________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XIV, N 4, 354 - 357, 2004

AISLAMIENTO DE Listeria monocytogenes EN ATN FRESCOEXPEDIDO EN LA CIUDAD DE CUMAN, VENEZUELA

Isolation of Listeria monocytogenes from Fresh Tuna Fish Expendedin Cumana City, Venezuela

Rosa E. Martnez N. y Luz Bettina Villalobos de Bastardo

Universidad de Oriente, Ncleo de Sucre, Postgrado en Biologa Aplicada, Cerro El Medio, Cuman, Estado Sucre.E-mail: rosamnazaret@hotmail.com. Telf: 0293-4302270; 0293-4332146

RESUMEN

Listeria monocytogenes se ha reportado como el agente cau-sal de varios brotes de listeriosis en humanos. Los alimentosimplicados hasta el momento han sido los lcteos, vegetales ycrnicos. Por otra parte, los alimentos pesqueros estn siendoconsiderados como vehculos posibles de la bacteria. En elpresente estudio se reporta el aislamiento de cepas de Listeriamonocytogenes en atn (Thunnus sp) expendido en puntos deventa en Cuman, Venezuela. Se sigui la metodologa descri-ta por la Food and Drug Administration y las pautas descritaspor Bubert y col. para el desarrollo de una reaccin en cadenade la polimerasa (PCR), a partir de colonias aisladas de me-dios de enriquecimiento y medios selectivos suplementadoscon antibiticos. Se analizaron 33 muestras de esa especie depescado en estado fresco y 24 en estado salado. Por el mto-do convencional, tres muestras de atn fresco fueron positivaspara el aislamiento de Listeria monocytogenes (3,75%) y cincopositivas para el aislamiento de las especies: L. welshimeri(2,5%), L. grayi (2,5%) y L. ivanovii (1,25%). La presencia deL. monocytogenes fue confirmada por un producto de amplifi-cacin de PCR, de aproximadamente 600 pares de bases, co-rroborando que la bacteria se encuentra en una de las espe-cies comerciales de mayor consumo en el pas.

Palabras clave: Listeria monocytogenes, aislamientos, ali-mentos, atn.

ABSTRACT

Listeria monocytogenes has been reported as the causal agentof several listeriosis outbreaks in humans. The foodsimplicated until recently have been the dairy products,

vegetables and meats. Now, on the other hand, fish productsare being considered as possible vehicles of the bacteria. Thisestudy report the isolation of strains of Listeria monocytogenesin tuna fish (Thunnus sp) expended in retail stores in Cumancity, Venezuela. The methodology used was the onerecommended by the Food and Drug Administration andBubert et al. for Polimerase Chain Reaction (PCR) using anenrichment media and selective media suplemented withantibiotics. By conventional method three positive strains for L.monocytogenes (3.75%) were identified in three samples andfive for L. welshimeri (2.5%), L. grayi (2.5%) and L. ivanovii(1.25%). The presence of L. monocytogenes was confirmed byPCR amplification product of approximately 600 base pairs,which confirmed that the bacteria is present in one of thecommercial species of high consumption in the country.

Key words: Listeria monocytogenes, isolations, foods, tunafish.

INTRODUCCINListeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, psi-

crotrfico y halotolerante, asociado a brotes alimenticios, am-pliamente distribuido en el ambiente y en alimentos crudos [1].Se puede aislar del suelo, materia vegetal en putrefaccin,aguas residuales, comida animal, pescados, pollos frescos ycongelados, vegetales frescos y congelados, quesos, leche noprocesada, desechos de mataderos, as como del tracto diges-tivo de humanos y animales asintomticos [2].

La listeriosis es una infeccin que tiene como punto deentrada el intestino, sin embargo, no se conoce la dosis infec-ciosa. El perodo de incubacin puede variar de un da a variassemanas. Las cepas virulentas se caracterizan por produciruna toxina citoltica y hemoltica llamada listeriolisina O, y soncapaces de producir septicemia seguida por la infeccin deotros rganos como el sistema nervioso central, el corazn, los

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Recibido: 26 / 11 / 2003. Aceptado: 13 / 05 / 2004.

ojos y pueden inclusive invadir los fetos de las mujeres emba-razadas. En adultos sanos, la listeriosis normalmente nunca sedesarrolla ms all de la fase entrica, que puede no presen-tar sntomas o tener slo sntomas leves de tipo resfriado [3].

Listeria monocytogenes no ha sido vinculada con muchafrecuencia a brotes de listeriosis por alimentos de origen mari-no, pero un producto listo para comer a base de salmn se en-contr como agente transmisor de un pequeo brote en Sue-cia [4]. Al igual que un salmn ahumado en fro [5, 6]. La pre-valencia de L. monocytogenes en pescado crudo es baja des-de un 0 a 1% a 10% [7, 8, 9]. Recientemente en un estudio deuna planta procesadora de bagre crudo, entero y procesado,se encontr que era en el pescado crudo donde ms se en-contraba L. monocytogenes [10].

Como contribucin a la documentacin de este patgenoen el caso particular de los alimentos marinos, se realiz unainvestigacin para detectar la presencia de especies del gne-ro Listeria en atn rojo fresco y salado. Para confirmar la pre-sencia de L. monocytogenes como especie patgena al huma-no, se utilizaron tcnicas de biologa molecular [11].

MATERIALES Y MTODOSSe analizaron 33 muestras de atn rojo (Thunnus sp) en

estado fresco y 24 en estado salado, las cuales fueron colecta-das en los puntos de venta del mercado municipal de la ciudadde Cuman, Venezuela. Una vez en el laboratorio cada muestrase analiz por separado, siguiendo las recomendaciones delManual Analtico de la Administracin de Drogas y Alimentos delos Estados Unidos [12] para el aislamiento e identificacin con-vencional de L. monocytogenes, por pruebas rpidas API Liste-ria y las pautas segn Bubert y cols. [13] para la identificacinpor el mtodo de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La identificacin contempl los siguientes anlisisEnriquecimiento: 25 g de cada muestra, se colocaron en

Caldo LEB (Oxoid, Basingstoke-England), suplementado conacriflavina, cido nalidxico y cicloheximida. Se incubaron a30C por 24 horas. Se tom una alcuota de 0,1 mL y se colo-c en un segundo caldo LEB (Oxoid) por 24 horas adicionales.

Aislamiento: del segundo caldo de enriquecimiento serealizaron siembras por estras hasta agotamiento en la super-ficie de medios de cultivo selectivos Oxford (Oxoid) y Palcalm(E. MercK - Germany), ambos suplementados con antibiticosy contenidos en placas de Petri. Se incubaron las placas a37C por 24 a 48 horas. Transcurrido las 48 horas, se procedia examinar las placas para obtener colonias sospechosas Enel medio Oxford, no se logr aislar ninguna colonia caracters-tica. En cambio en el medio Palcam, se aisl colonias presunti-vas de aproximadamente 2 mm de dimetro, de color verdegrisceo, con un centro hundido de color negro y un halo ne-gro a su alrededor. Las colonias sospechosas se sembraron

en agar tripticasa de soya (Oxoid) con 0,6% de extracto de le-vadura, para su posterior identificacin.

Identificacin convencional: se realiz mediante laspruebas bioqumicas siguientes: Hemlisis, catalasa, oxidasa,hidrlisis de esculina, motilidad a 4 y 25C, produccin de in-dol, Voges Proskauer, rojo de metilo, motilidad en vuelta decarnero, TSI, fermentacin del manitol, xilosa y ramnosa, re-duccin de nitrato. Una vez confirmado el gnero, las cepaspositivas fueron evaluadas por pruebas bioqumicas miniaturi-zadas en una galera API Listeria (BioMerieux-Zhuoz Pharma).Se utiliz una cepa control proveniente del CVCM 446 [14].

Identificacin por (PCR): Las colonias identificadas comoL. monocytogenes por pruebas bioqumicas, fueron sometidas aun ensayo de PCR. Para el mtodo, se tom una porcin de lascolonias previamente identificadas, y se procedi a la extracciny purificacin del ADN total de las muestras. Esta se realiz pormedio del kit de extraccin de ADN genmico Wizard (Promega),siguiendo las especificaciones del fabricante. Una vez purificadoel ADN y cumplidas las 24 horas de rehidratacin, se procedi arealizar la amplificacin por PCR utilizando las combinaciones delos primers MonoA(5-CAAACTGGTAACACAGCTACT-3) y Mo-noB(5-TGGGTCATCGGTGTGATCGTC- 3) (Sigma Genosys-U-SA), para la identificacin especfica del serotipo L. monocytoge-nes [13]). La especificidad de la prueba fue evaluada con unacepa de referencia de L. monocytogenes certificada por el CentroVenezolano de Coleccin de Microorganismos (CVCM) [14]. Elprograma de amplificacin fue el siguiente: 1 ciclo a 94C por 5minutos para la desnaturalizacin inicial, 35 ciclos a 94C por 5minutos para la desnaturalizacin, 58C por 30 segundos para lahibridacin de los primers, 72C por 45 segundos para la exten-sin y 1 ciclo a 72C por 10 minutos para la extensin final. Losproductos amplificados fueron corridos por electroforesis en gelde agarosa al 1,5%, en buffer TAE 1X a 80 V por 35 minutos. ElADN fue visualizado en un transluminador ultravioleta usando co-loracin con bromuro de etidio.

RESULTADOS Y DISCUSION

El presente estudio confirm la presencia de L. monocyto-genes en atn rojo (Thunnus sp) que se comercializa en la zonacapitalina del estado Sucre. De un total de 57 muestras de atnfresco y salado, se aislaron 80 cepas sospechosas de pertene-cer al gnero Listeria. De las 80, se identific 3 cepas como L.monocytogenes, aisladas de tres muestras diferentes de atnfresco (3,75%), 2 cepas como L. welshimeri (2,5%), 2 como L.grayi (2,5%) y 1 como L. ivanovii (1,25%), cada una provenientede cinco muestras ms de atn fresco. Las muestras saladasde atn, mostraron cero incidencia de Listeria spp (FIG.1). Porla identificacin convencional, las cepas aisladas mostraron lassiguientes caractersticas: Gram+ motilidad en vuelta de carne-ro; crecimiento en paraguas a 25C; betahemlisis (en el casode L. monocytogenes); esculina +, catalasa +, oxidasa - urea -;

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TSI a/a; glucosa O/F +/+ y MR-VP +/+. Por el sistema de iden-tificacin API los resultados fueron corroborados, evidencin-dose la presencia de L. monocytogenes, L. welshimeri, L. grayiy L. ivanovii, en el mismo porcentaje hallado por las pruebasbioqumicas convencionales.

Los aislamientos frecuentes a partir del pescado [15, 16]y la demostracin del potencial de proliferacin en salmnahumado en fro (4C) [17], son pruebas de que el pescadopuede ser importante en la transmisin de L.monocytogenes.En Japn (1992) evaluaron la incidencia de especies de Liste-ria en ventas de comidas, encontrando que un 56,6% de lasmuestras de carne, pescados y productos vegetales analiza-dos, estaban contaminados con especies de Listeria, siendo L.monocytogenes, la especie que se present con mayor fre-cuencia (36%) [18]. En un estudio realizado en carnes y ali-mentos marinos en la ciudad de Puerto Espaa, Trinidad, sedetect una prevalencia en pescados del 14,8% para especiesde Listeria, observndose un 1,9% de cepas positivas de L.monocytogenes. [19], valores prximos a los reportados en elpresente trabajo.

Segn indica Embarek y Huss [17], es poco comn elaislamiento de L. monocytogenes en agua de mar a menosque la costa est sujeta a contaminacin por fuentes industria-les, humanas o de animales.

Por un proceso de reaccin en cadena de la polimerasa(PCR), se confirm la presencia de L. monocytogenes en atnrojo a partir de primers especficos para la identificacin de estaespecie. Los resultados indicaron que 2 de las 3 cepas aisladase identificadas por el mtodo convencional como L. monocyto-genes, presentaron el mismo patrn de corrida electroforticaque la cepa certificada, mostrando un producto de amplificacinde aproximadamente 600 pares de bases (FIG. 2).

Es importante sealar que en Venezuela no se conocetrabajo que haya reportado la presencia de Listeria monocyto-genes en productos pesqueros. En el caso partcular del atnrojo que se expende en la ciudad de Cuman, al ser colectadoen zonas muy alejadas de la costa, se hace difcil dilucidar laposible fuente de contaminacin y descartar s su origen espor exposicin al microorganismo en el rea donde fueroncapturados, o por malas prcticas de manipulacin y falta dehigiene por parte de los expendedores.

Segn la norma de la Administracin de Drogas y Ali-mentos de los Estados Unidos [12], la tolerancia de L. mo-nocytogenes debe ser 0 UFC/g en pescados listos para consu-mir, bien sean frescos, congelados, salados o ahumados. Aun-que en el estado Sucre no se exige el cumplimiento de normasde control de calidad, por parte de todos los expendios de pes-cados existentes, es importante tomar en cuenta que un3,75% de incidencia de L. monocytogenes en pescado fresco,es un valor significativo, en el sentido que pone al descubiertoun riesgo potencial de contraer la listeriosis.

CONCLUSIONES

La identificacin convencional arroj un total de 3 cepaspositivas a la especie L. monocytogenes, 2 a L. welshi-meri, 2 a L. grayi y 1 a la especie L. ivanovii, en mues-tras de atn rojo (thunnus sp) fresco.

Las muestras saladas de atn rojo, mostraron cero inci-dencia de Listeria spp.

La identificacin por galeras API, corrobor los resulta-dos hallados por pruebas bioqumicas convencionales,evidenciando la presencia de cuatro especies de Listeria.

La tcnica de PCR mostr un grado de sensibilidad ex-celente, al confirmar dos cepas positivas de Listeria mo-nocytogenes, de las tres identificadas por el mtodo con-vencional en atn fresco.

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Aislamiento de Listeria monocytogenes en atn fresco / Martnez N., R.E. y col.________________________________________________

3,75%1,25%

2,5%

2,5%L. monocyotogenes L. welshimeri L. grayi L. inanovii

FIGURA 1. ESPECIES DE Listeria AISLADAS DE ATUNFRESCO EN LA CIUDAD DE CUMANA, ESTADO SUCRE,VENEZUELA.

FIGURA 2. IDENTIFICACIN POR PCR, CONTENIENDOLOS PRIMERS MONO A Y MONO B DE Listeria monocyto-genes AISLADAS DE ATUN FRESCO EN LA CUIDAD DECUMAN, ESTADO SUCRE, VENEZUELA.

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