Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa

8/9/2019 Aplicacin de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizn tardo (Phy

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Memoria presentada por

D. Julio Luis Gabriel Ortega

Para optar al grado de

Doctor en Produccin Agraria y Biotecnologia

por la Universidad Pblica de Navarra

Aplicacin de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

diferentes fuentes de resistencia a tizn tardo (Phytophthora infestans)en papa

Directores:

Dr. ENRIQUE RITTER AZPITARTE. Investigador principal de

NEIKER - Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo Agrario.

Dr. JOS IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GMEZ.

Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigacin y

Desarrollo Agrario.

Tutor:

Dr. ANGEL MINGO CASTEL. Profesor titular del Departamento de

Produccin Agraria de la Universidad Pblica de Navarra.

Universidad Pblica de Navarra

E.T.S. Ingenieros Agrnomos

Pamplona, 2008


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D. ANGEL MINGO CASTEL en su calidad de Profesor titular del Departamento de

Produccin Agraria de la Universidad Pblica de Navarra.

D. ENRIQUE RITTER AZPITARTE en su calidad Investigador principal de

NEIKER - Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo Agrario.

y D. JOS IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GMEZ en su calidad de

Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigacin y Desarrollo

Agrario.

.

CERTIFICAN:

Que D. JULIO LUIS GABRIEL ORTEGA, Ingeniero Agrnomo ha realizado bajo

nuestra direccin, el trabajo de investigacin correspondiente a la presente Memoria de

Tesis Doctoral in titulada:

Aplicacin de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

diferentes fuentes de resistencia a tizn tardo (Phytophthora infestans)

en papa

Y para que as conste en cumplimiento de la legislacin vigente, expedimos el siguiente

certificado

Pamplona, 01 de diciembre del 2008

Fdo. Enrique Ritter

Azpitarte

Fdo. Jos Ignacio Ruiz de

Galarreta

Fdo. Angel Mingo Castel


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AgradecimientosEl presente trabajo es el fruto de mucho esfuerzo y dedicacin de muchas horas y

muchas personas que con su ejemplo, enseanza, dedicacin, amistad y profesionalismo

hicieron posible alcanzar esta meta anhelada en mi formacin. A todos quienes de una

u otra manera contribuyeron a este logro quiero expresar mis sinceros agradecimientos y

les ruego me perdonen si no logro nombrar a todos, no es por omisin voluntaria.

En principio deseo agradecer de manera especial al Dr. Antonio Gandarillas,Gerente General de la Fundacin PROINPA en Bolivia por su amistad, confianza y

apoyo permanente para alcanzar esta meta, que es la culminacin de un largo anhelo y

sacrificio; y por intermedio de l al Directorio y al personal de la Fundacin PROINPA,

por depositar su confianza en quienes trabajamos en esta noble institucin dedicada al

desarrollo agrcola de mi pas. Por ende, tambin agradecer al laboratorio de biologa

molecular en la persona de mi gran amigo y colega Dr. Jorge Rojas y su equipo tcnico,

Yola Snchez y Eliana Alba. A Giovanna Plata y al Centro Toralapa por facilitarme los

invernaderos y la ayuda necesaria para hacer la evaluacin de resistencia en hoja y

tubrculo a P. infestans.

Quiero agradecer de manera expresa y especial a mis dos directores de tesis, los

Dres. Enrique Ritter y Jos Ignacio Ruiz de Galarreta, de Neiker Tecnalia, no slo por la

direccin de la tesis, sino por su gran amistad, confianza, apoyo, esfuerzo y

profesionalismo, razones que me han permitido pueda culminar este trabajo.

Agradezco de manera particular a la Dra. Pamela Anderson, Directora del CIP, ypor intermedio de ella a la sra. Mercedes Suito, Victor Mares y a todo el equipo que

maneja las becas INIA-Espaa, en el CIP - Lima, Per, por la permanente preocupacin

para que no me falte nada; y muy especialmente agradezco a la sra. Angeles Navarrete

y la Dra. Mara Teresa Dobao y a todo el equipo del INIA - Espaa por financiar mis

estudios doctorales en la UPNA, Espaa. Gracia por invertir en mi pas y mi gente.

A la Direccin de Neiker Tecnalia, por haberme acogido en esta prestigiosa

institucin del pas Vasco, Espaa - para realizar los trabajos de laboratorio para mi


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formacin cientfica en el mundo de la Biologa Molecular durante estos tres aos y

medio.

Al programa doctoral bajo la coordinacin del Dr. Jos Antonio Mendizabal del

Departamento de Produccin Agraria de la Universidad Pblica de Navarra, por suamistad y por permitirme la presentacin del presente trabajo y en especial al Dr. ngel

Mingo Castel por aceptar la tutora de esta tesis, y facilitarme en los primeros aos toda

la comprensin y ayuda necesaria; al igual que la Dra. Beatriz Amoreno, que me acogi

en un primer momento en el Instituto de Agrobiotecnologia de Arrosadia.

Al proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y al proyecto

patrocinado por el gobierno de Alemania BMZ, liderado acertadamente por la Dra.

Anne Forbes, por apoyar financieramente el presente trabajo de investigacin, que sinel patrocinio de estos hubiese sido muy difcil culminar este trabajo.

De manera muy especial quiero expresar mi agradecimiento a Mnica Hernndez,

por su amistad, esmero, dedicacin, paciencia y gran profesionalismo, que me enseo y

me ayud a introducirme y entender este complejo mundo de la biologa molecular; y de

igual manera deseo expresar mi gratitud a Leire Barandalla y Rakel Lpez que con

mucho denuedo, paciencia y amistad me han ayudado de manera decidida a alcanzar

este logro. Seguro estoy que sin la gran ayuda de todas ellas no hubiese logrado sacaradelante este trabajo.

A la Dra. Sonia Castaon, jefa del departamento de biotecnologa de Neiker

Tecnalia por permitirme trabajar y tener un lugar en el laboratorio de biologa

molecular. A Maite por su trabajo tan importante como es el preparando el material de

laboratorio, para que todos puedan trabajar con las facilidades necesarias.

Quiero agradecer de forma muy especial a ese equipo maravillo de personas de

Neiker Tecnalia: Noem, Isi, Ana A., Imanol, Raquel M., Judith, Ana H., Jhon, Monse,

Gorka, Nuria, Helena, Carlos, Marina, Arguia, Ziortxa, Eugenia, Ernesto, Pablo, Ins,

Susana, Begonia, Iratxe, por su gran amistad, confianza y constante apoyo, que me han

hecho sentir como en mi casa y mi pas.

A Claudia por su apoyo y facilitacin del material bibliogrfico en la biblioteca de

Neiker Tecnalia.


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A Gregorio, Vctor e Ignacio del departamento de mantenimiento de Neiker

Tecnalia, que en muchas oportunidades me facilitaron el transporte a la estacin de

buses para ir a Pamplona a cumplir las clases en la UPNA.

A toda la gente que he conocido durante estos aos y que me han ayudado cuandoles he necesitado.

No puedo dejar de agradecer su confianza, cario y apoyo de mi familia,

particularmente de mi madre Elsa Ortega, y mis hermanos Fernando, Edwin y Miguel y

mis cuadas Nevia, Martha y Jimena. En especial agradezco a mi esposa Anglica por

su apoyo, paciencia, esfuerzo, oracin, amistad y cario y a mis hijitas Angy, Keila y

Alejandra por soportarme en estos tres largos aos y medio de estudio y ausencias de mi

hogar y mi pas. Agradezco a Rodrigo y Raquel, Job y Mabel, Justo y Julieta, Anita,Marcelino y todas mis sobrinas, Humberto y Liz Vargas y Roberto por sus oraciones y

su gran amistad.

Tampoco puedo olvidar de agradecer a mis grandes amigos y amigas como Hugo

Ramrez y su linda familia, Laura N., Salom P., Lourdes G., Juan V., Enrique C.,

Pablo M., Noel O., Willman G., Jorge B., Javier F., Esther A., Edson G., Ximena C.,

Hermeregildo E., Ada A., Jimena C., Carolina C, Susana, Ana Mara C., Elizabeth P.,

Samantha C., Jury M., Ral G., Rolando O. y a todos que de manera directa o indirectame han colaborado para alcanzar esta meta.

Muchas gracias.


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Buena es la ciencia con herencia y provechosa para losque ven el sol, porque escudo es la ciencia, y escudo es el

dinero; ms la sabidura excede, en que da vida a susposeedores; mira la obra de Dios, porque quin podr

enderezar lo que l torci?

Eclesiats 7:11-12


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Dedicatoria

Al Seor mi Dios, que me ha dado la vida, fortaleza, sabidura e

inteligencia.

A mis padres Julio Gabriel A. (+) y Elsa Ortega

Al Dr. Nelson Estrada (+).

A mi esposa Anglica y a mis hijas Angy, Keila y

Alejandra.

A mis amigos agricultores paperos de Bolivia.


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ndice

1. Introduccin ..................................................................................................................... 11.1. Origen e importancia econmica y social de la papa ............................................ 2

1.2. Factores biticos que la afectan ............................................................................. 31.3. Caractersticas biolgicas de Phytophthora infestans ........................................... 41.4. Reproduccin ......................................................................................................... 5

1.4.1. Reproduccin asexual .................................................................................. 61.4.2. Reproduccin sexual ................................................................................... 7

1.5. Sntomas causados por P. infestans....................................................................... 81.5.1. En follaje .................................................................................................... 81.5.2. En tallos ....................................................................................................... 91.5.3. En tubrculos ............................................................................................... 9

1.6. Condiciones climticas favorables para el desarrollo de P.infestans .................. 101.7. Distribucin geogrfica de la enfermedad ........................................................... 111.8. Importancia econmica de la enfermedad ........................................................... 121.9. Fuentes de resistencia en el gnero Solanum....................................................... 131.10. Resistencia gentica a P. infestans ...................................................................... 15

1.10.1. Tipos de resistencia ................................................................................. 15Resistencia monognica ........................................................................ .17Resistencia oligognica ......................................................................... .17Resistencia Polignica ........................................................................... .17

1.11. Componentes de resistencia.................................................................................. 181.12. Tcnicas Moleculares en la mejora gentica ....................................................... 19

1.12.1. Marcadores moleculares ........................................................................... 19

1.12.2. Mapas genticos ....................................................................................... 211.12.3. Integracin de caracteres cualitativos ....................................................... 221.12.4. Anlisis de QTL ....................................................................................... 231.12.5. Genotipado de QTA ................................................................................. 251.12.6. Identificacin e integracin de genes candidato ....................................... 251.12.7. Mapas funcionales .................................................................................... 27

2. Objetivos ......................................................................................................................... 283. Materiales y mtodos ...................................................................................................... 30

3. 1. Resistencia a tizn en follaje ................................................................................. 313.1.1. Material vegetal y preparacin .................................................................... 313.1.2. Aislados de P. infestans.............................................................................. 32

3.1.3. Preparacin de fololos ................................................................................ 333.1.4. Preparacin de inoculo ................................................................................ 333.1.5. Inoculacin .................................................................................................. 343.1.6. Diseo experimental .................................................................................... 35

3.2 Variables de respuesta y anlisis estadstico ........................................................ 353.2.1. Intensidad de Esporulacin (IE) .................................................................. 35

3.2.2. rea bajo la Curva de Progreso de P. i. total (ABCPPI) ............................. 353.3. Evaluacin de la resistencia en tubrculos ............................................................. 36

3.3.1. Diseo experimental ..................................................................................... 373.3.2. Aislados de P. infestans................................................................................ 373.3.3. Preparacin de tubrculos ............................................................................. 38

3.3.4. Preparacin de inoculo ................................................................................. 383.3.5. Inoculacin ................................................................................................... 38


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3.4. Variables de respuesta y anlisis estadstico ......................................................... 383.5. Obtencin de mapa de referencia para genotipado de QTA ................................... 39

3.5.1. QTLs y genes de resistencia conocidos para el anlisis por SSRs ligados . 393.5.2. Proyeccin de QTLs, genes y SSRs ............................................................ 423.5.3. Otros marcadores y genes utilizados para el QTA genotyping .................... 46

3.6. Tcnicas moleculares ............................................................................................... 483.6.1. Extraccin de ADN ....................................................................................... 483.6.2. Cuantificacin de cidos nucleicos................................................................ 483.6.3. Determinacin en geles de agarosa ............................................................... 493.6.4. Anlisis de marcadores SSR .......................................................................... 493.6.5. Anlisis de genes candidato .......................................................................... 523.6.6. Anlisis de marcadores CAP ......................................................................... 52

3.7 Anlisis de alelos .................................................................................................... 544. Resultados ....................................................................................................................... 55

4.1. Anlisis de resistencia ............................................................................................. 564.1.1. Anlisis de la resistencia a P. infestans en hoja ........................................... 56

4.1.2. Anlisis de la resistencia a P. infestans en tubrculo .................................... 624.1.3. Correlacin de la resistencia entre hoja y tubrculo ...................................... 66

4.3. Anlisis de co-localizacin de SSRs y genes en el mapa poblacional UHD ........... 674.4. Resmen de los resultados del QTA genotyping .................................................... 744.5. Anlisis de genes candidato y otros marcadores ..................................................... 79

5. Discusin ........................................................................................................................ 826. Conclusiones ................................................................................................................... 897. Referencias .................................................................................................................... 92

Resumen ..................................................................................................................... 106Summary ..................................................................................................................... 107Acrnimos ................................................................................................................... 108


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Aplicacin de marcadores moleculares para el cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizn tardo (Phytophthora infestans) en papa Julio Luis Gabriel Ortega

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1. Introduccin


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1.1. Origen e importancia econmica y social de la papa

La papa (es su nombre en quechua1) pertenece a la familia de las Solanceas y al gnero

Solanum y posee, probablemente, ms especies silvestres relacionadas que cualquier otro

cultivo. El gnero Solanum engloba alrededor de 2.000 especies, las cuales se extienden por

todo el mundo, exceptuando el Norte y el Sur ms extremos. La evolucin filogentica y las

fuerzas evolutivas de seleccin, migracin, mutacin, hibridacin, poliploidizacin e

introgresin, han contribuido a la divergencia y a explicar el origen de la gran variabilidad

gentica presente en las especies silvestres y cultivadas (Egsquiza 1987).

Probablemente, la papa se domestic hace 10.000 aos en el altiplano, entre Per y

Bolivia, donde se encuentra la mayor variabilidad gentica de especies silvestres y variedadescultivadas (Engel 1964). Las primeras papas domesticadas eran especies diploides de la

especie Solanum stenotomum (Hawkes 1979). Estudios citoplasmticos, consideran que S.

andigena se origin de S. stenotomum y S. phureja. A partir de S. andigena se origin S.

tuberosum. A travs de los aos, mltiples cruzamientos con diferentes especies silvestres,

contribuyeron a la introgresin tanto de genes de resistencia como de caracteres de calidad

(Grun et al. 1977).

El nmero bsico de cromosomas de las papas cultivadas y especies silvestresemparentadas es x= 12. Es una especie poliploide y vara desde 2n=24, 36, 48, 60 y 72

cromosomas. Se cree que la evolucin hacia las papas actuales se realiz a nivel diploide

(Ross 1986, Hawkes 1990).

La papa es uno de los cultivos alimenticios ms importantes y difundidos a nivel

mundial. En produccin de protena por unidad de tiempo y superficie y en la obtencin de

energa es superior al resto de los cultivos (Estrada 2000). En cuanto a rendimiento, la papa

ocupa el cuarto lugar, despus del arroz, trigo y maz (FAO 2004).

En Bolivia ocupa el primer lugar entre los tubrculos cultivados con una superficie

aproximada de 130.000 ha y rendimientos promedio de 5 t/ha, mientras que la media mundial

se sita entre14 y 26 t/ha (Horton 1992, Zeballos 1997). Su cultivo involucra

1 La palabra "papa" es un prstamo lingstico del trmino quechua papa, con el mismo significado del cruce entre batata (Ipomoeabatatas), palabra originaria de la isla La Espaola , y papa resulta "patata", nombre que, por la similitud de formas, le fue aplicado en unprincipio por los conquistadores tanto a la papa como a la batata. "Papa" aparece por escrito por primera vez hacia 1540 . Por su parte,"patata" se usa en 1606 con el significado de batata y slo a partir del siglo XVIII con el significado de papa. As, en la mayor parte deEspaa se llaman "patatas", excepto en las Islas Canarias y en parte de Andaluca , donde predomina la palabra "papa", al igual que en elresto de los pases hispanohablanteshttp://es.mobile.wikipedia.org/transcode.php?go=Solanum+tuberosum&PHPSESSID=c925f5fd1f466d36c446fe1e348156d6)


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aproximadamente a 200.000 agricultores, lo que representa el 50% de las unidades agrcolas

del pas (Gabriel y Carrasco 1998) y an hoy es la principal fuente de alimentacin e ingresos.

El consumo per cpita est de 60 - 80 kg/ao (Estrada et al. 1994, Fernndez-Northcote et

al. 1999).

1.2. Factores biticos que afectan la papa

La produccin de papa est fuertemente afectada por diversas enfermedades. Hooker

(1980) menciona 25 virus, 38 hongos, 6 bacterias, 2 micoplasmas y un viroide; adems de 68

especies de nematodos y 128 insectos-plaga, totalizando unos 266 patgenos y plagas.

Tambin diezman la papa factores abiticos como las heladas y la sequa. Pero de las ms

importantes es el oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, que causa el tizntardo. Esta enfermedad generalmente se controla con fungicidas, que inciden

significativamente en los costos de produccin, afectan al medio ambiente y la salud humana,

adems inducen a la aparicin de nuevas razas del patgeno que son resistentes a fungicidas

(Andrade y Revelo 1994, Pineda y Corzo 1994, Egsquiza 1994). Por ello es necesario

considerar otras medidas de control, como el empleo de variedades resistentes, que adems

posean altos rendimientos y calidad culinaria aceptable para el mercado.

P. infestans, antiguamente clasificado en el reino fungi, Sub Reino talfitas, en laDivisin Mycota, en la Subdivisin Eumycotina, en la Clase Oomycetes, Sub Clase

Oomycetidae, Orden Peronosporales, Familia Phytiaceae, Gnero Phytophthora, Especie

infestans (Agrios 1991, Robertson 1991). Se le consideraba como hongo inferior

(Eumycotina), por ser un microorganismo formado por una sola clula continua, tubular,

ramificada, sin clorofila, con tejidos conductores y produciendo esporas asexuales en el

interior de un saco denominado esporangio.

Estudios bioqumicos y moleculares (Brasier y Hansen 1992) evidencian caractersticas

particulares de los Oomycetes, que los distancian del grupo de los hongos, por lo cual se

clasifican en uno diferente.

Evidencias de su similaridad estructural con los flagelados, su aparato mittico, su

oogamia, su retculo citoplasmtico, la estructura microfibrilar de su pared celular, el

metabolismo oxidativo, el almacenamiento de 1-3 Glucanasas, sus flagelos Hetecariontes y

la secuencia de sus cidos nucleicos, los encuadran filogenticamente en el reino de las algas


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Heterocariontes. El gnero Phytophthora est actualmente incluido en el reino Choromista

(Ribeiro 1995, Dick 1990, Vleeshouwers 2001).

1.3. Caractersticas biolgicas deP. infestans

Si se examina al microscopio un corte transversal de una hoja, de una de las manchas, se

observa micelio intercelular, hialino continuo de 3-4 de dimetro ramificado en algunos

sitios, de paredes delgadas y rico en protoplasma. Es fcil ver en los bordes las manchas; en

los tubrculos, el micelio es parecido al de las hojas, pero puede ser hialino o ligeramente

parduzco (Urquijo et al. 1971). Los conidios tienen forma parecida al limn y son hialinos y

continuos, sus dimensiones son entre 27-30 por 15-20. La ramificacin del conidiforo es

simpdica (Fig. 1).

Figura 1. Micelio y esporangios de P. infestans (Foto: Urquijo et al. 1971)

La principal caracterstica de los Oomycetes, es la presencia de un micelio cenoctico,

diploide en su estado vegetativo y producir dos tipos de esporas: zoosporas a partir de

zoosporangios y oosporas mediante la fusin de gametos morfolgicamente distintos (Phillips

y Keane 1993).

Segn el proceso de infeccin que produce, P. infestans se clasifica como un patgeno

hemibiotrfico, porque tan pronto ocurre el proceso de infeccin, el tejido de la planta

hospedante muere, siendo este grupo intermedio entre los patgenos biotrficos y los

Micelio (3-4 )

Esporangio(27-30 x 15-20)


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necrtroficos. Es decir que son biotrficos en el permetro de la lesin, pero necrotrficos

cerca al centro de la lesin(Niks y Lindhout 1999, Parlevliet 1997a).

1.4. Reproduccin

A P. infestans se lo considera como el causante de una epidemia policclica. Para ser

considerada como tal, debe tener ciclos de infeccin completa y repetida, es decir, la infeccin

debe ser seguida por el desarrollo del patgeno, la produccin de inoculo nuevo, la dispersin

del inoculo a nuevos sitios susceptibles y finalmente nuevas infecciones, todo ello dentro de

un solo ciclo del cultivo. Un buen ejemplo es el tizn de la papa, donde en un solo ciclo de

infeccin desarrolla lesiones, esporulacin, dispersin de los esporangios (Fig. 2) e

infecciones nuevas dentro de cinco das, ocurriendo muchos ciclos superpuestossimultneamente durante perodos de tiempo favorable. Cada ciclo puede aumentar ms de

diez veces el nmero de esporangios que aterrizan sobre sitios susceptibles, que resulta en

epidemias explosivas. La mayora de las enfermedades de plantas ocasionadas por bacterias

son policclicas y muchos de los virus de plantas, con la ayuda de sus vectores de insecto,

tambin pueden producir repetidos ciclos de infeccin en una temporada

(http://arneson.cornell.edu.)

Figura 2. Ciclo de la enfermedad (epidemia policclica) (Fuente: Adaptado de Hooker 1980)


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1.4.1. Reproduccin asexual

Entre tres y diez das despus de la infeccin, segn las condiciones ambientales, los

rganos portadores de esporas (esporangiforos) emergen a travs de estomas en la superficie

de las hojas (Fig. 3). Como los estomas son ms frecuentes en el envs que en el haz de lahoja, la esporulacin en el envs es ms abundante que en el haz (Henfling 1987).

Figura 3. Esporulacin de P. infestans en el envs de las hojas (Foto: Oscar Navia)

Los zoosporangios (esporangios o conidios), se desarrollan en el extremo de losesporangiforos (Fig. 4); cuando estn maduros, estos se desprenden fcilmente y son

diseminados por el viento. La mayora de las esporas caen a los pocos metros. Sin embargo,

pueden llegar a recorrer distancias de ms de 30 Km. El tamao de los zoosporangios se

encuentra justo debajo del lmite de deteccin del ojo humano. Su forma se parece a la de un

limn (Henfling 1987).

Figura 4. Produccin de esporangios en el esporangiforo (Foto: Henfling 1987).


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Los zoosporangios pueden germinar directa e indirectamente; la primera a temperaturas

mayores de 20 C (la ptima es de 24C). Un zoosporangio se comporta como una simple

espora, forma un tubo germinativo que puede entrar en el tejido de la planta.

Estos germinan indirectamente a temperaturas de 12 a 16C, desprendiendo entre 10-20

esporas mviles (zoosporas). Activadas por dos flagelos las zoosporas permanecen mviles

durante un tiempo que vara de algunos minutos a varias horas. Bajo ciertas condiciones

pierden los flagelos, forman una pared celular y a continuacin un tubo germinativo (Henfling

1987).

En las hojas y en los tallos los tubos germinativos pueden penetrar directamente en la

epidermis de la planta (no se requieren estomas). En los tubrculos, los tubos germinativospenetran a travs de lentcelas o de lesiones. Como el hongo no puede sobrevivir un tiempo

prolongado fuera del tejido hospedante, los zoosporangios o zoosporas mueren si no

encuentran un tejido hospedante apropiado (Henfling 1987).

1.4.2. Reproduccin sexual

Hasta 1984, el estado sexual de P. infestans solo haba sido sealado en Mxico y partes

de Centro Amrica. Fryet al.

(1993) describi su aparicin en otras partes del mundo,especialmente en el Este de Europa.

Cuando los micelios de diferentes tipos del hongo, llamados tipos de apareamiento A1 y

A2 crecen juntos, uno de ellos puede formar clulas masculinas (anteridios) y la otra clula

femenina (Oogonios). El oogonio crece a travs del anteridio, permitiendo la fertilizacin y

fertilizado se convierte en una espora de descanso de paredes gruesas (oospora). Las oosporas

a diferencia de los zoosporangios y las zoosporas, pueden resistir condiciones desfavorables,

como sequas y bajas temperaturas (Fig. 5). La recombinacin gentica puede generar nuevasrazas virulentas, haciendo que este tipo de reproduccin sea peligrosa para el cultivo de papa.

La formacin de oosporas ayuda a P. infestans y las especies afines a sobrevivir en

condiciones adversas como invierno, perodos secos y ausencia de hospederos. Las oosporas

de P. infestans germinan mediante la formacin de un esporangio que es similar a los

descritos en la reproduccin asexual (Fig. 5). Despus de producirse la infeccin en un

hospedero, las zoosporas resultantes pueden iniciar un nuevo ciclo de vida (Henfling 1987).


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Figura 5. Ncleo del anteridio dentro del Oogonio (Foto: Annimo).

1.5.Sntomas causados porP. infestans

1.5.1. En Follaje

En campo, los primeros sntomas de la enfermedad se presentan con frecuencia en las

hojas inferiores. Estos consisten en pequeas manchas de color verde, entre verde claro y

verde oscuro, que se convierten en lesiones pardas o negras segn la humedad del ambiente.

Las lesiones se inician frecuentemente en las puntas y los bordes de las hojas. Una aureola

verde clara o amarilla de algunos milmetros de ancho suele separar el tejido muerto del sano

(Fig. 6). Bajo condiciones de alta humedad (mayor a 90%) y temperaturas bajas (0 a 22 C)

las lesiones se expanden rpidamente. La esporulacin puede verse en el envs de las hojas

como un moho blanco que rodea las lesiones. Puede volverse poco notable durante el da

mientras las lesiones se secan y arrugan. En menos de una semana la enfermedad puede

propagarse desde los foliolos infectados en unas pocas plantas, hasta casi todas las plantas de

una parcela pudiendo llegar a caerse las hojas (Navia y Fernandez-Northcothe 1996).

Figura 6. Sntomas en hoja del ataque de P. infestans en papa (Foto: CIP 1996)


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1.5.2. En Tallos

Las lesiones pueden desarrollarse por infeccin directa o por extensin a partir de las

hojas, en los pecolos y los tallos, donde se expanden longitudinalmente. Presentan manchas

necrticas alargadas de color marrn oscuro, tomando las partes afectadas una consistencia

vtrea (Fig. 7). Los tallos infectados se debilitan, pueden tener un colapso y morir de la lesin

hacia arriba; adems dequebrarse por accin del viento. En algunas zonas los agricultores de

Bolivia lo conocen como paqui paqu (es su nombre en quechua) (Navia y Fernndez-

Northcothe 1996).

Figura 7. Sntomas en tallos por el ataque de P. infestans en papa (Foto: Henfling 1987).

1.5.3. En Tubrculos

Los tubrculos son infectados por las esporas que la lluvia lava de las hojas y los tallos y

penetran en el suelo hasta llegar a los tubrculos. Presentan en la parte externa reas

irregulares y ligeramente hundidas de color marrn oscuro y de apariencia hmeda; una

decoloracin superficial e irregular (Fig. 8). Partiendo el tubrculo, se observa una pudricin

corchosa de color pardo claro a oscuro debajo de la piel y hacia el interior del tubrculo

(Henfling 1987); este sntoma es conocido por los agricultores de Bolivia como kanura (es

su nombre en quechua) (Navia y Fernndez-Northcote 1996). Los patgenos secundarios,

principalmente bacterias, pueden convertir la casi inodora pudricin seca, tpica de P.

infestans, en una pudricin blanda maloliente, lo cual limita la comercializacin de stos

tubrculos. El tizn tardo no se propaga normalmente durante el almacenamiento; sin

embargo, las infecciones secundarias pueden contaminar los dems tubrculos (Navia y

Fernandez-Northcote 1996).


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Figura 8. Sntomas en tubrculos (Foto: Julio Gabriel)

En Latinoamrica no hay muchos estudios sobre la resistencia en el tubrculo, porque no

se presentan daos. Sin embargo, en Europa, es un problema importante, as Kapsa (2007),

menciona que la presencia de la enfermedad de tizn es un factor crtico en la sanidad de los

tubrculos en Polonia y otros pases europeos. Encontr que los sntomas de tizn varan en

aos particulares. La infeccin de tubrculos en 1998 fue de 19.5%, en 2003 del 21.8% y en

2006 del 14.8%. La alta incidencia de tizn sobre los tubrculos se relacion con la presencia

de lluvias en agosto y septiembre, correlacionndose con la virulencia del patgeno.

Se ha observado en tubrculos un tipo de resistencia horizontal. No se ha encontradocorrelacin entre resistencia de las hojas y la de tubrculos (Stegemann y Schnik 1985), pero

si se ha estudiado los compuestos fenlicos involucrados en la resistencia, tales como lignina,

suberina, calosa y las fitoalexinas (Estrada 2000).

1.6.Condiciones climticas favorables para el desarrollo deP. infestans

Henfling (1987) indica que el hongo desarrolla favorablemente a una alta humedad (90-

100%), propiciada por lluvias frecuentes o roco abundante y a temperaturas de 9 a 22 C. Eldesarrollo del hongo en la hoja es poco afectado por la humedad del ambiente, pero los

esporangios se forman solo cuando la humedad relativa (HR), dentro el follaje es superior a

95%. La enfermedad se desarrolla y propaga con mayor rapidez a temperaturas bajas y alta

humedad, puede sobrevivir en el hospedante a temperaturas entre 0 y 28C.

Cuando la temperatura es ptima se requieren 8 horas de alta humedad para la produccin

de esporangios, su liberacin y penetracin. Tiene que existir agua (roco, lluvia) en la

superficie de las hojas durante un mnimo de dos horas para que las zoosporas se formen,

germinen y penetren (PROINPA 1998).


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1.7. Distribucin geogrfica de la enfermedad

La enfermedad se presenta en casi todas las zonas donde se produce papa, abarcando una

amplia distribucin en la mayora de los pases de los cinco continentes y provocando grandes

daos (Junchaya 1983).

P. infestans emigr de Mxico a Estados Unidos y luego a Europa hacias el ao 1840

introducido y diseminado en tubrculos-semilla. La dispersin del patgeno se dio en primer

lugar desde Europa, por una primera migracin. Se presume que existi una segunda

migracin del patgeno en los aos 1970s desde Mxico a Europa (Fry et al. 1993, Forbes

1994, Garca 1997). En 1845 caus epidemias severas en la papa de Europa y Amrica del

Norte, ocasionando la hambruna, migracin y muerte de ms de un milln de personas enIrlanda. Esto llevo a la institucionalizacin del mejoramiento gentico de la papa y al

nacimiento de la fitopatologa como una ciencia (Estrada 2000).

El tizn en Bolivia (Fig. 9), se encuentra en los departamentos de La Paz, Cochabamba,

Santa Cruz, Oruro, Potos, Chuquisaca y Tarija (PROINPA 1996). Las zonas de mayor

incidencia del tizn son: Morochata, Monte Punku, Epizana, Candelaria, Valle de

Cochabamba, Escalante y Capinota (Cochabamba); Comarapa, San Isidro y Valle Grande

(Santa Cruz); y las zonas bajas de los departamentos de Tarija, La Paz, Potos, y Chuquisaca.En Cochabamba las zonas endmicas de mayor incidencia de tizn son Morochata, seguida

por Chullchunqani, Lope Mendoza, Candelaria y Mizque (Otazu et al. 1982).


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o Area de incidencia de A2

Zonas con tizn

Figura 9. Distribucin del tizn en Bolivia (Fuente: PROINPA 1998)

1.8. Importancia econmica de la enfermedad

El tizn tardo es considerado como la ms grave enfermedad de la papa en todo el

mundo. Ocurre en casi todas las zonas donde se cultiva este tubrculo. En los pases en

desarrollo, la prdida de rendimiento debido a la enfermedad se calcula cerca de 2,75 mil

millones de dlares (2,20 mil millones de EUR) cada ao. Adems, son muy cosotosos los

fungicidas (http://www.cipotato.org/potato/pests_diseases/late_blight/, Landeo et al. 1998).Por ejemplo, en el norte de Ecuador, los agricultores gastaron, en promedio, 120 dlares (96,3

EUR) por hectrea en fungicidas, que es un 10% del total de sus costes de produccin.

En Bolivia, en trminos econmicos, el tizn tardo es una de las enfermedades ms

importantes de la papa y se estima que ms de 40.000 familias de pequeos agricultores

paperos se ven afectadas. En las 20.000 hectreas de papas afectados por la enfermedad, las

prdidas directas son de unos 30 millones de dlares por ao (24 millones de EUR). La mayor

parte de la zona afectada se encuentra en las regiones productoras de semilla de papa, que en

la actualidad, apenas cubren el 5% de las necesidades nacionales de semilla de calidad. Esta


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prdida causada por la enfermedad pone de relevancia la importancia de la enfermedad en

Bolivia como un factor que limita la produccin y la productividad de las papas,

principalmente de las variedades Waycha, Sani Imilla, Alpha, Desire, etc., que son los ms

importante en la economa agrcola del pas (Bojanic 1995, Estrada et al. 1994, Fernndez-Northcote et al. 1999, Navia et al. 2002).

1.9. Fuentes de resistencia en el gnero Solanum

Los recursos genticos de especies silvestres de papa tienen un valor probado en los

programas de mejoramiento gentico para resistencia a enfermedades, estreses ambientales y

otros caracteres agronmicos de inters (Ross 1986, Spooner et al. 1991, Spooner and

Bamberg 1994, Ruiz de Galarreta et al. 1998, Jansky 2000, Ochoa 2001, Spooneret al. 2004).Las especies del Norte y Centro Amrica son particularmente ricos en cada caracterstica. Por

ejemplo muchas de las especies silvestres tienen alto nivel de resistencia contra P. infestans

(Bamberg et al. 1994, Song et al. 2003).

A principios del siglo XX se identificaron especies silvestres tuberferas como S.

demissum para utilizarlas como fuentes de resistencia a P. infestans. Sobre la base de esta

identificacin, se inici la introgresin de genes de resistencia mediante cruzamientos. A

partir de 1920, numerosas expediciones cientficas a Mxico, Amrica Central y Sudamrica,lugares que corresponden con los centros de origen y diversidad de la papa, permitieron

recolectar y describir taxonmicamente unas 200 especies silvestres y ocho especies

cultivadas (Hawkes 1990).

Diversos fitomejoradores han considerado que el uso de las especies silvestres es tedioso,

difcil y de larga espera para obtener logros. Esto posiblemente se ha debido en gran parte a

que la mayora de los fitomejoradores en Europa y Norteamrica han trabajado ms que todo

en la especie S. tuberosum ssp tuberosum y sus haploides. En ellos la fertilidad, especialmente

del polen es muy restringida y tambin la viabilidad gentica. El problema se vuelve ms

crtico cuando se hbrida con las especies silvestres (Peloquin et al. 1989, Estrada 1991,

Gabriel 1994).

Realmente slo despus de 1950 Ross (1986) ha intentado utilizar las especies silvestres,

especialmente con los trabajos de investigadores holandeses, alemanes, escandinavos,

polacos, espaoles y rusos. Tambin en Canad, Estados Unidos y en Latinoamrica (Wastie1991, Rivera-Pea 1992, Romero 1993, Ruiz de Galarreta 1998).


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La excepcin han sido los trabajos de Peloquin (1989) y su equipo de la Universidad de

Wisconsin, que utilizaron dihaploides de S. tuberosum con S. phureja o los trabajos de

Simmonds (1977) y Glendining (1975) en Scottish Plant Breeding Station de Escocia y

Plaisted et al. ( 1975) en Cornell University que lograron obtener tipos neotuberosum,extrados de la misma S. andigena, adaptndola en varias generaciones de seleccin a los das

largos del hemisferio norte, obteniendo as los cultivares neotuberosum.

En Latinoamrica los mejoradores contaron con ventajas comparativas muy grandes

como son la alta fertilidad y la flexibilidad de ploida que muestran los cultivares nativos

(Estrada 1984a, 1984b, 1990, 2000, Estrada y Gabriel 1991, Gabriel et al. 1995, Gabriel et al.

2007, Garca et al. 2007, Contreras 2008).

La manipulacin gentica bien dirigida ha abierto las puertas para explotar mucho ms

rpidamente, pocas generaciones (dos o tres), los grandes atributos de muchas especies

silvestres. Los trabajos de varios investigadores han contribuido a desarrollar mejores y ms

eficientes mtodos de mejoramiento gentico (Peloquin et al. 1989, Rivera-Pea 1992,

Nietherhauser 1993, Estrada 2000).

A pesar de la gran diversidad gentica disponible en las especies silvestres de este gnero,

slo un pequeo nmero de ellas han sido utilizadas para la introgresin de caracteres deresistencia en los cultivares. Se estima que apenas un 5% han sido utilizados en programas de

fitomejoramiento (Gabriel et al. 1995, Colque 1996, Estrada 2000, Gabriel et. al. 2001, Coca

y Montealegre 2006, Garca et al. 2007). Esto se debe, por un lado, a los problemas que

existen entre determinadas especies al cruzarse. El potencial de hibridacin de la papa

depende, en primera instancia, de la ploidia que presente la especie silvestre o cultivada y del

nmero de balance del endospermo (EBN). S. tuberosum presenta una ploidia/EBN = 4x

(4EBN), y el potencial de hibridacin es mayor con las especies 4x (4EBN) y 6x (4EBN),mientras que presenta un potencial de hibridacin menor con especies 4x (2EBN) y con

especies 2x (2EBN) (Spooner y Hijmans 2001). Por otra parte, en los cruzamientos, se

produce la introgresin de caracteres silvestres no deseados junto con los caracteres de

resistencia. Esto conlleva el desarrollo de mltiples ciclos de retrocruzamientos para

eliminarlos.

Existen papas nativas cultivadas originarias de los Andes que presentan una gran

variabilidad gentica, entre las que se encuentra resistencias a factores abticos (helada,

sequa) y biticos (hongos, bacterias, virus, nematodos); adems de factores de calidad. La


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introgresin en este germoplasma ha sido mnima y es posible que la evolucin de estos

cultivares contine in situ (Ugarte et al. 1994, Estrada 2000, Gabriel et al. 2007).

1.10. Resistencia gentica aP. infestans

Se entiende la resistencia como cualquier caracterstica heredada de una planta

hospedante para reducir el crecimiento y/o desarrollo del patgeno y/o parsito despus que

se ha iniciado o establecido el contacto. Se debe hacer la distincin de sta definicin con el

trmino tolerancia, que es cuando la planta susceptible, a pesar de estar infectada

severamente, soporta el ataque y logra produccin.

1.10. 1. Tipos de resistencia

La resistencia de las plantas a enfermedades, se puede investigar y determinar desde

diversos puntos:

a) Los cientficos que trabajan en el campo de la patologa de plantas tienen mayor intersen los mecanismos que confieren resistencia a la enfermedad, para lo que se considera: 1)

la infeccin y el establecimiento del patgeno en plantas infectadas, 2) la colonizacin y

esporulacin y/o 3) la reduccin de los efectos adversos sobre la expresin del

rendimiento. Por esta razn hay diferencias importantes entre la resistencia a la infeccin,

resistencia a la colonizacin y esporulacin y resistencia a la enfermedad o capacidad

para no perder rendimiento (Van der Plank 1984; Kirly et al. 1991, Sutic y Sinclair

1991).

b) Los mejoradores de plantas y genetistas han estudiado el grado de especificidad de laresistencia con las razas patognicas (Van der Plank 1968, 1984, 1991), identificndose

dos tipos de relacin: 1) resistencia a la raza especfica (vertical) y 2) resistencia a la raza

no especfica (horizontal). El primer tipo de resistencia es efectivo en contra de pocas

razas, especificas, del patgeno y ha sido usada intensivamente (Colon y Budding 1988 y

1993); la sintomatologa consiste en una reaccin hipersensitiva temprana y rpida que

produce un rea necrtica alrededor del punto de infeccin; es una respuesta especfica la

infeccin de cierta raza (Gabrielet al. 1988, Parlevliet y Niks 1989). El segundo tipo de

resistencia es eficaz en contra de muchas razas patognicas. Sin embargo, esta resistencia

no es perfecta, y no est asociada con una respuesta de hipersensibilidad. Como regla


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general se atribuye que la resistencia no especifica est determinada por el efecto de

muchos genes (Simmond y Wastie 1987).

c) El inters de los bilogos o bioqumicos en la resistencia es completamente diferente.Ellos hablan acerca de una resistencia preformada (pasiva y activa) e inducida

(adquirida). La resistencia preformada pasiva y activa est basada en la existencia de

barreras fsicas o qumicas en las plantas, sean stas infectadas o no. La resistencia

inducida slo ser dada cuando exista induccin de reaccin en la relacin planta -

patgeno (Daly 1984, Parlevliet y Niks 1989, Sutic y Sinclair 1991, Kirly et al. 1991,

Agrios 1991).

Varios investigadores han revisado los componentes bioqumicos de la resistencia (Sutic ySinclair 1991). Sin embargo, se han hecho pocas tentativas para relacionar estos con la

resistencia de campo; as, Duke y Tomiyama citados por Wastie (1991), examinaron el papel

de las glucanasas, quitinasas y componentes fenlicos, que al parecer son capaces de degradar

la pared celular del hongo y han sido estudiados muy ampliamente por diversos

investigadores.

En trabajos realizados por Miller y Brger citados por Sutic y Sinclair (1991) encontraron

que al inocular una raza incompatible de P. infestans, las plantas reaccionabanhipersensitivamente. De igual manera, al inocular una raza compatible en una variedad

susceptible de papa, observaron que el patgeno no se estableca. Esto les permiti deducir

que existen compuestos que ellos llamaron fitoalexinas, responsables de la resistencia.

Sustancias como la risitina (Keen 1982, Agrios 1991) slo se sintetizan en el momento en que

existe una interaccin entre la planta y el patgeno. Se sabe, adems, que un dao simple

sobre las hojas, tallos, races, frutos, etc., as como tejidos sometidos a radiacin, son capaces

de producir fitoalexinas. Sin embargo, Schber (1992) y Wastie (1991), mencionan que estarespuesta no est necesariamente correlacionada con la resistencia.

En resumen, no se puede afirmar con certeza si el patgeno infeccioso en las plantas

resistentes es en realidad inhibido como resultado de algn mecanismo, o a la inversa, el

patgeno activa mecanismos en el hospedero hipersusceptible.

Dentro del carcter de resistencia, es posible considerar aquellos caracteres gobernados

por un solo gen, unos pocos genes o muchos genes, recibiendo en cada caso los nombres demonognica, oligognica y polignica, respectivamente.


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Resistencia monognica

El gen de la resistencia monognica puede ser estudiado en detalle e identificado

individualmente, por letras, nmeros o de ambas maneras, por ejemplo Sr6, Sr11, Sr40, etc.,

que confieren resistencia en trigo a la roya; los genes R1, R2, R3, R4, , R10, etc. En S.

demissum para resistencia a diferentes razas de P. infestans; los genes A, B, F, etc. que dan

resistencia a la avena contra la roya del tallo; los genes Lr y Yr para roya de la hoja y roya de

las glumas del trigo. La resistencia que estos genes puede ser dominante o recesiva. Cuando la

resistencia monognica prevalece, es posible observar que las progenies segregantes pueden

ser clasificadas sin dificultad en clases discontinuas de individuos resistentes y susceptibles

(herencia mendeliana). Este tipo de resistencia est ntimamente aociado a la relacin gen a

gen, que involucra dos pares de genes acoplados: un par est en el hospedante y el otro est enel patgeno (Flor 1971)

Resistencia oligognica

La herencia de la resistencia oligognica es parecida a la resistencia monognica y, como

sta ltima, est asociada con genes mayores, los cuales no interaccionan con el ambiente o

interaccionan muy poco.

Resistencia polignica

La herencia de la resistencia polignica es ms compleja. Los genes que intervienen, en la

mayora de las veces son difciles de contarlos e identificarlos individualmente, conocindose

el efecto combinado de dichos genes como un total. Las plantas en las poblaciones

segregantes varan continuamente de resistencia sin poder ser agrupados claramente en grupos

definidos. La resistencia polignica est asociada con genes menores de efectos aditivos los

cuales interaccionan fuertemente con el ambiente. Sin embargo, es necesario notar que,normalmente es menos propensa a romperse por la aparicin de nuevas razas patognicas;

adems su expresin no es siempre del tipo de alta resistencia o inmunidad como en el caso

de la resistencia monognica (Rivera-Pea 1992, Niederhauser 1993).

1.11. Componentes de la resistencia

La introduccin de muchos genes deseables de resistencia puede ser posible, pero es

difcil identificar stos individualmente por mtodos tradicionales dado su efecto cuantitativo,lo cual hace la investigacin, as como el mejoramiento, difcil. Por esta razn, se han hecho


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diversos intentos para separar los componentes de la resistencia parcial, los cuales van

afectando a los diferentes estados en el ciclo del patgeno (Parlevliet 1997a, b, Parlevliet y

Niks 1989). Se han distinguido cinco componentes en P. infestans que determinan el

desarrollo de la epidemia (Van der Plank 1984, Colon y Budding 1988, Kirly et al. 1991,Sutic y Sinclair 1991) que pueden ser afectados por la planta hospedante y de este modo ser

utilizado en el mejoramiento: eficiencia de la infeccin (EI), periodo de latencia (PL), tasa de

crecimiento de la lesin (TCL), tamao de lesin (TL), periodo de infeccin (PI) e intensidad

de la esporulacin (IE). Para determinar la contribucin relativa de estos componentes de la

resistencia se han utilizado generalmente dos procesos (Van Oijen 1992; Colon et al. 1993,

Gabriel et al. 2007): 1) determinacin experimental de la correlacin entre los componentes

de la resistencia individual y tasa de progreso de la enfermedad y 2) construccin de modelos

matemticos de los patosistemas y un anlisis de sensibilidad.

Spielman et al. (1992) midieron tres componentes de agresividad (eficiencia de la

infeccin, rea de la lesin y capacidad de la esporulacin), para lo cual utilizaron 8 aislados

de P. infestans y una variedad susceptible 'Norchip'. Ninguno de los componentes fueron

predictores satisfactorios de la agresividad en campo por la influencia de los factores fsicos

del ambiente. La correlacin fue alta y negativa entre el rendimiento en campo y el tamao de

la lesin.

Por su parte, Hidalgo et al. (1998) en un estudio de componentes de resistencia horizontal

encontr correlacin significativa entre EI, PI, TCL y TL con el Area bajo la curva de

progreso de P. infestans (ABCPPI). Recomendando la EI, PI, TCL y TL como parmetros de

seleccin para resistencia horizontal en clones previamente seleccionados.

Umareus y Lihnell citados por Wastie (1991) hicieron mediciones cuidadosas de la

eficiencia de la infeccin, crecimiento de la lesin y produccin de conidios en evaluacionesde laboratorio, y posteriormente utilizaron estos parmetros para calcular el rea destruida por

el patgeno. Esta aproximacin analtica es un ejemplo de cmo puede medirse la importancia

relativa de los parmetros individuales, as como su valoracin como criterios de seleccin.

Por otra parte estudios realizados por Parlevliet (1979 y 1997a, b) sobre el periodo de

latencia de la roya de la roja del trigo Puccinia horde, mostr que la temperatura, el da largo

y la intensidad de luz no son importantes en el PL; pero si el estado de desarrollo de las

plantas. Demostrndose que el PL en plntulas no predicen bien el PL relativo de plantas

adultas. Trabajos recientes en Bolivia han encontrado una buena correlacin entre TL, rango


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de crecimiento de la lesin (RCL) e IE con el ABCPPI y que estos componentes pueden ser

utilizados eficientemente en evaluaciones de plantas en invernadero para seleccin de

genotipos resistentes (Gonzles et al. 1999, Orellana 2001, Gabriel et al. 2007).

1.12. Tcnicas moleculares en la mejora gentica

Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales

y microbianas basndose en el fenotipo. Las mejoras genticas eran posible gracias a la

variabilidad gentica, a la heredabilidad del carcter que se quera aislar, a la eficacia e

intensidad de la seleccin aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de seleccin.

Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son en muchos casos el nmero

exacto y efecto de los genes implicados en la expresin de un carcter y sus interacciones, ascomo la localizacin de estos genes, y el anlisis de su funcin fisiolgica.

Los avances en la biologa molecular y, particularmente, en la genmica y protemica

permiten aplicar nuevas estrategias y tcnicas eficientes para el detallado anlisis gentico de

cualquier fenotipo.

1.12.1. Marcadores moleculares

Los marcadores moleculares constituyen la herramienta bsica para los fines que se

describe en el primer prrafo del punto 1.12. Los marcadores son elementos discriminativos

que permiten distinguir y clasificar objetos.

Afortunadamente, la aparicin de los marcadores moleculares est ayudando a eliminar

tanto los inconvenientes de una seleccin basada en el anlisis exclusivo del fenotipo, como la

identificacin de especies y variedades de una forma ms rigurosa y repetitiva. Los

marcadores moleculares son biomolculas que se pueden relacionar con un rasgo gentico.

stas pueden ser marcadores moleculares como las protenas (antgenos e isoenzimas) y el

DNA (de genes conocidos o fragmentos de secuencia y funcin desconocida).

Un marcador molecular monomrfico es invariable en todos los organismos estudiados,

pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimtica, estructura, o

sitios de restriccin, se dice que es polimrfico. A veces el grado de variacin es tal que se

denominan hipervariable (www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/ y

opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MG01.html.).


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Los primeros marcadores desarrollados en papa a finales de los 70 se basaron en la

identificacin de protenas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidn o

poliacrilamida. Con ellos se abri el conocimiento de la estructura y heterogeneidad gentica

entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geogrfico. Pero estatcnica tena una limitacin muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo

entre variedades o especies prximas debido a que las protenas son el resultado de la

expresin gnica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a

otra, de un medio ambiente a otro, y de una poca del ao a otra. Los avances de la tecnologa

del DNA han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA,

consiguiendo estabilidad en la identificacin de especies y variedades.

El estudio genmico de una especie, normalmente, comienza con el desarrollo demarcadores moleculares. Los primeros marcadores de DNA descritos en papa fueron los

RFLPs (Gebhardt et al. 1989a). Esta tcnica requiere gran cantidad de ADN, es laboriosa y

costosa, aunque presenta una tcnica fiable. El descubrimiento y la explotacin de la tcnica

PCR (Reaccin en cadena de la Polimerasa) facilitaron enormemente el desarrollo y las

aplicaciones de marcadores moleculares.

Consecuentemente, se desarrollaron y aplicaron en la papa otros tipos de marcadores,

dominantes y codominantes, como los RAPD, AFLP (van Ecket al. 1995), SSR (Milbourne

et al, 1998), ISTR, ISSR, SCAR y CAP (Oberhagemann et al. 1999). Entre las aplicaciones

ms importantes de estos marcadores figuran la identificacin y la determinacin de la pureza

varietal (Grg et al. 1992) as como el anlisis de la biodiversidad y estudios filogenticos en

el gnero Solanum (Debeneret al. 1990).

Se pueden distinguir marcadores dominantes y codominantes. Esto implica que los

marcadores dominantes pueden ser especficos para un parental o comunes a ambosparentales, segregando 1:1 y 3:1 respectivamente en una progenie. En todos los casos existen

alelos nulos (ausencia del marcador dominante) que representan los otros alelos desconocidos

en una progenie.

Los marcadores codominates revelan cada uno de los diferentes alelos de un locus

conocido hasta diferente. A estos pertenecen generalmente los SSRs2, ESTs y TDFs (van Eck

2

Los SSRs (Simple Sequence Repeats), detectan regiones hipervariables del genoma. Un marcador SSR esuna repeticin de unas pocas bases (2-5) y est flanqueado por un nico DNA, son marcadores codominantes y

mapean regiones cromosmicas idnticas en diferentes entornos genticos. Debido a estas caractersticas,


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et al. 1995). Ellos tambin sirven para alinear los mapas genticos individuales de cada

parental y producir un mapa integrado (Ritteret al. 2008a).

Por otra parte hay marcadores indirectos y directos. Los marcadores indirectos son

aquellos que determinan la distancia entre el marcador y un gen de inters. En cambio, los

marcadores directos permiten la identificacin directa de los alelos de un gen de inters y se

pueden aplicar independientes del entorno gentico.

De particular inters son aquellos marcadores que mapean en diferentes entornos

genticos a la misma posicin genmica, ya que permiten por ejemplo alinear mapas de

diferentes entornos genticos. Obviamente tienen que ser single copy para evitar

confusiones. Entre ellos figuran generalmente copias simples de SSRs, TDFs, EST y COS.(Oberhagemann et al. 1999).

1.12.2. Mapas genticos

Para muchas aplicaciones genticas es necesario localizar el conjunto de marcadores

moleculares en el genoma. Para ello sirven los mapas genticos. El mapa gentico se deriva

de procesos estadsticos y refleja la estructura fsica de un genoma con sus correspondientes

cromosomas. Los mapas de ligamiento gentico se construyen a partir de cruzamientoscontrolados utilizando marcadores moleculares. En papa se han construido diferentes mapas

de ligamiento gentico a nivel diploide y tetraploide y en diferentes entornos genticos. El

primer mapa a nivel diploide se bas en marcadores RFLPs (Bonierbale et al. 1988). Luego el

construido por Gebhardt et al. (1989b).

En la actualidad existen muchos mapas genticos disponibles basados en diferentes

marcadores moleculares y se encuentran alineados con otros mapas de papa y tomate

mediante sondas comunes.

Cabe destacar que el mapa de SSRs fue descrito por Milbourne et al. (1998), que

contiene marcadores RFLPs mapeados tambin en el mapa de papa de la base de datos Gabi

(Pomamo) y sondas de tomate. Este mapa pudo ser anclado al mapa de Coromel et al. (2003),

el cual fue obtenido en una poblacin de S. tuberosum x S. spegazzinii y mapa de tomate

(Tanksley et al. 1992). El mapa ultradenso (UHD) de papa por Isidore et al. (2004) y van Os

estos marcadores son utilizados para el alineamiento entre los mapas individuales obtenidos para cada parental,as como para alinear mapas construidos a partir de diferentes poblaciones (Valadez y Kahl 2005).


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et al. (2006), que a parte los 10.000 marcadores AFLPs, contiene 40 marcadores RFLPs y

SSRs que se utilizaron como marcadores directos. Por otro lado, este mapa est alineado con

el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) mediante sondas RFLPs y cuenta con 66 marcadores

comunes al mapa de papa de Caromel et al. (2003). Recientemente, Ritteret al. (2008a), hancontribuido con un mapa completo de transcriptoma constitutivo expresando genes del

genoma de la papa, que se ha construido utilizando cDNA-AFLP. Los TDFs fueron anclados

a las cajas del mapa UHD.

1.12.3. Integracin de caracteres cualitativos

La disponibilidad de mapas genticos permite integrar en los mismos datos fenotpicos

que pueden ser causados por un gen (carcter monognico), por varios e incluso muchosgenes.

Los caracteres monognicas como por ejemplo la resistencia al virus Y de la papa (PVY)

se pueden tratar estadsticamente igual que un marcador molecular (presencia vs. ausencia)

para su integracin en un mapa.

Ritter et al. (2005) menciona que en los mapas genticos de la papa se han integrado

caracteres cualitativos como resistencia monognica a PVY (Ry

sto, Brignetiet al.

1997,Ryadg, Hmlinen et al. 1997), PVX (Rx1, Rx2, Ritteret al. 1991;Nb, De Jong et al. 1997,

Nxp, Tommiska et al. 1998), nematodos (Gro1, Barone et al. 1990,H1, Gebhardt et al. 1993,

Gpa1, Kreike et al. 1994, Gpa2, Rouppe van der Voort et al. 1997, Gpa5, Rouppe van der

Vooret al. 2000) y P. infestans (R1, Leonards-Schippers et al. 1994,R3, El-Kharbotly et al.

1994,R2, Li et al. 1998,R6yR7, El-Kharbotly et al. 1996).

1.12.4. Anlisis de QTL

Sin embargo, la variacin cuantitativa observada para la mayor parte de los caracteres

fenotpicos en plantas es causada por genes polignicos, que frecuentemente interacciona con

el medio ambiente (Vargas et al. 2006). La accin colectiva de los loci genticos en la

expresin de un carcter se ha denominado QTL (Geldermann 1975). Los efectos

cuantitativos de los QTLs no se pueden estudiar mediante el anlisis mendeliano, sin embargo

cuando un marcador molecular segrega segn un patrn mendeliano y est ligado a un QTL,

la posicin en el cromosoma del QTL y su contribucin fenotpica puede ser estimada

(Thoday 1961).


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Hasta ahora, hay numerosos modelos estadsticos para el anlisis QTL, que determinan la

posicin y el efecto de cada loci que influye en el carcter cuantitativo (Lander y Botstein

1989, Knapp et al. 1990, Martnez y Curnow 1992, Jansen y Stam 1994, Zeng 1994).

En papa, se han desarrollado diferentes anlisis de caracteres cuantitativos, considerando

resistencias polignicas a P. infestans (Leonards-Schippers et al. 1994) y G. pallida (Kreike et

al. 1993, Caromel et al. 2003). Tambin, se realizaron otros anlisis de QTL considerando los

componentes del rendimiento (Schfer-Pregl et al. 1998), la tuberizacin, la dormancia (van

den Berg et al. 1996), la forma del tubrculo (van Ecket al. 1994) y el contenido de azcares

y almidn (Menndez et al. 2002).

Los anlisis de caracteres cuantitativos han revelado que muchos QTL coinciden o estnlocalizados cerca de genes con determinadas propiedades biolgicas. En estudios de

resistencia a P. infestans se ha determinado que la posicin de un QTL con efecto importante

coincide con la del gen R1 y con otros genes Prp, que estn involucrados en reacciones de

defensa tras la invasin de patgenos (Leonards-Schippers et al. 1994).

El presente trabajo se centra en el anlisis de QTLs de resistencia a P. infestans. Dada la

importancia de este patgeno existen numerosos estudios de QTLs a este carcter en

diferentes entornos genticos. As, Ghislain et al. (2001) analizaron una poblacin de S.phureja (phu) con un dihaploide de S. tuberosum (dih tbr), en la que encontraron dos

importantes QTLs (loci de caracteres cuantitativos) en los cromosomas VII y XII como una

contribucin de ambos progenitores. Otro QTL fue detectado en el cromosoma XI como una

contribucin del parental phu, y otros tres fueron detectados en los cromosomas III, V y VIII,

como una contribucin del parental dih tbr. Bormann et al. (2004), seleccionaron 30

marcadores basados en DNA que se conoca estaban ligados con loci de resistencia a P.

infestans en papas diploides y fueron probados como marcadores ligados a loci de caracteres

cuantitativos (QTL) para la resistencia a P.infestans y madurez en dos poblaciones de medios-

hermanos tetraploides de papa.

Sorensen et al. (2006), evaluaron en campo dos poblaciones originadas de un

cruzamiento entre un clon de S. vernei y dos clones de S. tuberosum, por su resistencia al

tizn. S. vernei no fue previamente mapeado para QTLs. El ABCPPIrel fue estimado y

utilizado para el mapeo de QTLs. Se construy un mapa de S. vernei, con 11 grupos ligados,

de los cuales nueve podran ser asignados a los cromosomas. Los resultados indicaron que laresistencia en S. vernei era de herencia cuantitativa. Se identificaron, asimismo, QTL


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significativos en los cromosomas VI, VIII, y IX. Adicionalmente, fueron detectados en los

cromosomas VII y IX QTLs potenciales. Un QTL posible para rendimiento en tubrculo fue

encontrado en los cromosmas VI y VII, pero no estaba asociado a resistencia. El QTL de

resistencia a P. infestans fue mapeado para el cromosoma IX, y podra ser utilizado en mejoragentica para P. infestans, el mismo est asociado al marcador SSR STM1051, en ambas

poblaciones.

Un caso interesante es el descrito por van der Vossen et al. (2005), que mencionan una

posicin clonada deS. bulbocastanum del cual deriv el gen blb2 RPI-gen, el cual cuando se

presenta en papa confiere una amplia resistencia al P. infestans. El gen RPI-blb2 fue

inicialmente mapeado en varias poblaciones de retrocruzamientos de tetraploides, derivados

de un complejo de hibridos interespecficos con alta resistencia denominado ABPT (unacrnimo de cuatro especies de Solanum: S. acaule, S. bulbocastanum, S. phureja y S.

tuberosum), en la misma regin del cromosoma VI como el gen Mi-1 de tomate, que confiere

resistencia a nematodos, pulgones y mosca blanca. Los marcadores ligados a QTLs que

controlan caracteres de inters, posibilitan la seleccin asistida por marcadores moleculares

(SAM).

Sin embargo, si el mapa contiene solo pocos marcadores, la distancia gentica existente

entre el marcador y el QTL es en muchos casos insuficiente para que este marcador permitaun buen diagnstico del carcter. Con el objeto de resolver esta situacin, es conveniente

desarrollar mapas de ligamiento gentico de alta densidad, para poder disponer de marcadores

moleculares fsica y estrechamente ligados al QTL que controle el carcter de inters (Ritter

et al. 2004).

1.12.5. Genotipado de QTA

Independiente del modelo particular del anlisis de QTL, la estrategia clsica para ladeteccin de genes que influyen en un carcter cuantitativo consiste en: a) establecer

progenies apropiadas a partir de cruzamientos, b) la construccin de mapas genticos basados

en marcadores moleculares en estas progenies y c) en la realizacin de un anlisis estadstico

de QTLs (Leonards-Schippers et al. 1994).

Esta estrategia representa una tarea laboriosa sobre todo si se quiere procesar varias

progenies a su vez. Con el fin de ahorrar trabajo para el anlisis de QTLs en diferentes

progenies se podran analizan nicamente aquellas posiciones genmicas de QTLs para

resistencia a P. infestans que se hayan publicado previamente. Para ello los SSRs son


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marcadores ideales, ya que son altamente polimrficos, muestran una herencia codominante y

sobre todo mapean en diferentes entornos genticos a posiciones genmicas idnticas. En el

caso de la papa ya existe un mapa denso de SSRs que cubre todo el genoma (Milbourne et al.

1998). Esto permite determinar los QTLs y sus posiciones genmicas en los diferentesparentales de las progenies, as como obtener directamente marcadores (aqu alelos de SSRs)

para la seleccin asistida en los programas de mejora gentica.

La estrategia que denominamos QTA genotyping (Quantitative trait allele genotyping)

tambin se ha empleado en el presente trabajo, utilizando varias progenies con diferentes

parentales como fuentes de resistencia a P.infestans (entornos genticos diferentes).

1.12.6. Identificacin e integracin de genes candidato

Tradicionalmente, los marcadores empleados para el mapeo de ligamiento y anlisis de

QTL fueron marcadores neutrales e identificaban DNA genmico en general. Pueden estar

ms o menos vinculados a un alelo de QTL y su configuracin depende de los antecedentes

genticos particulares. Por lo tanto, sera conveniente para detectar directamente los genes que

influyen en un carcter de inters para analizar y comparar los efectos de sus diferentes alelos.

Estos tipos de marcadores podran ser aplicados directamente en la seleccin asistida por

marcadores moleculares con ayuda de la seleccin, independiente de los antecedentesgenticos y son tiles para establecer mapas funcionales.

Los genes candidato, son los genes conocidos o sospechosos de tener un papel funcional

en la expresin fenotpica de un rasgo que co-localiza con QTL para el mismo carcter

(Pfliegeret al, 2001). A este tipo de marcadores pertenecen los CAPS (Cleaved Amplified

Polymorphic Sequence, Secuencia polimrfica amplificada y cortada) descritos por

Konieczny y Ausbel (1993). Los fragmentos amplificados se someten a una restriccin

enzimtica y se migra en un gel de agarosa, para detectar polimorfismo, despus de una

amplificacin de PCR (Nuez y Carrillo 2000). Las variaciones se detectan por presencia o

ausencia de sitios de restriccin. Se pueden as localizar cambios finos en una zona especfica.

Se trata de un marcador ampliamente utilizado, sobre todo tras la conversin de otros tipos de

marcadores en marcadores de PCR.

Bormann et al. (2004) evaluaron marcadores basados en DNA que se sabe estn

vinculadas a loci de resistencia del patgeno en dos familias tetraploides de papa. En el CIP,Kreuze et al. (2006, no publicado) evalu en la poblacin PCC1 algunos de estos genes


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candidatos que fueron objeto en el cromosoma XI y encontr alta asociacin con la resistencia

a P. infestans. Adems, Manosalva et al. (2000) evaluaron los marcadores correspondientes a

la planta de genes de defensa a travs de la vinculacin con el desequilibrio cuantitativo de

resistencia a P.infestans en una poblacin diploide y tetraploide mapeadas. Algunos de estosgenes resultaron estar asociados con QTLs y basado en PCR marcadores de osmotina y genes

STH para PCR, mostr una asociacin significativa con la resistencia. Kreuze et al. (2006, no

publicado), diseo primers utilizando secuencias de BAC- finales sobre la base de secuencias

del marcador NL27 (Marczewski et al. 2001) y ambos se relacionaron con resistencia a P.

infestans en la poblacin PCC1.

Trujillo (2004), report cuatro marcadores provenientes de AFLPs, ligados a QTL de tbr

en el cromosoma XII. Estos fueron convertidos en marcadores de secuencia especfica parafacilitar su deteccin en poblaciones segregantes.

Otros genes candidatos desarrollados se obtuvieron a travs de anlisis transcripcional

utilizando microarrays de cDNA y la mayora est relacionada con el metabolismo, defensa

de la planta, sealizacin y regulacin de la transcripcin, envueltos todos con el proceso de

defensa de las plantas como respuesta a patgenos. As por ejemplo, Hernndez et al. (2008)

utiliz cDNA-AFLP diferenciales para detectar cDNAs que se expresan en forma diferencial

despus de una inoculacin con P. infestans y posteriormente se ha analizado su significado

biolgico. Adems, realizaron un ensayo de microarrays para detectar genes de respuesta o de

resistencia a la infeccin de P. infestans, diseando cebadores de los genes candidatos

(nuevos o ya conocidos), con el propsito de integrarlos en el mapa de referencia de la

especie. De estos estudios obtuvieron polimorfismos segregantes en el caso de BS2

(TC148920). Este cDNA pudo ser mapeado en un mapa de referencia de papa en el

cromosoma XI. Se observ que este cDNA, esta co-localizado con el QTL Pi-11b.

Tras el diseo de cabadores apropiados basados en sus secuencias estos genes candidatos

se dejan tambin integrar en un mapa gentico si se obtienen productos de amplificacin

segregantes. Estos se pueden utilizar igual que los otros marcadores para el mapeo. Si estn

asociados a un particular QTL conocido, entonces puede representar un gen candidato

potencial para este carcter.

En el presente trabajo se han utilizado varios marcadores de genes candidatos para

complementar el QTA genotyping con SSRs.


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1.12.7. Mapas funcionales

Es conveniente unir toda la informacin con respecto a marcadores de DNA, mapas

genticos, caracteres cualitativos, QTLs, genes y otra informacin en un nico "mapa

funcional consensuado" (Gebhardt et al. 1999). El volumen de datos que generan los

proyectos genmicos es enorme y es necesario presentar los datos combinados e interpretados

a cualquier usuario con el fin de obtener sinergia y colaboracin complementaria entre

diferentes grupos de investigacin. Para maximizar la difusin de resultados y estimular la

explotacin de los recursos generados es necesario establecer una base de datos en Internet

con amplias opciones de bsqueda.

En nuestro trabajo hemos utilizado varias de estas bases de datos en Internet para recabarinformacin sobre marcadores y genes y QTLs de resistencia a P. infestans.


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2. Objetivos


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El presente trabajo de investigacin se plante con los siguientes objetivos:

Evaluar la resistencia a P. infestans en follaje y tubrculo en cinco progenies de papaobtenidas de cruzamientos interespecficos entre especies silvestres (oka, can, buk,

jam, rap) y especies cultivadas (phu, gon y un dihaploide de tbr).

Identificar marcadores discriminatorios para genes de resistencia a P. infestansaplicando como estrategia de genotipado de QTA (QTA genotyping) utilizando

SSRs ligados a QTLs conocidos de resistencia a P. infestans en las diferentes

progenies.

Evaluacin de marcadores y genes candidatos conocidos de resistencia a P. infestansen algunas progenies.


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3. Materiales y mtodos


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3.1. Resistencia a tizn en follaje

Los estudios de resistencia fueron realizados en las instalaciones de la Fundacin para la

Promocin e Investigacin de Productos Andinos (PROINPA) en Cochabamba, Bolivia y en

Neiker Tecnalia, Vitoria-Gasteiz, Espaa.

3.1.1. Material vegetal y preparacin

En el marco del proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y BMZ-CIP, se

obtuvo semilla sexual de familias de cruzamientos entre especies silvestres diploides

S.okadae, S. canacense, S. bukasovii, S. jamesii (oka 498063.6, can 310956.8, buk 210042.5,

jam 27521.48 y rap 636) y cultivadas diploides S. phureja, S. goniocalyx (phu 81ccc, gon CIP

703354 y H88.31/34 (dihaploide de Solanum tuberosum). Todas ellas conservadas en elBanco de Germoplasma de Races y Tubrculos Andinos de la Fundacin PROINPA en

Bolivia y una de ellas (H88.31/34 x rap 636) obtenida en NEIKER derivada del programa de

mejora gentica de papa (Tabla 1). Las especies silvestres utilizadas en la presente

investigacin, fueron estudiadas y caracterizadas como nuevas fuentes de resistencia a P.

infestans en estudios previos (Colque 1996, Estrada 2000).

Tabla 1. Parentales y progenies de cruzamiento entre especies silvestres (Solanum okadae,

S. canasense, S. bukasovii, S. jamesii y S. raphanifolium) con especies cultivadasdiploides (S. phureja y S. goniocalyx) y un dihaploide de S. tuberosum.

Cdigoexperimental

Genealoga No. genotiposevaluados

Hembra Macho

C oka 498063.6 phu 4238.1 (81 ccc) 50D can 310956.8 gon 60324/41 (CIP 703354) 83E buk 210042.5 phu 4238.1 (81 ccc) 66G jam 27521.48 gon 60324/41 (CIP 703354) 72

N H88.31/34 rap 636 96

Total 367oka = S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovii, jam = S. jamesii, phu = S. phureja,gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide de S. tuberosum (dihtbr)

Antes de la siembra se sumergi la semilla sexual (TPS) en una solucin de cido

giberlico a 1.500 ppm, (disolvindose 0,75 g en medio litro de agua destilada esterilizada)

por 24 horas, con el propsito de romper la dormancia y uniformizar la germinacin.


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Tras secar

Documents

Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa