma viva esporulada, no encapsulada, mantenida en suspensión. En Rusia y algunos países de Europa del Este, se usa un tipo equivalente de vacuna (cepa 55). La vacuna Pasteur ya no se usa en Italia. Se ha desarrollado una nueva vacuna, Carbosap, que retiene ambos plásmidos y muestra muy poca virulencia. En las directrices del carbunco de la Organización Mundial de la Salud se proporciona una lista de productores (14).

No existen requisitos estandarizados para materiales de diagnóstico. El fago gamma de diagnóstico puede obtenerse, por ejemplo, de los Centros para Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos1 o de varias centrales veterinarias o laboratorios de referencia del carbunco.

A. INTRODUCCIÓN

El carbunco es fundamentalmente una enfermedad de animales herbívoros, aunque algunos mamíferos, incluyendo los humanos, y al menos algunas especies aviares pueden contraerlo. La mortalidad puede ser muy alta, especialmente en herbívoros. El agente etiológico es Bacillus anthracis, formador de esporas, Gram-positivo y con forma bacilar, el único patógeno obligado dentro del género Bacillus. La mayoría del resto de especies de Bacillus, son saprofitas frecuentes en el medio ambiente, aunque algunos, particularmente B. cereus, B. licheniformis y B. subtilis, se asocian en ocasiones con intoxicaciones alimenticias en el hombre y con otras manifestaciones clínicas tanto en humanos como en animales.

El carbunco animal se presenta en al menos tres formas diferentes: la forma hiperaguda o apopléctica, la forma aguda, y la forma subaguda o crónica. Los rumiantes son los más propensos a manifestar las formas hiperagudas y agudas, los caballos la forma aguda, y los perros, gatos y cerdos, una forma subaguda, crónica o localizada. En la enfermedad hiperaguda, los signos que preceden a la muerte son a menudo inapreciables. La historia clínica suele describir que unas pocas horas antes de la muerte el animal está en buenas condiciones. Si se observa al animal inmediatamente antes de la muerte, los síntomas más comunes son fiebre hasta 42°C (107°F), temblores musculares, disnea y congestión de las mucosas. Poco después, el animal tiene a menudo convulsiones terminales, colapso y luego muere. Después de la muerte se puede ver a veces exudación de sangre no coagulada por el ano, la vulva, las narices y/o la boca. También es usual un rigor mortis incompleto.

1 The Division of Bacterial and Mycotic Diseases, Centers for Disease Control, 1600 Clifton Road, Atlanta, Georgia 30333,

United States of America.

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La forma aguda puede ocurrir en el ganado y se pueden observar síntomas clínicos 48 horas antes de la muerte, tales como depresión, anorexia, fiebre, respiración rápida, aceleración cardiaca, congestión de las membranas mucosas e hinchamientos edematosos. La forma aguda se presenta normalmente en caballos y depende del sitio de exposición. Signos de enteritis y cólico se acompañan con fiebre alta y depresión. La muerte ocurre, por lo general, entre las 48-96 horas. Las esporas introducidas subcutáneamente, por ejemplo, por insectos picadores, provocan un hinchamiento local edematoso y caliente que se extiende al cuello, tórax, abdomen, prepucio o glándula mamaria. También puede aparecer disnea debida al hinchamiento del cuello con la consiguiente compresión de la tráquea. La duración de la enfermedad es normalmente de 1-3 días, aunque algunos animales sobreviven durante una semana o más.

La forma subaguda o crónica del carbunco aparece en cerdos domésticos y salvajes, en perros y en gatos. La bacteria infecciosa penetra normalmente cuando el hospedador se alimenta de una fuente contaminada. El organismo tiende a localizarse en los nódulos linfáticos regionales del área faríngea, donde puede ocurrir un hinchamiento grave, ocasionando la muerte por oclusión de la vía respiratoria. En los casos en que esto no ocurre, puede desarrollarse una bacteriemia fatal, aunque resulta relativamente común la recuperación después de unos días de enfermedad. En carnívoros y omnívoros también aparece una forma intestinal con gastroenteritis aguda grave.

La sospecha de la existencia de carbunco dependerá de síntomas, tales como muerte súbita con o sin hemorragia por los orificios y rigor mortis incompleto, o de la historia del lugar, la manada, etc. Si se sospecha que puede ser carbunco, se hace un frotis delgado sobre un porta de microscopio con una pequeña gota de sangre. La sangre se puede obtener haciendo un pequeño corte en una vena de la oreja o de cualquier vena disponible con una jeringa (ha de tenerse cuidado en evitar contaminar el ambiente o al operador). El frotis de sangre se seca al aire, se fija por inmersión in alcohol de 95-100% durante 1 minuto y se decolora con azul de metileno policrómico (se dan más detalles más adelante). La presencia de un bacilo encapsulado semejando furgones del ferrocarril en pares o en cadenas cortas, generalmente en gran número, es prueba definitiva de carbunco. Frotis hechos de la sangre que sale de cualquiera de los orificios revelará los bacilos encapsulados, pero pueden contaminarse con otros organismos o artefactos. Se pueden también tomar muestras de la sangre para cultivo.

En casos confirmados o sospechosos, para evitar la contaminación ambiental, es normal no llevar a cabo una necropsia de la res muerta. Si se abre el cadáver para una necropsia o lo hacen animales carroñeros, la forma vegetativa de B. anthracis se liberará del entorno ácido de la descomposición y producirá esporas que crearán focos de contaminación. En algunos países, los análisis post morten están prohibidos. Sin embargo, los hallazgos después de análisis post morten están bien documentados. No hay lesiones patognomónicas grandes y se ven considerables similitudes con otras causas tóxicas o infecciosas de muerte aguda. Es frecuente la sangre oscura poco coagulada, el bazo pulposo agrandado con consistencia de "mermelada de mora", y múltiples hemorragias petequiales características de septicemia. En los caballos, los hallazgos post morten pueden ser similares a los de los rumiantes, pero a veces pueden consistir simplemente en lesiones edematosas confinados a la garganta y cuello sin involucrar a órganos internos. En omnívoros (cerdos) y carnívoros, se pueden dar síntomas de septicemia como los descritos para los rumiantes, pero se produce con más frecuencia un extenso edema e inflamación en el área faríngea. Si el foco de la infección está en el tracto gastrointestinal, se puede ver inflamación grave, a veces con hemorragia y necrosis, en el estómago, intestino y nódulos linfáticos mesentéricos, acompañada de peritonitis y excesivo líquido peritoneal.

La descomposición natural de una res muerta destruye la mayor parte de los organismos vegetativos por la acción de bacterias que causan la putrefacción. Esto puede ocurrir en uno o dos días en climas cálidos si la res muerta no se toca. Puede que los bacilos encapsulados no se vean fácilmente en frotis de muestras de sangre tomadas después de que esto haya sucedido, a pesar de que la sangre puede dar positiva para cultivos durante un día o más. Puede ocurrir cierta esporulación en los fluidos exudados a través de las aberturas naturales del cuerpo y, especialmente si la res muerta ha sido abierta por carroñeros, se pueden dispersar muchas esporas al medio ambiente. Muestras de fluidos congelados o muestras de suelo contaminado por los fluidos es probable que desarrollen B. anthracis en cultivo. El cultivo de muestras de suelo puede ser la mejor forma de confirmar que la muerte fue debida a carbunco en reses muertas putrefactas.

• Eliminación después de la recogida de muestras

La adecuada eliminación por incineración de una res muerta infectada (aunque es un procedimiento trabajoso y con consumo de energía) es el método más deseable y con frecuencia el dispuesto por ley. El suelo contaminado, los lechos, etc. deberían incinerarse junto con la res muerta, e, idealmente, el lugar debería ser desinfectado para más seguridad. Donde no se pueda llevar a cabo la incineración, la alternativa es un enterramiento profundo (preferentemente con cal viva), aunque la recuperación periódica de esporas de carbunco en algunas sitios de antiguos enterramiento de reses muertas, ha puesto de manifiesto que esta alternativa es menos satisfactoria.



• Factores de riesgo para manipuladores de reses muertas por carbunco

El riesgo de inhalar dosis infecciosas es importante en ocupaciones que impliquen el procesamiento de materiales derivados del animal en la fabricación de productos (carbunco industrial). Éstas incluyen el procesado del cuero, de la lana, de la piel para alfombras, de los huesos, y otras ocupaciones en industrias similares donde el potencial de aerosolización de una cantidad importante de esporas incrementa el riesgo de exposición a dosis infecciosas. Los que trabajan en laboratorios deberían tener una buena práctica cuando trabajan con especímenes de casos sospechosos de carbunco y cuando crezcan B. anthracis. Se requiere una cabina de seguridad biológica para la manipulación de caldos de cultivo o suspensiones de esporas. La descontaminación de todos los materiales y superficies contaminadas debe llevarse a cabo mediante el autoclave, incineración o tratamiento con hipoclorito sódico al 10% (lejía). No se requiere el uso de animales de laboratorio para diagnóstico, pero si se usan, los lechos y las jaulas deben pasarse por el autoclave después de su uso y el lecho debe ser incinerado. Ha de tenerse cuidado en no producir aerosoles de polvo cuando se maneje el lecho. También han de evitarse heridas en la piel por instrumentos afilados o picaduras y arañazos de animales.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

1. Identificación del agente

La demostración de B. anthracis encapsulado en frotis de sangre o de tejidos de cadáveres frescos infectados de carbunco, y el crecimiento del organismo en placas de medio sólido con sangre, no resulta muy complicado y está al alcance de la mayoría de los laboratorios de bacteriología. Puede haber cierta dificultad en el caso de cerdos y carnívoros en los cuales la bacteriemia terminal no es muy marcada, o en animales que recibieron antibióticos antes de morir.

La recuperación de B. anthracis de reses antiguas muertas en descomposición, de materiales procesados (hueso, carne, pellejo), o de muestras ambientales (suelo contaminado) es a menudo difícil, requiriendo procedimientos de mucho tiempo y trabajo.

a) Muestras frescas

• Visualización de la cápsula

Como se ha descrito anteriormente, ha de buscarse el B. anthracis encapsulado y virulento presente en tejidos, sangre y otros fluidos del cuerpo de los animales muertos por carbunco en los frotis de estas muestras que se han secado, fijado en alcohol absoluto durante 3 minutos y teñido con azul de metileno policrómico (reacción de M'Fadyean) o tinción de Giemsa. La cápsula se colorea de rosa, mientras que las células del bacilo se tiñen de azul oscuro. Las células se encuentran en pares o en cadenas cortas y a menudo terminan como cortadas a bisel (las cadenas a veces parecen un conjunto de coches del tren -la llamada apariencia en "furgón de ferrocarril"). La tinción de Gram no revela la cápsula. La cápsula no se presenta en B. anthracis cuando crece aeróbicamente sobre agar nutritivo o en caldo nutritivo, pero puede verse cuando la bacteria virulenta se cultiva durante unas pocas horas en unos mililitros de sangre (la sangre desfibrinada del caballo parece ser la que mejor funciona). Alternativamente, la cápsula se produce cuando B. anthracis virulento se cultiva en medio de agar nutritivo que contenga 0,7% de bicarbonato sódico y se incuba en presencia de CO2 (20% es óptimo, pero también sirve una jarra de anaerobios). El medio sólido se prepara poniendo en 90 ml de agua el suficiente agar nutritivo en polvo para hacer 100 ml de medio sólido. Después se lleva al autoclave y se enfría a 50°C en baño de agua; se añaden 10 ml de una solución de bicarbonato sódico al 7% esterilizada por filtración (filtro de 0,22-0,45 µm) y se mezcla. La solución se vierte después en placas Petri. B. anthracis encapsulado formará colonias mucosas y la cápsula se puede visualizar haciendo frotis finos sobre portas de microscopio, fijando y tiñendo como antes con azul de metileno policromático.

• Azul de metileno policromático (tinción de M'Fadyean)

El azul de metileno policromático se prepara de la siguiente forma: 0,3 g de azul de metileno se disuelven en 30 ml de etanol al 95%; 100 ml de 0,01% de hidróxido potásico (KOH) se mezclan con la solución de azul de metileno. Esta solución preferentemente debería exponerse al aire, con agitación ocasional, durante al menos 1 año para que se oxide y madure. La adición de K2CO3 (a una concentración final del 1%) acelera la "maduración" del colorante, pero antes de que se considere fiable desde el punto de vista diagnóstico, debe establecerse su eficacia probándola en paralelo con un lote previo de colorante funcional sobre muestras bona fide. Se ha encontrado que las tinciones que dan reacción positiva con cultivos de B. anthracis cultivado artificialmente en sangre de caballo no dan a veces resultados positivos en el campo. La preparación comercial de tinción de azul de metileno policrómico (M'Fadyean) es cada vez más difícil de obtener.



Para hacer frotis para tinciones, solo se necesitan gotitas de sangre o fluido del tejido, y es mejor un frotis pequeño. Después de fijarla en etanol y secarla, una gota de colorante (aproximadamente 20 µl) se coloca sobre el frotis y se extiende sobre él con un asa de cultivo. Después de 1 minuto, el colorante se lava con agua, se empapa el exceso, se seca al aire y se observa inicialmente usando una lente con un objetivo de 10x bajo el cual las cadenas cortas aparecen como cabellos pequeños; una vez encontradas, se pueden observar con aceite de inmersión (1.000x) para buscar la presencia de la cápsula rosa rodeando los bacilos teñidos de azul/negro. Para evitar la contaminación en el laboratorio, la placa y el papel absorbente se deben llevar al autoclave o dejar durante algunas horas en una disolución de hipoclorito sódico al 10%.

• Identificación y cultivo de Bacillus anthracis

Bacillus anthracis crece fácilmente en la mayoría de los tipos de medios sólidos nutritivos, aunque el medio de diagnóstico que se suele escoger es medio sólido con sangre de caballo u oveja. La inclusión de polimixina (100.000 unidades por litro de medio) suprimirá las bacterias contaminantes y ayudará al aislamiento de B. anthracis. La sangre es el material clínico primario para someter a examen. Frotis de sangre, de otros fluidos del cuerpo o tomados de incisiones en tejidos u órganos se pueden sembrar por extensión sobre placas de medio sólido con sangre. Después de incubación durante toda la noche a 37°C, las colonias de B. anthracis son de un color entre blanco grisáceo y gris, con un diámetro entre 0,3-0,5 mm, no hemolíticas, con una superficie húmeda traslúcida, y muy pegajosa cuando se toma con un asa de cultivo. A veces se ven rastros y manojos prominentes de crecimiento hacia la colonia de origen, todos en la misma dirección. Esta característica se puede describir como apariencia en forma de "cabeza de medusa". La confirmación de que se trata de B. anthracis se puede llevar a cabo demostrando la presencia en el cultivo con sangre de un bacilo encapsulado, formador de esporas y Gram-positivo. Se puede determinar la ausencia de movilidad como una prueba adicional.

La susceptibilidad de B. anthracis al bacteriófago gamma fue descrita inicialmente por Brown y Cherry en 1955 (3). El fago esta disponible en el CDC (ver nota a pie de página 1), en varios laboratorios veterinarios centrales nacionales y en otros laboratorios de referencia del carbunco. El procedimiento para la prueba es simplemente sembrar en estría una línea con el organismo sospechoso sobre una placa con medio sólido nutritivo o con sangre, o en una porción de una placa (se pueden llevar a cabo varias pruebas sobre una placa), y colocar una gota de 10-15 µl de la suspensión del fago sobre una parte del área sembrada y colocar un disco de penicilina de 10-unidades en el otro lado. Hay que dejar que la gota de la suspensión del fago penetre e incubar la placa a 37°C. Se debe incluir un cultivo control; la vacuna de Sterne se puede usar para este propósito. Si el cultivo es B. anthracis, el área bajo el fago estará desprovista de crecimiento bacteriano, debido a la lisis, y una zona clara se podrá ver alrededor del disco de penicilina después de incubación durante la noche. (Nota: muy ocasionalmente se encuentra aislados de B. anthracis resistentes al fago; de forma similar, en la literatura hay algunos informes de resistencia a la penicilina). La inducción de la cápsula se describió anteriormente.

• Confirmación de la virulencia con la reacción en cadena de la polimerasa

La confirmación total de la virulencia se puede llevar a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las siguientes instrucciones están tomadas de la referencia 14. El ADN molde para PCR se puede preparar desde una colonia fresca de B. anthracis sobre agar nutritivo por resuspensión de la masa de crecimiento que se recoge con un asa en 25 µl de agua estéril desionizada (o destilada) y calentando a 95°C durante 20 minutos. Es importante considerar que, si se usa de otra forma una colonia joven, podría haber algunas bacterias vivas en el lisado. Después de enfriar hasta aproximadamente 4°C y de centrifugar brevemente, el sobrenadante se puede usar para la reacción PCR.

Los cebadores adecuados (2,6) para confirmar la presencia de los plásmidos pX01 y pX02 se dan en el cuadro que se incluye a continuación.

Diana Cebador ID Secuencia 5’–3’ Tamaño del producto

Concentración

Antígeno de protección

(PA)

PA 5 3048–3029

TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG 596 bp 1 mM

PA 8 2452–2471

GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT

Cápsula 1234 1411–1430

CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG 846 bp 0,2 mM

1301 2257–2238

TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG



La PCR se puede llevar a cabo en volúmenes de 50 µl usando los cebadores indicados anteriormente, 200 µM en cada caso de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 1,5 mM de MgC2 y 2,5 unidades de polimerasa amplitaq, todo en tampón NH4, seguido de la adición de 5 µl de ADN molde. Se ha encontrado que un gel de agarosa al 2% funciona bien con estos fragmentos pequeños.

Alternativamente, hay preparaciones "Ready-to-GoTM" que están disponibles comercialmente en Pharmacia Biotech2. Se trata de preparados secos, mezclados previamente, y ya distribuidos, que son estables a temperatura ambiente, y que contienen todos los reactivos necesarios, excepto el molde y el cebador, para llevar a cabo reacciones de PCR de 25 µl. El molde se puede añadir en un volumen de 2.5 µl.

Se puede usar el siguiente ciclo de PCR: 1 x 95°C durante 5 minutos; 30 x 95°C durante 0,5 minutos seguido de 0,5 minutos a 55°C y de 0,5 minutos a 72°C; 1 x 72°C durante 5 minutos; enfriar a 4°C.

Ha de tenerse en cuenta que los cebadores incluidos en el cuadro anterior, que se han usado durante algunos años en una instalación de referencia del carbunco, han sido útiles para confirmar la presencia o ausencia de pXO1 y/o pXO2 en cultivos puros de aislamientos procedentes de especies animales (incluyendo humanos) o en muestras ambientales. Sin embargo, no son adecuados para la detección directa de B. anthracis en tales casos. En la ref. 7 se puede encontrar una selección de alternativas. En el caso improbable de que un aislamiento carezca tanto de pXO1 como de pXO2, se debería usar también un marcador cromosómico; los cebadores para éstos se proporcionan en la ref. 7.

b) Identificación del agente en muestras antiguas o descompuestas, materiales procesados y muestras ambientales, incluyendo suelo.

Estas muestras contienen con frecuencia contaminantes saprofitas que inhiben y obscurecen el crecimiento de B. anthracis en medios sólidos no selectivos. Se sugiere el siguiente procedimiento:

i) La muestra se mezcla con dos volúmenes de agua estéril destilada o desionizada y se coloca en un baño de agua a 62,5 ± 0,5°C durante 15 minutos.

ii) Se preparan diluciones decimales de 10-2 o 10-3. De cada dilución se siembran 10-100 µl en medio sólido con sangre y 250-300 µl en medio sólido PLET (polimixina, lisozima, EDTA [ácido etilén diamino tetraacético], acetato talioso) (8,14). Todas las placas se incuban a 37°C.

iii) Las placas de medio sólido con sangre se examinan para la aparición de colonias típicas como se ha descrito previamente después de la incubación durante toda la noche, y las placas con medio PLET se examinan después de 40-48 horas. La confirmación de la identidad de colonias sospechosas de B. anthracis se lleva a cabo como se describió anteriormente.

El medio PLET (8,14) se prepara usando medio sólido base de infusión de corazón (DIFCO) según las instrucciones del fabricante y añadiendo 0,25-0,3 g/litro de EDTA y 0,04 g/litro de acetato talioso. (NOTA: el acetato talioso es venenoso y debe manejarse con cuidado). La mezcla se lleva al autoclave y se enfría uniformemente hasta 50°C antes de añadir la polimixina a 30.000 unidades/litro y la lisozima a 300.000 unidades/litro. Después de mezclar homogéneamente, el medio sólido se distribuye en placas Petri.

Están surgiendo informes sobre procedimientos para la detección directa de B. anthracis en suelos y otras muestras ambientales usando la técnica de PCR. Hasta ahora, ninguno de ellos tiene uso rutinario.

Si todos los otros métodos fallan, se puede tener en cuenta la inoculación en animales para recuperar B. anthracis. Un ejemplo es el caso de muestras de animales que han recibido terapia antibiótica antes de la muerte, o de muestras ambientales que contengan compuestos inhibidores de las esporas. A causa del aumento en la preocupación por eliminar el uso de animales en pruebas biológicas, este enfoque debería usarse como último recurso y solamente si estuviera justificado. Los ratones o cobayas adultos son los animales de elección. Si las muestras son de suelos, los animales deberían pretratarse el día antes de la prueba con antisueros contra el tétanos y la gangrena gaseosa. Las muestras se preparan como se describió para el cultivo (Sección B.1.a., más arriba), incluyendo un choque térmico a 62,5°C por 15 minutos. Los ratones se inyectan subcutáneamente con 0,05-0,1 ml; los cobayas se inoculan intramuscularmente con hasta 0,4 ml (0,2 ml en el músculo de cada muslo). Cualquier B. anthracis presente provocará la muerte en 48-72 horas y el organismo se puede cultivar de la sangre como se describió anteriormente.

2 Uppsala, Sweden, producto número 27-9555-01.



c) Detección inmunológica y diagnóstico

Hay que resaltar que B.anthracis está muy relacionado antigénicamente con B.cereus, que es un componente ubicuo de la microflora ambiental. Los únicos antígenos no compartidos que permiten diferenciar por métodos inmunológicos estas dos especies son los antígenos de la toxina del carbunco, que se producen durante la fase exponencial de crecimiento, y la cápsula de B. anthracis. Esto limita considerablemente la medida en que los métodos inmunológicos pueden usarse en sistemas de detección rutinaria.

• Pruebas de Ascoli (1)

En 1911, Ascoli (1) publicó un procedimiento para detectar el antígeno termoestable del carbunco en tejidos animales usados en la fabricación de productos derivados. Este ensayo usa antisuero obtenido en conejos para producir una reacción de precipitación. La prueba carece de elevada especificidad, ya que los antígenos termoestables de B. anthracis son compartidos por otras especies de bacilos, y es dependiente de la probabilidad de que B.anthracis sea el único que prolifere en el animal y produzca antígenos suficientes para dar una reacción positiva. Hoy día parece usarse solamente en la Europa del Este.

Para realizar la prueba de Ascoli, se ponen aproximadamente 2 g de muestra en 5 ml de solución salina conteniendo una concentración final de ácido acético de 1/100 y se hierve durante 5 minutos. La solución resultante se enfría y se pasa a través de papel de filtro. Se colocan unas cuantas gotas de antisuero de conejo (ver la preparación más adelante) en un pequeño tubo de ensayo. El filtrado del paso previo se deposita cuidadosamente sobre el antisuero. Un ensayo positivo es la formación de una banda visible de precipitación en menos de 15 minutos. Se deberían incluir suspensiones con muestras control positivas y negativas.

El antisuero se prepara en conejos por la inoculación subcutánea de la vacuna Sterne del carbunco los días 1 y 14. Los días 28 y 35 los conejos reciben 0,5 ml de una mezcla en solución salina de varias cepas virulentas de B. anthracis que no exceda de 105 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml. Alternativamente, las bacterias vivas virulentas se pueden inactivar por suspensión prolongada en solución salina con 0,2% de formol, pero la masa de antígenos se incrementa entonces a 108-109 CFU/ml. La suspensión debería analizarse en cuanto a inactivación de B. anthracis antes de la inoculación en el animal mediante cultivo de 0,1 ml en 100 ml de caldo nutritivo que contenga 0,1% de histidina y, después de incubar por 7 días a 37°C, mediante subcultivo en sangre o agar nutritivo. El régimen de dosis para la suspensión con formol después de la vacunación inicial los días 1 y 14 consiste en dosis incrementadas de 0,1, 0,5, 1, y 2 ml suministradas intravenosamente cada cuatro o cinco días. En cualquiera de estos procedimientos se hace necesaria una sangría de prueba a los diez días después de la última inyección para determinar si se deberían administrar dosis adicionales de 2 ml para estimular el título de precipitina.

• Inmunofluorescencia

Aunque se ha obtenido un cierto éxito con la inmunofluorescencia aplicada a la observación de cápsulas en contextos de investigación (4), la misma no se presta a métodos usuales de diagnosis.

2. Pruebas serológicas

Históricamente, no ha habido mucha necesidad de apoyo serológico para la diagnosis del carbunco en animales. O el animal tenía carbunco, reconocible por la reciente historia de la manada o del sitio, y era tratado convenientemente, o fallecía. La mayor parte del interés en el desarrollo de pruebas serológicas ha derivado de investigaciones sobre la respuesta humoral en humanos, y en menor medida en animales, a fin de evaluar vacunas y para estudios epidemiológicos que implicaban seroconversión adquirida naturalmente en humanos, animales domésticos y mamíferos salvajes.

En la actualidad se acepta que el mejor procedimiento serológico es el enzimoinmunoensayo (ELISA) en placas de microtitulación con revestimiento del componente del antígeno de protección (PA) de la toxina del carbunco a 3-5 µg/ml en tampón carbonato de revestimiento a alto pH (9,5). Los antígenos de la toxina parecen ser verdaderamente específicos para B. anthracis, aunque actualmente no están comercialmente disponibles. Esto implica que la serología del carbunco está reducida en la actualidad a la actividad de unos cuantos laboratorios especializados. Existen varias versiones de ELISA que se pueden encontrar en manuales estándar de laboratorio; cualquier versión es válida para serología del carbunco, aunque algunos sueros parecen ser más pegajosos que otros. Un detalle útil es usar leche reconstituida en polvo como agente bloqueante y elevar su concentración hasta que los sueros control negativos den resultados negativos de forma repetitiva. Para suero bovino, suele ser una suspensión al 10% o más alta.

En otra parte se recogen ejemplos de aplicación con éxito de la serología para el carbunco en condiciones de campo (5, 11, 15),



3. Prueba de la hipersensibilidad (Antraxina TM) 3

En Europa Central y del Este se ha extendido el uso de una prueba cutánea usando AntraxinaTM, autorizada primero en la antigua URSS en 1962, para la diagnosis retrospectiva del carbunco en humanos y animales y para la evaluación de vacunas (12). Es un producto comercial que contiene un complejo termoestable de proteína/polisacárido/ácido nucleico, obtenido del fluido edematoso de animales inoculados con la vacuna STI o con las cepas Zenkowsky de B. anthracis. La prueba consiste en la inyección intradérmica de 0,1 ml de Antraxina y la inspección 24 horas después del eritema y la induración que aparece en tal sitio y que dura hasta 48 horas después de la inyección. Esta hipersensibilidad de tipo retardado se cree que refleja la inmunidad mediata por células contra el carbunco y ha sido la prueba capaz de diagnosticar de modo retrospectivo la existencia de una infección primaria de 31 años de antigüedad en el 72% de los casos. También se usó con éxito en Suiza en una investigación retrospectiva de una serie de casos ocurridos en una fábrica de tejidos donde se combinaban fibras sintéticas con pelo de cabra de Pakistán (10). La fiabilidad diagnóstica de la Antraxina, como la de la prueba de Ascoli, depende de la naturaleza del carbunco más bien que de la especificidad de los antígenos implicados.

C.1. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO: VACUNAS

La vacuna de más amplio uso para prevenir el carbunco en animales es la desarrollada por Sterne en 1937 (13). Este autor obtuvo una variante rugosa de B. anthracis virulento en cultivos sólidos con suero en atmósfera de elevado contenido en CO2. Esta variante, llamada 34F2, era incapaz de formar cápsula y después se descubrió que había perdido el plásmido pX02, que codifica la formación de la cápsula. Ha llegado a ser la cepa más usada en todo el mundo para producción de vacunas contra el carbunco en animales. En Europa Central y del Este, el ingrediente activo de las vacunas actuales para el ganado es un derivado equivalente, la cepa 55, que también carece de pX02. En el Apéndice V de la ref. 14 se suministra una lista de fabricantes de vacuna contra el carbunco para uso en animales.

La siguiente información referente a la preparación de vacuna contra carbunco, para uso en animales está basada en las referencias 9 y 16. Se describen procedimientos generales, pero las Autoridades Reguladoras Nacionales deben ser consultadas en relación a las operaciones de los procedimientos estándares que pueden ser de incumbencia local.

1. Control del inóculo

a) Características del inóculo

La producción de vacunas del carbunco se basa en un sistema de lotes de inóculos. Un lote de inóculo es una cantidad de esporas de composición uniforme que son procesadas a la vez y mantenidas con el fin de preparar vacunas. Cada lote de inóculo no tiene más de tres pases del cultivo original y debe producir una vacuna que sea eficaz y segura para uso en animales. Se recomienda preparar un gran lote de siembra de la cepa original y conservarlo por liofilización para preparación de futuros lotes. Los cultivos originales se pueden adquirir4. El lote se siembra es aceptable para producir LA vacuna de carbunco si una vacuna preparada de dicho lote o una suspensión derivada de un cultivo del lote supera los requisitos de control final respecto a ausencia de contaminación bacteriana, seguridad y eficacia (inmunogenicidad),

b) Preparación del inóculo original

Se cultivan lotes de siembra sobre medios sólidos diseñados para favorecer la esporulación del organismo (ver Sección C.1.2, más adelante). La fórmula del medio sólido de la ref. 9 es: 50 g de caseína digerida con tripsina de (tripticasa); 10 g de extracto de levadura; 0.1 g CaCl2.6H2O; 0,01 g de FeSO4.7H2O; 0,05 g de MgSO4.7H2O; 0,03 g de MnSO4.4H2O; 5,0 g de K2HPO4; 1,0 g de KH2PO4; 22 g de agar; 1.000ml de agua desionizada o destilada. Los ingredientes se disuelven en agua convenientemente calentada; la solución se ajusta a pH 7.4, se distribuye en botellas Roux (120 ml por botella) u otro recipiente apropiado, se esteriliza por autoclave y se enfría en posición horizontal. Después de que el agar se haya solidificado, se extrae asépticamente el exceso de líquido y las botellas se dejan en un incubador (37°C) por al menos 2 días para secarse y para comprobar su esterilidad.

Sobre el agar de las botellas Roux se siembran volúmenes de 2 ml de inóculo vacunal de un laboratorio de referencia, y se debe incubar a 37°C hasta que se aprecie un mínimo de 80% de esporulación (al menos 72 horas) mediante examen microscópico de muestras tomadas asépticamente con el asa de cultivo. La masa microbiana se recoge con 10 ml de de agua estéril desionizada o destilada por botella y se

3 V.O. Medexport, 113461 Moscow, Russia 4 National Institute for Biological Standards and Control, Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG,

United Kingdom.



comprueba su pureza. Después de lavar tres veces con agua estéril desionizada o destilada se añade a la suspensión final un estabilizador estéril para liofilización, en el mismo tipo de agua, y se distribuye la solución en viales para liofilización, que luego se congelan.

c) Preparación y prueba del inóculo de trabajo

Se reconstituye un vial del stock de inóculos y se siembran varios cultivos (de aproximadamente 10 ml) para esporulación en tubos con agar inclinado (con tripticasa). Se incuban 72 horas a 37°C y se guardan en nevera. Los tubos con agar inclinado se ensayan en cuanto a pureza mediante cultivo en placas de agar nutritivo y en caldo nutritivo (0,1 ml en 100 ml de caldo nutritivo). Éste último se debe subcultivar en agar nutritivo después de incubar a 37°C durante 7 días y debería ser un cultivo puro de B. anthracis. También se debe ensayar una muestra del caldo nutritivo para comprobar la falta de movilidad.

Para un proceso de producción, los volúmenes de inóculo que se necesitan deben calcularse dependiendo de la cantidad de esporas recogidas de cada tubo de agar inclinado con 10 ml de agua estéril desionizada o destilada, que se usarán para inocular cinco botellas Roux.

d) Seguridad del lote de inóculo

Se deben inyectar subcutáneamente no menos de 5 x 109 esporas cultivables en cada una de tres ovejas no vacunadas de 1-2 años de edad, que deben sobrevivir después de un período de observación que supere 10 días.

e) Inmunogenicidad del lote de inóculo

Se deben inocular al menos 10 cobayas sanos, de 300-500 g de peso, con 5 x 106 esporas viables y tenerlos en observación 21 días. Debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los animales inmunizados, junto con tres controles, deben de ser luego desafiados con 10 dosis letales medias (LD50) de la cepa JB de B. anthracis. Durante un período de observación de 10 días, ninguno de los animales debe sucumbir ante el desafío o descarga mientras que todos los controles deben morir de carbunco. Se deberá repetir la prueba en caso de muerte de alguno de los animales inmunizados.

2. Método de producción

a) Preparación de concentrados de vacuna

Se preparan botellas Roux con medio de agar tripticasa como para el caso del inóculo original visto antes en la Sección C.1.1.b. Una botella Roux puede suministrar unas 2.000 dosis de vacuna. Cada botella Roux se inocula con 2 ml de suspensión de inóculo de trabajo y se incuba a 37°C con tapón poroso durante varios días hasta que muestras de cultivo tomadas con un asa de siembra de botellas seleccionadas al azar revelen que al menos un 90% de los organismos están en forma esporulada cuando dichas muestras se examinan en preparaciones montadas para contraste de fases (las esporas aparecen brillantes en contraste de fases) o mediante tinción de esporas. Entonces se recoge el crecimiento de cada botella con 20 ml de solución salina fisiológica. Se deben realizar pruebas de contaminación por subcultivo en placas de agar nutritivo e inoculación de 100 ml de caldo nutritivo con 0,1 ml de las esporas recogidas y su posterior subcultivo en agar nutritivo después de 7 días a 37°C y mediante pruebas de movilidad. Las masas microbianas recogidas después de el crecimiento que sean aceptables (es decir, aquellas que no muestran evidencia de contaminación), se almacenan juntas.

b) Glicerinación

Al volumen de masa microbiana final recogida se debe añadir el doble del volumen de glicerol neutro puro y estéril. También se puede añadir en este paso saponina (a concentración final de 0,1%) si se tuviera que incluir como adyuvante. Se mezcla exhaustivamente (la adición de perlas de vidrio esterilizadas suele ser de ayuda). Se realizan pruebas de pureza como antes y se mantiene el producto a temperatura ambiente durante 3 semanas para permitir la lisis de cualquier forma de bacteria vegetativa, se realiza una determinación de esporas viables y se guarda después en nevera.

c) Determinación del título y dilución para uso

El número de esporas cultivables en el producto se determina luego sembrando por extensión diluciones decimales sobre placas con agar nutritivo. La suspensión se diluye de modo que la masa final contenga el número deseado de esporas cultivables. El diluyente empleado debe contener la misma proporción de solución salina, glicerol y (en su caso) saponina que la presente en el concentrado de vacuna. La vacuna debe contener no menos de 10 millones de esporas viables por dosis para el ganado bovino, búfalos y caballos, y no menos de 5 millones de esporas por dosis para ovejas, cabras y cerdos.



d) Inocuidad

La prueba de seguridad se realiza sobre dos ovejas o cabras sanas y consiste en la inoculación subcutánea del doble de la dosis vacunal recomendada. Los animales se observan por 10 días. El producto final supera la prueba si no se desarrollan reacciones sistémicas y si no se observa algo más que un edema transitorio en el lugar de la inyección. Si la prueba se realiza solo en ovejas, un edema progresivo indica que la vacuna puede resultar inadecuada para cabras.

e) Llenado de recipientes

La distribución de alícuotas de las vacunas en recipientes de mono y multidosis se realiza como se indica en el Informe Técnico No. 363 de la serie publicada por la Organización Mundial de la Salud titulada Requisitos Generales para Establecimientos de Producción y Laboratorios de Control (Requirementes for Biological Substances No.1), 1965, 16-17. Básicamente, el producto final se distribuye en los recipientes de modo aséptico en un área no usada para la producción, y se debe evitar cualquier contaminación o alteración del producto. Después de la distribución, la vacuna debe liofilizarse en recipientes adecuados a las dosis. Los recipientes se sellan tan pronto como sea posible con un material que no perjudique al producto y que se a capaz de mantener un cierre hermético durante la validez de la vacuna.

3. Control del proceso

Las pruebas de pureza se basan en el examen microscópico de frotis teñidos y en pruebas de cultivo y movilidad como se indico (10) en la Sección C1.2.a.

4. Control de lotes y pruebas sobre el producto final

a) Esterilidad

La vacuna es un cultivo de esporas vivas de B. anthracis; la esterilidad no es de aplicación, pero los lotes se deben ensayar en cuanto a ausencia de contaminación (ver Capítulo I.1.5,).

b) Eficacia

La eficacia o inmunogenicidad se prueba en el producto final del siguiente modo: se inoculan al menos 10 cobayas sanos de 300-500 g con una dosis de vacuna para ovejas. Los cobayas se observan por 21 días, y durante este período debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los cobayas inmunizados supervivientes y tres controles no vacunados se desafían con una dosis apropiada de B. anthracis virulento. Un desafío recomendado es suministrar 200 LD50 de la cepa Pasteur II (JB), que se puede obtener de la misma fuente que la cepa vacunal Sterne 34F2. Si 10 días después del estímulo de desafío, todos los cobayas vacunados sobreviven y los animales control mueren, se estima que el producto final es satisfactorio. Si durante el período que sigue al desafío muere cualquier animal vacunado por causa distinta al carbunco, y la muerte no se asocia con la vacuna, la prueba debe repetirse.

c) Dosis

La dosis mínima recomendada para ganado vacuno y para caballos es 10 x 106 esporas cultivables; para ovejas, cabras y cerdos es 1-5 x 106 esporas cultivables. La vacuna debe contener estas esporas en un volumen apropiado, por ejemplo 1 x 107/ml.

d) Duración de la inmunidad

La mayor parte de los expertos consideran que la inmunidad es buena durante al menos 1 año y se recomienda dar una dosis estimulatoria anual de recuerdo. Los caballos pueden ser más lentos en el desarrollo de la inmunidad después de la vacunación inicial; en consecuencia, algunos productores recomiendan una vacunación inicial con dos dosis, administradas con separación de 1 mes, seguida por una única dosis anual de recuerdo.

e) Estabilidad

Al no existir una prueba de aceptación general para la estabilidad de las vacunas del carbunco, se recomienda que, al llenar cada lote, se determine el número de esporas cultivables antes y después de conservarlos a una temperatura apropiada por un cierto período. No debería evidenciarse un descenso en el número de esporas cultivables.



f) Conservantes y almacenamiento

Las esporas de Bacillus anthracis son estables en vacunas liofilizadas y no liofilizadas y no se necesitan conservantes. Se recomienda su almacenamiento con refrigeración (4°C).

g) Precauciones (riesgos)

Se sabe que la vacuna produce enfermedad en algunas cabras y llamas; esto puede deberse al adyuvante de saponina. No se recomienda el uso de la vacuna en hembras grávidas ni en animales destinados al sacrificio a las 2-3 semanas de la vacunación. Las regulaciones locales en algunos países o regiones pueden especificar otros intervalos temporales, pero no existe ninguna razón científica para considerar que la carne de animales clínicamente sanos no es apta para el manejo o consumo humano después de un período de retención de 2 semanas después de la vacunación. Está contraindicada la administración simultánea de antibióticos a animales vacunados, pues el antibiótico puede interferir con la vacuna. No se deben dar antibióticos durante algunos días antes y algunos días después de la vacunación. La vacuna viva no usada, los viales vacíos, y el equipo usado para la vacunación están contaminados con esporas vivas y deberían ser autoclavados, desinfectados o incinerados. En el hombre, la inoculación accidental se trata eliminando en lo posible el inóculo en el sitio de la inyección y lavando extensamente la herida con agua y jabón. Debe buscarse atención médica si se desarrollara infección.

5. Pruebas sobre el producto final

a) Seguridad

Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a seguridad como se describe en la Sección C1.2.d.

b) Potencia

Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a potencia como se describe en la Sección C1.4.b.

C2. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO: MATERIALES BIOLÓGICOS DE DIAGNÓSTICO

• Propagación del bacteriófago “gamma” para diagnóstico

1. Preparar un crecimiento en “césped” de B. anthracis en placas de 150 x 15 mm con medio Mueller-Hinton y 5% de sangre de oveja.

2. Incubar por 4-6 horas a 37°C, y si hay suficiente crecimiento vegetativo (visible a simple vista) sembrar el cultivo con fago. Si el crecimiento es débil, incubar entonces toda la noche antes de sembrar el fago.

3. La siembra se hace usando una pipeta estéril de transferencia. Se colocan 2 ml aproximadamente del stock de bacteriófago gamma sobre la superficie del crecimiento vegetativo. La placa se ladea hasta permitir que el fago cubra todo el área de crecimiento. Esto se debe repetir hasta que toda la superficie del crecimiento vegetativo se cubra con el fago.

4. Se incuba la placa a 37°C toda la noche.

5. Se colocan las placas en un congelador a –20°C toda la noche.

6. El día siguiente se sacan las placas del congelador y se deja descongelar durante 2 horas.

7. Se recoge el líquido marrón rojizo y se pre-filtra a través de papel de filtro Whatman No. 3.

8. Se lleva a cabo una esterilización final por filtración con un recipiente de recogida estéril usando filtros de 0,22 µ.

9. Para confirmar la potencia del fago se hace una dilución seriada 1/1, 1/10, hasta 1/10,000 y se prueba frente a B. anthracis para susceptibilidad.

10. Guardar el fago en un refrigerador a 2-8°C. No congelar.



REFERENCIAS

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LECTURA ADICIONAL

A. LOGAN N.A. & TURNBULL P.C.B. (1998). Bacillus and recently derived genera. In: Manual of Clinical Microbiology, Seventh Edition, Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C. & Yolken R.H., eds. American Society for Microbiology, Washington DC, USA, 357–369.

B. QUINN C.P. & TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. 3, Ninth Edition, Collier L., Balows A. & Sussman M., eds. Arnold, London, UK, 799–818.



C. TURNBULL P.C.B., (ED.) (1996). Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Special Supple. No. 87, 139 pages.

D. TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Zoonoses. Biology, Clinical Practice, and Public Health Control. Palmer S.R., Soulsby E.J.L. & Simpson D.I.H., eds. Oxford University Press, Oxford, UK, 3–16.

E. WHITFORD H.W. & HUGH-JONES M.E. (1994). Anthrax. En: Handbook Series in Zoonoses, Second Edition, Beran G.W., editor-in-chief. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 61–82.

* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Carbunco (véase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consulte la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).


http://www.oie.int/

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2.2.01_carbunco