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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABADDEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS, QUMICAS YMATEMTICAS

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA YBIOQUMICA

Practica de Bioqumica IICurso: Bioqumica

Docente: Qco. Ciro Tomaylla

Alumnos: Torres Caviedes Judith Lindsay

Tema: Laboratorio 9

Hora: Jueves 7-9pm

Cusco-Per

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AISLAMIENTO DEL RNA DE LEVADURA Y CUANTIFICACION COLORIMETRICA

I. OBJETIVOS:

Cuantificar ARN mediante el azcar que conforman los acidos ribonucleicos. Aprender a extraer el ARNII. MARCO TEORICO:

ACIDOS NUCLEICOSLos cidos nucleicos fueron descubiertos en 1868 porFriedrich Miescher, que los llam nuclena ya que losaisl del ncleo celular.Ms tarde, se comprob que lasclulas procariotas, que carecen de ncleo, tambincontenan cidos nucleicos. El papel del ARN en la

sntesis de protenas fue sospechado en 1939. SeveroOchoa gan el Premio Nobel de Medicina en 1959 trasdescubrir cmo se sintetizaba el ARN. En 1965 RobertW. Holley hall la secuencia de 77 nucletidos de unARN de transferencia de una levadura, con lo que obtuvoel Premio Nobel de Medicina en 1968. En 1967, CarlWoese comprob las propiedades catalticas de algunosARN y sugiri que las primeras formas de vida usaronARN como portador de la informacin gentica tantocomo catalizador de sus reacciones metablicas(hiptesis del mundo de ARN). En 1976, Walter Fiersy

sus colaboradores determinaron la secuencia completadel ARN del genoma de un virus ARN (bacterifagoMS2). En 1990 se descubri en Petunia que genesintroducidos pueden silenciar genes similares de lamisma planta, lo que condujo al descubrimiento del ARNinterferente. Aproximadamente al mismo tiempo sehallaron los micro ARN, pequeas molculas de 22nucletidos que tenan algn papel en el desarrollo deCaenorhabditis elegans. El descubrimiento de ARN queregulan la expresin gnica ha permitido el desarrollo demedicamentos hechos de ARN, como los ARN pequeosde interferencia que silencian genes.El ARN o RNA es un cido nuclico formado por unacadena de ribonucletidos. Est presente tanto en lasclulas procariotas como en las eucariotas, y es el nicomaterial gentico de ciertos virus (virus ARN). El ARNcelular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma

de algunos virus es de doble hebra.En los organismos celulares desempea diversas funciones. Es la molcula que dirige las etapasintermedias de la sntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN paratransferir esta informacin vital durante la sntesis de protenas (produccin de las protenas

que necesita la clula para sus actividades y su desarrollo). Varios tipos de ARN regulan laexpresin gnica, mientras que otros tienen actividad cataltica. El ARN es, pues, mucho msverstil que el ADN.

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III. MATERIALES Y REACTIVOS:

IV. PROCEDIMIENTOS:Se realizo mediante dos pasos:

A. Extraccin del ARNSe preparo 3.5g de levadura en 15ml de agua a 37C por 15 minutos, se disolvi en 20ml de fenolconcentrado agitando por 30 min a temperatura ambiente, se centrifugo se supone a 3000g perose malogro la centrifuga con el fin de romper la emulsion, sesaco para remover la capa acuosa y se centrifugo otra vez sesupone a 10000g por 5 minutos pero lo hicimos a 2500rpm por30 minutos refrigerando de cuando en cuando los tubos paraseparar la protena desnaturalizada, separamos el sobrenadante

en este se puso acetato de potasio 20g/l y etanol 2ml paraprecipitar el ARN luego repos en hielo por 1 hora, se centrifugopara recoger el precipitado en frio a 2000g pero fue realmentea 2500rpm por 30 minutos, llevo a bao maria y se lavo elprecipitado con agua-etanol(1:3); luego solo con etanol yfinalmente se lavo con ter para sacar el ARN puro y evaporarrpidamente.Segn bibliografa el peso de ARN en levaduras debe ser 4% delpeso seco.B. Determinacin colorimtrica del ARN mediante ribosaEsta es una reaccin general para las pentosas y se debe a la formacin de furfural cuando secalienta la pentosa con HCl concentrado. El orcinol reacciona con furfural en presencia de clorurofrrico como catalizador, dando una coloracin verde. Solamente los nucletidos de purina danuna reaccin considerable.Descripcin del mtodo:Esta tcnica denominado mtodo de Bial (9,10) (Orcinol) se realiza en condiciones detemperatura y tiempo estables, utilizando una mezcla de cido clorhdrico, orcinol y FeCl3El cido rompe los enlaces glicosdicos y deshidrata los monosacridos para la condensacin con elorcinol, ascomo para la oxidacin de los grupos cetonas libres, a una temperatura de 100 C y untiempo de 20 min. Esto provoca la formacin de un complejo verde

estable que absorbe a una longitud de onda de 670 nm. El mtodo utilizado en el ensayo se valid.Metodo:

MATERIALES REACTIVOS MUESTRAS Tubos de ensayo

Bao isotrmico Espectrofotmetro Micropipeta y Pipetas Baguetas Gradilla Vasos de precipitados Balanza analtica Termmetro Congeladora pa el rotor Centrifuga sorvall WX ultra 80

Solucin de fenol (900g/l)

Acetato de potasio (200g/l,pH=5) Etanol absoluto ter etlico

Levaduraseca

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Mezclamos 2ml de la solucin de acido nucleico con 3 ml de reactivo de orcinol. Calentamol unbao de agua hirviendo por 20 minutos, enfriamos y llevamos al espectrmetro a 660nm, el blancofue orcinol.Se disolvi una cantidad de ARN en agua caliente:

Blanco Estandar1

Estandar2

Estandar3

Estandar4

Problema6

Agua d ml 1.80 1.75 1.70 1.65 1.60 1.30Estndar ribosa ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 -

Sol.ARN ml - - - - - 0.50FeCl3, HCl(c) ml 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00Rvo. Orcinol ml 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

Absorbancia 660nm - 0.0957 0.1209 1347 0.1509 0.1673Concentracion mg - 0.013 0.025 0.037 0.050 0.060

Se homogenizo y calent en bao de agua hirviendo por 30 minutos, hasta observar la aparicin

de un color, se dejo enfriar y se llevo al espectrofotmetro.

V. CUESTIONARIO:1) Explicar la importancia del RNA en el organismo humano.

Es importante decir que el ARN a diferencia del ADN se distribuyepor toda la celula, esta en el citoplasma como ARN soluble y ARNribosomal, 10% aprox. Esta en el nucleo y poco en mitocondrias.Son importantes pues cumplen diferentes funciones en el organismo,mencionare algunas:mARN: Interviene en la primera etapa de la sntesis de protenas

transcripcion del ADN al mARN. El mARN va al citoplasma y esprecisamente all donde, con la participacin de rebosomas y tARN,las 4 bases nucleotidicas se convierten en el cdigo de 20 tripletasque llevan la clave de la ordenacin de aminocidos en las protenas. Esmetablicamente inestable es su caracterstica nica del mARNARN ribosomal (rARN): Unido a protenas de carcter bsico,forma los ribosomas. Los ribosomas son partculas microscpicasde la celula, visibles nicamente bajo microscopio electrnico, conuna composicin bastante uniforme de aproximadamente 60% deprotena y 40% de ARN. Varios ribosomas pueden unirse a unacinta de mARN para formar un POLISOMA que se asemeja

bastante a las cuentas de un collar de perlas. Hay dos tipos deribosomas, el que se encuentra en clulas procariotas y en elinterior de mitocondrias y cloroplastos, y el que se encuentra en elhialoplasma o en el retculo endoplsmico de clulas eucariotas.

ARN de transferencia (tARN): existe un tARN especifico paracada aminocido activado al lugar de sntesis de protena. Tienenun peso molecular mas bajo que todas y gracias a esto la secuenciade nucletidos ha sido determinada para muchos de ellos.El ARN transferente o soluble es un ARN no lineal. En l se pueden

observar tramos de doble hlice intracatenaria, es decir, entre lasbases que son complementarias, dentro de la misma cadena. Estaestructura se estabiliza mediante puentes de Hidrgeno.

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Adems de los nucletidos de Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo, el ARN transferentepresenta otros nucletidos con bases modificadas. Estos nucletidos no pueden emparejarse,

y su existencia genera puntos de apertura en la hlice, produciendo bucles.En el ARNt se distinguen tres tramos (brazos). En uno de ellos 1, aparece una secuencia de

tres nucletidos, denominada anticodon. Esta secuencia es complementaria con una secuenciadel ARNm, el codon. En el brazo opuesto 2, en el extremo 3' de la cadena, se une unaminocido especficopredeterminado por la secuencia de anticodon.La funcin del ARNt consiste en llevar un aminocido especfico al ribosoma. En l se une a lasecuencia complementaria del ARNm, mediante el anticodon. A la vez, transfiere elaminocido correspondientea la secuencia de aminocidos queest formndose en el ribosoma.ARN heteronuclear (ARNhn): El ARN heteronuclear, oheterogneo nuclear, agrupa a todos los tipos de ARN queacaban de ser transcritos (pre-ARN). Son molculas dediversos tamaos.Este ARN se encuentra en elncleo de las clulas eucariotas.En clulas procariotas no aparece.Su funcin consiste en ser el precursorde los distintos tiposde ARN.

2) Explique la funcin que cumplen los reactivos: fenol, acetato de potasio, etanol absolutoy ter etlico en el aislamiento de RNA.Fenol: La solucin concentrada de fenol rompe los enlaces de hidrogeno en lasmacromolculas, causando desnaturalizacin de protenas. La suspensin turbia se centrifuga

y aparecen dos fases: la inferior de fenol contiene ADN y la superior acuosa contienecarbohidratos y ARN. La protena desnaturalizada esta presente en ambas fases y puederemoverse por centrifugacin.Acetato de potasio: Enlaza al ARN para hacer posible el precipitado.Etanol: Precipita al ARN. No contiene ADN pero esta contaminado con polisacridos.ter etlico: ARN mas soluble en este compuesto, se usa con fines practicos lavar y secarrpidamente.

3) Cuales son las posibles reacciones?

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