AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

Enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas que adems poseen cientos de otras enzimas. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificacin.CAROLINA VITA

MTODOS DE ESTIMACIN - UNIDADESEl 1 requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad

Para decidir si es conveniente un paso de purificacin, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y despus de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles.

Naturaleza del ensayo

Depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. Resultar conveniente la medicin de la aparicin de un producto o la medicin de la desaparicin de sustrato.La actividad de una enzima depende de condiciones tales como T, pH, concentracin; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades.

Eleccin del sustratoEs muy importante: barato de fcil determinacin estable no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentracin saturante as la velocidad es independiente de la [sustrato] y proporcional a la cantidad de enzima.

Unidad enzimticaSe define en forma particular para cada reaccin segn sea conveniente.

Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad de producto (o desaparicin de reactivo) en un tiempo dado en determinadas condiciones de reaccin.

Actividad especficaLa pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad especfica (Ae)

Actividad especfica es el cociente de actividad enzimtica (expresada en unidades enzimticas) y la cantidad total de protenas. Ae = Actividad enzimtica Protenas totales

ANLISIS DE LOS DATOS

Para juzgar si un mtodo de purificacin es adecuado, deben calcularse: recuperacin y el grado de purificacin alcanzados.

Las unidades enzimticas totales de la etapa inicial (100%) puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales.

Grado de purificacin, debe obtenerse primero el valor de Ae alcanzado en cada paso.

Si se considera la Ae inicial como unidad de purificacin, el grado de purificacin de cada etapa se calcula haciendo el cociente entre la Ae de dicha etapa y la del primer paso.

CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD

Cuando una purificacin enzimtica ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la actividad especfica, pueden investigarse con mtodos analticos la homogeneidad y pureza de la preparacin obtenida.

Pueden utilizarse mtodos cromatogrficos, electroforesis, isoelctroenfoque La obtencin de un nico pico proteico es indicativo de homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios mtodos.

Monitoreo del proceso de purificacinAE Unidades totales en la fraccin iTotal de protenas en la fraccin i Rendimiento Unidades totales en la fraccin i Unidades totales en la fraccin originalPorcentaje de purificacin AE en la fraccin i AE en la fraccin original