Desafos en el desarrollo de anticuerpos contra Tn y sialil-Tn Antgenos

Resumen: Los antgenos de carbohidrato Tn y sialil-Tn (STN) se expresan en la mayora de carcinomas y

generalmente est ausente en los tejidos sanos. Estos antgenos se han correlacionado con la progresin del cncer y de

mal pronstico, y se asocia con un microambiente inmunosupresor. Actualmente se utilizan en ensayos clnicos como

la vacunacin teraputica, pero con un xito limitado debido a su baja inmunogenicidad. Alternativamente, los

anticuerpos anti-Tn y / o STN pueden usarse para aprovechar el sistema inmune contra las clulas tumorales. Mientras

que el desarrollo de anticuerpos contra estos antgenos han tenido un impulso hace dos dcadas para uso diagnstico,

hasta ahora no hay tal anticuerpo en ensayos clnicos. Limitaciones posibles son la baja especificidad y eficiencia de

los anticuerpos existentes y que los nuevos anticuerpos siguen siendo necesarias. La amplia gama de metodologas

disponibles hoy permitir el desarrollo de anticuerpos rpida y nuevos formatos. Tras la llegada de la tecnologa de

hibridoma, la inmortalizacin de clulas B humanas se convirti en una metodologa para obtener anticuerpos

monoclonales humanos con una mejor especificidad. Los avances en la biologa molecular, incluyendo la tecnologa

de presentacin en fagos para la seleccin de alto rendimiento, los ratones transgnicos y ms recientemente

anticuerpos manipulados molecularmente mejorando el campo de la produccin de anticuerpos. El desarrollo de

nuevos anticuerpos contra Tn y STN aprovechando tecnologas innovadoras y tcnicas de ingeniera puede dar lugar a

anticuerpos teraputicos innovadores para el tratamiento del cncer.

1. Introduccin

La expresin desquiciada de glicanos es una caracterstica del cncer. Los glicanos tales como los antgenos de

Thomsen-Friedenreich relacionados, Tn y sialil-Tn (STN), muestran un patrn muy especfico de tumor y, en muchos

tipos de cncer, que estn asociados con la progresin de la enfermedad y la respuesta del paciente al tratamiento. Por

tanto, estos antgenos han provocado entusiasmo entre la comunidad cientfica como biomarcadores de diagnstico y

pronstico. Se han desarrollado un nmero relevante de anticuerpos y se caracteriz para ser utilizados en protocolos

de tincin inmunohistoqumica. Sin embargo, el valor aadido de la identificacin de STn o Tn como biomarcadores

ha demostrado ser insuficiente, en comparacin con los protocolos estndar, para justificar su uso habitual en la

prctica clnica. Un segundo y ms pronunciada entusiasmo surgi con el desarrollo de inmunoterapias dirigidas a

estos antgenos para aumentar la respuesta inmune, es decir, la vacunacin. Sin embargo, el entusiasmo se abstuvo

rpidamente debido a los resultados de los ensayos clnicos sin xito. Hallazgos ms recientes han ayudado a

comprender que estos antgenos tienen potencial para amortiguar la respuesta inmune que nos obligan a revisar la

eficacia de los procedimientos de inmunizacin y la bsqueda de estrategias ms eficaces para el tratamiento de

tumores que expresan estos antgenos.

Curiosamente, los anticuerpos desarrollados contra estos antgenos se han considerado principalmente como

herramientas para el diagnstico y el pronstico. La explotacin de estos anticuerpos como herramientas

inmunoteraputicos para provocar respuestas inmunes anti-tumorales ha sido completamente ignorada. Aqu

revisamos los esfuerzos integrados para el desarrollo de anticuerpos contra antgenos de alta afinidad STN y Tn y las

metodologas implicadas. Una carpeta de corte borde de metodologa se describe aqu que se puede utilizar para

acelerar la produccin de anticuerpos ms eficaces o nuevas molculas diseadas basadas en anticuerpos como

inmunoterapias innovadoras contra STn o Tn.

2. La glicosilacin en Cncer

La glicosilacin es la modificacin postraduccional ms frecuente y bien conocida de las protenas. Los glicanos estn

presentes en todos los organismos vivos y regulan una diversidad de procesos biolgicos, incluyendo el plegamiento

de protenas y el trfico intracelular, de clula-clula y las interacciones clula-matriz, diferenciaciones celulares y la

respuesta inmune. La relevancia de glicosilacin se pone de relieve por el hecho de que aproximadamente el 1% -2%

de los genes humanos son necesarios para la biosntesis de glicanos, que es catalizada por la reaccin enzimtica de

varias enzimas que transfieren mono u oligosacridos, es decir, glicosiltransferasas, con su especificidad estricta para

donante y sustratos aceptores. En los seres humanos, las protenas pueden estar glicosilados con dos tipos principales

de glicanos: N-glicanos y O-glicanos. N-glicanos estn unidos covalentemente a travs de un enlace amida a la

asparagina en la secuencia de polipptidos, y por lo general implica la secuencia Asn-X-Ser / Thr (X? Pro). O-glicanos

son a menudo unidos covalentemente al grupo hidroxilo de una serina o treonina en el polipptido a travs de N

acetilgalactosamina (GalNAc).

conseguido por los niveles de expresin y la actividad de las diferentes enzimas que intervienen en el proceso de

glicosilacin Como la biosntesis de glicano no es un proceso basado en plantillas, tal como ADN, ARN, o sntesis de

protenas, la expresin de glicano depende del equilibrio, as como por su localizacin / organizacin, por ejemplo en

el retculo endoplsmico y aparato de Golgi, y sobre la disponibilidad de molculas precursoras de monosacridos.

A mediados de la dcada de 1990 hubo un pico de inters en la glicosilacin, porque se observ una correlacin

significativa entre ciertos tipos de glicosilacin alterado y el pronstico de cncer. De hecho, la glicosilacin aberrante

se produce con frecuencia en el cncer y juega un papel fundamental en la progresin del cncer, la angiognesis y la

metstasis, el contacto clula-clula, la motilidad y la transicin epitelial-mesenquimal (EMT) en las clulas

cancerosas. Estas alteraciones de glicosilacin comprende sub o sobre-expresin de estructuras de glicano, as como la

aparicin de estructuras nuevas o truncadas. Sin embargo, a pesar de la diversidad de glicanos en la superficie celular,

slo unas pocas estructuras distintas estn asociados con la transformacin maligna y la progresin del tumor. Esto

sugiere que los patrones de glicosilacin especficos contribuyen a mecanismos precisos como ganancia de funcin, la

aptitud y la supervivencia celular.

Uno de las glicosilaciones aberrantes ms comnes en el cncer es la neo-expresin de antgenos relacionados con

Thomsen-Friedenreich. Esta familia de O-glicanos incompletos (Figura 1) incluye: El Thomsen-nouveau antgeno

(Tn) ( GalNAc- 1-O-Ser / Thr), que consta de un residuo de GalNAc alfa-O-ligado a una serina o un residuo de

treonina en la cadena de polipptido; Thomsen-Friedenreich la (T) antgeno (Gal 1-3GalNAc- 1-O-Ser / Thr) o sin

modificar core-1 estructura, donde un residuo de galactosa (Gal) es -vinculada a GalNAc; el antgeno STn, en la que el

residuo GalNAc en el antgeno Tn es unido a un cido silico (Neu5Ac) en el carbono 6; y la sialil-T (ST), en el que el

residuo Gal en el antgeno T est unido a un Neu5Ac en el carbono 3 (Figura 1). La sialilacin de ambos antgenos Tn

y T bloquea el alargamiento adicional de ncleo-1 estructuras, con la excepcin de ST (es decir, monosialyl-T) que

todava se puede convertir en estructura disialyl-T.

Histricamente, el antgeno T se identific por primera vez en 1930 por Thomsen, en colaboracin con Friedenreich,

en una muestra de sangre contaminada por bacterias. Especficamente, la accin de la neuraminidasa bacteriana libera

el cido silico que cubra la cadena de glicano, exponiendo el antgeno T en las clulas rojas de la sangre, que luego

fueron reconocidas por anticuerpos anti T presentes en el suero, haciendo que la hemaglutinacin subsiguiente. La

expresin de los antgenos Tn y STN ms tarde fueron descubiertos en 1957 por Moreau en subpoblaciones de clulas

de la sangre que caracterizan una enfermedad hematolgica rara, el sndrome Tn.

Los antgenos de la familia Thomsen-Friedenreich han sido llamados inicialmente como antgenos oncofetales ya que

generalmente son precursores en cadenas normales-O glicanos complejos. Principalmente expresado en las clulas

epiteliales, la sobreexpresin de estos antgenos se ha reportado en varios tumores humanos diferentes, por lo general

debido a defectos en los orgnulos va secretora (Retculo endoplasmtico y aparato de Golgi) y para la expresin

glicosiltransferasa alterado.

T antgeno se sobreexpresa en cncer de mama, colon, pncreas y cncer de pulmn; pero tambin puede ser detectado

hasta en el 40% de los tejidos normales y en los tejidos inflamados. Del mismo modo, la expresin se incrementa en

gran medida ST en algunos tipos de cncer en comparacin con los tejidos normales, tales como cncer de mama y

vejiga, pero tambin se expresa en el epitelio normal, muchas protenas y leucocitos de suero. En contraste, el Tn y los

Figura 1. Vas de Thomsen-Friedenreich biosntesis de antgenos. En primer lugar, se transfiere GalNAc a un residuo de

serina o treonina en un polipptido por peptidil-N-acetylgalactosaminyltransferasa (GalNAc-T). GalNAc? 1-Ser / Thr, es

decir, el antgeno Tn, se convierte entonces por T-sintasa a Gal? 1-3GalNAc? 1-Ser / Thr, es decir, el antgeno T-1 o

ncleo estructura. El antgeno Tn se puede tambin sialilada por ST6GalNAc-I formacin de Neu5Ac? 2-6GalNAc? 1-

Ser / Thr, es decir, el sialil-Tn. GalNAc? 1-Ser / Thr puede tambin ser convertido en ncleo-3 estructuras por la alfa

3GnT-6. Antgeno T se convierte en ncleo-2 estructuras por C2GnT-1, -2 y -3 o puede sialidarla por ST3Gal-I,

procedente del antgeno sialil-T. Por otra parte, sialil-T antgeno puede sialilada por ST6GalNAc-I originarios disialyl-T

antgeno.

antgenos STN muestran un patrn de cncer asociado mejor, con expresin ausente o muy limitada en tejidos adultos

sanos, y por lo tanto son ms interesantes como dianas teraputicas.

2.1. Tn antgeno

Antgeno Tn es un antgeno pan-carcinoma, expresada sobre la mayora de los carcinomas, como el de mama,

pncreas, colon, pulmn y vejiga, siendo menos comn en neoplasias hematolgicas. En los tejidos normales, la Tn

slo se expresa en el cerebro embrionario y est protegido en el tejido adulto. Tn es en realidad un precursor

biosinttico normal de O-glicanos, sin embargo no un producto terminal de lo normal, observndose ocasionalmente

en las clulas normales adultas en el aparato secretor, pero no se encuentra en las protenas en la superficie celular o

secretada.

Tn normalmente est extendido por el 1,3-galactosiltransferasa C1GalT1?, Tambin denominado T-sintasa o ncleo-1

sintasa, o por el ncleo-3? 1,3-N-acetylglucosaminetransferase (C3GnT) para formar el antgeno T (ncleo-1) o la

estructura del ncleo-3, respectivamente (Figura 1). En el cncer, la prdida de T-sintasa o enzimas C3GnT puede

conducir a la sobreexpresin del antgeno Tn. La expresin alterada de GalNAc-Ts glicosiltransferasas, y re-

localizacin del Golgi al retculo endoplsmico, tambin resulta en la sobreexpresin Tn. Adems, los defectos en

COSMC, una chaperona esencial para la actividad de C1GalT1, debido a silenciamiento epigentico o mutaciones

tambin pueden conducir a aumentar la expresin del antgeno Tn en el cncer.

La sobreexpresin de antgenos Tn promueve la proliferacin de clulas cancerosas y la invasividad. De hecho, en el

cncer de mama, la acumulacin de Tn-cojinete protenas de lamellipodia en la superficie celular promueve la

adhesin celular, la motilidad celular y la invasin. Sorprendentemente, tambin se detecta el antgeno Tn en las

primeras etapas del desarrollo del tumor y puede servir como un biomarcador, ya que su expresin se asocia con

tumores invasivos y altamente proliferativas, y metstasis.

2.2. Sialyl-Tn antgeno

Sialyl-Tn es tambin un antgeno carcinoma de pan que se expresa temprano en la tumorignesis. En contraste con Tn,

STn no es un precursor biosinttico de lo normal, lo que significa que su expresin es necesariamente patolgica.

Como nota aparte, en algunos tejidos normales, tales como colon, el residuo de cido silico de STn puede ser O-

acetilados, enmascarando as la STn y por lo tanto su reconocimiento por los anticuerpos anti-STN. No hay otros

azcares que sean conocidos por ser aadido al antgeno STn. STn es a menudo co-expresada con Tn, y por lo tanto

los mecanismos que dan lugar a la sobreexpresin de Tn aplican probablemente a STN.. Mecanismos especficos para

sobreexpresin de STn, incluyen ST6GalNAc-I upregulation, o re-localizacin del retculo de Golgi al endoplsmico y

tambin la prdida de grupos O-acetilo STN, se han demostrado en algunos tipos de cncer. Especficamente, que la

expresin STn modulan un fenotipo maligno al inducir un comportamiento ms agresivo de clulas en clulas de

carcinoma gstrico y de mama, como la disminucin de la agregacin de clula-clula y aumento de la adhesin de la

matriz extracelular, la migracin y la invasin.

2.3. Papel Patolgica de Tn y STN en Cncer

Ambos antgenos Tn y STN se han correlacionado con la progresin del cncer y pobre supervivencia. Alta expresin

de Tn y STN en el carcinoma de ovario humano se asoci con enfermedad en estadio, el grado histolgico y el bajo

tiempo de supervivencia global. Adems, Tn se ha mostrado como un buen biomarcador de carcinoma invasivo de

cuello uterino. Por otra parte, la expresin STn se asoci con la invasividad del cncer de hgado y con una menor tasa

de supervivencia en los carcinomas gstricos avanzados. En el cncer de mama, la expresin STn se asoci con

metstasis en los ganglios linfticos y alto grado histolgico, as como con la resistencia a la quimioterapia adyuvante.

Antgeno STn tambin estaba relacionado con un alto grado de tumores, las tasas de proliferacin elevadas y un alto

riesgo de recurrencia y progresin en los tumores de vejiga.

La combinacin de ambas caractersticas: Una especificidad aceptable al tumor y casi ausencia de expresin de Tn y

STN en clulas normales; junto con su asociacin con el pronstico del tumor y una mayor malignidad, incluyendo

metastizacin, antgenos Tn y STN se volvieron como excelentes objetivos para ser utilizados en teraputica.

3. Respuesta Inmune e inmunoterapias contra Carbohidratos

La respuesta inmune es la clave no slo para provocar la proteccin contra los agentes patgenos, sino tambin para

mantener la vigilancia inmune contra el desarrollo de clulas malignas. Desde esta perspectiva, el desarrollo del cncer

puede ser visto como un fracaso de Surveillanc inmune. La mayora de los hidratos de carbono asociados a tumores no

provocan fuertes respuestas humorales y, de hecho, las evidencias han demostrado que su expresin aberrante es uno

de los mecanismos desarrollados por las clulas cancerosas para evitar respuestas inmunes eficaces contra el cncer.

Los mecanismos para proporcionar proteccin antitumoral pueden clasificarse en la respuesta inmune celular y

humoral. Si bien la respuesta inmune celular involucra principalmente linfocitos citotxicos tales como las clulas T

citotxicas que pueden eliminar potencialmente las clulas tumorales; la respuesta humoral implica clulas B y la

produccin de anticuerpos contra los antgenos tumorales especficos, que en ltima instancia conducen a la

citotoxicidad dependiente de anticuerpos, como se mencionar en ms detalle a continuacin. Ambos brazos de la

respuesta inmune implican la activacin de una variedad de otras clulas inmunes, que convergen en ltima instancia,

para ambas respuestas. Para el desencadenamiento de respuestas inmunes celulares, clulas presentadoras de antgenos

como las clulas dendrticas (DCs), macrfagos y clulas B, la captacin de antgenos y luego presente a travs del

complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) una pequea porcin de pptidos antgenos (eptopos) para activar

tanto la especificidad citotxica CD8 + Clulas T y las clulas CD4 + T helper (Th). Los receptores tanto de las clulas

citotxicos y Th, es decir, los receptores de clulas T (TCR), estn restringidos a reconocer pptidos, presentado en el

contexto de MHC de clase I o clase II, respectivamente, por la clulas presentadoras de antgeno. Por consiguiente, la

respuesta inmune celular se formatea principalmente para luchar contra antgenos peptdicos y esto puede imponer una

limitacin a desarrollar fuertes respuestas inmunes contra hidratos de carbono. Si bien se ha informado de que las

clulas T citotxicas pueden reconocer mono- y disacridos unido a pptidos con Ser o Thr, investigaciones

adicionales son necesarios para comprender mejor la relevancia de tal reconocimiento en el contexto de las respuestas

inmunitarias antitumorales.

La respuesta inmune humoral contra hidratos de carbono juega un papel clave en las respuestas antitumorales. En

contraste con TCR, los receptores de las clulas B (BCR) pueden reconocer antgenos de hidratos de carbono

directamente sin necesidad de presentacin a travs de MHC. La reticulacin del antgeno en BCR activa las clulas B,

que inician la secrecin de anticuerpos IgM. IgM es el primer isotipo de inmunoglobulina para ser secretada por las

clulas B del plasma (clulas efectoras B), caracterizado por una estructura pentamrica con afinidad relativamente

baja a los antgenos y un corto perodo de tiempo, en comparacin con los otros isotipos. Este proceso se llama

activacin de las clulas B de clulas T independiente (Figura 2 Panel superior), y es capaz de proporcionar inmunidad

sin embargo, con duracin limitada.

A los efectos anti-tumor de larga inmunidad humoral, la produccin de otros anticuerpos isotipos IgG tales como es

deseable. Fisiolgicamente, esto por lo general implica la participacin de las clulas Th, en un proceso llamado

activacin de clulas B dependiente de clulas T (Figura 2 inferior del panel). Las clulas Th especficas para pptidos

particulares se activan inicialmente por clulas presentadoras de antgeno. Luego, las clulas B especficas de hidratos

de carbono reciben seales estimuladoras (citoquinas) de clulas Th, que permiten la conmutacin de los subtipos de

anticuerpos de IgM a IgG de alta afinidad y la diferenciacin de clulas plasmticas en las clulas B de memoria. Estos

anticuerpos IgG de alta afinidad pueden unirse a las clulas cancerosas diana, marcndolas para su destruccin ya sea

por el complemento (citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)) o natural killer (NK) clulas (citotoxicidad

mediada por clulas dependiente de anticuerpos (ADCC)) .

El conocimiento de estos mecanismos fisiolgicos, en los ltimos aos, ha levantado los esfuerzos para provocar el

aumento de la inmunogenicidad de los antgenos de hidratos de carbono, con el objetivo de generar inmunoterapias

potentes, tales como vacunacin. Los enfoques para mejorar la inmunogenicidad de hidratos de carbono incluyen el

acoplamiento covalente de hidratos de carbono a los portadores de protena inmunolgicamente activas, tales como

hemocianina de lapa californiana (KLH) o adyuvantes o a los transportistas fisiolgicas / patolgica, tales como

mucina protena1 (MUC1), para garantizar una gama de relevantes eptopos. Curiosamente, varios estudios han

demostrado que la conjugacin de pptidos de MUC1 glicosilados con un pptido eptopo de clulas T helper, un

receptor 2 agonista Toll-like, toxoide del ttanos, o una combinacin de estos portadores de protenas activas induce

una respuesta inmune antignica y celular potente que puede matar a las clulas tumorales y reducir la carga tumoral.

Figura 2. Representacin simplificada de reconocimiento del antgeno tumoral y la induccin de respuestas inmunes

humorales. Antgenos del panel-Glycan superiores pueden ser directamente reconocidos por las clulas B y el

entrecruzamiento de los receptores de las clulas B conducir a la secrecin de IgM a travs de T activacin de las clulas B de

clulas independientes. En la parte baja del panel, antgenos del tumor puede ser endocitosis por las clulas presentadoras de

antgenos, como las clulas dendrticas, o clulas B y luego ser presentados a los ayudante de clulas T clulas (Th) lo que

conduce a la activacin de clulas T y la posterior activacin de clulas B dependiente de clulas T.

Respuesta Inmune y TN / STN Antgenos

Hay un nmero importante de informes que describen la respuesta inmune contra los antgenos Tn o STN. Por

ejemplo, autoanticuerpos contra STn y Tn mucina se identificaron 1 glicopptidos en mama y pacientes con cncer

colorrectal. Estos autoanticuerpos se encuentran en los niveles ms altos en los pacientes con cncer de mama en fase

inicial y se asocian con una reduccin de tasa de metstasis [54], lo que sugiere un papel en la induccin de la

respuesta inmune antitumoral. Significativamente, estos anticuerpos reaccionan con el hidrato de carbono solamente

cuando se lleva en la protena MUC1, enfatizando el papel de la cadena principal del pptido en respuesta anti-

carbohidrato. Un estudio posterior con una cohorte de pacientes ms alta mostr que los autoanticuerpos frente a

pptidos de MUC1 o glicopptidos no podan utilizarse para el cribado de cncer.

Los estudios preclnicos y clnicos tambin han demostrado que la inmunizacin con vacunas que contienen STn o Tn

generalmente induce anticuerpos especficos de antgenos. La elicitacin de tales respuestas inmunes despus de la

vacunacin podra explicar el retraso observado en el crecimiento tumoral en ratones y el tiempo hasta la progresin

incrementado en los pacientes. Curiosamente, los pacientes que recibieron la vacuna Theratope, que consista en STn

anclado a la KLH, desarrollaron anticuerpos-STN anti, cuya abundancia se correlacion directamente con la

supervivencia libre de enfermedad [60]. Sin embargo, las respuestas inmunolgicas observadas contra antgenos STN

y Tn, parecen ser lo suficientemente robusta como para inducir respuestas inmunes protectoras. De hecho, a pesar del

hecho de que y ensayos STN / o vacunas contra el cncer basados en Tn ya han entrado clnicos (NCT00030823),

incluyendo el caso de Theratope que alcanz la fase III (NCT00046371) [58], ninguna vacuna ha sido aprobado para

uso clnico an. La mayora de vacunas probadas no inducir robusta T inmunidad mediada por clulas y no traer

ningn beneficio de supervivencia para los pacientes. Se aconseja una mejor comprensin de la respuesta inmune

contra estos antgenos para provocar un aumento de la inmunogenicidad para mejorar la potencia de los enfoques

inmunoteraputicos. En los ltimos aos, una mejor comprensin del papel inmunomodulacin de los antgenos Tn y

STN ha dilucidado su contribucin a la tolerancia inmune, lo que explica en parte el fracaso con los protocolos de

vacunacin. Por ejemplo, el antgeno Tn expresa en la mucina 6 protenas (MUC6) abroga respuestas de clulas Th1 y

promueve la interleucina 17 (IL-17) de respuesta, lo que podra favorecer escape inmune de las clulas tumorales.

Por otra parte, Tn es reconocido por la galactosa-lectina de tipo C tolerognico-lectina de macrfagos (MGL),

expresada por DCs y macrfagos, lo que dota a estas clulas para suprimir la inmunidad de clulas T, desempeando

as un papel en la progresin tumoral. La sobreexpresin de STn se asocia con una baja infiltracin de nido CD8 + en

el cncer de endometrio [63]. Adems, STn presente en secretadas mucinas de cncer de colon se puede interactuar

con CD22 y abajo-modular la seal de la clula B transduccin. Por otra parte, siglec-15 reconoce el antgeno STn

expresado por las clulas cancerosas y transduce una seal para una mayor factor de crecimiento transformante beta

(TGF?) Secrecin en los macrfagos asociados al tumor, lo que puede contribuir a la progresin del tumor por el TGF

modulacin mediada por -? - microambiente intratumoral. Ms recientemente, nuestro grupo demostr que STN-que

expresan las clulas cancerosas deterioran maduracin de DCs, dotando una funcin tolerognico y por lo tanto

limitando su capacidad para desencadenar anti-tumorales respuestas protectoras de clulas T. Tambin hemos

observado que el bloqueo de antgenos STN expresadas por las clulas cancerosas era capaz de reducir la induccin de

tolerancia in vitro y DCS ser ms maduro. Estos hallazgos sugieren que las terapias dirigidas basados en anticuerpos

pueden proporcionar medios eficientes para mejorar las respuestas inmunes contra las clulas tumorales STN.

4. Anticuerpos

Durante los ltimos 20 aos, el tratamiento a base de anticuerpos monoclonales ha sido una de las estrategias

teraputicas ms exitosas en diferentes campos, incluyendo el cncer. Debido a sus caractersticas nicas, tales como

una alta especificidad y el compromiso con el sistema inmunolgico, el impacto anticuerpos 'ha sido reconocido en

muchas reas teraputicas. El desarrollo incesante y optimizacin de los mtodos involucrados en anticuerpos

ingeniera, produccin y purificacin, as como el aumento del conocimiento de la interaccin entre los anticuerpos,

clulas de cncer y el sistema inmunolgico han contribuido al desarrollo de anticuerpos de prxima generacin

innovadores que son ms eficaces, ms seguros y con aplicaciones ms amplias. Hoy en da, el mercado de los

anticuerpos teraputicos ha estado creciendo de manera significativa dentro de la industria de la salud para que 40 aos

despus de la generacin del primer anticuerpo monoclonal (mAb), alrededor de 47 productos de anticuerpos

monoclonales recombinantes se han aprobado en los Estados Unidos o en Europa para el tratamiento de una amplia

variedad de enfermedades, que van desde el cncer a enfermedades infecciosas y cardiovasculares a las enfermedades

autoinmunes.

4.1. Estructura y funcin de los anticuerpos

Los anticuerpos son molculas de glicoprotena con una notable capacidad de reconocer y unirse a los antgenos con

alta afinidad y especificidad, por lo tanto promover an ms su inactivacin o eliminacin. Tpicamente, los

anticuerpos (o inmunoglobulinas (Igs)) se componen de dos fragmentos de unin a antgeno (Fab) unidos a travs de

una regin flexible (regin bisagra) a una regin constante (Fc) (Figura 3). Especificidad de antgeno es conferida por

el sitio de unin al antgeno del anticuerpo, que est formada por las regiones determinantes de complementariedad

hipervariables (CDR) en las regiones variables de cada cadena pesada y ligera, presente en las porciones Fab. Por otro

lado, la regin Fc es responsable de las funciones efectoras inmunes de los anticuerpos, promoviendo la unin a

diversas molculas efectoras y clulas del sistema inmune.

Mecanismo de accin Anticuerpos 'implica ADCC, CDC, o bloqueo de la accin de molculas especficas.

Adicionalmente, los anticuerpos tambin pueden funcionar como molculas de sealizacin. Especficamente, ADCC

es un mecanismo efector en la que los anticuerpos clulas NK directos para destruir las clulas que expresan el

antgeno. Este mecanismo se basa en el acoplamiento de receptores de Fc expresados por las clulas NK que conducen

a su activacin y la exocitosis de los grnulos citoltica complejo perforina / granzima, lo que resulta en la destruccin

de clulas diana mediante apoptosis. CDC, tambin conocida como la va clsica del sistema del complemento, es una

cascada citoltica mediada por una serie de protenas del complemento (C1-C9) que son abundantemente presente en el

suero.

Se inicia con la unin de la molcula del complemento, C1q, el dominio Fc del anticuerpo (IgG o IgM) unida en la

superficie de la clula diana. Esto desencadena la cascada del complemento posterior que conduce a la lisis de las

clulas diana. Los anticuerpos tambin pueden presentar

una actividad de bloqueo, que impide que los factores de

crecimiento, citocinas y otros mediadores solubles

lleguen a sus receptores diana. Por ltimo, los anticuerpos

pueden inducir la reticulacin de los receptores que estn

conectados a los mediadores de la apoptosis de las

clulas, tales como caspasas, que conduce a la muerte

celular [79]. Los anticuerpos que retienen estas funciones

representan una estrategia teraputica importante en

muchos campos diferentes.

Figura 3. Representacin esquemtica de

una estructura de G (IgG) mAb

inmunoglobulina. La molcula de IgG est

compuesta por constantes (C) y variables

(V) dominios para cada luz (L) o (H) de la

cadena pesada. La cadena pesada

comprende tres dominios constantes (CH) y

uno variable (VH), y la cadena ligera

contiene un constante (CL) y uno variable

(VL) de dominio. Esta molcula se puede

4.2. Los anticuerpos teraputicos en cncer

Anticuerpos teraputicos son ahora una de las estrategias ms exitosas e importantes para el tratamiento de pacientes

con cncer. En sus primeros aos, los anticuerpos teraputicos fueron derivados de murino o basados en una secuencia

de aminocidos de anticuerpos de ratn, lo que llev a los posibles problemas relativos a la generacin de anticuerpos

humanos anti-ratn resulta en inmunogenicidad o alrgica-como reacciones. El uso de anticuerpos murinos tambin

tiene el problema de la baja funcin efectora de Fc desde regin Fc murino no estn correctamente reconocida por

receptores Fc humanos. Esto resulta en una baja eficiencia en el reclutamiento del sistema inmunolgico humano,

incluyendo ADCC y CDC, lo que impide el uso eficaz de los anticuerpos murinos en la terapia. En alternativa, la

prxima generacin de anticuerpos teraputicos implicados fusin por ingeniera gentica de variable de ratn con

dominios constantes humanos, lo que result en un perfil de seguridad ms favorable y la vida media, mientras que

conserva la especificidad de los anticuerpos murinos.

Anticuerpos teraputicos pueden funcionar a travs de la mediacin de alteraciones en las funciones de los receptores

de antgeno o, la modulacin del sistema inmune o la entrega de un medicamento especfico que se conjuga a un

anticuerpo que se dirige a un antgeno especfico. Hoy en da, existen tcnicas moleculares que pueden alterar la

funcin efectora de anticuerpos, el tamao y la inmunogenicidad de contribuir al desarrollo de terapias nuevas y ms

eficaces basados en anticuerpos.

Anticuerpos teraputicos pueden matar a las clulas tumorales mediante varios mecanismos, por la accin directa del

anticuerpo, que incluye: El bloqueo de receptores o actividad agonista; la induccin de la apoptosis o la entrega de un

agente de drogas o

citotxico; o clula inmune

mediada por mecanismos

de matar, que implica CDC,

ADCC, y la induccin de la

fagocitosis (Figura 4).

Adems, la activacin de

clulas T se puede mejorar

mediante la orientacin

mediada por anticuerpos y

an ms la presentacin

cruzada de antgenos a los

DC, las clulas T dirigidas

al tumor se mejora por el

bloqueo mediado por

anticuerpos de T puntos de

control inhibidora de las clulas (por ejemplo, CTLA4 y PD1) son tambin entre las estrategias para la eliminacin de

clulas tumorales. Todos estos enfoques se han aplicado con xito en la clnica.

En particular, el antgeno diana de anticuerpos teraputicos debe expresarse en la superficie de las clulas cancerosas y

ser abundante y accesible a los anticuerpos. Dependiendo de los mecanismos de accin deseado, los anticuerpos

teraputicos podran ser internalizados rpidamente, en caso de entrega de toxinas en las clulas cancerosas y

regulacin a la baja de los receptores de la superficie celular. Por otro lado, en ADCC y CDC estas deberan

permanecer en la superficie de la clula ya que la regin Fc debe estar disponible para las clulas inmunes y protenas

del complemento.

5. Teraputico anticuerpos contra Tn y STN Antgenos

Debido a la asociacin de los antgenos Tn y STN con varios tipos de cnceres, as como a la progresin tumoral y la

metstasis, se han hecho esfuerzos para desarrollar anticuerpos contra estas estructuras glicosiladas. Adems, el hecho

de que los pacientes con cncer son capaces de producir autoanticuerpos, impuls su uso como biomarcadores para la

deteccin precoz del cncer [86] o la respuesta a la terapia. Curiosamente, los anticuerpos que se encuentran en

pacientes con cncer no han demostrado ser eficaz en la activacin del sistema inmune y la eliminacin de las clulas

malignas. Por lo tanto, es esencial para producir anticuerpos ms eficaces que matan especficamente a las clulas

cancerosas.

Hasta ahora, la mayora de los anticuerpos existentes se obtuvieron mediante tecnologa de hibridoma. Desde el

desarrollo de la primera mAb especfico anti-STn en 1981, llamado B72.3, se han producido ms anticuerpos contra el

antgeno STn. Durante esta bsqueda, se utilizaron diferentes inmungenos y tcnicas y stas llevan a la formacin de

anticuerpos que presentan diferentes afinidades y especificidades hacia el antgeno STn. El mAb B72.3 fue generado

despus de la inmunizacin de ratones con fraccin de membrana enriquecida de clulas de carcinoma de mama

humano y se encontr que reaccionar con TAG-72, una glicoprotena con caractersticas de tipo mucina, y con mucina

submaxilar ovina (OSM), que es rica en eptopos STN. El CC49 anticuerpo de segunda generacin se gener despus

de la inmunizacin de ratones con afinidad B72.3 purificados TAG-72 molculas [89]. Otros estudios se han

desarrollado utilizando este anticuerpo humanizado y su formato, que se encuentra actualmente en un ensayo clnico

para su uso en ciruga radioimmunoguided. Sin embargo, la especificidad fina de estos mAbs no est clara y, adems

de obligar a STN, CC49 tambin reconoce otros glicanos. TKH2 y HB-STN1 son otros dos mAbs anti-STN que se

generaron mediante la inmunizacin de ratones con OSM [88]. Ogata y sus colegas informaron que B72.3 fuertemente

se une glicoprotenas que llevan STN-trmeros, pero mal interacta con glicoprotenas monomrica-STN. Esto plantea

la cuestin de configuraciones STN para el reconocimiento de anticuerpos. Ms tarde, se inform el anticuerpo

MLS102 generada por la inmunizacin de ratones con LS 180 clulas de cncer de colon que es especfica para STn

agrupado. Ms recientemente, la novela anti-STn LLU9B4 anticuerpos y 3P9 se han producido. El primero se gener

por inmunizacin de ratones con glicoprotenas STN extrados de colon humano lnea celular de adenocarcinoma

LS174T y 3P9 se obtuvo usando clulas SW1116 adenocarcinoma colorrectal humano para inmunizar ratones. Este

ltimo anticuerpo mencionado es particularmente interesante ya que es un mAb IgM que mostr un efecto inhibidor

significativo sobre la proliferacin y la migracin de clulas que expresan STN y el crecimiento tumoral mediante la

induccin de apoptosis. Estos resultados sugieren que 3P9 mAb tiene aplicaciones potenciales, no slo en el

diagnstico y formacin de imgenes, como se inform para la mayora de los anticuerpos mencionados anteriores,

sino tambin para la terapia tumoral basada en anticuerpos.

Varios mAbs con diferentes especificidades hacia el antgeno Tn tambin se han generado utilizando diferentes

inmungenos. Algunos de estos anticuerpos son CU-1, MLS 128, BRIC 66 (IgM) y BRIC 111 (IgG1), PMH1, y ms

recientemente el mAb KM3413 [99], 2154F12A4 y GOD3-2C4. Los anticuerpos monoclonales, tales como MLS128,

KM3413 y GOD3-2C4 han demostrado tener un potencial teraputico debido a su capacidad para inhibir el

crecimiento de ciertas lneas celulares de cncer, y en particular limitar el crecimiento de una xenoinjertos de un

carcinoma de pulmn humano, en el caso del mAb GOD3-2C4.

Si bien la mayora de estos anticuerpos son prometedores, su especificidad es an discutible y el efecto teraputico

potencial en las clulas cancerosas y tejidos del paciente debe ser evaluado a fondo antes de su uso como agentes

teraputicos. Una tcnica ampliamente utilizada para caracterizar la especificidad de un anticuerpo es el ensayo de

inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA) y muchas variaciones de esta metodologa en contra de glicoconjugados

que se inmoviliza en placas de revestimiento de plstico o, alternativamente, con los anticuerpos. Sin embargo, en la

mayora de los casos, los antgenos de glicanos pueden no estar disponibles y la interpretacin es difcil. Por lo tanto,

todava existe la necesidad de desarrollar ensayos que caracterizan plenamente esta especificidad de los anticuerpos

anti-carbohidrato. Los recientes esfuerzos a este respecto se han logrado con el desarrollo de las tecnologas de

microarrays de glicano, que permiten el estudio de las interacciones entre anticuerpos con hidratos de carbono de una

manera de alto rendimiento. Adicionalmente, los anticuerpos son anticuerpos reactivos existentes de hidratos de

carbono, lo que significa que reaccionan con cualquier glicoprotena que lleva los glicano. Slo unos pocos fueron

capaces de reconocer eptopos glicanos / pptidos aunque con baja afinidad. Los anticuerpos para STn prometedora o

eptopos glicopeptdicos Tn expresada por glicoprotenas de la superficie celular mejoraran especificidad y evitar la

unin a glicoprotenas extracelulares irrelevantes, como mucinas, que pueden engaar a la unin efectiva de

anticuerpos a la superficie celular.

5.1. Produccin de Anticuerpos

El impulso para la aplicacin teraputica de anticuerpos afines a los avances y la innovacin en la biologa molecular a

travs de los aos permitidos para el desarrollo de varios mtodos para la produccin de mAb. Estas tecnologas

apoyaron la generacin de anticuerpos contra virtualmente cualquier molcula diana en clulas humanas que permitan

su empleo en particular en la teraputica del cncer. Inicialmente, la produccin de mAbs fue exclusivamente a cabo

utilizando la tecnologa de hibridomas y la inmortalizacin de clulas B usando el virus de Epstein-Barr (EBV). Unos

aos ms tarde, el desarrollo de mtodos alternativos como la inmunizacin de ratones transgnicos que expresan

pantalla loci y fago Ig humana permiti seguir avanzando con la produccin de anticuerpos totalmente humanos.

5.1.1. Hibridoma Tecnologa

Tecnologa de hibridoma ha sido durante mucho tiempo una herramienta extraordinaria e imprescindible para la

generacin de anticuerpos monoclonales de alta calidad. Se permite el aislamiento y la produccin de mAb con alta

afinidad y especificidad contra antgenos solubles o unidas a la membrana utilizando el sistema inmunolgico de un

animal. Esta tecnologa fue desarrollada en 1975 por Kohler y Milstein, quien recibi el Premio Nobel por este logro,

en el que la produccin de anticuerpos por las clulas B del bazo obtenidas de ratones inmunizados fue inmortalizado

por fusin con clulas de mieloma cancerosas (Figura 5). El paso inicial en la produccin de mAbs mediante

tecnologa de hibridoma es la estimulacin del sistema inmune de un husped adecuado, normalmente un ratn, con el

antgeno deseado. Por lo general, el antgeno se mezcla con un adyuvante para potenciar la respuesta inmunitaria y, en

consecuencia aumentar la produccin de anticuerpos. Despus de la inmunizacin, las clulas B secretoras de

anticuerpos se aslan del bazo de ratn y se fusionan, mediante el uso de polietilenglicol (PEG) con un no secretor

lnea celular de mieloma inmortalizadas inmunoglobulina que carece de la hipoxantina-guanina

fosforribosiltransferasa-gen (HGPRT). Estas clulas se cultivan a continuacin en hipoxantina-aminopterina-timidina

(HAT) medio de seleccin en el que slo las clulas de hibridoma son capaces de sobrevivir y proliferar ya que han

heredado la inmortalidad de las clulas de mieloma y resistencia selectiva de las clulas B para sobrevivir en medio

con aminopterina. Por lo general, la proyeccin de las clulas productoras de anticuerpos deseados se realiza usando

tcnicas tales como ELISA, Western blot y citometra de flujo para analizar la reactividad de su sobrenadante de

cultivo. Clulas de hibridoma positivas se cultivan y se clonaron de manera an ms altas cantidades de mAbs por lo

tanto pueden ser producidos in vitro. Varias mejoras tcnicas han llevado a cabo para resolver el problemtico de esta

tcnica, a saber, la inmortalizacin de clulas de ratones B y el desarrollo de las diferentes clulas asociadas para la

fusin; uso de capas de alimentacin para aumentar la supervivencia de hibridomas y la estabilidad en la cultura y el

uso de diferentes mtodos para la fusin celular, a saber electrofusin.

El primer anticuerpo que se apruebe para el mercado, muromonab-CD3, era un anticuerpo murino sin modificar

desarrollado utilizando la tecnologa de hibridomas. Sin embargo, mAbs murinos provocan reactividad inmune cuando

se aplica a los seres humanos y tambin tienen baja funcin efectora Fc debido al reconocimiento ineficaz de su regin

Fc por los receptores Fc humanos, lo que limita sus aplicaciones en teraputica. En consecuencia, el uso y la

produccin de mAbs humanos fue impulsado de una manera que mtodos alternativos se han estudiado y desarrollado,

como la inmunizacin de ratones transgnicos que expresan loci de Ig humana, bibliotecas de presentacin de fagos, y

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Figura 5. Representacin esquemtica de la tecnologa de hibridoma. Esta tecnologa implica la etapa inicial de

inmunizacin de ratones con el antgeno deseado, seguido por la recuperacin de las clulas B del bazo de los ratones

y la consiguiente fusin con clulas de mieloma. Despus de eso, se seleccionan clulas de hibridoma en medio HAT

y los clones son seleccionados de acuerdo con la reactividad de sus sobrenadantes contra el antgeno. Por ltimo, los

5.1.2. B inmortalizacin celular

Poco despus de la introduccin de la tecnologa de hibridoma, un enfoque alternativo para obtener productoras de

anticuerpos lneas de clulas B humanas estables fue creado en el cual las clulas especficas de antgeno plasma B se

inmortalizan usando el virus de Epstein-Barr (EBV). Este virus pertenece a la familia de los herpes y tiene la

capacidad para inmortalizar de manera eficiente in vitro casi todas las clulas B humanas. Debido a la baja frecuencia

de clulas B especficas de antgeno entre los linfocitos de sangre perifrica de los donantes, las clulas que expresan

el anticuerpo deseado sobre su superficie deben ser seleccionados. Despus de la seleccin, las clulas B especficas de

destino estn infectadas con este virus.

Las clulas B se transforman en clulas diploides inmortalizadas que por lo general no liberan las partculas del virus y

preservan las caractersticas de las clulas B infectadas inicialmente, lo que significa que son capaces de producir de

forma continua y secretar los anticuerpos deseables. Los anticuerpos producidos por este mtodo representan el

repertorio de anticuerpos de los linfocitos del donante, as como, cuando se utilizan clulas de un paciente B, ofrece la

posibilidad de obtener anticuerpos con especificidad nica contra neoantgenos. Sin embargo, las clulas

transformadas con EBV no pueden crecer indeterminadamente ya que no tienen el fenotipo de las clulas malignas.

Adems, estas clulas son difciles de clonar y usualmente producen slo rendimientos bajos de inmunoglobulinas. De

esta manera, las mejoras a este mtodo han llevado a cabo, es decir, la fusin de la EBV-inmortalizado clulas

secretoras de anticuerpos con parejas de fusin heterohibridoma apropiadas, que promovi una mayor estabilidad y

una mayor cantidad de anticuerpos secretados. Esta tcnica se ha aplicado con xito para generar anticuerpos contra

varios antgenos, como las protenas y los hidratos de carbono, pero nunca contra STn y Tn.

5.1.3. Phage Display Technology

La principal lucha en los mtodos tradicionales es el desarrollo de mAbs totalmente humanos para aplicar en la

teraputica y, en consecuencia, varios esfuerzos han esforzado para superar este problema. El debut de la tecnologa

del ADN recombinante, junto con los avances de las tecnologas in vitro proporciona varias formas nuevas y

poderosas que conducen al desarrollo de la tecnologa de presentacin de fagos para crear anticuerpos teraputicos.

Esta tecnologa romper el suelo se introdujo en 1985 por Smith centra en la seleccin de un fenotipo particular (por

ejemplo, un ligando especfico para un antgeno diana) a partir de repertorios de molculas que aparecen en fagos. En

1990, McCafferty y colegas demostraron que la visualizacin de fragmentos de anticuerpos en fagos era concebible a

travs del uso de vectores para introducir ADN en genomas de fagos de anticuerpos, combinando as genotipo y

fenotipo en una partcula de fago. El concepto detrs de esta tecnologa de pantalla es que se crea una gran biblioteca

de anticuerpos potencialmente interesantes, a partir del cual los fragmentos de anticuerpos con especificidad y afinidad

deseables se pueden seleccionar contra un antgeno especfico. El uso de bibliotecas de fagos que llevan genes de Ig-

anticuerpo bibliotecas de presentacin en humanos fue una de las aplicaciones ms exitosas de este enfoque.

Para la construccin de una biblioteca de anticuerpos, el repertorio de genes V que codifican los anticuerpos de las

clulas B se amplifica mediante PCR usando un conjunto de cebadores especficos que cubren todas las familias de

genes V. Posteriormente, los fragmentos de anticuerpos se generan por combinacin aleatoria de VL y VH genes de la

cadena. Basado en el origen de genes de anticuerpos, las bibliotecas se pueden clasificar en natural o sinttico.

Adems, las bibliotecas repertorio de origen natural pueden ser ingenuo o inmunolgico. Bibliotecas Naive se derivan

de donantes no inmunizados de clulas B, y las bibliotecas inmunes se derivan de diferentes tipos de animales

inmunizados, pacientes humanos con una determinada enfermedad o previamente expuesta. Adems, varios formatos

de fragmentos de anticuerpos, ms comnmente Fab y scFv se pueden clonar y se muestran en bibliotecas de fagos.

Una vez creado el repertorio de fragmentos de anticuerpos, esta mezcla heterognea de clones de fago se criban

mediante un proceso de seleccin por afinidad denominado panning, durante el cual las poblaciones de fagos se

presentan a los objetivos especficos con el fin de seleccionar fagos de unin a diana especfica (Figura 6).

El antgeno de inters se inmoviliza sobre un soporte slido y la biblioteca de fagos de anticuerpos se aplica a

promover la unin de los fagos especficos contra el antgeno seleccionado. Extensas lavados se realizan para eliminar

los fagos no unidos que no presentan especificidad contra el antgeno diana. Fagos positivos de unin se eluyen y se

amplifican a travs de la infeccin bacteriana y se cultivaron para producir fago de alto ttulo y utilizar en posteriores

rondas de seleccin. Por lo general, se llevan a cabo varias rondas de cribado (2 a 5 rondas) con el fin de enriquecer

progresivamente la piscina fago con fagos de unin especficos. Los anticuerpos especficos para el antgeno deseado

se identifican generalmente por ELISA mediante el cribado de un conjunto de clones al azar que fueron elegidos para

ser analizados.

Una vez que se aslan los fragmentos de anticuerpo de inters, debido a la relacin establecida en la presentacin en

fagos entre genotipo y fenotipo, la secuencia que codifica estas molculas puede ser determinado y se utiliza para

producir los anticuerpos deseados, as como para refinar las propiedades de los anticuerpos aislados 'con prontitud.

Actualmente, hay tres anticuerpos en el mercado creadas usando la tecnologa de presentacin en fagos Humira,

Benlysta, y ABthrax. En particular, la investigacin que utiliza esta tecnologa ha facilitado el progreso en la

produccin de anticuerpos contra los antgenos desafiantes, a saber, los hidratos de carbono asociados a tumores. En

particular, esta estrategia puede ser una alternativa a la tecnologa de hibridomas convencional, especialmente cuando

el objetivo de obtener anticuerpos contra los antgenos conformacionales simples y pequeas, con baja

inmunogenicidad. Kubota y sus colegas han utilizado con xito el anticuerpo tecnologa de presentacin de fagos para

identificar un anticuerpo scFv anti-Tn. Este ha sido formateado en una IgG humana con promesa para la terapia, ya

que se ha demostrado que se unen especficamente a las clulas tumorales Tn-positivas y para inducir la actividad

citotxica significativa en los experimentos de ADCC. Por otra parte, en comparacin con los de tipo salvaje

molculas de IgG, el formato scFv-Fc tiene beneficios potenciales para el desarrollo teraputico y uso. Estos tipos de

anticuerpos tienen peso molecular pequeo y por lo tanto se cree que tienen mejor penetracin en el tejido. Adems,

puesto que se componen de una nica cadena polipeptdica, no se requiere la asociacin heteromrica disulfuro y, por

consiguiente, la expresin de scFv funcional-FCS ha informado usando levadura.

5.1.4. Ratones Transgnicos

Entre las diversas tcnicas desarrolladas para producir mAbs humanos, recientemente una tecnologa centrado sus

esfuerzos en la generacin de mAbs inmunognicas bajos utilizando ratones transgnicos que expresan repertorios de

secuencias de genes de anticuerpos humanos. La produccin de mAbs humanos utilizando la tecnologa de hibridoma

y ratones genticamente modificados que expresan humanos repertorios de anticuerpos se inform por primera vez en

1994. Los ratones modificados fueron generados a travs de la interrupcin de la cadena de Ig endgena de ratn-Ig

pesada y? Loci de cadena -light para evitar la expresin del ratn pesado o cadenas ligeras. Al mismo tiempo, con el

fin de reemplazar las cadenas de ratn, los transgenes que codifican la cadena de Ig-pesada humana y la cadena -light

Ig? Se introdujeron. Tras la inmunizacin, estos ratones knockout / knockin fueron capaces de producir anticuerpos

humanos y usando tecnologa de hibridoma convencional, los bazos se utilizaron ms en la produccin de mAbs

humanos por las lneas celulares de hibridoma.

En los ltimos aos, el progreso se ha logrado y segmentos de genes V adicionales puede ser expresada por ratones

transgnicos ampliando el repertorio de los anticuerpos obtenidos. Actualmente, varias versiones diferentes de ratones

modificados de manera similar se han desarrollado y explotado por diferentes empresas biotecnolgicas y

farmacuticas. De hecho, ms de 50 anticuerpos monoclonales humanos desarrollados con esta tecnologa estn en

ensayos clnicos y en 2010 de seis de hecho llegaron al mercado.

5.1.5. Molecularmente Engineered Anticuerpos

La expansin de los anticuerpos teraputicos es un campo dinmico que evoluciona junto con los avances

tecnolgicos. Los avances en la ingeniera de anticuerpos les permite superar los principales problemas asociados con

la respuesta inmune contra desarrollado anticuerpos extraos introducidos en los seres humanos. Anticuerpo

quimerizacin, humanizacin y el desarrollo de anticuerpos humanos fueron las principales estrategias adoptadas para

reducir la inmunogenicidad. Adems, se han empleado esfuerzos para mejorar la afinidad, la farmacocintica y la

avidez de anticuerpos teraputicos, as como mejorar sus funciones efectoras naturales. Varios enfoques pueden ser

utilizados para manipular las regiones variables con el fin de aumentar la afinidad de unin para antgenos, o

sintonizar la especificidad de unin, es decir, la cadena de barajado, la aleatorizacin de CDR y las mutaciones

inducidas en las regiones variables. Por otra parte, las modificaciones en la glicosilacin o secuencias de aminocidos

de la regin constante puede modular las funciones efectoras Fc de los anticuerpos, ya que esta regin est implicada

en ADCC y CDC. La extensin de la vida media de IgG en suero se logra mediante el diseo de la regin Fc en

particular en la modulacin de su interaccin con el receptor Fc neonatal (FcRn) que se asocia con la proteccin de

inmunoglobulina de la degradacin intracelular. Actualmente, los conjugados anticuerpo-frmaco, la multimerizacin

de fragmentos de anticuerpos y la produccin de una variedad de formatos que no se encuentran en la naturaleza, tales

como Fab y scFv fragmentos, diacuerpos y minicuerpos estn emergiendo rpidamente como estrategias clave en el

campo de la ingeniera de anticuerpos. Como se prevea, la ingeniera de anticuerpos ha fomentado la investigacin

continua y el desarrollo en el refinamiento y la fabricacin de anticuerpos innovadores que muestran propiedades

nuevas y mejoradas para estimular la respuesta inmune antitumoral y ser aplicado en la teraputica.

6. Conclusiones

Los anticuerpos contra antgenos STN y Tn han planteado inicialmente un gran inters debido a su uso potencial como

herramientas de diagnstico. Este inters se extendi an ms a la explotacin del valor predictivo de los anticuerpos

'en pacientes vacunados. Inesperadamente, no ha habido esfuerzos (o muy limitado) que se extiende en el uso

teraputico de anticuerpos para aumentar las respuestas inmunes antitumorales o conjugado con cargas tiles txicos.

El hecho de que no hay anticuerpos teraputicos han entrado en ensayos clnicos podra explicarse por una aparente

falta de inters dada la promesa deslumbrante de la vacunacin o por un interludio mientras que los nuevos

anticuerpos estn siendo desarrollados por empresas acadmicas o biofarmacuticos. Sin lugar a dudas, existe la

necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos con mejores caractersticas especficas dirigidas STn o Tn.

Alternativamente, los anticuerpos contra glicopptidos podra ser un enfoque adecuado para aumentar su especificidad.

La obtencin de anticuerpos con dicha especificidad para la conformacin de glicano es metodologas de vanguardia

tcnicamente exigentes, por lo tanto novedosas descritos en este documento surgen como recursos muy atractivos para

acelerar el desarrollo de anticuerpos teraputicos anti-Tn y -STn que podra ser particularmente til en la mejora de la

respuesta inmune o como sistemas de administracin de frmacos.

Chicos, para el artculo de esta semana poner enfasis en:

- El resumen

- Introduccin

- Anticuerpos, sus mtodos de produccin

- Conclusiones

Agradecimientos no ah XD